Бівалентна вакцинна композиція та її застосування для лікування злоякісних пухлин

Реферат: Винахід належить до вакцинної композиції, яка містить позаклітинний домен (ECD) рецепторів фактора росту Her1 та Her2 в однакових пропорціях в діапазоні концентрацій від 100 до 800 мкг/дозу і протеоліпосоми дуже малого розміру, отриманої з білків зовнішньої мембрани Neisseria meningitides, і гангліозид GM3 (VSSP-GM3). Винахід також належить до застосування даної вакцинної композиції при лікуванні злоякісних пухлин, які експресують Неr1 і Неr2. UA 116154 C2 (12) UA 116154 C2 UA 116154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується біотехнології й імунології застосовно до здоров'я людини. Конкретно він стосується вакцинного складу для лікування злоякісних пухлин. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ, ЩО ПЕРЕДУЄ ВИНАХОДУ Рецептори Her1 і Her2 являють собою трансмембранні глікопротеїни з тирозинкіназною активністю, що належать до сімейства рецепторів, відомому як сімейство ErbB (Normanno N, et al (2005) Curr. Drug. Targets 6, (3): 243-257). Her1 надекспресований у пухлинах легень, молочних залоз, голови і шиї, колоректальних пухлинах, пухлинах підшлункової залози, сечового міхура, яєчників і гліобластомах (TM Brand, et al, (2011) Cancer Biol. Ther. 11 (9): 777792); (Zhau HY et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, (26): 15152-15157; Liu XH, et al, (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 77 (6): 1472-1478; Neal DE, et al, (1985) Lancet 1 (8425): 366-368; Gullick WJ, et al, Cancer Res. 46 (1): 285-292; Salomon DS, et al, (1995) Crit Rev Oncol Hematol 19 (3): 183-232). Надекспресія Her1 асоційована з несприятливим прогнозом при пухлинах голови і шиї і раку легень, з високим ризиком рецидивів захворювань (Turkeri LN et al, (1998) Urology 51 (4): 645-649; Chow NH, et al, (1997) Anticancer Res. 17 (2B): 1293-1296) і зі зниженою виживаністю пацієнтів з раком яєчників, кишечнику, сечового міхура, щитовидної залози і голови і шиї (Grandis et al, (1998) J. Cell. Biochem Suppl. 69 (1):55-62). Крім того, рівні експресії Her1 корелює зі стійкістю до загальноприйнятих терапевтичних засобів (Holbro T, et al, (2003) Exp. Cell. Res. 284 (1): 99-110). Аномальна експресія рецептора Her2 у порівнянні з експресією в нормальних тканинах також виявлена в пухлинах молочної залози, шлунка, яєчників і передміхурової залози (Tai W et al, (2010) J. Control Release 146 (3): 264-275). Крім того, порушення регуляції цього рецептора спостерігали при злоякісній трансформації дихальних шляхів (Andrade Filho et al., 2010), і воно є механізмом стійкості пухлин до терапевтичних засобів проти Her1 (Brand et al, (2011) Cancer Biol. Ther. 11 (9): 777792). Надекспресія Her2 у пухлинах молочної залози корелювала з більш низькою загальною виживаністю і виживаністю без рецидивів. У багатьох із вказаних вище пухлин спостерігають високий рівень коекспресії Her1 і Her2, і надекспресія обох рецепторів пов'язана зі зниженою виживаністю пацієнтів ((Wiseman SM, et al, (2005) Cancer. May 1; 103(9): 1770-7). У пацієнтів з позитивним по Her2 раком молочної залози існує високий ризик смертності, асоційований із захворюванням, і, крім того, коекспресія Her1 і Her2 у цих пухлинах значно підвищує цей ризик, що свідчить про те, що експресія Her1 у цих карциномах чинить синергічну дію на експресію Her2 (Suo Z et al, (2002) J. Pathol. 196 (1): 17-25). Експериментально продемонстровано, що існує синергетична взаємодія між цими рецепторами при злоякісній трансформації клітин (Kokai Y et al, (1989) Cell 58 (2): 287-292). Інші приклади пухлин, у яких виявлена коекспресія Her1 і Her2, являють собою злоякісні пухлини головного мозку, яєчників, голови і шиї, легень, стравоходу і товстого кишечнику (Emanuel SL et al, (2008) Mol. Pharmacol. 