Водорозчинний гідролітично стабільний активований полімер, спосіб одержання активованого поліетиленгліколю (варіанти), біологічно активний кон’югат

1 Водорастворимый гидролитически стабильный активированный полимер, содержащий по меньшей мере один активный сульфоновый остаток, присоединенный к полимеру, выбранному из группы, состоящей из полиалкиленоксидов, полиоксиэтилированных полиолов и полиолефиновых спиртов, где указанный по меньшей мере один активный сульфоновый остаток является а) активным этилсульфоновым остатком, б) SO2-CH2-CH2-X, где X обозначает галоген, в) винилсульфоновой группой, происходящей из активного этилсульфонового остатка, г) CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, д) NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 2 Водорастворимый полимер по п 1 , отличающийся тем, что полимер обладает гантельной структурой, включающей сульфоновый активный остаток по меньшей мере на одном конце главной полимерной цепи и активный остаток, который может быть таким же или отличным от указанного активного остатка на противоположном конце главной полимерной цепи 3 Водорастворимый полимер по п 2, отличающийся тем, что включает другой активный остаток на противоположном конце главной полимерной цепи, который реакционноспособен в отношении аминовых остатков 4 Водорастворимый полимер по п 1 , отличающийся тем, что по меньшей мере один активный сульфоновый остаток способен образовывать связь с реакционноспособным остатком на по верхности биологически активной молекулы 5 Водорастворимый полимер по п 4, отличающийся тем, что реакционноспособный остаток представляет собой тиоловый остаток 6 Водорастворимый полимер по п 1 , отличающийся тем, что имеет формулу R-(OCH2CH2)n-Y, где п составляет 5-3000, Y обозначает группу, выбранную из -SO2-CH=CH2, и -SO2-CH2-CH2-X, где X обозначает галоген, или производные этой группы, R выбирают из группы, состоящей из НО-, НзСО-, SO2-CH=CH2 и -SO2-CH2-CH2-X, где X обозначает галоген 7 Водорастворимый полимер по п 1 , отличающийся тем, что указанный полимер является полиэтиленгликолем 8 Водорастворимый полимер по п 6, отличающийся тем, что R представляет собой остаток, взаимодействующий с аминовым остатком, представленный группой X-CH2-CH2-SO2-, где X обозначает галоген 9 Биологически активный конъюгат, состоящий из (а) одной, имеющей по меньшей мере одну реакционноспособную тиоловую группу, или двух биологически активных молекул, по меньшей мере одна из которых имеет реакционноспособную тиоловую группу, и (б) водорастворимого гидролитически стабильного активированного полимера, содержащего по меньшей мере один активный сульфоновый остаток, присоединенный к полимеру, выбранному из группы, состоящей из полиалкиленоксидов, полиоксиэтилированных полиолов и полиолефиновых спиртов, где указанный по меньшей мере один активный сульфоновый остаток является а) активным этилсульфоновым остатком, б) SO2-CH2-CH2-X, где X обозначает галоген, в) винилсульфоновой группой, происходящей из активного этилсульфонового остатка, г) CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2, д) NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 10 Биологически активный конъюгат по п 9, отличающийся тем, что указанная биологически активная молекула является белком, имеющим цистеиновые группы 11 Биологически активный конъюгат по п 10, от О 00 ^00 ю 58481 личающиися тем, что указанный конъюгат имеет следующую формулу n3r-SO2-CH2-CH2-S-W, где W представляет собой биологически активную молекулу, и ПЭГ обозначает полиэтиленгликоль 12 Биологически активный конъюгат по п 9, отличающийся тем, что указанный конъюгат включает две биологически активные молекулы, по меньшей мере одна из которых имеет реакционноспособный тиоловый остаток, а водорастворимый гидролитически стабильный активированный полимер представляет собой полимер с гантельной структурой, имеющий по меньшей мере один концевой активный сульфоновый остаток, который образует связь с тиоловым остатком указанной биологически активной молекулы, а другая биологически активная молекула образует связь с другим активным остатком на указанном полимере 13 Биологически активный конъюгат по п 12, отличающийся тем, что указанная биологически активная молекула выбрана из группы, включающей белки, фармацевтические вещества, клетки, витамины и их комбинации 14 Биологически активный конъюгат по п 13, отличающийся тем, что указанный биологически активный конъюгат включает водорастворимый полимер, имеющий активный сульфоновый остаток, который селективен в отношении реакции с тиоловым остатком, и активный остаток, который селективен в отношении реакции с аминовым остатком, и два белка, причем первый белок, имеющий тиоловый остаток, который образует с сульфоновым остатком указанного полимера гидролитически стабильную связь, и второй белок, содержащий аминовый остаток, у которого аминовый остаток образует связь с другим активным остатком указанного полимера 15 Биологически активный конъюгат по п 9, отличающийся тем, что указанный гидролитически стабильный биологически активный конъюгат является продуктом взаимодействия 1) по меньшей мере одной биологически активной молекулы формулы W-SH, где W представляет собой остаток биологически активной молекулы, a SHпредставляет собой реакционноспособный тиоловый остаток, и 2) производного полиэтиленгликоля, активированного одним или несколькими сульфоновыми остатками и имеющего формулу R-CH2-CH2-(OCH2CH2)n-Y, где п - составляет 5 - 3000, Y обозначает -SO2-CH=CH2 или SO2-CH2-CH2-X, где X обозначает галоген, значения R выбирают из группы, состоящей из НО-, Н3СО-, X-CH2-CH2-SO2-, где X обозначает Настоящее изобретение относится к активным производным полиэтиленгликоля и родственным гидрофильным полимерам и к способам их синтеза для использования при модификации характеристик поверхностей и молекул Проводились исследования по использованию галоген, и CH2=CH-SO2-, где реакционноспособный остаток присоединен к по меньшей мере одному активированному сульфоновому остатку 16 Биологически активный конъюгат по п 15, отличающийся тем, что указанная биологически активная молекула является белком, а реакционноспособный тиоловый остаток содержится в цистеиновом остатке указанного белка 17 Биологически активный конъюгат по п 15, отличающийся тем, что указанный конъюгат имеет следующую формулу R-CH2-CH2-(OCH2CH2)n-SO2-CH2-CH2-S-W, где п составляет 5-3000, значения R выбирают из группы, состоящей из НО- и НзСО-, W представляет собой остаток биологически активной молекулы 18 Биологически активный конъюгат по п 15, отличающийся тем, что указанный конъюгат имеет следующую формулу W-S-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-(OCH2CH2)n-SO2-CH2CH2-S-W, где п составляет 5-3000, W представляет собой остаток биологически активной молекулы 19 Биологически активный конъюгат по п 15, отличающийся тем, что указанный конъюгат имеет следующую формулу R-CH2-CH2-(OCH2CH2)n-SO2-CH2-CH2-S-6enoK, где п составляет 5-3000, значения R выбирают из группы, состоящей из НО- и НзСО20 Биологически активный конъюгат по п 15, отличающийся тем, что указанный конъюгат имеет следующую формулу 6enoK-S-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-(OCH2CH2)n-SO2CH2-CH2-S-6enoK, где п составляет 5-3000 21 Способ получения активированного полиэтиленгликоля, имеющего активную винилсульфоновую группу, предусматривающий взаимодействие активированного амином полиэтиленгликоля с молекулой, которая имеет сукцинимидильную активную эфирную единицу NHS-O2C на одном терминальном конце и винилсульфоновую единицу SO2-CH=CH2 на другом конце, с получением n3r-NH-CO-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 22 Способ получения активированного полиэтиленгликоля, имеющего активную винилсульфоновую группу, предусматривающий взаимодействие сукцинимидилового активного сложного эфира полиэтилегликоля с молекулой, которая имеет аминогруппу -NH2 на одном конце и винилсульфоновую группу -SO2-CH=CH2, с получением n3r-CO-NH-CH2-CH2-SO2-CH=CH2 полиэтиленгликоля ("ПЭГ") в фармацевтических препаратах, искусственных имплантатах и других областях применения, где важное значение имеет биологическая совместимость Чтобы обеспечить возможность присоединения ПЭГ к фармацевтическим веществам и имплантатам, а также к моле 58481 кулам и поверхностям обычно для модификации физических или химических характеристик