Капсула, що містить інкапсульовані клітини, спосіб одержання капсули

Даний винахід відноситься до інкапсульованих клітин, що продукують вірусні частки, зокрема, ретровірусні частки, що містять геном ретровірусного вектору, що несуть терапевтичні гени; до способів отримання таких інкапсульованих клітин; а також до використання вказаних інкапсульованих клітин для доставки генів, зокрема, терапевтичних генів до органів/клітин-мішеней. Передумови створення винаходу Доставка терапевтично цінних генів до клітин-мішень є основним принципом генної терапії. Для того, щоб генна терапія стала звичайною процедурою, дуже важливо розробити такі системи, які забезпечували б ефективну in vivo-доствку терапевтичних генів до клітин-мішень. Вірусні вектори, зокрема, вектори на основі ретровірусів, являються засобами, що найбільш часто використовуються для переносу генів у генній терапії (Morgan та Anderson, 1993). В основі більшості апробованих схем генної терапії лежить ex vivo-метод, який заключається в тому, що у пацієнта удаляють відповідні клітини, ці клітини генетично модифікують in vitro, а потім знову вводять пацієнту. Цей метод являється працевмісним та досить вартісним, а також обмежений технологічними складностями. Крім того, можливості цього методу обмежені конкретними клітинами, які повинні бути легко виділені, культивовані, та знову імплантовані (Gunzburg та ін., 1995). Хоча in vivo-доставка терапевтичних генів має багато переваг, однак, у тій формі, в якій її здійснюють в цьому методі вона являється неефективною та проблематичною. Основною проблемою, пов'язаною з низькою ефективністю переносу генів в данному методі, являється необхідність багаторазового введення вірусного вектору. Така необхідність здійснення множини циклів доставки вектору робить цей метод не тільки працевмісним, але також, очевидно, і неефективним із-за імунної відповіді, що продукується проти вірусних часток. Одним з шляхів вирішення проблеми являється безпосередня імплантація клітин, що продукують вірусні частки. Імплантація клітин, що продукують вірусні частки та містять геном вірусного вектору, in vivo поблизу органу-мішені або клітин-мішеней, дозволила б також доставляти вірусний вектор безпосередньо до клітин/органів-мішеней. Крім того, у випадку, коли вірусом, що використовується для вірусного вектору, являється ретровірус, цей метод являється більш ефективним, ніж метод введення більшості одноразових високих доз, оскільки в даному випадку, існує вірогідність того, що векторний вірус буде присутній при реплікації клітин-мішеней, що підвищує його шанс інфікувати ці клітини-мішені. До того ж, вивільнення більш низьких рівней вірусних часток, але більш довготривале, може бути переважливим, оскільки воно дозволяє уникнути імунної відповіді проти цих вір усних часток. Для ефективної доставки вірусних векторів, клітини, що продукують вірусні частки, мають бути життєздатними на протязі довгого періоду часу після їх імплантації хазяїну, і в цей період часу мають продукуватися та вивільнятися з клітин вірусні частки. У відсутності значної імунної відповіді, наприклад, після імплантації у головний мозок, ці клітини можуть зберігати життєздатність на протязі довгого періоду часу (Gulver та ін., 1992, Ram та ін., 1993). Однак, для успішного здійснення імплантації в інші ділянки організму, клітини-продуценти мають бути спочатку захищені від імунної відповіді. Таким чином, довготривала ефективність цього методу залежить від (1) захищеності клітин від імунної системи хазяїна, яка звичайно елімінує клітини, що продукують вірусні частки, особливо, якщо ці клітини походять з різних видів, як це звичайно має місце у випадку таких клітин; та (2) життєздатності клітин in vi vo на протязі тривалого періоду часу, яке може знадобитися для васкуляризації. Інкапсуляція клітин у проникних структурах, які допускають вивільнення деяких біологічно активних молекул, але які, в той же час, захищають клітини, що продукують ці молекули, від імунної системи хазяїна, мала певний успіх (див. огляд Chang, 1995). Були інкапсульовані клітини, піддані генетичній модифікації для продукування гормону росту людини (hGH) (Tai та Sun, 1993) або секретованої форми аденозиндеамінази людини (Hunges та ін., 1994). В обидвах цих дослідженнях, клітини були інкапсульовані в полі-L-лізинальгінатні мікрокапсули, та було показано, що ці клітини залишаються життєздатними на протязі довгого періоду часу в культурі. Таким чином було здійснено довге продукування ферменту або гормону. Крім того, було показано (Таі та Sun, 1993), що після трансплантації мікрокапсул мишам, клітини залишаються життєздатними на протязі 1 року та продовжують продукувати hGH, щ освідчить про те, що капсули захищають трансфекування клітини від дестркуції імунної системи хазяїна. Сповіщалось також про проведення інкапсуляції клітин з використанням інших матеріалів. Клітини нирки детища хом'яка, модифіковані так, щоб вони продукували фактор росту нервової тканини, були інкапсульовані в поліакрилонітрид/ввінілхлорид та імплантовані в головний мозок пацюка. Інкапсульовані клітини зберігали життєздатність на протязі, принаймні, 6 місяців, та продовжували продукувати NGF (Winn та ін., 1994; Deglon та ін., 1995). Крім того, гепатоцити були успішно інкапсульовані в поліелектролітний комплекс сульфату целюлози та полідиметилдиаліламонію (Stange та ін., 1993). Більш 90% інкапсульованих гепатоцитів зберігали свою життєздатність, та у протилежність гепатоцитам, культивованим у вигляді моношару, інкапсульовані клітини виявляли підвищену метаболічну активність. Однак, в цій роботі не було висловлено яких-небудь пропозицій відносно того, що капсули з сульфату целюлози/полідиметилдиаліламонію здатні забезпечувати ріст клітин іншого типу, таких, як клітини, що продукують вірусні частки, або забезпечувати ви хід вірусних часток з цих капсул. Отримання капсул з сульфату целюлози, що використовуються в даному винаході, було детально описано в роботі DE 40 21 050 А1. В цій патентній заявці був також описаний синтез сульфату целюлози. Методи для повної характеризації капсул з сульфату целюлози були розроблені Н.Dautzenberg та ін. (Biomat, Art. Celles & Immob. Biotech., 21 (3), 399-405 (1993)). Інші капсули з сульфа ту целюлози були описані в патенті GB2 135 954. Властивості целюлозних капсул, тобто розмір пор, товщина