73 (2): 338-348; Ako E et al, (2007) Oncol. Rep. 17 (4): 887-893; Venkateswarlu S et al, (2002) Oncogene 21 (1): 78-86). У літературі добре описана фізіологічна роль аномальної експресії і коекспресії рецепторів Her1 і Her2 у пухлинах. За допомогою формування димерів і гетеродимерів (Pinkas-Kramarski R et al, (1996) EMBO J. 15 (10): 2452-2467) ці рецептори регулюють важливі процеси в біології пухлини, такі як безперервна проліферація, ангіогенез, інгібування апоптозу, перепрограмування метаболізму, здатність до інвазії і метастазування (Hanahan D et al (2011) Cell 144 (5): 646-674). Рецептори Her1 і Her2 мають схожу структуру, що складається з позаклітинного домену (ECD), одиночного трансмембранного домену і внутрішньоклітинного домену з тирозинкіназною активністю. Молекулярна маса ECD Her1 (ECD-Her1) і ECD Her2 (ECD-Her2) складає 105 і 110 кДа, відповідно, і вони на відміну від іншої молекули можуть приймати різні конформації. ECD містять чотири субдомени, які позначаються I, II, III і IV. Субдомени I і III являють собою області, що формують ділянку зв'язування ліганду, і містять потенційні ділянки глікозилування. Субдомен II є ключовою областю для димеризації рецепторів, і його називають "плечем димеризації" (Garrett TP et al, (2002) Cell 110 (6): 763-773; Ferguson KM et al, (2003) Mol. Cell 11 (2): 507-517). Усього описано сім лігандів Her1, серед яких найбільш значущими для пухлиноутворення є епідермальний фактор росту (EGF), що стимулює проліферацію клітин епідермісу, які експресують рецептор, трансформуючий фактор росту (TGF) і амфірегулін (Normanno et al, (2005) Curr. Drug. Targets 6 (3): 243-257). ECD-Her1 знаходиться в динамічній рівновазі і має декілька конформацій, що включають "закриті" конформації і конформації, у яких субдомен II знаходиться в більш рухливому стані. Зв'язування ліганду зрушує рівновагу убік "протяжної" або 1 UA 116154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активної конформації, конформаційного стану, який здатний до димеризації (Ferguson KM, (2008) Annu. Rev. Biophys. 37: 353-373). Однак специфічного ліганду Her2 не виявлено. Передача сигналу через цей рецептор не вимагає факторів росту, тому що рецептор у конститутивній формі має активну або "протяжну" конформацію, що експонує його субдомен димеризації (Cho HS et al, (2003) Nature 421 (6924): 756-760). З цієї причини рецептор Her2 є переважним партнером димеризації для всіх інших представників сімейства ErbB, включаючи Her1 (Franklin MC et al, (2004) Cancer Cell 5 (4): 317328). Гетеродимеризація з Her2 сприяє зменшенню ступеня ендоцитозу Her1 і збільшенню повернення на мембрану рецепторів, що формують гетеродимери (Lenferink A E et al, (1998) EMBO J. 17 (12): 3385-3397). Як описано Baselga J et al, ((2009) Nat. Rev. Cancer 9 (7): 463-475), індукована лігандами димеризація забезпечує аутофосфорилування і трансфосфорилування залишків тирозину в цитоплазматичній області рецепторів. Одержувані залишки фосфотирозину запускають кілька внутрішньоклітинних сигнальних шляхів. Одним з ініційованих сигнальних шляхів є шлях мітоген-активованих протеїнкіназ (MAPK), у каскаді активації яких беруть участь регульовані позаклітинними сигналами протеїнкінази Erk1 і Erk2. Вони індукують експресію факторів транскрипції, що підсилюють транскрипцію генів, залучених до клітинної проліферації, таких як циклін D1, що стимулює проходження клітинного циклу до фази G1/S. Комбінації гетеродимерів є найбільш ефективними сигнальними комплексами і можуть прямо регулювати клітинний цикл (Pinkas-Kramarski R et al, (1996) EMBO J. 15 (10): 2452-2467). Ці пухлинні мішені ретельно перевірені в клінічних дослідженнях. Проведено оцінку клінічного ефекту лікування інгібіторами тирозинкіназ (TKI) цих рецепторів, такими як гефітиніб і лапатиніб (Ciardiello F et al, (2000) Clin. Cancer Res. 6 (5): 2053-2063; Kondo N et al, (2010) Oncol. Rep. 23 (4): 957-963). Також існують протоколи клінічних випробувань з використанням моноклональних антитіл (MAb) до