молекулы или поверхности, были предложены различные производные полиэтиленгликоля ("ПЭГпроизводные"), содержащие активный остаток Так, например, для присоединения ПЭГ к поверхностям с целью регулирования смачивания, накопления статического электричества и присоединения к поверхности молекул других типов, включая белки и остатки белков, предложены ПЭГ-производные В частности, были предложены ПЭГ-производные для присоединения к поверхностям пластмассовых контактных линз с целью уменьшить накопление белков и улучшить зрительное восприятие за счет уменьшения помутнения таких линз Были предложены ПЭГпроизводные для присоединения к искусственным кровеносным сосудам с целью уменьшить накопление белков и опасность закупорки Предложены ПЭГ-производные для иммобилизации белков на поверхности, как при ферментном катализе химических реакций Кроме того, например, были предложены ПЭГпроизводные для присоединения к молекулам, включая молекулы белков, с целью защиты молекулы от химического воздействия, для ограничения нежелательных побочных эффектов молекулы или для увеличения размеров молекулы, потенциально содействуя тем самым созданию полезных веществ, которые с медицинской точки зрения приносят определенную пользу, но в остальном бесполезны или даже вредны для живого организма Небольшие молекулы, которые обычно выделялись бы через почки, удерживают в токе крови, если их размеры увеличивают присоединением биологически совместимого ПЭГпроизводного Белки и другие вещества, которые при их инъекции вызывают иммунную реакцию, можно в определенной мере скрыть от иммунной системы присоединением к белку ПЭГ-молекулы Были предложены также ПЭГ-производные для выделения по сродству, например, ферментов, из клеточной массы При разделении по сродству ПЭГ-производное вводит функциональную группу для обратимого присоединения к ферменту, который содержится в клеточной массе ПЭГ и продукт присоединения фермента выделяют из клеточной массы, а затем при необходимости фермент отделяют от ПЭГ-производного Сочетание ПЭГ-производных с белками отражает некоторые проблемы, с которыми приходится сталкиваться при присоединении ПЭГ к поверхностям и молекулам У многих поверхностей и молекул число участков, доступных для реакций сочетания с ПЭГ-производным, до некоторой степени ограничено Так, белки, как правило, располагают ограниченным числом реакционноспособных участков определенного типа, которые доступны для сочетания Еще более проблематичным является то, что некоторые реакционноспособные участки могут быть ответственными за биологическую активность белка, как это бывает, когда фермент катализирует некоторые химические реакции ПЭГ-производное, которое присоединено к достаточному числу таких участков, может оказывать неблагоприятное воздействие на активность белка Реакционноспособные участки, которые образуют места присоединения ПЭГ-производных к белкам, определяются структурой белка Белки, включая энзимы, построены из различных последовательностей альфа-аминокислот, которые характеризуются общей структурой H2N-CHR-COOH Альфа-аминовый остаток (H2N-) одной аминокислоты соединен с карбоксильным остатком (СООН) смежной аминокислоты, образуя амидные мостики, которые могут быть представлены как (NH-CHR-CO)n-, где п может составлять сотни или тысячи Фрагмент, обозначенный R, может содержать реакционноспособные участки, обусловливающие биологическую активность белка и место присоединения ПЭГ-производных Так, например, в лизине, который является аминокислотой, образующей часть главной цепи большинства белков, остаток -NH2 находится в эпсилон-положении, а также в альфа-положении Эпсилон-остаток -NH2 в условиях щелочных значений рН свободен для реакций Много усилий в данной области техники было направлено на создание ПЭГ-производных для присоединения к эпсилон-остатку -NH2 лизиновои фракции белка Общим у всех этих ПЭГ-производных является то, что такая лизиновая аминокислотная фракция белка обычно оказывается инертной, что может является недостатком там, где важное значение для активности белка имеет лизин В патенте США 5122614 на имя Zahpsky указано, что ПЭГ-молекулы, активированные оксикарбонил-Ы-дикарбоксимидной функциональной группой, в водных щелочных условиях могут быть присоединены посредством уретанового мостика к аминогруппе полипептида Отмечено, что активированный ПЭГ-Ы-сукцинимидный карбонат образует с аминогруппами стабильные, стойкие к гидролизу уретановые мостики Там же указано, что аминогруппа более реакционноспособна при щелочных величинах рН (8,0-9,5), а при пониженных значениях рН реакционная способность резко падает Однако при значениях рН 8,0-9,5 также резко усиливается гидролиз несвязанного ПЭГпроизводного Zahpsky устраняет проблему повышения скорости взаимодействия несвязанного ПЭГ-производного с водой применением избытка ПЭГ-производного для связывания с поверхностью белка Используя избыток, с ПЭГ связывают достаточное количество реакционноспособных эпсилон-аминовых участков для модификации белка до того, как у ПЭГ-производного появляется благоприятная возможность оказаться гидролизованным и не способным к взаимодействию Способ Zahpsky приемлем для присоединения лизиновои фракции белка к ПЭГ-производному по одному активному участку этого ПЭГпроизводного Однако, если скорость гидролиза ПЭГ-производного оказывается существенной, присоединение по более чем одному активному участку ПЭГ-молекулы может стать проблематичным, так как простой избыток не снижает скорости гидролиза Так, например, линейный ПЭГ с активными участками на каждом конце присоединяется к белку одним концом, но если скорость гидролиза зна 58481 8 единения, но подвергаются гидролизу до образочительна, другой конец взаимодействует с водой вания такого соединения, а это означает, что и скорее оказывается блокированным относиреакционноспособная группа ПЭГ-производного тельно нереакционноспособным гидроксильным может оказаться инертной еще до того, как может остатком, который структурно обозначен как -ОН, быть присоединен белок Некоторые в опредечем образует "гантелеподобную" молекулярную ленной мере токсичны, поэтому менее пригодны структуру с присоединенными с каждого из концов для использования in vivo Некоторые слишком белковыми или другими требуемыми группами медленно взаимодействуют, чтобы быть практиПодобная проблема возникает, если молекулу чески полезными Некоторые вызывают потерю необходимо присоединить к поверхности с помобелком активности из-за присоединения по участщью ПЭГ-соединительного агента, поскольку ПЭГ кам, ответственным за активность белка Некотовначале присоединяют к поверхности или он сорые не обладают специфическими свойствами на единяется с молекулой, а противоположный конец участках, к которым они присоединяются, что такПЭГ-производного должен оставаться активным же может привести к потере требуемой активности для последующей реакции Если из-за гидролиза и отсутствию воспроизводимости результатов возникает сложная ситуация, тогда противоположный конец обычно становится инертным Согласно изобретению предложены водорастворимые и гидролитически стабильные произКроме того, в патенте США 5122614 на имя водные полиэтиленгликолевых ("ПЭГ") полимеров Zahpsky описано несколько других ПЭГи родственные гидрофильные полимеры, содерпроизводных, взятых из ранее выданных патенжащие по одному или несколько активных сультов Отмечается, что ПЭГ-сукциноил-Мфоновых остатков Эти полимерные производные гидроксисукцинимидный эфир образует сложнос активными сульфоновыми остатками высоко эфирные мостики, которые в водной среде обласелективны для сочетания не с аминовыми остатдают ограниченной стабильностью, что указывает, ками, а с тиоловыми остатками молекул и на потаким образом, на нежелательно короткий период верхностях, прежде всего при значениях рН приполупревращения этого производного Указано, близительно 9 или меньше Сульфоновый что ПЭГ-цианурхлорид проявляет нежелательную остаток, связь между полимером и сульфоновым токсичность и не обладают способностью для остатком и связь между тиоловым остатком и специфического взаимодействия с конкретными сульфоновым остатком в восстановительных усфункциональными группами белка Следовательловиях обычно не обладают обратимостью и усно, ПЭГ-цианур-хлоридное производное может тойчивы к гидролизу в течение продолжительных проявлять нежелательные побочные эффекты и