стінки та механічні властивості, залежать від декількох факторів, наприклад, таких, як фізичні умови, при яких були отримані ці капсули; в'язкість осаджуючої бані; її йонна сила; температура; швидкість додавання суспензії клітин/сульфату целюлози; та структура сульфату целюлози; а також від інших параметрів, що описані групою Dautzenberg. Несподівано було виявлено, що тривале продукування вірусних часток з імплантованих клітин може бути досягнено шляхом інкапсуляції клітин в поліелектролітному комплексі. Хоча пори таких капсул являються досить великими та здатні пропускати всередину капсул антитіла та комплемент, які як відомо, інактивують віруси (Welch та ін., 1975, Cornetta та ін., 1990), однак, яких-небудь значних імунних або запальних реакцій, або некрозу в області імплантації капсул не спостерігалось. Крім того, несподівано було виявлено, що капсули даного винаходу добре імплантуються хазяїну та швидко васкуляризуються. Тому інкапсульовані клітини даного винаходу забезпечують пролонговану доставку вірусни х векторів, що несуть терапевтичні гени in vivo. Короткий опис винаходу Даний винахід, inter alia, включає (окремо або в комбінації): продукуючі вірусні частки клітини, що заключені в капсулу, яка складається з ядра, що містить клітини, та пористої стінки, яка оточує це ядро; причому вказана пориста стінка капсули є проникливою для вказаних вірусних часток; вищевказані клітини, що поміщені в капсулу, пориста стінка якої складається з поліелектролітного комплексу, утвореного протилежно зарядженими поліелектролітами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, пориста стінка яких складається з поліелектролітного комплексу, утвореного з полісахаридів, що містять сульфонатну груп у, або похідних полісахариду, або з синтетичних полімерів, що містять сульфонатну груп у, та полімерів з четвертинно-амонієвими групами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, де полісахаридами, що містять сульфатну груп у, або похідним полісахарида є сульфат целюлози, ацетосульфат целюлози, сульфат карбоксиметилцелюлози, сульфат декстрану, або сульфат крохмалю; а синтетичним полімером, що містить сульфонову гр уп у, є сульфонат полістиролу; вищевказані клітини, що заключені в капсули, в яких полімером з четвертинно-аммонієвими групами є поліметидіаліламоній або полівінілбензил-триметиламоній; вищевказані клітини, що заключені в капсули, в яких пориста стінка капсули складається з комплексу, утвореного з сульфату целюлози та полідиметилдіаліламонію; вищевказані клітини, що заключені в капсули, які мають форму мікрокапсул з діаметром 0,01-5мм; а переважно, 0,1-1мм; вищевказані клітини, що заключені в капсулу, яка складається з матриці на основі губчатої сульфатної целюлози, яка утворює вн утрішню частину капсули, оточену поверхнею стінки капсули, що містить пори; причому вказана губчата матриця заповнена клітинами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, де пориста стінка капсули має розмір пор від 80 до 150нм, а переважно від 100 до 120нм; вищевказані інкапсульовані клітини, що продукують вірусні частки, де вказаними вірусними частками є ретровірусні частки, які містять геном ретровірусного вектору; вищевказані інкапсульовані клітини, що продукують ретровірусні частини, де вказані інкапсульовані клітини представляють собою пакувальну клітинну лінію, що трансфекується експресійним вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, яка здатна інфікувати та регулювати експресію у клітинах-мішенях однієї або декількох кодуючих послідовностей, що присутні у вказаній ретровірусній конструкції; причому, вказана пакувальна клітинна лінія включає, принаймні, один експресійний вектор, що несе гени, що кодують білки, необхідні для упаковки ретровірусної векторної конструкції; вищевказані інкапсульовані клітини, де, принаймні, одну з вказаних послідовностей, що кодує гетерологічні пептиди, вибирають з маркерних генів, терапевтичних генів, противірусних генів, протипухлинних генів та генів, що кодують цитокіни; вищевказані інкапсульовані клітини, де вказаний маркерний ген вибирають з групи, що включає маркерні гени, які кодують такі білки, як b-галактозидаза, неоміцин, алкогольдегідрогеназа, пуроміцин, гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (НРРТ), гігроміцин, та секретуюча лужна фосфатаза; а вказаний терапевтичний ген вибирають з генів, які кодують такі білки, як тимідинкіназа вірусу простого герпесу, цитозиндеаміназа, гуанінфосфорибозилтрансфераза (gpt), цитохром Р450, генів, що регулюють клітинний цикл, таких, як SDI; пухлинно-супресорних генів, які кодують такі білки, як р53, або антипроліферативних генів, які кодують такі білки, як мелітин, цекропін, або цитокіни, такі ,як IL-12; вищевказані інкапсульовані клітини, де лінію клітин з дефектом упаковки вибирають з psi-2, psi-crypt, psiAM, GP+E-86, РА317, та GP+envAM-12; вищевказані інкапсульовані клітини, де експресійним вектором, трансфікованим в пакувальну клітинну лінію, є pBAG, pLXSN, p125LX, pLX2Bl, або рсЗ/2В1, або їх похідні; спосіб отримання вищевказаних інкапсульованих клітин, який заключається в тому, що клітини, продукуючі вірусні частки, суспендують у водному розчині поліелектроліту, а потім суспензію у формі попередньо сформованих часток вводять в осаджаючу баню, що містить водний розчин протилежно заряженого поліелектроліту; вищевказаний спосіб, в якому утворення частин проходить шляхом розпилення; вищевказаний спосіб, в якому клітини суспендують у водному розчині полісахариду, що містить сульфатну груп у, або його похідну, або синтетичного полімеру, що містить сульфонатну гр упу; вищевказаний спосіб, де полісахарид, що містить сульфатну груп у, або похідну полісахариду вибирають з сульфату целюлози, ацетосульфату целюлози, сульфа ту карбоксиметилцелюлози, сульфату декстрану або сульфату крохмалю; а синтетичним полімером, що містить сульфонатну гр упу, є полістиролсульфонат; вищевказаний спосіб, де осаджуюча баня містить водний розчин полімеру з четвертинно-амонієвими групами; вищевказаний спосіб, де полімером з четвертинно-амонієвими групами є поліметилдіаліл- або полівінілбензилтриметиламоній; вищевказаний спосіб, в якому клітини суспендують у водному розчині сульфату натрій-вмісної целюлози, та отриману суспензію вводять в осаджуючу баню, що містить водний розчин хлориду полідиметилдіаліламонію; вищевказаний