вказаних вище мішень, таких як цетуксимаб (Jean GW et al, (2008) Pharmacotherapy 8(6):742-54) і німотузумаб (Ramos TC, et al, (2006) Cancer Biol. Ther. 5 (4): 375-379), специфічних до ECD HER1, і трастузумаб, що розпізнає ECD Her2 (Clifford A, (2007) N. Engl. J. Med.; 357: 39-51) Незважаючи на потужну протипухлинну дію деяких з цих терапевтичних засобів, таких як цетуксимаб, описані молекулярні механізми стійкості, серед яких знаходиться підвищені рівні експресії іншого рецептора цього сімейства, наприклад, Her2 (Brand TM et al, (2011) Cancer Biol. Ther. 11 (9): 777-792). З іншого боку, більш гарна реакція карцином молочної залози і легень, які експресують гетеродимери Her2, на пертузумаб, MAb миші до Her1, виявлена з іншими представниками сімейства ErbB (Agus DB et al, (2005) J. Clin. Oncol. 23 (11): 2534-2543). Це підтримує представлення, що інгібування гетеродимеризації є перспективною стратегією для терапії злоякісних пухлин. Крім того, як нова терапевтична можливість з'явилася активна терапія вакциною проти злоякісних пухлин, метою якої є активація реакції імунної системи в пацієнтів з пухлинами, які експресують Her1 і Her2. Однак цей вид терапії є складним, тому що він включає стимуляцію імунної системи, придушеної супресуючою дією пухлини, що робить необхідним використання у вакцинних складах ад'ювантів, які допомагають одержати ефективну відповідь. До таких ад'ювантів належать протеоліпосоми дуже малого розміру (VSSP), одержувані з білків зовнішньої мембрани Neisseria meningitidis, які здатні активувати дендритні клітини (DC) і направити імунну відповідь за зразком відповіді Т-хелперів першого типу (Th1), як описано в патенті WO 02/45746, зареєстрованому 6 грудня 2001 року. Рецептори Her1 і Her2 були мішенями різних кандидатів на роль вакцин, оцінюваних у доклінічних і клінічних дослідженнях. При розробці вакцин на основі Her2 використовували вакцини DC (Czerniecki BJ et al, (2007) Cancer Res. 67 (4): 1842-1852), пептиди Her2 і ECD Her2. (Ladjemi MZ et al, (2010) Cancer Immunol. Immunother. 59 (9): 1295-1312). У фазі II клінічних випробувань у пацієнтів з раком молочної залози оцінювали активну імунізація пептидом p369377 (пептид E75), який отримувався з ECD Her2 і презентувався MHC-I, з використанням гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (GM-CSF) як ад'юванта. Ця вакцина здатна породжувати in vivo цитотоксичні Т-лімфоцити (CTL), специфічні до клітин, які надекспресують Her2, і в даний час знаходиться у фазі II клінічних випробувань (Knutson KL et al, (2002) Clin. Cancer Res.8 (5): 1014-1018; Patil R et al, (2010) J. Am. Coll. Surg. 210 (2): 140147). Крім того, розроблена терапевтична вакцина на основі ECD Her2 з GM-CSF як ад'юванта, яка здатна затримати ріст карцином, які експресують Her2 і продовжувати тривалість життя імунізованих тварин (Helguera et al, (2006) Vaccine 16;24(3):304-16). У патентній заявці EP-A-661061 і патенті US-A-6149921 описані вакцинні композиції, які стимулюють або підсилюють утворення антитіл до гангліозидів і містять імуноген і імунологічний ад'ювант. Описані імуногени являють собою VSSP, утворені за допомогою асоціації N 2 UA 116154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ацетильованих GM3-гангліозидів (N-AcGM3) і N-гліколіл-GM3 (N-GcGM3) з білковим комплексом зовнішньої мембрани (OMPC) бактерії Neisseria meningitidis. Імуногени N-AcGM3/VSSP і NGcGM3/VSSP мають дуже маленький розмір, практично не видні під електронним мікроскопом, розчинні у воді і мають високу плавучість. У патенті WO-A-02145746 описані вакцинні композиції, що містять: (A) один або декілька слабко імуногенних антигенів; (B) VSSP із включеними гангліозидами, в основному N-AcGM3/VSSP і N-GcGM3/VSSP; і (C) необов'язково один або декілька ад'ювантів. Зокрема описана вакцина, активним інгредієнтом якої є ECD Her1, а як ад'ювант використані VSSP і монтанід (Монтанід) ISA51 VG. Доклінічні