периодов в водной окружающей среде при значеможет понижать белковую активность, поскольку ниях рН приблизительно 11 или менее Следовапо различным реакционноспособным участкам оно тельно, такими активными сульфонсодержащими соединяется с рядом аминокислот различных типолимерными производными в требуемых водных пов ПЭГ-фенилкарбонат, как сказано, образует условиях можно модифицировать физические и токсичные гидрофобные фенольные остатки, кохимические характеристики самых разнообразных торые обладают сродством с белками О ПЭГ, веществ активированном карбонилдиимидазолом, говорится, что он слишком медленно взаимодействует с Так, условия для модификации биологически белковыми функциональными группами, требуя активных веществ можно оптимизировать с учедля достижения достаточной модификации белка том сохранения высокой степени биологической большой продолжительности реакции активности Фармацевтические препараты, начиная аспирином и кончая пенициллином, можно Тем не менее для присоединения к функциоуспешно модифицировать присоединением активнальным группам аминокислот, отличными от эпных сульфонсодержащих полимерных производсилон-остатка -NH2 лизина, были предложены ных, если эти фармацевтические вещества преддругие ПЭГ-производные Гистидин включает реварительно модифицируют с тем, чтобы они акционноспособный иминовый остаток, отвечаюсодержали тиоловые остатки Также успешно щий формуле -N(H)-, но многие производные, можно модифицировать большие белки, вклювзаимодействующие с эпсилон-остатком -NH2, чающие цистеиновые звенья, у которых имеются вступают также во взаимодействие с -N(H)- Цисактивные тиоловые остатки Для введения цистеин включает реакционноспособный тиоловый теиновых групп по требуемым местам молекулы остаток, отвечающий формуле -SH, но ПЭГбелка можно применять технику получения рекоммалеимидное производное, которое взаимодейстбинантной ДНК ("генетической инженерии") Эти вует с этим остатком, подвергается гидролизу цистеины можно сочетать с активными сульфонКак можно видеть из приведенных выше ссысодержащими полимерными производными для лок, затрачены значительные усилия на создание создания гидролитически стабильных соединений различных ПЭГ-производных, предназначенных с различными белками, которые обычно не содля присоединения к лизиновой аминокислотной держат цистеиновых звеньев фракции различных белков, в частности к -МЬЬостатку Продемонстрирована проблематичность синтеза и использования многих из этих производных Некоторые образуют с белком нестабильные соединения, которые подвержены гидролизу и, следовательно, в водной среде, в такой, как ток крови, на очень длительный срок не сохраняются Некоторые образуют более прочные со Специфические сульфоновые остатки для активированных полимеров по изобретению представляют собой те, у которых имеется по меньшей мере по два углеродных атома, связанных с сульфоновой группой -SO2-, так, чтобы присутствовал реакционноспособный участок для тиолспецифических реакций сочетания при втором от 58481 10 сульфоновой группы углеродном атоме гидроксильный остаток, вступает во взаимодействие с образованием замещенного полимера, соБолее конкретно активные сульфоновые осдержащего более реакционноспособный остаток татки представляют собой винилсульфон, активЭтот полученный замещенный полимер вступает ные этилсульфоны, включая галоид эти лсульфово взаимодействие с замещением этого более ны, и тиолспецифические активные производные реакционноспособного остатка серусодержащим этих сульфонов Винилсульфоновый остаток моостатком, у которого имеются по меньшей мере жет быть представлен структурно как -SO2 два углеродных атома, причем сера в этом серуСН=СЬІ2, активный этилсульфоновый остаток мосодержащем остатке связана непосредственно с жет быть структурно представлен как -SO2 -СНгуглеродным атомом полимера Далее серусодерСЬІ2 -Z, где Z может обозначать галоидную или жащий остаток вступает в реакции с окислением какую-либо другую отщепляемую группу, способсеры, -S-, до сульфона, -SO2-, и с образованием ную замещаться тиолом с образованием соединеучастка при втором углеродном атоме сульфонсония сульфона или тиола -SO2 СЬЬ -S-W, где W держащего остатка, реакционной способности обозначает биологически активную молекулу, покоторого достаточно для образования связей с верхность или какой-нибудь другой объект Протиолсодержащими остатками изводными винил- и этилсульфонов могут служить и другие заместители при условии сохранения Еще более конкретно способ синтеза актививодорастворимости и тиолспецифической реакцированных полимеров по изобретению включает онной способности реакционноспособного участка взаимодействие полиэтиленгликоля с гидроксиу второго углеродного атома лактивиру-ющим соединением с образованием Изобретение включает гидролитически стабильные конъюгаты веществ, включающих тиоловые остатки, с полимерными производными, содержащими активные сульфоновые остатки Так, например, водорастворимый, активированный сульфоном ПЭГ-полимер можно сочетать с биологически активной молекулой на ее реакционноспособном тиоловом участке Химическая связь, посредством которой ПЭГ сочетают с биологически активной молекулой, включает сульфоновыи остаток, присоединенный к тиоловому остатку, и имеет формулу n3r-SO2-CH2-CH2-S-W, где W обозначает биологически активную молекулу независимо от того, являлся ли сульфоновыи остаток перед сочетанием с ПЭГ винилсульфоном или активным этил сульфоном В объем изобретения включены также биологические материалы, у которых имеется поверхность, содержащая один или несколько реакционноспособных тиоловых участков и один или несколько водорастворимых, активированных сульфоном полимеров по изобретению, присоединенных к поверхности сульфоновой и тиоловой связью Биологические материалы и другие вещества можно также сочетать с активированными сульфоном полимерными производными посредством связи, отличной от сульфоновой и тиоловой связи, такой, как обычная аминовая связь, в результате чего уходит более гидролитически стабильная активирующая группа, т е сульфоновыи остаток, способная вступать в последующие реакции Изобретение включает способ синтеза активированных полимеров по изобретению Серусодержащий остаток присоединяют непосредственно к углеродному атому полимера, а затем превращают в активный сульфоновыи остаток Альтернативно этому сульфоновыи остаток может быть получен присоединением соединительного агента, на одном конце которого имеется такой сульфоновыи остаток, к обычному активированному полимеру таким образом, что этот сульфоновыи остаток содержится на конце полученного полимера Более конкретно водорастворимый полимер, включающий по меньшей мере один активный сложного эфира или с галоидсодержащим производным с образованием галоидзамещенного ПЭГ Затем полученный активированный ПЭГ вступает во взаимодействие с меркаптоэтанолом с замещением меркаптоэтанольным радикалом сложноэфирного остатка или галогенида Серу в меркаптоэтанольном остатке окисляют до сульфона Этанольный сульфон активируют либо активированием гидроксильного остатка, либо замещением этого гидроксильного остатка более активным остатком, таким, как атом галогена Затем при необходимости активный этилсульфон полиэтиленгликоля можно конвертировать в винилсульфон отщеплением активированного гидроксила или другого активного остатка и введением углеродуглеродной двойной связи, смежной с сульфоновой группой -SO2 Изобретение включают также способ получения конъюгата какого-либо вещества и полимерного производного, которое содержит активный сульфоновыи остаток Этот способ включает стадию образования связи между полимерным производным и веществом, причем такое связывание происходит между сульфоновым остатком и тиоловым остатком Таким образом, по изобретению предлагаются активированные полимеры, которые обладают специфической реакционной способностью, стабильностью в воде, стабильностью в восстановительных условиях и которые образуют более стабильные соединения с поверхностями и молекулами, включая биологически активные молекулы, чем те, что достигались ранее Такой активированный полимер может быть использован для модификации характеристик поверхностей и молекул, когда важное значение имеет биологическая совместимость Поскольку активированный полимер стабилен в водных условиях и образует с тиоловыми остатками стабильные соединения, для сохранения активности