спосіб, де водний розчин сульфату целюлози складається з 0,5-50%, а переважно 2-5% сульфату натрій-вмісної целюлози, та з 2-10%, переважно 5% фетальної телячої сироватки в забуференому фізіологічному розчині; вищевказаний спосіб, де водний розчин в осаджуючій бані складається з 0,5-50%, переважно 2-10%, а більш переважно 3% хлориду полідиметилдіаліламонію в забуфероному розчині; вищевказані інкапсульовані клітини, отримані вищеописаним способом; використання вищевказаних інкапсульованих клітин для доставки генів до органів/клітин-мішеней, що передбачає: а) культивування інкапсульованих клітин у підходящому середовищі; та б) імплантацію інкапсульованих клітин в живий організм тварини, включаючи людину; використання, що описане вище, де органом-мішенню/клітинами-мішенями є молочна залоза або підшлункова залоза; та використання, описане вище, де органом-мішенню/клітинами-мішенями є клітини гладких м'яз та клітини інших типів, що обмежують артерії. Цілі даного винаходу Ціллю даного винаходу є отримання інкапсульованих клітин, що продукують вірусні частки, причому вказані капсули дозволяють вивільнятися вірусним часткам, що продукуються клітинами, не викликаючи, при цьому, значної імунної або запальної відповіді хазяїна після їх імплантації цьому хазяїну. Іншою ціллю даного винаходу є спосіб отримання вказаних інкапсульованих клітин, продукуючи х вірусні частки. Ще однією ціллю даного винаходу є розробка способу доставки генів, а зокрема, терапевтичних генів, до органу-мішені/клітинам-мішеням шляхом імплантації вказаних інкапсульованих клітин , продукуючих вірусні частки хазяїну; та, тим самим, способа тривалого продукування та вивільнення вірусних часток в органахмішенях або поблизу клітин-мішеней. Опис винаходу У відповідності з даним винаходом, клітини, продукуючі вірусні частки, заключають в капсули, які здатні вивільняти вірусні частки, які продукуються клітинами, не викликаючи, при цьому, значної імунної або запальної відповіді хазяїна після їх імплантації цьому хазяїну. Інкапсульовані клітини даного винаходу можуть бути отримані шляхом суспендування клітин, які продукують вірусні частки, у водному розчині поліелектроліту (наприклад, вибраного з полісахаридів, що містять сульфатну гр упу, або їх похідних, та синтетичних полімерів, що містять сульфонатну груп у), з по слідуючим введенням суспензії, отриманої у вигляді попередньо зформованих часток, в осаджуючу баню, що містить водний розчин протилежно заряженого поліелектроліту (наприклад, полімеру з четвертинноамонієвими групами). Полісахаридами, що містять сульфа тну гр упу, або їх похідними є сульфатна целюлоза, ацетат сульфатної целюлози, сульфатна карбоксиметилцелюлоза, сульфат декстрану, або сульфат крохмалю у формі солі, а зокрема, натрієвої солі. Синтетичним полімером, що містить сульфонатн у гр упу, може бути полістиролсульфонатна сіль, а переважно, натрієва сіль. Полімерами, що мають четвертинно-амонієві групи, є полідиметилдіаліламоній або полівінілбензилтриметиламоній у формі їх солі, переважно хлориду. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, клітини, продукуючі вір усні частки, інкапсульовані в комплекс, утворений з сульфатної целюлози та полідиметилдіаліламонію. Вказані капсули отримують переважно шляхом суспендування клітин, що продукують вірусні частки, у розчині, що містить 0,5-50%, переважно 2-5% натрій-сульфатної целюлози, та 5% фетальної телячої сироватки, необов'язково у буфері. Потім цю суспензію за допомогою дозуючого пристрою (наприклад, повітряного ежектру або п'єзоелектричної системи) вводять, розмішуючи при цьому, в осаджуючу баню, що містить 0,5-50%, переважно 2-10%, а найбільш переважно біля 3% хлориду полідиметилдіаліламонію, необов'язково в буфері. Утворення капсул проходить за міллісекунди, та клітино-вмісні капсули витримують в осджуючіій бані на протязі часу від 30 секунд до 5 хвилин, а потім промивають. Швидкість цього методу дає гарантію того, що інкапсульовані клітини не будуть піддаватися досить великому стресу під час всієї процедури (Stange та ін., 1993). Капсули даного винаходу мають діаметр, що варірує від 0,01 до 5мм, а переважно від 0,1 до 1мм. При цьому, можуть бути виготовлені капсули, що містять різні кількості клітин. З використанням способу інкапсулювання даного винаходу, в поліелектролітний комплекс може бути інкапсульовано до 1010, а переважно 105-107 клітин, продукуючи х вір усні частки. Капсули, що складаються з сульфатної целюлози та полідиметилдіаліламонію мають прекрасні механічні властивості та можуть бути вигото влені в різних розмірах та з різним розміром пор. Розмір пор складає від 80 до 150нм, а переважно від 100 до 120нм. Інкапсульовані клітини можуть бути культивовані в нормальному середовищі для культивування клітин (природа якої залежить від конкретно інкапсульованих клітин) при стандартних умовах вологості, температури та концентрації СО2. Вивільнення вірусних часток з капсул в культуральне середовище в процесі культивування може бути продемонстровано або з використанням RT-PCR-технології (завдяки полімеразної ланцюгової реакції з зворотною транскриптазою), або шляхом переносу безклітинного супернатанту (відфільтрованого через 0,45мкм-фільтр) до клітин-мішеней з послідуючим виявленням вірусної інфекції за допомогою аналізу на активність маркерних білків, що кодуються генами, які несуть вірусну векторну конструкцію, що міститься у вірусній частці. Якщо маркерний ген, присутній у вірусному векторі, є геном, що несе стійкість до специфічної сполуки на клітині-мішені, то може бути встановлений титр вірусу, що продукується цією системою. Після відповідного періоду культивування (звичайно, не менш і години та не більш 30 днів), капсули що містять клітини, можуть бути хір ургічно імплантовані або безпосередньо, або шляхом ін'єкції з використанням шприцу в різних ділянках організму. Вірусні частки, що продукуються інкапсульованими клітинами даного винаходу, можуть бути отримані на основі будь-якого вірусу, що використовується для генної терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, аденовіруси, аденоасоційовані віруси, віруси герпесу або ретровіруси; див., наприклад, огляд Gunzbiirg та Salmons, 1995. В переважному варіанті здійснення даного винаходу, інкапсульованими клітинами є пакувальні клітинні лінії, продукуючі ретровірусні частки, що містять