випробування цієї вакцини продемонстрували її протипухлинну дію in vitro і in vivo (Ramirez BS, et al, (2006) Int. J. Cancer 119 (9): 2190-2199; Ramirez BS, et al (2008) Vaccine 26 (38): 4918-4926). Хоча результати отримані з моновалентними терапевтичними засобами, вони не були досить ефективними, тому що ці терапевтичні засоби не можуть повністю видалити масу пухлини, і, навіть коли розмір пухлини зменшується, в остаточному підсумку вона рецидивує після появи стійких варіантів. Це дозволяє припускати, що специфічні порушення не здатні знищити такі складні біологічні системи, як пухлини. Це може передбачати, що в стійких варіантах, утворених під дією монотерапевтичних засобів, мішенню яких є представники сімейства ErbB, збільшуються рівні експресії інших представників сімейства (Brand TM, et al, (2011) Cancer Biol. Ther. 11 (9): 777-792), дозволяючи пухлинам уникати атак імунної системи. Унаслідок цього, множинні порушення біології пухлин за допомогою інактивації декількох рецепторів ErbB могти б привести до підвищення ефективності. У патентній заявці WO-A-02145746 також заявлена композиція, що містить рецептори факторів росту Her-1, Her-2 і PDGF-R або будь-які їхні варіанти, що містять позаклітинний домен із трансмембранною ділянкою або без неї. Однак ні в цій заявці, ні в якому-небудь іншому документі в даній галузі техніки не пояснюється, як комбінувати два рецептори, зокрема ECD рецепторів Her1 і Her2 для виробництва бівалентної вакцини, яка ефективно індукує продукцію антитіл у вакцинованого індивідуума. Автори даного винаходу виявили, що при змішуванні в однакових пропорціях ECD Her1 і Her2 і VSSP-GM3 одержують вакцинну композицію, здатну індукувати продукцію титрів антитіл, які інгібують фосфорилування Her1 і Her2, і ці антитіла чинять антипроліферативну дію на пухлинні клітини. Автори винаходу також виявили, що пропорції, у яких комбінують ECD Her1 і Her2, є вирішальними для одержання бажаної імунної відповіді, тобто що не будь-яка комбінація ECD рецепторів Her1 і Her2 ініціює цю імунну відповідь. Метою даного винаходу є нові вакцинні композиції з однаковими пропорціями ECD рецепторів Her1 і Her2 і VSSPs-GM3 для підшкірного введення. Додатковою метою даного винаходу є спосіб лікування пацієнтів, які страждають на захворювання, які викликаються пухлинами, які експресують рецептори факторів росту Her1 і Her2, що включає підшкірне уведення вакцинної композиції ECD рецепторів Her1 і Her2 і VSSPsGM3, де ECD рецепторів Her1 і Her2 знаходяться в однакових пропорціях. Додатковою метою даного винаходу є вакцинні композиції з однаковими пропорціями ECD рецепторів Her1 і Her2 і VSSP-GM3 і з додатковим ад'ювантом, який може бути масляним або не масляним. Додатковою метою даного винаходу є спосіб, за допомогою якого індукують імунну відповідь при лікуванні злоякісних пухлин, які експресують рецептори Her1 і Her2. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується вакцинної композиції, що містить ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхні фрагменти, використовувані для індукції імунної відповіді проти злоякісних пухлин, які експресують рецептори Her1 і Her2. Ця вакцинна композиція додатково містить протеоліпосоми дуже малого розміру, очищені з білків зовнішньої мембрани Neisseria meningitidis, і GM3 (VSSPGM3). У конкретному варіанті здійснення композиція за даним винаходом додатково містить фармацевтично придатний ад'ювант. Ці фармацевтично придатні ад'юванти включають, але не обмежуються, масляні ад'юванти, такі як високоочищене мінеральне масло і поверхневоактивну речовину, і немасляні ад'юванти, наприклад, оксид алюмінію. Автори даного винаходу несподівано виявили, що пропорція, у якій комбіновані ECD рецепторів, значима для індукції імунної відповіді проти злоякісних пухлин, які експресують рецептори Her1 і Her2. Бівалентна вакцинна композиція, описувана в даному документі, містить ECD