биологически активных веществ и для оптимизации скорости реакции сочетания полимера можно выбирать наиболее благоприятные реакционные условия Синтез, используемый для получения активных сульфонов полиэтиленгликоля и родственных полимеров, включает по меньшей мере четыре 11 58481 12 стадии, на которых серу связывают с полимерной чения поддающихся определению участков или молекулой, а затем конвертируют посредством звеньев молекулы и тех звеньев, которые выполряда реакций в активную сульфоновую функционяют некоторую функцию или проявляют активнальную группу Молекула исходного ПЭГность и являются реакционноспособными в отнополимера включает по меньшей мере один гидрошении других молекул или частей молекул В этом ксильный остаток, -ОН, который способен принисмысле при сочетании с полимером белок или мать участие в химических взаимодействиях, и его остаток белка можно рассматривать как молекулу рассматривают как "активный" гидроксильный осили как функциональную группу либо остаток таток Молекула ПЭГ может включать множество Термин "ПЭГ" в данной области техники и в активных гидроксильных остатков, способных настоящем описании используют для описания вступать в химическое взаимодействие, как это любого из нескольких конденсационных полимеописано ниже В действительности же эти активров этиленгликоля, отвечающих общей формуле, ные гидроксильные остатки являются относительструктурно изображаемой как Н(ОСН2СН2)ПОН, но нереакционноспособными, и первая стадия которая может быть также представлена как НОсинтеза состоит в получении ПЭГ, содержащего СН2СН2-(ОСН2СН2)-ОН ПЭГ известен также как более реакционноспособный остаток полиоксиэтилен, полиэтиленоксид, полигликоль и полиэфиргликоль ПЭГ может быть получен в виБолее реакционноспособный остаток обычно де сополимеров окиси этилена и многих других следует получать по одному из двух путей актимономеров вированием или замещением гидроксила Для любого специалиста в данной области техники Полиэтиленгликоль используют для биологиочевидны и другие методы, но активирование или ческих целей, так как он обладает свойствами, замещение гидроксила являются двумя наиболее которые весьма желательны и в целом приемлечасто используемыми техническими приемами мы для биологических или биотехнических обласПри активировании гидроксила водородный атом тей применения ПЭГ обычно прозрачен, бесцвеН гидроксильного остатка -ОН замещают более тен, не обладает запахом, растворим в воде, активной группой Обычно проводят взаимодейсттермостабилен, инертен ко многим химическим вие кислоты или производного кислоты, такого, как реагентам, не гидролизуется, не деструктируется галоидангидрид кислоты, с ПЭГ с получением реи нетоксичен Полиэтиленгликоль считают биолоакционноспособного сложного эфира, в котором гически совместимым, то есть можно сказать, что ПЭГ и кислотный остаток соединены через сложПЭГ способен к сосуществованию с живыми тканоэфирную связь Такой кислотный остаток обычнями и организмами, не принося им вреда Более но более реакционноспособен, чем гидроксильный конкретно ПЭГ не обладает иммуногенностью, остаток Типичными сложными эфирами являются т е , иными словами, ПЭГ не проявляет тенденсульфонатные, карбоксилатные и фосфатные цию вызывать иммунную реакцию организма При эфиры присоединении к остатку, выполняющему в организме некоторую определенную функцию, ПЭГ Сульфониловые галоидангидриды кислот, копроявляет тенденцию к маскировке этого остатка торые пригодны для использования при практичеи способен ослаблять или устранять любую иммуском осуществлении изобретения, включают менную реакцию, благодаря чему организм способен тансульфонилхлорид и ппереносить присутствие такого остатка Таким толуолсульфонилхлорид Метансульфонилхлорид образом, активированные сульфоном ПЭГ по изоотвечает формуле CH3SO2CI и известен также как бретению должны быть практически нетоксичнымезилхлорид Метансульфо-ниловые сложные ми и по существу не должны проявлять тенденции эфиры иногда называют мезилатами Парак возбуждению иммунной реакции или вызывать толуолсульфонилхлорид отвечает формуле свертывание крови либо другие нежелательные H3CC6H4SO2CI и известен также как тозилхлорид эффекты Толуолсульфониловые сложные эфиры иногда называют тозилатами Вторая стадия синтеза состоит в связывании В реакции замещения гидроксильную группу серы непосредственно с углеродным атомом поОН молекулы ПЭГ целиком замещают более релимера и в такой форме, в которой ее можно конакционноспособным остатком, обычно атомом вертировать в этилсульфон или этилсульфоновое галогена Так, можно провести взаимодействие производное, обладающее сходными свойствами тионилхлорида, отвечающего формуле SOCb, с реакционноспособности Термин "этил" относится ПЭГ с получением более реакционноспособного к остатку, содержащему идентифицируемую групхлорзамещенного ПЭГ Замещение гидроксильнопу из двух соединенных между собой углеродных го остатка другим остатком в данной области техатомов Необходимо, чтобы второй углеродный ники иногда называют активированием гидроксиатом в цепи активного сульфонового ПЭГла Термин "активирование гидроксила" в данном производного в направлении от сульфоновой описании следует понимать как обозначающий группы образовывал реакционноспособный учазамещение, а также этерификацию и другие метосток для соединения тиоловых остатков с сульды активирования гидроксила фоном Такого результата можно достичь за счет взаимодействия активного участка, созданного на В области химической технологии термины вышеупомянутой первой стадии, который обычно "группа", "функциональная группа", "остаток", "аксодержится в эфир- или галоидзамещенном ПЭГ, тивный остаток", "реакционноспособный участок" в ходе проведения реакции замещения со спири "радикал" в некоторых случаях являются синотом, который также содержит реакционноспособнимами, и в данной области техники и в настояный тиоловый остаток, присоединенный к этил ощем описании их используют для четкого обозна 58481 14 13 вой группе, т е тиоэтаноловый остаток Этоттиочистом виде и пригоден для тиолселективных реловый остаток окисляют до сульфона, а второй в акций сочетания направлении от сульфона в этильной группе угКак показано в примерах, ПЭГлеродный атом конвертируют в реакционноспохлорэтилсульфон стабилен в воде при значениях собный участок рН приблизительно 7 или меньше, но тем не менее может быть успешно использован для тиолСоединения, включающие тиоловые остатки, селективных реакций сочетания в условиях щеSH, представляют собой органические соединелочных значений рН, вплоть до по крайней мере ния, схожие со спиртами, которые содержат гидприблизительно 9 роксильный остаток-ОН, за исключением того, что в тиолах кислородный атом по меньшей мере одВ ходе проведения реакции тиолового сочетаного гидроксильного остатка замещен серой Акния возможно вытеснение хлорида тиоловым остивирующий остаток ПЭГ-производного после татком, как это происходит в нижеследующей репервой реакции, который обычно представляет акции собой либо галоидный, либо кислотный остаток эфира, отщепляют от полимера и замещают спирCH2-S-W, товым радикалом тиоэтанолового соединения где W обозначает остаток, к которому присоеСеру этого тиолового остатка спирта связывают диняется тиоловый остаток SH и который может непосредственно с углеродным атомом полимебыть биологически активной молекулой, поверхра ностью или каким-либо другим веществом ОднаВ качестве спирта следует использовать тот, что дает тиоэтаноловый остаток для прямого присоединения к углеродному атому полимерной цепи или который можно легко конвертировать в тиоэтаноловый остаток или замещенный остаток с аналогичными свойствами реакционноспособности Примером такого спирта служит меркаптоэтанол, который отвечает формуле HSCH2CH2OH и который иногда называют также тиоэтанолом На третьей стадии синтеза для конверсии серы, которая присоединена к углероду, в сульфоновую группу, -SO2, используют окислитель Существует множество таких окислителей, включая перекись водорода и перборат натрия Может быть использован катализатор, такой, как вольфрамовая кислота Однако образующийся сульфон находится не в той форме, которая активна для тиолселективных реакций, и необходимо удалять относительно нереакционноспособныи гидроксильный остаток спирта, который присоединяли в ходе проведения реакции замещения на второй стадии На четвертой стадии