геном ретровірусної векторної конструкції, що несе маркерні та/або терапевтичні гени. Ретровірусні векторні системи складаються з двох компонентів: 1) першим компонентом є експресійний вектор (плазмідний вектор), що несе ретровірусну векторну конструкцію, що представляє собою модифікований ретровірус, в якому гени, кодуючі вір усні білки, були замінені терапевтичними генами, включаючи, але необов'язково, маркерні гени, призначені для перенесення до клітин-мішеней. Оскільки заміна генів, кодуючих вірусні білки, приводить до значного пошкодження вірусу, то він повинен бути "врятований" за допомогою другого компоненту даної системи, який забезпечує захист модифікованого ретровірусу від можливого його пошкодження із-за втрати вірусни х білків; 2) другим компонентом є лінія клітин, яка продукує велику кількість вірусних білків, але яка, при цьому, не здатна продукувати компетентний у відношенні реплікації вірус. Ця клітинна лінія відома як пакувальна клітинна лінія та представляє собою клітинну лінію, трансфіковану плазмідами, що несуть гени, які дозволяють здійснювати упаковку модифікованого ретровірусного геному. Ці плазміди регулюють синтез потрібних вірусни х білків, необхідних для продукування віріону. Для генерування упакованого ретровірусного вектору, векторну плазміду трансфікують в пакувальну клітинну лінію. В цих умовах, модифікований ретровірусний геном, що включає вбудовані терапевтичні та необов'язково маркерні гени, транскрибуються з векторною плазмідою, та генерований в результаті цього модифікований ретровірусний геном упаковується в ретровірусні частки. Клітина, інфікована такою вірусною часткою, не може продукувати вір усні частки, оскільки в цих клітинах відсутні вірусні білки. Однак, в інфікованих клітинах присутня ретровірусна векторна конструкція, що несе терапевтичні та маркерні гени, та ця конструкція може експресуватися в даних клітинах. В WO94/29437, WO 89/11539 та WO 96/07748 описані різні типи ретровірусних векторних систем, які можуть бути використані в цілях даного винаходу. Вірусні частки, продуковані інкапсульованими клітинами даного винаходу, можуть бути сконструйовані так, що вони будуть містити геном вірусного вектору, що несе маркерні та/або терапевтичні гени. Прикладами маркерних або терапевтичних генів, присутніх у вір усному векторі, можуть служити гени, які кодують такі білки, як b-галактозидаза, неоміцин, алкогольдепдрогеназа, піроміцин, гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (HPRT), гігроміцин та секретована лужна фосфатаза; або терапевтичні гени, які кодують такі білки, як тимідинкіназа вірусу простого герпесу, цитозиндеаміназа, гуанінфосфорибозилтрансфераза (get), цитохром Ρ450, гени, регулюючі клітинний цикл, такі, як SDI, пухлинно-супресуючі гени, які кодують такі білки, як р53, антипроліферативні гени, які кодують такі білки, як мелітин, цекропін, або цитокіни, такі, як IL-2. В одному з конкретних своїх варіантах, даний винахід відноситься до використання інкапсульованих клітин даного винаходу для лікування пухлинних захворювань. Багато злоякісних пухлин не дуже добре піддаються хіміотерапії. Протипухлинні лікарські засоби, що використовуються для лікування пухлин, застосовуються, у більшості випадків, системно, а тому розсіюються по всьому організму пацієнта. Використання високих системних доз таких лікарських засобів, що необхідні для протиракової терапії, часто супроводжуються небажаними для пацієнта бічними ефектами. Одним з засобів, завдяки якому можуть бути вирішені проблеми, пов'язані з високою системною концентрацією протиракових лікарських засобів, є безпосереднє введення лікарського засобу в пухлин у, або активація цього лікарського засобу безпосередньо поблизу пухлини. Це може бути досягнено шляхом імплантації інкапсульованих клітин даного винаходу, продукуючи х вірусні частки, що містять геном сконструйованого вірусу, а зокрема, ретровірусного вектору, що несе ген, кодуючий протираковий лікарський засіб, наприклад, активуючий фермент, здатний перетворювати пролікарську сполуку в цитоксичний агент або в пухлинних клітинах, або поблизу пухлинних клітин. В одному з варіантів даного винаходу отримують інкапсульовані клітини, продукуючі ретровірусні частки, що містять геном ретровірусного вектору, що несе гени пухлинно-релевантних ферментів, таких, як цитохром Ρ450, або "гени-самовбийці", включаючи гени тимідинкінази (але не обмежуючись ними), яка перетворює нетоксичні пролікарські засоби в один або декілька токсичних метаболітів. Вказані інкапсульовані клітини даного винаходу можуть бути використані для лікування раку шляхом імплантації капсул в пухлини або поблизу пухлин, наприклад, пухлин в підшлунковій залозі або у молочній залозі. Додатково забезпечення направленої доставки може бути досягнено шляхом використання регуляторних елементів та промоторів, специфічних до даних клітин-мішеней, для регуляції експресії зціплених терапевтичних генів в конкретних типах клітин. Такими регуляторними елементами та промоторами, специфічними для клітин-мішеней, є, наприклад, регуляторні елементи та промотори, специфічні для підшлункової залози, наприклад, такі, як регуляторні елементи та промотори гену вугольної ангідрази ІІ та b-глюкогинази; лімфоцит-специфічні регуляторні елементи та промотори, включаючи імуноглобулін-специфічні регуляторні елементи та промотори, та лімфоцит-специфічні регулюторні елементи та промотори вірусу п ухлини молочних залоз миші (MMTV); регуляторні елементи та промотор, специфічні ля молочних залоз, включаючи WAR (білок молочної сироватки)-, MMTV-, b-лактоглобулін- та казеін-специфічні регуляторні елементи та промотори, а також MMTV-специфічні регуляторні елементи та промотори, що несуть сприйнятливість до глюкокортикоідних гормонів, та регулюючі експресію в молочних залозах. Прикладами інших промоторів с промотори CD4, CD34 та IL2. Вказані регуляторні елементи та промотори регулюють, переважно, експресію вищеописаного ретровірусного вектору. Можуть бути також використані індукуючі промотори, такі, як промотори, що індукуються випроміненням, наприклад, промотор фактору міжклітинної адгезії-1 (ІСАМ-1), промотор рецептору епідермального фактору росту (EGFR), та промотор фактору некрозу пухлин (TNF). Нижчеслідуючі приклади ілюструють даний винахід, однак, вони не повинні роздивлятися як деяке обмеження об'єму