рецепторів Her1 і Her2 у однакових пропорціях. Суміш обох активних речовин, а саме ECD рецепторів Her1 і Her2, в інших пропорціях не чинить бажаної дії на імунну систему. В одному з варіантів здійснення композиція за даним винаходом містить ECD рецепторів Her1 і Her2 у діапазоні концентрацій приблизно від 100 до приблизно 800 мкг/дозу. Більш конкретно, 3 UA 116154 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композиція даного винаходу містить 800 мкг/дозу кожного з ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхніх фрагментів і додатково містить 1,2 мг/дозу VSSP-GM3, уводяться підшкірно у водному розчині. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає ці дози по 800 мкг/дозу кожного з ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхніх фрагментів і 1,2 мг/дозу VSSP-GM3, які можна змішувати з ад'ювантом, таким як монтанід ISA 51 або оксид алюмінію. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується вакцинної композиції, що містить ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхні фрагменти, для використання для індукції імунної відповіді, як спосіб лікування злоякісних пухлин, які експресують рецептори Her1 і Her2. Спосіб лікування за даним винаходом включає підшкірне введення щонайменше однієї дози ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхніх фрагментів у діапазоні доз приблизно від 100 до 800 мкг/дозу і додатково 200 мкг/дозу приблизно при 1,2 мг/дозу VSSP-GM3. Уведення можна проводити за допомогою підшкірних ін'єкцій кожні два тижні до завершення всього 5 доз, а потім протягом 1 року вводять підтримуючу дозу. У конкретному варіанті здійснення даний винахід включає вакцинну композицію з ад'ювантом монтанідом ISA 51, що уводиться внутрішньом'язово. Даний винахід стосується використання ECD рецепторів Her1 і Her2 або їхніх фрагментів, одержуваних за допомогою синтезу білка або за допомогою генно-інженерних технологій. У даному винаході терміни "бівалентний вакцинний склад" або "бівалентна вакцинна композиція" використовують взаємозамінно, і у всіх випадках вони стосуються вакцинної композиції, що містить позаклітинні домени (ECD) рецепторів Her1 і Her2 або їхні фрагменти, використовувані для індукції імунної відповіді проти злоякісних новоутворень, які експресують рецептори Her1 і Her2, і яка може додатково містити VSSP-GM3. Злоякісні пухлини, які можна лікувати цією вакцинною композицією, включають пухлини, які експресують щонайменше один рецептор сімейства Her, зокрема Her1 і/або Her2. Переважно пухлини, які експресують обидва рецептори, а більш переважно пухлини, надекспресують обидва рецептори. У переважному варіанті реалізації, даний винахід стосується пухлин епідермального походження, а більш конкретно пухлин голови, шиї, молочної залози, легень, товстого кишечнику, підшлункової залози, передміхурової залози, сечового міхура і яєчників і гліоми. Абревіатури MAb і PAb стосуються моноклональних і поліклональних антитіл, відповідно. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На фігурі 1 представлена кінетика Ab IgG у мишей BALB/c (n=5), підшкірно імунізованих чотири рази кожні 14 доби і через 30 діб після останньої імунізації 100 мкг ECD-Her1 і 100 мкг ECD-Her2 у 200 мкг VSSP. Забір крові робили на 7, 21, 35, 56, 87 і 102 добу для вимірювання титрів Ab IgG в імунних сироватках з використанням аналізу ELISA. Кінетика Ab IgG виражена у вигляді логарифма (1/середовище для титрування+1) для кожної доби виділення, після обробки ECD-Her1 (a) і ECD-Her2 (b). На фігурі представлена відповідь Ab окремих мишей (n=5), відповідь специфічна для ECD-Her1 (c) і ECD-Her2 (d) і її вимірювали за допомогою побудови графіка логарифма зворотної величини титру Ab плюс 1 на 87 добу протоколу імунізації. Різні літери означають статистичну значимість, проаналізовану за допомогою двостороннього ANOVA (де фактором є група лікування) з використанням виправлення Бонферроні (p