гидроксильный остаток спирта, который присоединяли на второй стадии, конвертируют в более реакционноспособную форму либо путем активирования гидроксильной группы, либо путем замещения гидроксильной группы более реакционноспособной группой, как и на первой стадии этой реакционной последовательности Замещение обычно производят галогенидом с получением галоид эти л сульфона или его производного, обладающего реакционноспособным участком у второго относительно сульфонового остатка углеродного атома Обычно второй углеродный атом этиловой группы следует активировать хлоридным или бромидным галогеном Активирование гидроксила должно создавать участок аналогичной реакционной способности, такой, как остаток сульфонатного эфира Приемлемыми реагентами являются кислоты, галоидангидриды кислот и другие, упомянутые ранее в связи с первой стадией этой реакционной последовательности, прежде всего тионилхлорид в случае замещения гидроксильной группы атомом хлора Получаемый полимерный активированный этилсульфон стабилен, может быть выделен в ко, не руководствуясь какой-либо теорией, на основании поддающейся наблюдению кинетики реакции, как показано в примере 3, полагают, что хлорэтил и другие активированные этилсульфоны и реакционноспособные производные конвертируют в ПЭГ-винилсульфон и что с тиоловым остатком фактически связывают именно ПЭГвинилсульфон или его производное Тем не менее получаемая сульфоновая и тиоловая связь не отличима ни от активного ПЭГ-этилсульфона, ни от ПЭГ-винилсульфона, вследствие чего для присоединения к тиоловым группам активный этилсульфон можно использовать при значениях рН выше 7 ПЭГ-винилсульфон также стабилен, может быть выделен в чистом виде и способен образовывать тиолселективные, гидролитически стабильные соединения, обычно за гораздо меньший период, чем галоидэтилсульфон или другой активированный этилсульфон, как это подробнее поясняется ниже На пятой стадии, которую можно добавить к синтезу, проводят взаимодействие активированного этилсульфона с любым из разнообразных оснований, таким, как гидроксид натрия или триэтиламин, с получением ПЭГ-винилсульфона или одного из его активных производных для использования в тиолселективных реакциях сочетания Как показано в нижеприведенных примерах, прежде всего в примере 3, ПЭГ-винилсульфон быстро взаимодействует с тиоловыми остатками и стоек к гидролизу в воде при значениях рН менее приблизительно 11 в течение по крайней мере нескольких дней Эту реакцию можно представить следующим образом S-W Тиоловый остаток присоединяют, как принято говорить, "через двойную связь" W-S-остаток присоединяют к концевому звену СНг этой двойной связи, углерод которой является вторым от сульфоновой группы SO2 углеродным атомом Водородный атом Н присоединяется к группе СН с двойной связью Однако при рН выше приблизительно 9 селективность сульфонового остатка к тиолу уменьшается, и сульфоновый остаток становится несколько более реакционноспособен в 15 58481 16 отношении аминогрупп желательно просто присоединить по различным Согласно другому варианту вышеописанного тиоловым участкам вдоль белковой цепи Присоесинтеза активированные сульфоном ПЭГдинение ПЭГ-молекул к биологически активной производные можно получать присоединением молекуле, такой, как белок или другое фармацевсоединительного агента, содержащего сульфонотическое средство, или к поверхности иногда навый остаток, к ПЭГ, активированному другой зывают "ПЭГилированием" функциональной группой Так, например, активиЛинейный ПЭГ с активными гидроксилами на рованный амином ПЭГ, ПЭГ-МНг, при благоприяткаждом конце может быть активирован с каждого ных условиях при рН приблизительно 9 или менее конца винилсульфоном либо его предшественнивзаимодействует с небольшой молекулой, у котоком или же производными сходной реакционнорой на одном конце имеется сукцинимидиловый способности, в результате чего он становится биактивный сложноэфирный остаток NHS-O2C-, а на функциональным Такую бифункциональную другом конце сульфоновый остаток, винилсульструктуру, например, ПЭГ-бис-винилсульфон, инофон -SO2-CH=CH2 Активированный амином ПЭГ гда называют гантельной структурой, которая мообразует с сукцинимидиловым эфиром прочную жет быть использована, например, в качестве связь Получаемый ПЭГ активируют винилсульмостика или распорки для присоединения биолофоновым остатком на конце и делают его гидрогически активной молекулы к поверхности или для литически стабильным Реакцию и полученный присоединения более чем одной такой биологичеактивированный винилсульфоном ПЭГ структурно ски активной молекулы к ПЭГ-молекуле Стойотображают следующим образом кость сульфонового остатка к гидролизу делает его особенно пригодным для бифункциональных n3r-NH2+NHS-O2C-CH2-CH2-SO2или гетеробифункциональных применений Аналогичный активированный ПЭГ можно получить взаимодействием активированного амином ПЭГ, такого, как сукцинимидиловый активный сложный эфир ПЭГ, n3r-CO2-NHS, с небольшой молекулой, на одном конце которой имеется аминовый остаток, а на другом - винилсульфоновый остаток Такой сукцинимидиловый эфир образует прочную связь с аминовым остатком, как показано в следующей схеме n3r-CO2-NHS+NH2-CH2-CH2-SO2Активные ПЭГ-сульфоны по изобретению могут характеризоваться любой молекулярной массой и могут быть линейными или разветвленным с сотнями ответвлений ПЭГ может быть замещенным или незамещенным при условии, что по крайней мере один реакционноспособный участок пригоден для замещения сульфоновыми остатками Типичная средняя молекулярная масса ПЭГ составляет 200-100000, а его биологические свойства могут варьироваться в зависимости от молекулярной массы и от степени разветвленное™ и замещения, поэтому не все такие производные могут быть использованы для биологических или биотехнических целей Для большинства биологических и биотехнических целей следует использовать практически линейный, прямоцепочечный ПЭГ-винилсульфон или бис-винилсульфон или же следует применять активированный этилсульфон, практически незамещенный, кроме винилсульфоновых или этилсульфоновых остатков и при необходимости других дополнительных функциональных групп Для многих биологических и биотехнических областей применения такими заместителями обычно служат нереакционноспособные группы, такие, как водородный атом Н- и метил СНз- ("м-ПЭГ") ПЭГ может включать более одного присоединенного винилсульфонового остатка либо остаткапредшественника или один конец ПЭГ может быть блокирован относительно нереакционноспособным остатком, таким, как метиловый радикал, СНз Такая блокированная форма может быть использована, например, если полимерные цепи Другой областью применения ПЭГвинилсульфона и его предшественника - является дендритный активированный ПЭГ, у которого множество ответвлений из ПЭГ присоединено к центральной, сердцевинной структуре Дендритные ПЭГ-структуры могут быть высоко разветвленными, они общеизвестны как "звездчатые" молекулы Звездчатые молекулы в целом описаны в патенте США 5171264, выданном на имя Merrill, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки Сульфоновые остатки могут быть использованы для получения на конце ПЭГ-цепи, проходящей от сердцевины, активной функциональной группы и в качестве мостика для присоединения функциональной группы к лучам звездчатой молекулы ПЭГвинилсульфон и его предшественники и производные могут быть использованы для непосредственного присоединения к поверхностям и молекулам, у которых имеется тиоловый остаток Однако более типично присоединение гетеробифункционального ПЭГ-производного, на одном конце которого имеется сульфоновый остаток, а у группы на противоположном конце - другой функциональный остаток, к поверхности или молекуле посредством другого остатка В случае замещения одним из других активных остатков гетер о бифункциональная гантельная структура ПЭГ может быть использована, например, для переноса белковой или другой биологически активной молекулы сульфоновыми мостиками на один конец и другим мостиком, таким, как аминовый мостик, на другой конец, в результате чего образуется молекула, проявляющая два различных действия Гетеробифункциональный ПЭГ, у которого имеется сульфоновый остаток на одном конце и аминовый специфический остаток на другом конце, может присоединяться как к цистеиновому, так и к лизиновому фрагментам белков При необходимости можно достичь прочной аминовой связи, и в этом