винаходу. Приклад 1 Ліпофекція РА317 вектором pBAG та виділення резистентних клітин G418 Амфотропні NIH3T3 основні пакувальні клітини РАЗ 17 (Miller & Buttimor, 1986) культивували в модифікованій по способу Дульбекко середовищі Ігла (DMEM), що містить 10% фетальну сироватку теляти. Потім, за один день до ліпофекції, клітини засівали в 10-сантиметрові чашки Петрі при щільності 3х105, після чого, ці клітини піддавали липофекції 2 мікрограмами вектору pBAG (Рігесе та ін., 1987), що несе ML V (вірус лейкозу мишей), на основі ретровірусного вектору, з використанням ліпофектамінового набору від GIBCO/BRL, у відповідності з інструкціями виробника. Потім, клітини розводили 1:10 та культивували у звичайному середовищі, що містить додатково 400мкг/мл G418 (GIBCO/BRL). Через 14 днів колонії резистентних клітин G418 об'єднували. Приклад 2 Мікроінкапсулювання 107 клітин суспендували в 1мл забуферованого фізіологічного розчину, що містить 2,5%-ний натрійвмісний сульфат целюлози, та 5%-ну фетальну сироватку теляти, а потім отриману суспензію вводили за допомогою дозуючої системи (ежекторної системи) в баню для осадження, що містить 2-3%-ний полідиметилаліламоній в забуфероному фізіологічному розчині. Утворення капсули проходило за міллісекунди з послідуючим формуванням внутрішнього, більш пористого шару для механічної підтримки, що складається, в основному, з сульфату целюлози. Капсули, що містять клітини, витримували у бані для осадження на протязі часу від 30 секунд до 5 хвилин, а потім промивали у середовищі DMEM (Stange та ін., 1993). Для біологічних досліджень були використані партії, отримані з різними параметрами, описані вище, тобто такими як концентрація натрій-вмісного сульфату целюлози, поток в ежекторній системі, та час перебування у бані для осадження. Прикладами характерних умов є слідуючі умови: 2,5% натрій-вмісний сульфат целюлози, 2% полідиметилаліламоній, та 1 хвилина перебування у бані для осадження; або 1,5% натрій-вмісний сульфат целюлози, 2% полідиметилаліламоній, та 0,5 хвилин перебування у бані для осадження; або 3% натрій-вмісний сульфат целюлози, 3%-ний полідиметилаліламонш, та 2 хвилини перебування у бані для осадження. Точні параметри були вибрані також з урахуванням точного розміру капсул, які треба отримати, товщини стінок капсул, а також інших властивостей. Приклад 3 Імплантація мікрокапсул в молочній залозі миші Мікрокапсули вводили в молочні залози двомісячних самок мишей BALB/c шляхом операції по типу "ключзамок", та вхідний отвір закривали одним швом. В кожну ділянку операції було введено до 6 капсул діаметром 0,5-2мм. В in vitro-дослідженнях вірусу, що вивільнюється з мікрокапсул, структур у мікрокапсул та вплив імплантації капсули в імунокомпетентну мишу, досліджували з використанням слідуючих тест-методів: A) b-галактозидна активність. Виявлення інфікованих клітин шляхом гістохімічного фарбування здійснювали, як описано раніше (Серkо, 1989). Зрізи клітин, капсул або тканини промивали охолодженим PBS, а потім фіксували 2% параформальдегідним розчином на протязі 20 хвилин-24 години у відповідності з товщиною зразка. Після інтенсивної промивки фосфатно-буферним розчином, зрізи клітин, капсул або тканини були інкубовані в розчині, що містить субстрат X-gal (20мМ K3 FeCN6, 20мМ K4FeCN6 3Н2О, 2 мМMgCl2 та 1мг/мл X-gal), принаймні, на протязі 2 годин при 37°С. B) Інфікування 4х104 клітин-мішеней засівали в 6-лункові планшети для культивування тканини за 6 годин до інфікування. Капсули, що містять вірус-продукуючі клітини, поміщали поверх клітин-мішеней, та до середовища додавали полібрен (8мкг/мл). Через чотири години середовище заміняли для видалення залишкового полібрену. Через 5 днів деякі лунки були пофарбовані завдяки b-галактозидазної активності, як описано вище, а інші лунки були трипсинізовані в більші чашки для культивування тканини, та культивували в середовищі, що містить 400мкг/мл G418. G418-резистентні колонії були виявлені через 16 днів. C) RT-PCR-аналіз Вірусні частки від 5мл супернатанту культурального середовища капсул осаджували шляхом ультрацентрифугування (240000xg, 1 годину, 4°С). Утворений осад ресуспендували у буфері для лізису (1% Тритон 100, 0,5% дезоксихолат натрію, 0,1% додецилсульфат натрію, PBS), та РНК екстрагували фенолом з послідуючим осадженням етанолом, як описано раніше (Salmons та ін., 1986). Потім, РНК піддавали зворотній транскрипції в ДНК з використанням готового до вживання набору з Т-праймованою одноланцюговою послідовністю (Ready-To-Go T-ptimed first-strand kit Pharmacia). PCR-ампліфікацію здійснювали з використанням праймерів, локалізованих в env та R з MLV по хідного BAG -вектору LTR (Фіг.2А). PCRампліфікацію здійснювали в 100 мікролітрах реакційної суміші, що містить 500мМ КСl, 10мМ Трис-НСІ (рН 8,3), 1,5мМ MgCl2, 0,01% (мас/об.) желатину, а також 100мМ кожного dNTP, 40пМ кожного праймеру, та 2,5 одиниць полімерази Tag (Perkin Elmer). Реакції проводили в термолунках 9600 (Perkin Elmer Cetus Therma cycler) при слідуючи х умовах: 1 хвилина при 94°С, 2 хвилини при 53°С та 3 хвилини при 72°С за 35 циклів. PCR-продукти виділяли на 0,8% агарозному гелі, а потім переносили на Zeta зондові мембрани (BIORAD), та гібридизували, як описано раніше (Indraccolo та ін., 1995), з 32Р-міченим PCR-фрагментом (612п.о.) геному MLV, генерованого з використанням тих же праймерів та pBAG в якості матриць. MLV-специфічні послідовності візуалізували з використанням фосфовізуалізованої системи Fuji (ВAS 1000). D) PCR-аналіз Геномну ДНК (1мкг) ампліфікували за допомогою PCR з використанням одного праймеру, розташованого всередині залишкових послідовностей env вектору BAG, та іншого праймеру в поліомній області плазміди, розташованій за межами ретровірусних векторних послідовностей (Фіг.3В). PCR-реакції проводили, як описано вище, з використанням слідуючих умов: 1хв. при 94°С, 2хв. пр 50°С та 3 хв. при 68°С за 35 циклів. PCRпродукт гібридузували з 32Р-міченим Xbal-ДНК-фрагментом 1,5kb вектору pBAG, який є специфічним до поліомних послідовностей. F) Електронна мікроскопія Зразки для оцінки скануючої електронної мікроскопії (SEM) та трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) промивали в PBS (рН=7,35), а потім фіксували в 1% глутаральдегіді в PBS на протязі 15 хвилин, після чого фіксували в 2% OsO4 на протязі 15 хвилин. Зразки дегідратували в ступінчатому градієнті етанолу, а потім розділяли на дві групи: а) SEM-зразки осушували при критичній температурі з використанням СО2 та покривали платиновим шаром 1-3нм (Emscope SC 500; Asliford, England). Покриті зразки оцінювали в емісійному скануючому електронному мікроскопі при 10кВ (Jeol JSM-6300F; Токіо, Японія) з прискорюючою напругою 5-10кВ у другому режимі; b) ТЕМ-зразки занурювали в Ероn. Зверхтонкі зрізи два рази фарбували уранілацетатом та цитратом свинцю, та просліжували у просвічуючому електронному мікроскопі Zeiss Em-10C (Oberkochen, Німеччина). Результати In νitro-дослідженнях вірусу, що вивільнюється з мікрокапсул Фарбування клітин в мікрокапсул, отриманих в Прикладі 2, субстратом X-gal, описаному у ви щевказаному тесті на b-галактозидазну активність, виявило, що інкапсульовані клітини експресують ген b-галактозидази, що кодується вектором pBAG (Фіг.1), також як і неінкапсульовані клітини, продукуючі вектор (не показані). Для ілюстрації того, що вірусні частки вивільнюються з клітин в мікрокапсули в культуральне клітинне середовище, РНК отримували з осаджених віріонів, зібраних з супернатантів капсул після різних періодів часу культивування. Цю РНК аналізували шляхом полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскриптазою (RT-PCT) з використанням праймерів, комплементарних вірусу env та області R, описаній у вищевказаному RT-PCR-аналізі. MLV-специфічний PCR-генерований фрагмент потрібного розміру (612п.о.) досліджували в культуральному середовищі мікрокапсул, принаймні, на протязі 6 тижнів (Фіг.2В, шляхи 1-4), причому, в цей період часу аналізи переривали. Цей фрагмент не є наслідком контамінації ДНК, оскільки попередня обробка вірусної РНК РНКазою перед полімеразною ланцюговою реакцією з зворотною транскриптазою не переводила до появи сигналу (Фіг.2В, 1-4). Продукування та вивільнення інфекційного вірусу з капсул може бути підтверджено шляхом їх сумісного культивування (описаного вище в тесті на їх інфікування) з клітинами-мішенями, такими як, наприклад, NIT3T3 (Jainchill та ін., 1969) або CRFK (Crandell та ін., 1973). Через 4 дні після сумісного культивування, аліквоту клітин-мішеней, а також інкапсульованих клітин з дефектом упаковки фарбували для проведення аналізу на bгалактозидазну активність, як описано вище. Клітини-мішені, що залишилися, були відібрані на резистентність до G418. Було показано, що багато сумісно культивованих клітин NIH3T3 та CRFK експресують ген b-gal (Фіг.3А). Для підтвердження того, що клітини-мішені можуть придбати ген b-gal шляхом інфікування, ці клітинимішені аналізували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, BAG-продукуюча пакувальна клітинна лінія основана на клітинній лінії РА317 (Miller & Buttimore, 1986), та несе ген тимідинкінази вірусу простого герпесу (HSV-TK), продукт якого перетворює сполуку проліків ганцикловір в цитотоксичну лікарський засіб. Клітини мішені NIH3T3 та CFRK звичайно не несуть цього гену. В експерименті, який проводили для того, щоб продемонструвати, b-gal-експресуючі сумісно культивовані клітини-мішені NIT3T3 та CFRK є резистентним до GCV, що вказує на відсутність витоку BAG-продукуючи х клітин, геномну ДНК екстрагували з клітин-мішеней та аналізували за допомогою PCR-аналізу (описаного вище) на присутність плазмдних послідовностей за межами вектору. Ці послідовності були присутні у пакувальних клітинах, оскільки вектор BAG був ліпофікований у ці клітини у формі плазмідного вектору BAG. Однак, вірус, продукований з клітин з дефектом упаковки, не несе цих плазмідних послідовностей, а тому вони не повинні бути присутні в інфікованих клітинах-мішенях. На Фіг.3В показано, що плазмідні послідовності не були виявлені, що вказує на інфікування цих клітин вектором BAG. Структура мікрокапсул Були отримані зрізи мікрокапсул, а їх стр уктура було проаналізовано за допомогою електронної мікроскопії. Внутрішню частину капсули, що складається з губчатоподібної матриці, заповняли клітинами (Фіг.4). Аналіз поверхні мікрокапсул, проведений за допомогою скануючої електронної мікроскопії, виявив присутність пор, які є достатньо великими, що дозволяє ретровірусним векторним частинкам вивільнятися з капсул, що підтверджує біла смуга на зображенні поверхні капсули (Фіг. 4), яка представляє середній діаметр ретровірусної частки. In vi vo-стабільність в імунокомпетентних мишах Для оцінки in vivo-стабільності мікрокапсул, та для того, щоб визначати чи мікрокапсули продукують чи вірус високу імунну відповідь, ці мікрокапсули імплантували в молочні залози двомісячних самок мишей BALB/c. Мишей умертвляли у різні інтервали часу після імплантації для кількісної оцінки присутніх мікрокапсул та для того, щоб визначити чи продукується інфікційний вірус. Як можна явно бачити, імплантовані мікрокапсули були поміщені всередину жирного шару молочних залоз, принаймні, на протязі 6 тижнів після імплантації (Фіг.5А). Цікаво відмітити, що васкуляризація поблизу мікрокапсул проходила у всіх тварин, яких аналізували, (Фіг.5 А), що, можливо, є результатом продукування факторів ангіогенезу або факторів росту пакувальними клітинами. Зрізи, приготовлені з мікрокапсул, та тканеве обрамлення молочної залози підтверджують, що кровеносні судини можуть знаходитися у безпосередній близькості від капсул (Фіг.5В). За допомогою цих зрізів було також виявлено присутність шару сполучної тканини, розташованого між мікрокапсулами та тканиною молочної залози. Ці зрізи не виявляли високої протизапальної або імунної відповіді, направленої проти мікрокапсул або вірусо-продукуючих клітин, які містяться у цих мікрокапсулах. Для ілюстрації того, що інфекційні ретровірусні векторні частки вивільняються з капсул та інфікують навколишню тканину молочної залози, деякі зрізи були проаналізовані на експресію b-gal шляхом X-galфарбування. Клітини, експресуючі ген b-галактозидази, були добре помітні за межами мікрокапсул (див. Фіг.5С). Приклад 4 У даному прикладі описано конструювання ретровірусного експресуючого вектору для внуфішньопухлинної інфекції, який містить ген для цитохрому пацюка Р450 2В1. Вектор експресії pLX2Bl, показаний на Фіг.6, конструювали шляхом лігування фрагментів, отриманих від плазміди pLX125 та pSWl (Kedzie та ін., 1991). Плазміду pLX125 лінеризували ферментом Нраl, та отримані тупі кінці дефосфорилювали з використанням фосфатази кишечнику теляти. ДНК очищали шля хом розділення на 1% агарозному гелі, а потім вирізали, та виділяли у відповідності зі схемою Qiaquick (Qiagen). Після осадження етанолом, ДНК ресуспендували у воді. Клонуючий вектор pSWl гідролізували ферментами Smal та Hincll з отриманням двох затуплених по кінцям фрагментів. Суміш для гідролізу розділяли на 1% агарозному гелі. Найкоротший фрагмент (1,5kb), що містить кДНК цитохрому Р450 1В1 пацюка (Fuji-Kuriyama та ін., 1982), вирізали та елюювали у відповідності з процедурою екстрагування ДНК (Qiaquiak), a потім осаджували етанолом, та ресуспендували у воді. 7, 6 фМолей pLX125 та 24 фМолей Smal/Hincll-фрагменту змішували та лігували на протязі 3 днів при 12°С з використанням Т4-лігази (Boehringer). Лігазу шактивували при температурі 65° С на протязі 10 хвилин, а потім ДНК осаджували 10-кратним об'ємом бутанолу. Осаджену ДНК ресуспендували у воді та піддавали електропорації в DH10OB-бактерію (Gibco). Колонії, резистентні до ампіциліну, відбирали, а потім отриману ДНК гідролізували ферментами SspBl/Sall, BainHl/SsBl, Pvul та BamHl. Кінцеву правильно зконструйовану плазміну позначали pLX2B 1. Ліпофекція За один день до ліпофекції, 3х105 ретровірусни х клітинних ліній з дефектами упаковки РА317 (Miller & Buttimore, 1986) засівали у 6-сантиметрові чашки Петрі або планшети ля культивування. Через один день після інфікування, 2 мікрограми pLX2Bl змішували з 100 мікролітрами без сироваткового середовища. Одночасно, 15мкл ліпофектаміну (GIBCO, BRL) змішували з 100 мікролітрами безсироваткового середовища. Розчин, що містить плазміду. змішували з ліпофектаміном та інкубували 45 хвилин. Через 35 хвилин клітини один раз промивали 2 мілілітрами безсироваткового середовища. 800мкл безсироваткованого середовища наносили на отримані клітини. Через 6 годин додавали 1мл модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла, що містить 10% фетальну сироватку теляти. На слідуючий день клітини трипсинізували та розводили у відношенні 1:10, а потім засівали в 10 мілілітрові чашки. Через 24 години середовища заміняли на середовище, що містить аналог неоміцину G418. Одиничні клітинні клони або клітинні популяції виділяли та аналізували на експресію цитохрому Р450. Інкапсулювання Отримані пакувальні клітинні лінії, продукуючі ретровірусний вектор, інкапсували, як описано вище, у Прикладі 2 Імплантація Отримані капсули вводили хірургічно по типу "ключ-замок" біля, або у трансплантовані, або у спонтанно утворені пухлини мишей BALB/c або GR. У кожну ділянку операції було введено 6 капсул діаметром в 1мм. Цю ділянку операції закривали одним швом. Потім мишей обробляли циклофосфамідом або іфосфамідом за допомогою місцевого введення шляхом безпосередньої внутрішньопухлинної ін'єкції 100мкл - 20мг/мл або системних концентрацій 130мг GPA/кг маси тіла (внутрішньочеревинно), та 40-60мг IFO/кг маси тіла (внутрішньочеревинно) на протязі максимального періоду часу 10 тижнів. На протязі цього періоду часу кожний день просліджували розмір пухлини аж до її візуального виявлення. Після цього періоду часу мишей умертвляли, а тканину, що містить введені капсули та пухлин у, удаляли та отримували гістологічні зрізи для оптичної та електронної мікроскопії. Ці зрізи явно показували досить добре приживлення капсул, васкуляризацію, а також, не виявляли наявність лімфоцитів, що вказують на клітинну імунну відповідь. Ці зрізи також не показували яких-небудь ознак загибелі клітин або некрозу клітин всередині капсули. У протилежність цьому, пухлини виявляли некроз та явне візуальне зниження своїх розмірів під час періоду досліджень. Приклад 5 В цьому прикладі описана конструкція стабільної клітиннної лінії, яка експресує цитохром пацюка Р450 2В1 конститути вно. Вектор експресії рс3/2В1 конструювали шляхом лігування фрагментів, отриманих від плазміди pcDNA3 (Invitrogen) та pSWl (Kedzie та ін., 1991). Плазміду pcDNA3 гідролізували ферментами Xhol/Xbal, та отримані липкі кінці фрагментів дедефосфосфолювали з використанням фосфатази кишечнику теляти. ДНК-каркас вектору очищали шляхом виділення на 1% агарозному гелі, вирізали та отримували у відповідності зі схемою Qiaquick (Quigen). Після осадження етанол ом ДНК ресуспендували у воді. Клонуючий вектор pSWI гідролізували ферментами Xhol та Xbal з отриманням двох фрагментів. Гідролізну суміш виділяли на 1% агарозному гелі. Найбільш короткий фрагмент (1,5kb), що містить кДНК цитохрому пацюка Р450 2В1 (Fuji-Kuriyama та ін., 1982), вирізали, елюювали у відповідності зі схемою екстракції ДНК (Qiaquick), осаджували етанолом та ресуспендували у воді. 8,3 фМолей каркасу pcDNA3 та 24,8 фМолей Xhol/Xbal фрагменту pSWl змішували та лігували на протязі одного дня при 12°С з використанням Т4-лігази (Boehringer). Лігазу інактивували на протязі 10 хвилин при 65°С та ДНК осаджували 10-кратним об'ємом бутанолу. Осаджену ДНК ресуспендували у воді та піддавали електропорації у DHlOB-бактерію (Gibco). Колонії, резистентні до ампіциліну, відбирали та після аналізу отриману ДНК гідролізували ферментами EcoRl, BamHl, EcoRV та Xhol. Кінцеву правильно сконструйовану плазміду позначали рсЗ/2В1. Ліпофекція За один день до інфікування 3x105 клітин ΝΊΗ3Τ3 засівали у 35-міліметрові чашки. У день інфікування 2мкг рс3/2В1 змішували з 100 мікролітрами безсироваткового середовища. Розчин, що містить плазміду, додавали до суміші ліпофектаміну та інкубували на протязі 45 хвилин. Через 35 хвилин клітини один раз промивали 2 мілілітрами безсироваткового середовища. До суміші для ліпофекції додавали 800мкл безсироваткового середовища, та 1мл отриманого розчину речовини наносили на клітини. Через 6 годин додавали 1мл DMEM (Glutamax), що містить 10% фетальну сироватку теляти. На слідуючий день клітини трипсинузували, 10-кратно розводили та засівали на 10-міліметрові чашки. Через 24 години середовище заміняли на середовище, що містить неоміцин. Через 14 днів клони, резистентні до неоміцину, виділяли та аналізували на присутність вектору та його активність. Капсули, що містять ці клітини, були продуковані, як описано у Прикладі 2, та імплантовані в мишей у місце біля пухлини. Після обробки циклофосфамідом або іфосфамідом ефективність обробки оцінювали, як описано вище. Опис креслень Фіг.1 Гістологічне фарбування інкапсульованих клітин РА317, стабільно трансфікованих вектором pBAG для ілюстрації експреси b-галактозидази. Фіг.2. RT-PCR-аналіз вірусних часток, що вивільняються капсулами (2В; шляхи 1-4: середовище, взяте після 2-, 3-. 5- та 6-тижневого культивування капсул). Культуральне середовище від неінкапсульованих BAGвірус-продукуючи х клітин була використана в якості позитивного контролю (шлях 5), а середовище від нетрансфікованих клітин РА317 була використана у якості негативного контролю (шлях 6). У випадку, коли вірусні зразки піддавали гідролізу РНКазою перед здійсненням RT-PCR-аналізу, то ніяких сигналів не спостерігалось, що свідчить про те, що ампліфікована смуга походить від вірусної РНК (2С; шляхи 1-4). Вірусна РНК, отримана від неінкапсульованих BAG-вір ус-продукованих клітин, без обробки РНКазою, була використана в RT-PCR-реакції у якості позитивного контролю (шлях 7). Фіг.3. Культивування інкапсульованих вірус-продукуючи х клітин разом з клітинами NIH3T3. (А) Клітини-мішені засівали з низькою щільністю за один день до того, як були добавлені капсули, що містять пакувальні клітини, продукуючі ретровірусний вектор. Через декілька днів клітини та капсули піддавали гістолологічному фарбуванню для проведення аналізу на b-галактозидазну активність. (В) Для підтвердження того, що клітини-мішені, експресуючі b-галактозидазу, були отримані в результаті інфікування, а не завдяки витоку вір ус-продукуючи х клітин, геномну ДНК екстрагували з клітин та проводили PCR-аналіз. Фіг.4. Скануюча електронна мікроскопія показала поверхню капсули, в якій пориста структура стає виявленою лише при великому збільшенні (х75000). Біла смуга означає 100нм (діаметр ретровірусної частки), що показує на те, ці стр уктури можуть представляти собою пори, через які вірус вивільнюється з капсули. Фіг.5. Гістологічний аналіз капсул, імплантованих в молочну залозу миші (А), (В) оптична мікроскопія поперечного перерізу капсули на протязі 4 тижнів після імплантації в молочну залозу миші (збільшення х133), (С) шфікування клітин молочної залози миші після імплантації капсул, що містять BAG-вектор-продукуючі клітини РА317. Фіг.6. Стр уктура експресійного вектору pLX2Bl, що містить ген, який кодує цитохром Р450 2В1 пацюка, та який знаходиться під контролем промотору U3-MMT після конверсії промотору. Посилання: Серко, С. (1989). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Meth. Neurosci. 1,367-392. Chang, P.L. (1995). Nonautologous somatic gene therapy. In Somatic Gene Therapy. P.L Chang, ed. (CRC Press, Boca Raton) pp.203-223. Cornetta, K., Moen, R.C., Culver, K., Morgan, R.A., Mclachlin, J.R., Sturm, S., Selegue, J., London, W., Blaese, R.M., and Anderson, W.F. (1990) Amphotropic murine leukemia retrovirus is not an acute pathogen for primates. Hum. Gene Ther, 1, 15-30. Crandelll, R.A., Fabricant, C.G., and Nelson-Rees, W.A. (1973). Development, characterization, and virus susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK). In vitro 9,176-185. Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., and Baese, R.M. (1992). In vivo gene transfer with retroviral vector producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256,1550-1552. Deglon, N.. Zurn, Α., Baetge, E., and Aebischer, P. (1995) Development of gene therapy for the treatment of neurodegenerative diseases; Parkinson disease, Al zheimer disease and amyotrophic lateral sclerosis therapy; polymer encapsulated neurotrophic-secreting cell intrathecal transplantation. Gene Ther. 2,563. Fuji-Kuryama, Υ., Mi zukami, Υ., Kawajiri, К, Sogawa, К. and Muramutsu, Μ.: Primary structure of a cytochrome P-450: Coding nucleotides sequence of phenobarbital-inducible cytochrome P-450 cDNA from rat liver, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982 May; 79:2793-97 Gunzburg, W.H., Sailer, R., and Salmons, B. (1995). Retroviral vectors directed to predefined cell types for gene therapy. Biologicals 23,5-12. Gunzburg, W.H. and Salmons, B. (1995) Virus vector design in gene therapy. Molecular Medicine Today, 1,410417. Hughes, M., Vassilakos, Α., Andrews D.W., Hortelano, G., Belmont, J.W., and Chang, P.L. (1994). Delivery of a secretabie adenosine deaminase through microcapsules a novel approach to somatic gene therapy. Hum. Gene Ther. 5,1445-1455. Indraccolo, S., Gunzburg, W.H., Leib-Mosch, CM Erfle, V., and Salmons, B. (1995). Identification of three human sequences with viral superantigen-specific primers. Mammalian Genome 6,339-344. Jainchill, J.L, Andeson, S.A., andTodaro, G.J. (1969). Murine sarcoma and leukaemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol. 4,549-553. Kedzie, KM; Balfour, CA; Escobar, GY; Grimm, SW; He, YA; Pepperl, DJ; Regan, JW; Stevens, JC; Halpert, JR: Molecular basis for a functionally unique cytochrome P450IIB1 variant, J. Biol. Chem. 1991 Nov25; 266(33): 2251521 Miller, A.D., and Buttimore, C. (1986). Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Мої. Cell. Biol. 6,2895-2902. Morgan, R.A., and Anderson, W.F. (1993). Human gene therapy. Ann. Rev. Biochem. 62,191-217. Price, J., Turner, D., and Серко, С (1987). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirusmediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,156-160. Ram, Z., Culver, K.W., Walbridge, S., Blaese, R.M., and Oldfieid, E.H. (1993). In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats. Cancer Res. 53, 83-88. Salmons, В., Knedlitschek, G., Kennedy, N.. Groner, В., and Ponta, H. (1986). The endogenous mouse mammary tumour virus locus Mtv-8 contains a defective envelope gene. Virus Res. 4, 377-389. Stange, J., Mitzner, S., Dautzenberg, H., Ramlow, W., Knippel, M., Steiner, №, Emst В., Schmidt, R., and Klinkmann, H. (1993). Prolonged biochemical and morphological stability of encapsulated liver cells - a new method. Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 343-352. Tai, I.T., and Sun, A.M. (1993). Microencapsulation of recombinant cells: a new delivery system for gene therapy. FASEB J. 7,1061-1069. Welsh, R.M., Cooper, N.R., Jensen, F.C., and Oldstone, M.B.A. (1975). Human serum lyses RNA tumour viruses. Nature 257, 612-614. Winn, S.R., Hammang, J.P., Emerich, D.F., Lee, Α., Palmiter, R.D., and Baetge, E.E. (1994). Polymer encapsulated cells genetically modified to secrete human nerve growth promote the survival of axotomized septal cholinergic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,2324-2328.