случае гидролитически стабильный непрореагировавший сульфоновый остаток оказывается доступным для последующих тиолепецифических реакций 58481 18 17 Другие активные группы для гетеробифункмолекулярная масса от примерно 2000 до 5000, циональных, активированных сульфоном ПЭГ что соответствует значению "п" от примерно 45 до можно выбрать среди остатков самых разнооб110 разных соединений Для биологических и биотехВ вышеприведенной формуле Y обозначает нических применений заместители обычно следуSO2-, СН=СН2 или -SO2-CH2-CH2-X, где X обознает выбирать из реакционноспособных остатков, чает атом галогена R обозначает группу, которая которые, как правило, используют в химии ПЭГ может быть той же, что и Y, или отличной от нее для активирования ПЭГ, такие, как альдегиды, R может представлять собой НО-, НзСО-, трифторэтилсульфонат, который также иногда CH2=CH-SO2-, CI-CH2-CH2-SO2- или активирующую называют трезилатом, н-гидроксилсукцинимидный полимер группу, отличную от CH2=CH-SO2-, CIэфир, цианурхлорид, цианурфторид, ацилазид, CH2-CH2-SO2-, такую, как упоминаемая в отношесукцинат, пара-диазобензиловая группа, 3-(парании вышеперечисленных патентов и опубликовандиазофенилокси)-2-гидроксипропилоксигруппа и ных заявок на патент другие Активные полимерные производные являются водорастворимыми и гидролитически стабильныПримеры активных остатков, отличных от ми и образуют с тиоловыми группами водораствосульфона, представлены Davis и др в патенте римые и гидролитически стабильные связи Эти США 4179337, Lee и др в патентах США 4296097 производные рассматривают как неограниченно и 4430260, Iwasaki и др в патенте США 4670417, растворимые в воде или как приближающиеся к Katre и др в патентах США 4766106, 4917888 и неограниченной растворимости и как обеспечи4931544, Nakagawa и др в патенте США 4791192, вающие способность молекул, которые в других Nitecki и др в патентах США 4902502 и 5089261, условиях нерастворимы, переходить в раствор Saifer в патенте США 5080891, Zahpsky в патенте при образовании с ними конъюгатов США 5122614, Shadle и др в патенте США 5153265, Rhee и др в патенте США 5162430, в Гидролитическая стабильность производных публикации заявки на Европейский патент означает, что связь между полимером и сульфо0247860 и в Международных заявках US86/01252, новым остатком является водостойкой и что виGB89/01261 GB89/01262, GB89/01263, нилсульфоновый остаток не взаимодействует с водой при рН менее приблизительно 11 в течение US90/03252, US90/06843, US91/06103, US92/00432 продолжительного периода времени, составляюи US92/02047, содержание которых включено в щего по меньшей мере несколько дней, и потеннастоящее описание в качестве ссылок циально неограниченного, как показано в нижеДля любого специалиста в данной области приведенном примере 3 Активированный техники должно быть очевидно, что гантельные этилсульфон можно конвертировать в винилсульструктуры, о которых речь шла выше, могут быть фон в условиях щелочных значений рН с идентичиспользованы для переноса самых различных ной конечной стабильностью Гидролитическая заместителей и сочетаний заместителей Можно стабильность тиоловой связи означает, что конъмодифицировать фармацевтические вещества, югаты активированного полимера и вещества, такие, как аспирин, витамины, пенициллин и друсодержащего тиоловый остаток, в водной среде гие многочисленные материалы, полипептиды, обладают стабильностью по месту сульфонтиолобелки и фрагменты белков различных функциовой связи в течение длительного периода временальности и молекулярной массы, клетки различни при значениях рН ниже приблизительно 11 От ных типов, поверхности для биоматериалов и почмногих белков можно ожидать утраты активности ти любое вещество Под используемым в при щелочных значениях рН, равных 11 или выше, описании термином "белок" следует понимать, вследствие чего для любого специалиста в дансреди прочего, пептиды и полипептиды, которые ной области техники должно быть очевидно, что являются полимерами аминокислот Термин во многих областях применения активных суль"биоматериал" обозначает материал, обычно синфонсодержащих ПЭГ-производных значения рН тетического происхождения, а иногда полученный должны составлять менее 11, несмотря на стаиз пластмассы, который пригоден для имплантабильность сульфонового остатка при более высоции в живой организм для восстановления повреких значениях рН жденных или больных частей организма Примером биоматериала служат искусственные Для возможности применения для модификакровеносные сосуды ции белков и других веществ необходима лишь стабильность сульфона в течение промежутка Одно из прямоцепочечных ПЭГ-производных времени, достаточного для взаимодействия сульпо изобретению для биологических и биотехничефона с реакционноспособным тиоловым остатком ских целей отвечает базовой формуле R-CH2CH2такого белка или другого вещества Скорость ре(OCbbCbhJn-Y Предпочтительный ПЭГ-мономер акции сульфонового остатка с тиолом в зависимоОСН2СН2 вдоль главной полимерной цепи практисти от значения рН может варьироваться, как это чески не замещен и не имеет боковых показано в нижеприведенном примере 2, и реакгрупп Величина подстрочного символа "п" составция может завершаться в течение от примерно 2 ляет от примерно 5 до 3000 Более типичный индо ЗОмин, т е значительно быстрее реакции гидтервал равен от примерно 5 до 2200, что соответролиза, если таковой имеет место Можно ожиствует молекулярной массе от примерно 220 до дать, что время взаимодействия винилсульфона с 100000 Еще более типичен интервал от примерно тиолом находится в гораздо более широком ин34 до 1100, что соответствует молекулярной мастервале, поскольку он стабилен в течение длисе в интервале от примерно 1500 до 50000 В тельного периода времени Кроме того, как покабольшинстве областей применения приемлема 19 зано в нижеприведенном примере 3, в условиях щелочных значений рН хлорэтилсуль-фон не гидролизуют, а конвертируют в винилсульфон, который остается стабильным в течение нескольких дней и является еще более реакционноспособным в отношении тиоловых групп Таким образом, в отношении модификации характеристик веществ активные этилсульфоны также можно рассматривать как гидролитически стабильные в течение длительного периода времени в широком интервале значений рН Полагают, что для подобных модификации и активирования активным сульфоновым остатком приемлемы другие водорастворимые полимеры, отличные от ПЭГ Эти другие полимеры включают поливиниловый спирт ("ПВС"), другие полиалкиленоксиды, такие, как полипропиленгликоль ("ППГ") и тому подобное, полиоксиэтилированные полиолы, такие, как полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит и полиоксиэтилированная глюкоза и тому подобное Полимеры могут представлять собой гомополимеры или статистические или блоксополимеры и тройные сополимеры на основе мономеров вышеуказанных полимеров, прямоцепочечные или разветвленные, замещенные или незамещенные, подобные ПЭГ, но обладающие по крайней мере одним активным участком, способным взаимодействовать с образованием сульфонового остатка В нижеследующем примере 1 представлен синтез, выделение и определение характеристик поли(этиленгликоль)-хлорэтилсульфона с последующим получением поли (этиленгликоль)винилсульфона из хлорэтилсульфона Другие полимерные сульфоны, реакционноспособный участок которых находится у второго от сульфоновой группы углеродного атома, получают аналогично, поэтому стадии такой процедуры должны быть очевидными для любого специалиста в данной области техники, если основываться на нижеприведенном примере 1 и полимерах, перечисленных выше Пример 1 Синтез Стадии реакции можно проиллюстрировать с помощью нижеследующих схем (1) ПЭГ-ОН+СН3ЗО2С1^ПЭГ-ОЗО2СН3, (2) ПЭГ-ОЗО2СН3+НЗСН2СН2ОН^ПЭГSCH2CH2OH, (3) ПЭГ-ЗСН 2 СН 2 ОН+Н 2 О 2 ^ПЭГSO2CH2CH2OH, (4) ПЭГ-ЗО2СН2СН2ОН+ЗОС12^ПЭГSO2CH2CH2CI, (5) n3r-SO 2 CH 2 CH 2 CI+NaOH^n3r-SO 2 CH=CH2+HCI Каждая из вышеприведенных реакций подробно описана ниже Реакция 1 Реакция 1 представляет собой получение метансульфонилового эфира полиэтиленгликоля, который можно также называть метансульфонатом или мезилатом полиэтиленгликоля Тозилат и галогениды могут быть получены по аналогичным процедурам, которые очевидны любому специалисту в данной области техники Для получения мезилата двадцать пять граммов ПЭГ с молекулярной массой 3400 сушили 58481 20 азеотропной перегонкой в 150мл толуола Во время сушки ПЭГ отгоняли приблизительно половину толуола В толуол и раствор ПЭГ добавляли сорок миллилитров сухого дихлорметана с последующим охлаждением на ледяной бане В охлажденный раствор добавляли 1,230мл дистиллированного метансульфонилхлорида, что составляет 1,06 весового эквивалента гидроксильных групп ПЭГ, и 2,664мл сухого триэтиламина, что составляет 1,3 весового эквивалента гидроксильных групп ПЭГ Термин "весовой эквивалент", используемый выше, можно понимать как "совместный вес", относящийся к весу соединения, которое взаимодействует с эквивалентным весом гидроксильных групп ПЭГ Реакционную смесь оставляли на ночь, причем в течение этого промежутка времени она нагревалась до комнатной температуры В осадок выпадал гидрохлорид триэтиламмония, и этот осадок удаляли фильтрованием После этого выпариванием в роторном испарителе объем массы уменьшали до 20мл Добавлением в 100мл холодного сухого этилового эфира осаждали мезилат Ядерно-магнитный резонансный (ЯМР) анализ показал 100%-ную конверсию гидроксильных групп в мезилатные группы Реакция 2 Реакция 2 представляет собой получение поли(этиленгликоль)-меркаптоэтанола взаимодействием мезилата с меркаптоэтанолом Это взаимодействие вызывает вытеснение метансульфонатного радикала из ПЭГ Серу мерка птоэтан олово го радикала присоединяют непосредственно к углероду углерод-углеродной главной цепи ПЭГ Двадцать граммов мезилата из реакции 1 растворяли в 150мл дистиллированной воды Раствор мезилата и воды охлаждали погружением в ледяную баню В охлажденный раствор добавляли 2,366мл меркаптоэтанола, что составляло 3 весовых эквивалента гидроксильных групп ПЭГ Добавляли также 16,86мл 2Н NaOH Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение Зч, т е это означает, что пары, поднимавшиеся из реакционной смеси, непрерывно конденсировали и возвращали в реакционную смесь Полученный поли(этиленгликоль)меркаптоэтанол трижды экстрагировали дихлорметаном, используя каждый раз приблизительно 25мл дихлорметана Органические фракции собирали и сушили над безводным сульфатом магния Объем массы уменьшали до 20мл и продукт осаждали добавлением в 150мл холодного сухого диэтилового эфира ЯМР-анализ ПЭГ-ЗСН2СН2ОН в de-ДМСО, в диметилсульфоксиде, давал нижеследующие пики 2,57 частей/млн, триплет, -CH2-S-, 2,65 частей/млн, триплет, -S-CH2-, 3,5 частей/млн, синглет главной цепи и 4,76 частей/млн, триплет, -ОН Гидроксильный пик при 4,76 частей/млн указывал на 81%-ное замещение Однако пик 2,65 частей/млн для -S-CH2- указывал на 100%-ное замещение Согласно наблюдениям гидроксильные пики часто дают заниженные значения процентного замещения, поэтому пик 2,65 частей/млн для 58481 22 21 S-СНг-считают более достоверным и подтверксильный триплет примеси появлялся при 3,94 ждающим 100%-ное замещение частей/млн Расчет процентного замещения для этого спектра был затруднен из-за близости важРеакция 3 ных пиков к очень большому пику главной цепи Реакция 3 представляет собой окисление поли (этиленгликоль)-меркаптоэтанольного продукта Реакция 5 перекисью с конверсией серы, S, в сульфон, SO2 Реакция 5 представляет собой конверсию поПолучают ПЭГ-этанолсульфон ли(этиленгликоль)-хлорэтилсульфона из стадии реакции 4 в поли(этиленгликоль)-винилсульфон и Двадцать граммов n3T-SCH2CH2OH раствовыделение и определение характеристик винилряли в 30мл 0.123М раствора вольфрамовой кисульфонового продукта слоты и охлаждали на ледяной бане Раствор вольфрамовой кислоты готовили растворением ПЭГ-винилсульфон легко получали растворекислоты в растворе гидроокиси натрия с рН 11,5 и нием твердого ПЭГ-хлорэтилсульфона в дихлорс последующим доведением значения рН до 5,6 метановом растворителе с последующим добавдобавлением ледяной уксусной кислоты В раслением двух эквивалентов NaOH Раствор твор вольфрамовой кислоты и пофильтровали для удаления основания и растволи(этиленгликоль)-меркаптоэтанола добавляли ритель выпаривали, выделяя в качестве конечнодвадцать миллилитров дистиллированной воды и го продукта n3l~-SO2-CH=CH2, ПЭГ2,876мл 30%-ной перекиси водорода, что составвинилсульфон ляло 2,5 весового эквивалента гидроксильных Характеристики ПЭГ-винилсульфона опредегрупп, и в течение ночи реакционной смеси даваляли ЯМР-анализом в de-ДМСО, в диметилсульли нагреться до комнатной температуры фоксиде ЯМР-анализ давал нижеследующие пики 3,50 частей/млн, главная цепь, 3,73 Окисленный продукт трижды экстрагировали частей/млн, триплет, -CH2-S02-, 6,21 частей/млн, дихлорметаном, используя каждый раз по 25мл триплет, =СН2, 6,97 частей/млн, дублет дублетов, дихлорметана Собранные органические фракции -SO2-CH- Пик 6,97 частей/млн для -SO2-CH- укапромывали разбавленным водным раствором бизывал на 84%-ное замещение Пик 6,21 часкарбоната натрия и сушили над безводным сультей/млн для =СН2 указывал на 94 %-ное замещефатом магния Объем массы уменьшали до 20мл ние Титрование меркаптоэтанолом и 2,2'ПЭГ-этанол-сульфоновый продукт осаждали додитиодипиридином указывало на 95%-ное замебавлением в холодный сухой этиловый эфир щение ЯМР-анализ ПЭГ-ЗО2СН2СН2ОН в de-ДМСО, в диметилсульфоксиде, давал нижеследующие пиПример 2 Тиолселективная реакционная споки 3,25 частей/млн, триплет, -CH2-SO2-, 3,37 чассобность тей/млн, триплет, -SO2CH2-, 3,50 частей/млн, Пример 2 показывает, что ПЭГ-винилсульфон главная цепь, 3,77 частей/млн, триплет, -СН2ОН, и его предшественник ПЭГ-хлорэтилсульфон зна5,04 частей/млн, триплет, -ОН Гидроксильный пик чительно более реакционноспособньт в отношепри 5,04 частей/млн указывал на 85%-ное замении тиоловых групп (-SH), чем аминогруппы (-NH2) щение Однако пик при 3,37 частей/млн для -S02или иминогруппы (-NH-) Соединения, содержащие СН2- указывал на 100%-ное замещение, и его считиоловые группы, представляют собой органичетают более достоверным ские соединения, схожие со спиртами, которые содержат гидроксильные группы -ОН, за исключеРеакция 4 нием того, что в тиолах кислородный атом гидроРеакция 4 представляет собой заключительксильной группы заменен серой ную стадию синтеза, выделения и определения характеристик поли(зтиленгликоль)Тиолы иногда называют также сульфгидрилахлорэтилсульфона ми или меркаптанами ПЭГ-винилсульфон содержит винилсульфоновую группу -SO2-CH=CH2 ПЭГДля синтеза этого продукта двадцать граммов хлорэтилсульфон содержит хлорэтилсульфоноПЭГ-ЗО2СН2СН2ОН, поли (этиленгликоль)вую группу -SO2CH2CH2CI этанолсульфона, растворяли в 100мл свежеперегнанного тионилхлорида и кипятили с обратным Селективность в отношении тиолов при мохолодильником в течение ночи Тионилхлорид дификации белка важна, поскольку это означает, перегоняли над хинолином Перегонкой удаляли что цистеиновые звенья (содержащие -SH) должизбыток тионилхлорида Добавляли пятьдесят ны быть модифицированы предпочтительнее лимиллилитров толуола и 50мл дихлорметана и зиновых звеньев (содержащих -NH2) и гистидиноудаляли перегонкой вых звеньев (содержащих -NH-) Селективность ПЭГ-винилсульфона в отношении тиолов означаДля выделения продукта ПЭГет, что ПЭГ может быть селективно присоединен к хлорэтилсульфоновый раствор растворяли в 20мл цистеиновым звеньям, таким образом сохраняя дихлорметана и осаждали добавлением в 100мл активность белка в случае особых белков и регухолодного сухого этилового эфира Осадок перелируя число ПЭГ-молекул, присоединенных к белкристаллизовывали из 50мл этилацетата, выдеку ляя конечный продукт Для определения характеристик этого продукта использовали ядерно-магнитный резонансный анализ ЯМР-анализ ПЭГ-ЗО2СН2СН2С1 в d 6 ДМСО, в диметилсульфоксиде, давал нижеследующие пики 3,50 частей/млн частей, главная цепь, 3,64 частей/млн, триплет, -CH2-SO2-, 3,80 частей/млн, триплет, -S02-CH2- Небольшой гидро Относительную реакционную способность ПЭГ-винилсульфона в отношении тиоловых и аминогрупп определяли измерением скоростей реакции ПЭГ-винилсульфона с N-aацетиллизинметиловым эфиром и с меркаптоэтанолом N-a-ацетиллизинметиловый эфир представляет собой лизиновую модель, содержащую 58481 24 23 аминогруппу, сокращенно представляемую как винилсульфон показывал более значительную Lys-NH2 Меркаптоэтанол служит в качестве цисреакционную способность При рН 9,0 реакция теиновой модели, содержащей тиоловую группу и завершается по истечении двух минут в случае сокращенно представляемую как Cys-SH Аналоиспользования винилсульфопа и по истечении гично определяли относительную реакционную 15мин в случае использования хлорэтилсульфоспособность ПЭГ-хлорэтилсульфона Эта молекуна Однако эти реакции оказывались слишком была может служить как "защищенная" форма вистрыми для определения точных констант скоронилсульфона, так как она стабильна в кислоте, но сти При рН 8,0 реакции протекали медленнее, но при добавлении основания конвертируется в ПЭГвсе же завершались в течение одного часа для винилсульфон винилсульфона и в течение трех часов для хлорэтилсульфона Реакционную способность ПЭГвинилсульфона и ПЭГ-хлорэтилсульфонового Конверсия хлорэтилсульфона в винилсульфон предшественника изучали при значениях рН 8,0, значительно медленнее взаимодействия винил9,0 и 9,5 Буферами для регулирования рН служисульфона с Cys-SH Таким образом, скорость ли 0,1 М фосфат для рН 8,0 и 0,1 М борат для рН взаимодействия хлорэтилсульфона с Cys-SH за9,0 и 9,5 Для замедления конверсии тиола в дивисит, по-видимому, от скорости конверсии хлорэсульфид при измерении реакционной способности тилсульфона в винилсульфон Тем не менее скомеркаптоэтанол а в оба буфера добавляли 5мМ рость такой реакции все же намного выше раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты скорости взаимодействия с Lys-NH2 (ЭДТК) Вышеописанные исследования кинетики показывают, что ПЭГ-винилсульфон намного более Для каждого из трех уровней щелочных знареакционноспособен стиоловыми группами, чем с чений рН в ходе проведения взаимодействия ПЭГаминовыми группами, а это свидетельствует о производных по изобретению с Lys-NH2 в О.ЗмМ том, что присоединение ПЭГ-винилсульфона к раствор Lys-NH2 в соответствующем буфере при белку, содержащему как цистеиновые, так и лизиперемешивании добавляли ЗмМ раствор ПЭГновые группы, происходит преимущественно за производного За взаимодействием наблюдали счет взаимодействия с цистеином Поскольку редобавлением флуоресцамина в реакционный расакционная способность с аминогруппами идентичтвор с получением флуоресцентного производнона реакционной способности с иминогруппами, го в результате взаимодействия с аминогруппами реакционная способность гистидиновых подЭту стадию наблюдения осуществляли добавлезвеньев должна быть также намного меньше рением 50мкл реакционной смеси в 1,950мл фосакционной способности с цистеиновыми подфатного буфера с рН 8,0 с последующим добавзвеньями Кроме того, селективность в отношении лением при интенсивном перемешивании 1,0мл тиоловых групп очевиднее при пониженных знараствора флуоресцамина Раствор флуоресцамичениях рН в случае ПЭГ-хлорэтилсульфо-на и на представлял собой 0,3 мг флуоресцамина на ПЭГ-винилсульфона, хотя реакции ПЭГ1 мл ацетона хлорэтилсульфона оказываются несколько более Флуоресценцию измеряли спустя Юмин после замедленными смешения Возбуждение оказывалось видимым при длине волны 390нм Излучение света происПрименимость многих ПЭГ-производных ограходило при 475нм При рН 8,0 в течение 24ч никаничена, так как они быстро взаимодействуют с кой реакции не наблюдали ни для ПЭГводой, препятствуя тем самым попыткам присоевинилсульфона, ни для ПЭГ-хлорэтилсульфона динить это производное к молекулам и поверхноПри рН 9,5 реакция протекала медленно, но по стям в водных условиях Нижеприведенный приистечении нескольких дней все аминогруппы окамер 3 показывает, что ПЭГ-винилсульфон и ПЭГзывались прореагировавшими хлорэтилсульфон обладают стабильностью в воде В ходе проведения взаимодействия ПЭГвинилсульфона и ПЭГ-хлорэтилсульфонового Пример 3 Гидролитическая стабильность предшественника с Cys-SH для каждого из трех ПЭГ-винилсульфон растворяли в тяжелой воуровней щелочных значений рН 2мМ раствор де, в окиси дейтерия D2O, и вели наблюдения с ПЭГ-производного добавляли в 0,2мМ раствор помощью ЯМР-анализа Реакции не происходило Cys-SH в соответствующем буфере За реакцией В тяжелой воде, в которую добавляли боратный наблюдали добавлением в реакционный раствор буфер до рН 9,0, раствор ПЭГ-хлорэтилсульфона 4-дитиопиридина Этот 4-дитиопиридин взаимообразовывал ПЭГ-винилсульфон Наблюдения действует с Cys-SH с образованием 4посредством ЯМР-анализа показали, что после тиопиридона, который поглощает ультрафиолетообразования ПЭГ-винилсульфон оставался ставые лучи бильным в тяжелой воде в течение трех дней Стадию наблюдения осуществляли добавлеПЭГ-хлорэтилсульфон остается в воде станием 50мкл реакционной смеси в 0,950мл 0,1 М бильным до тех пор, пока раствор не становится фосфатного буфера с рН 8,0, содержавшего 5мМ основным, после чего он превращается в винилЭДТК, с последующим добавлением в тот же сасульфон Конверсия в винилсульфон продемонстмый буфер одного миллилитра 2мМ 4рирована растворением ПЭГ-хлорэтилсульфона в дитиопиридина воде при рН 7 и в боратном буфере при рН 9 ПЭГ-производное экстрагируют хлористым метиПоглощение лучей 4-тиопиридоном измеряли леном Удаление хлористого метилена с послепри 324нм ПЭГ-винилсульфон, а также ПЭГдующим ЯМР-анализом показали, что ПЭГхлорэтилсульфон проявляли реакционную спохлорэтилсульфон стабилен при нейтральном рН собность в отношении Cys-SH, причем ПЭГ 25 58481 7,0 и взаимодействует с основанием с образованием ПЭГ-винил сульфона Винилсульфон стабилен в воде в течение нескольких дней даже при щелочных значениях рН Высокие гидролитическая стабильность и тиолспецифическая реакционная способность ПЭГвинилсульфона означают, что ПЭГ-винилсульфон и его предшественник могут быть использованы для модификации молекул и поверхностей в водных условиях, как показано в нижеприведенном примере 4 Пример 4 Конъюгирование с белком Модификацию белка демонстрировали присоединением ПЭГ-производного к бычьему сывороточному альбумину (БСА) двумя различным методами БСА представляет собой белок Природный немодифицированныи БСА включает цистеиновые группы, которые не содержат тиоловых групп Цистеиновые звенья связаны как дисульфидные мостики, S-S В первом методе в течение 24ч в 0,1М боратном буфере при рН 9,5 и комнатной температуре проводили взаимодействие м-ПЭГ-винил сульфона с молекулярной массой 5000 с немодифицированным БСА Раствор содержал 1мг БСА и 1мг мПЭГ-винилсульфона с молекулярной массой 5000 на каждый миллилитр раствора Результаты использования модельных соединений примера 2 показали, что лизиновые подзвенья (и, возможно, гистидиновые подзвенья) должны быть модифицированы в таких относительно щелочных условиях и в отсутствии свободных тиоловых групп, доступных для взаимодействия Присоединение к лизиновым подзвеньям демонстрировали двумя путями Во-первых, хроматография с вытеснением по размерам показала, что молекулярная масса белка увеличивалась приблизительно на 50%, что указывало, таким образом, на присоединение к белку примерно 10 Комп'ютерна верстка Т Чепелева 26 молекул ПЭГ Во-вторых, анализ с флуоресцамином показал, что число лизиновых групп в молекуле БСА уменьшалось приблизительно на десять Во втором методе БСА обрабатывали трибутилфосфином для восстановления дисульфидных связей S-S до тиоловых групп, -SH, которые доступны для взаимодействия Затем модифицированный БСА при рН 8,0 и комнатной температуре в 0,1 М фосфатном буфере обрабатывали в течение 1ч ПЭГ-хлорэтилсульфоном Раствор содержал 1мг модифицированного БСА и 1мг м-ПЭГхлорэтилсульфона с молекулярной массой 5000 на миллилитр раствора Результаты показали, что лизиновые группы в таких условиях оказывались нереакционноспособными Однако тиоловые группы проявляли реакционную способность Присоединение ПЭГ к белку демонстрировали хроматографией с вытеснением по размерам, которая показала увеличение молекулярной массы белка приблизительно на 25% Анализ с флуоресцамином указывал на отсутствие изменений числа лизиновых подзвеньев в белке, подтверждая таким образом, что присоединения ПЭГ к лизиновым подзвеньям не происходило Тем самым подтверждалось замещение тиоловых групп Заявляемое изобретение описано на примере конкретных вариантов его выполнения Однако вышеприведенное описание не следует рассматривать как ограничивающее объем изобретения приведенными в качестве примеров вариантами выполнения, и для любого специалиста в данной области техники должно быть очевидно, что в них можно вносить изменения, не выходя при этом за существо и объем изобретения, которое описано выше Напротив, изобретение включает все варианты, модификации и эквиваленты, которые могут подпадать под фактический объем изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна