Іморталізована лінія клітин нервової тканини людського плода, призначена для лікування паркінсонізму, та композиція, придатна для трансплантації, що містить клітини іморталізованої лінії

1 Іморталізована ЛІНІЯ КЛІТИН нервової тканини людського плода, призначена для лікування паркінсонізму, модифікована молекулою гетеролопчної нуклеїнової кислоти, яка кодує тирозинпдроксилазу, причому ця ЛІНІЯ КЛІТИН експресує згадану молекулу гетеролопчної нуклеїнової кислоти, і, крім того, ця ЛІНІЯ клітин продукує серотонін 2 Композиція, придатна для трансплантації, яка містить клітини іморталізованої лінії за п 1, шкапсульовані непроникною для антитіл мембраною з альпнатного гелю, а також фармацевтично прийнятний носій О Цей винахід, у цілому, має відношення до методів лікування реципієнту шляхом імплантування йому генетично неспоріднених клітин Зокрема, цей винахід надає іморталізовані лінії клітин нервової тканини людського плода та методи лікування реципієнту шляхом імплантування цих клітинних ЛІНІЙ згаданому реципієнту або пацієнту Трансплантування органів стало успішним засобом, який широко практикується для лікування різних захворювань Пересадка серця, нирок, навіть печінки стала майже повсякденним явищем у багатьох медичних центрах На жаль, захворювання багатьох органів не піддаються лікуванню шляхом трансплантування цілих органів Наприклад, поразки центральної нервової системи не можна вилікувати пересадкою цілого органу для заміщення ушкодженої тканини Оскільки заміщення пошкодженої тканини шляхом трансплантування цілого органу є неможливим у разі багатьох захворювань або навіть для всіх пацієнтів, які мають ВІДПОВІДНІ захворювання, були зроблені спроби по розробці методів трансплантування клітин Сан (Sun) та ін , Biomat, Art Org , 15 483 - 496 (1987) Поразки паренхіматозної тканини, наслідком яких є недостатність біологічно активної сполуки, можна лікувати трансплантуванням окремих клітин або сполучень клітин, які секретують згадану біологічно активну сполуку Наприклад, діабетичних тварин успішно лікували імплантуванням острівців Лангерганса, відокремлених від донорних підшлункових залоз Ноель (Noel) та ш , Metabolism, 31 184 (1982) Клітинна трансплантаційна терапія особливо приваблива для лікування неврологічних захворювань Трансплантування паренхіматозної тканини є особливо неприйнятним для неврологічних захворювань з декількох причин Хірургічне оголення головного мозку, необхідне для трансплантування паренхіматозної тканини, може спричинити незворотнє пошкодження провідних шляхів нервової системи, наслідком чого є КЛІНІЧНІ неврологічні розлади Крім того, неврологічна функція часто залежить від комплексу МІЖКЛІТИННИХ зв'язків, ЯКІ не можуть бути встановлені хірургічним шляхом Далі, клітини центральної нервової системи є надзвичайно чутливими до кисневого голодування та позбавлення живлення Критичною є швидка васкуляризація паренхіматозних трансплантатів, оскільки клітинам у внутрішній частині 0 0 ю о (О 61058 клітини центральної нервової системи(наприклад, астроцити та олігодендроцити) є критичними для виживання нейронів у КЛІТИННІЙ культурі О'Мелі (О'МаІІеу) та ш , Exp Neurol , 112 40 - 48 (1991) Було показано, що імплантовані фібробласти, генетично змінені, для експресування фактору росту нервової тканини, підвищувало виживаність холшерпчних нейронів базального діенцефалону після пошкодження бахромки-склепіння, наслідком чого є загибель ацетилхолінових нейронів у базальному діенцифалоні, що спостерігається при хворобі Альцгеймеру Розенберг (Rosenberg) та ш , Science, 242 1575 -1577 (1988) Незважаючи на те, що попередні спроби клітинно-трансплантаційної терапії при неирологічних розладах дали підбадьорливі результати, залишилось декілька суттєвих проблем Постачання фетальної тканини для клітинних трансплантатів є вельми обмежене Для забезпечення максимальної виживаності фетальні клітини повинні бути свіжозібраними перед трансплантуванням Це вимагає координування антипсихотичними речовинами або ХІМІЧНИМИ імплантаційної процедури з елективними речовинами, наприклад, 1-метил-4-феніл-1,2,3,6абортами тетрапдропіридином Бьорнс та ш, Proc Natl Acad Sei USA, 80 4546 - 4550 (1983) та Банкевич Навіть за таких умов фетальна тканина не є (Bankiewicz) та ш, Life Sei, 39 7-16 (1986) легкодоступною у Сполучених Штатах На виживаність трансплантату впливає також Були спроби реверсувати КЛІНІЧНІ прояви внутрішньоутробний вік плода, з якого одержують експериментально викликаного паркінсонізму клітини Гейдж та Фішер, див раніш Одержання шляхом трансплантування допамшерпчних клітин фетальної тканини тільки у певних до смугастого тіла вражених тварин Генетично внутрішньоутробних вікових межах додає модифіковані фібробласти(трансфектовані ДНК, додаткові обмеження до доступності фетальних яка кодує тирозшпдроксилазу) було вдало клітин для трансплантату Далі, етичні міркування трансплантовано тваринам з поразками роблять деяких потенційних реципієнтів допамінерпчних провідних шляхів Моторна трансплантатів неохочими до проходження цієї функція та поведінка тварин поліпшилась після процедури, коли імплантуються СВІЖІ фетальні імплантації допамінпродукуючих фібробластів клітини Вулф та ш, Proc Natl Acad Sei USA, 86 9011 9014 (1989), Фішер (Fisher) та ш Neuron, 6 371 Оскільки фетальну тканину одержують зі 380 (1991) Виживаність трансплантату може бути свіжих абортплодів, існує значна небезпека підвищена і, тим самим, клінічне покращання інфекційного контамшування Незважаючи на те, подовжене трансплантуванням тканини плота, у що абортуючих жінок, які поставляють фетальну порівнянні до клітин, одержаних після народження тканину, перевіряють на різні інфекції, деякі з цих Гейдж (Gage) та Фішер, Neuron, 6 1-12 (1991) інфекцій, наприклад, ВІЛ, можуть не піддаватися клінічному виявленню, і, таким чином, не бути СВІЖІ фетальні допамшерпчні нейрони було ідентифікованими під час процесу перевірки трансплантовано до хвостатого ядра мавп після Таким чином, у разі широкого поширення, ХІМІЧНОГО пошкодження допамшової системи чорна трансплантати свіжих фетальних клітин були б речовина-смугасте тіло Після трансплантації спроможні спричинити багато інфекційних розлади поведінки, обумовлені пошкодженням, ускладнень поліпшились Банкевич та ш , J Neurosurg , 72 231 - 244 (1990) та Тейлор (Taylor) та ш , Prog Використання іморталізованих клітинних ЛІНІЙ Brain Res, 82 543-559(1990) дозволило б подолати багато з цих ускладнень, пов'язаних з доступністю та інфікуванням Про Людей, які страждають паркінсонізмом, іморталізовану ЛІНІЮ КЛІТИН нервової тканини лікували трансплантуванням допамінерпчних людського плода було повідомлено Меджором нейронів до смугастого тіла Ліндвел (Lmdval) та (Mejor) та ш , Proc Natl Acad Sei USA, 82 1257ш , Arch Neurol , 46 615 - 631 (1989), Віднер 1262 (1985) та у патенті США №4707448 Далі, (Widner) та ін , New Engld Med , 327 1556 - 1563 іморталізовані КЛІТИННІ ЛІНІЇ, за самою своєю (1992) Трансплантовані клітини одержували від природою, є схильні до утворення пухлин після абортплодів Перед абортуванням жінок трансплантування in vivo Таким чином, перевіряли на антитіла проти деяких терапевтичні штрацеребральні трансплантації хворобочинних вірусів Після хірургічного іморталізованих клітин становлять високий втручання у пацієнтів, яких піддавали лікуванню, ступень небезпеки тим, що спричинюють спостерігалось поліпшення неирологічних функцій штракраніальні пухлини Навіть пухлини, які мають Однак, пацієнти потребували підтримуючої доброякісну ГІСТОЛОГІЮ, можуть нести поганий імуносупресорної терапії прогноз у разі їх присутності під черепним Недавні дослідження свідчать про те, що склепінням трофічні фактори, які виділяють підтримуючі паренхіматозних трансплантатів часто бракує достатнього рівня перфузм для підтримки життєздатності Стеневай (Stenevi) та ш , Brain Res, 114 1 -20(1976) Один з доволі розповсюджених синдромів, паркінсонізм, був об'єктом спроб проведення клітинної трансплантаційної терапії Бьорклунд (Bjorkhmd) та ш , Brain Res , 177 555 - 560 (1979), Ліндвал (Lindvale) та ш , Science, 247 574 - 577 (1990), Фрід (Freed), Restor Neural Neurosci , З 109 - 134 (1991) Паркінсонізм є наслідком втрати допамінпродукуючих нейронів у чорній речовині базальних ядер Бьорнс (Burns) та ш, N Engl J Med, 312 1418-1421 (1985), Вулф (Wolfі) та ш, Neurobiologi, 86 9011 - 9014 (1989) Хвороба Паркінсону, хвороба невідомої етіології, яка характеризується КЛІНІЧНИМИ проявами паркінсонізму, викликається ідюпатичним руйнуванням цих допамінпродукуючих нейронів Паркінсонізм може визиватись різними лікарськими засобами, наприклад, 61058 ЛІНІЇ цього винаходу з фармацевтично прийнятним носієм Короткий опис фігур Фіг 1 - морфологія клітин SVG in vitro Фіг 2 - імунопероксидазне забарвлення антитіл до SV40 Т-білку у клітин SVG Фіг 3 - слід голки у базальному ядрі при невеликому збільшенні Фіг 4 - слід голки у базальному ядрі при великому збільшенні Фіг 5 - ще одне зображення сліду голки у базальному ядрі при великому збільшенні Фіг 6 - скупчення клітин SVG на СТІНЦІ бокового шлуночку Фіг 7 - імплантовані клітини SVG на СТІНЦІ бокового шлуночку, забарвлені антитілами до гліального фібрилярного кислотного білку Невідкладно потрібними у цій галузі є методи терапевтичного імплантування іморталізованих Фіг 8 - in vivo зріз імплантованих клітин SVG, клітин нервової тканини людського плода та забарвлених анти-Т-білковими антитілами клітинних ЛІНІЙ, придатних для цього Фіг 9 ТІ зважена ЯМР-томограма(з використання У ідеальному випадку, ці методи не гадолінієвим підсиленням) головного мозку мавпи повинні визивати утворення пухлин або через 6 МІСЯЦІВ після імплантування інтенсивного запалення після трансплантування Фіг 10 - ріст тирозинпдроксилазного нейрону Бажано, щоб у цих методах могли на шарі імплантованих клітин SVG in vivo використовуватись клітини, які є похідними Фіг 11 - схематичне зображення конструкції клітинних ЛІНІЙ, для зведення загрози інфекційного плазміди phTH/Neo, яку було використано при контамшування та обмеженої клітинної конструюванні ЛІНІЙ КЛІТИН SVG-TH доступності до мінімуму Напрочуд, але цей Фіг 12 імунопстохімічне забарвлення винахід задовольняє цим і іншим спорідненим тирозинпдроксилазою стійкого трансфектанту потребам phTH/Neo Суть винаходу Фіг 13 вестерн-блотинг одного ТНЦей винахід надає методи лікування позитивного клону(1 В1 В), який підтверджує реципієнта, які включають імплантування клітин результати імунопстохімічного аналізу, іморталізованої лінії клітин нервової тканини представлені на фігурі 12 плода реципієнту Загалом, КЛІТИННІ ЛІНІЇ Фіг 14 - хроматограма HPLC аналізу одержують з астроцитів людського плода, супернатанту культури клітин SVG-TH Два піки, з наприклад, клітинну ЛІНІЮ SVG Клітини часто часом утримування 25,65 та 37,1 хвилин, імплантують до центральної нервової системи відповідали часу утримання серотоніну та 5реципієнта Клітини можуть бути шкапсульованими пдроксишдолоцтової кислоти, продукту розкладу до мембран, які є непроникними для антитіл серотоніну, ВІДПОВІДНО Це було підтверджено реципієнту імунопстохімічним забарвленням клітин SVG-TH на серотонін У деяких варіантах втілення цього винаходу, клітини можуть бути трансфектовані ПОСЛІДОВНІСТЮ Фіг 15 - електронна мікрофотографія клітин нуклеїнової кислоти, яка кодує пептид Пептидами, SVG-TH взагалі, будуть ферменти, наприклад, Фіг 16А - імунопстохімічне забарвлення клітин тирозшпдроксилаза, або фактори росту, співкультивування hNT/SVG-TH, приблизно, через наприклад, фактор росту нервової тканини 72 години Невеликі плоскі окремі клітини - клітини Пептидом може також бути антиген, який SVG-TH асоціюється з хворобою Клітини можна На фіг 16В представлено імунопстохімічне імплантувати з метою лікування або профілактики забарвлення клітин співкультивування PC12/SVGУ деяких випадках клітини можна видаляти після ТН, приблизно, через 92 години Поблизу центру імплантування фотографії представлено клітину РС12 з нейтронними відростками, які протягуються від неї У додаткових варіантах втілення, цей винахід до клітин SVG-TH, які знаходяться поблизу надає іморталізовану ЛІНІЮ КЛІТИН нервової Подібні результати було одержано також для тканини людського плода, до складу якої входить клітин SVG ПОСЛІДОВНІСТЬ гетеролопчної нуклеїнової кислоти, де клітинна ЛІНІЯ здатна експресувати Фіг 17 - крива розподілу КІЛЬКОСТІ ТНПОСЛІДОВНІСТЬ гетеролопчної нуклеїнової кислоти позитивних клітин для допамшерпчних клітин, які Особливо переважні лінії клітин, здатні до було висіяно з розрахунку 100000 клітин на камеру експресування нуклеїнової кислоти, яка кодує Костара з/без співкультури SVG Показана тирозшпдроксилазу У більш переважних аспектах, КІЛЬКІСТЬ ТН-позитивних клітин середнього мозку КЛІТИННІ лінії цього винаходу здатні до пацюків, яка залишилась на камеру Костара(вісь експресування серотоніну Y), коли ці клітини було співкультивовано впродовж 96 годин у відсутності/присутності клітин У спорідненому варіанті втілення, цей винахід SVG Співкультивування з клітинами SVG-TH дало надає композицію, придатну для ідентичні результати трансплантування, до складу якої входять КЛІТИННІ У додаток до небезпеки утворення пухлин, трансплантати генетично неспоріднених клітин також несуть загрозу імунологічного відторгнення трансплантату та штрацеребрального запалення Віднер (Widner) та Брандін (Brundin), Brain Res Rev, 13 287 - 324 (1988) Усі трансплантати генетично неспоріднених клітин несуть цю небезпеку Таким чином, пацієнти, ліковані штрацеребральним клітинним трансплантуванням, потребують довгострокової підтримуючої імуносупресивної терапії, яка, навіть при відсутності трансплантованих іморталізованих клітин, несе високу небезпеку інфекційних та злоякісних ускладнень Трансплантування іморталізованих клітин тільки підвищує небезпеку цих ускладнень 61058 8 системи Такі пептиди можуть бути природними нейропептидами, білками або ферментами, або можуть бути ферментами пептиду або білку, які мають терапевтичну активність у межах центральної нервової системи До прикладів належать фактори росту нервової тканини та ферменти, які використовують для каталізування важливих неирохімікатів або їх проміжних речовин У особливо переважних аспектах, клітини трансфектують нуклеїновою кислотою, яка кодує тирозшпдроксилазу Тирозшпдроксилаза є ферментом, який перетворює тирозин на L-ДОФА, що є також етапом обмеження швидкості у продукуванні допамшу Таким чином, експресування тирозшпдроксилази Фігури 19, 20 та 21 - розвиток у часі поліпшення показників неповноцінності при імплантованими клітинами дозволяє цим клітинам хворобі Паркінсона при трансплантуванні клітин продукувати та секретувати допамін Таким чином, SVG-TH до хвостатого ядра та смугастого тіла у додаток до стимулювання регенерування макак-резус(Н002, Н005 та Т022), яким вводили нейронів, імплантовані клітини можуть МРТР з метою індукування симптомів хвороби підвищувати концентрацію допамшу у чорній Паркінсону речовині та обмежувати або інверсувати ефект втрати допамінерпчних нейронів Опис конкретного варіанту втілення Цей винахід, у цілому, має відношення до Методи цього винаходу можна також іморталізованих ЛІНІЙ КЛІТИН ЛЮДСЬКОГО плода, використовувати для лікування інших одержаних з клітин центральної нервової системи, неврологічних захворювань, наприклад, хореї та методів використання цих ЛІНІЙ КЛІТИН ДО Гентінгтона, хвороби Альцгеймера або розсіяного лікування розладів центральної нервової системи склерозу Оскільки іморталізовані клітини нервової Зокрема, лінії клітин та методи цього винаходу тканини людського плода є сумісними з можна використовувати для лікування розладів, центральною нервовою системою(ЦНС), ці клітини викликаних пошкодженнями центральної нервової можна також тран ефекту вати послідовностями системи, наприклад, паркінсонізму ДНК, які кодують фізіологічно активні пептиди, або імплантувати до ЦНС для здійснення лікування І Методи лікування інших розладів Наприклад, при хореї Гентінгтона За одним з варіантів втілення, цей винахід та боковому аміотрофічному склерозі пептид може надає методи лікування реципієнта, який страждає блокувати збуджуючі нейротрансмітери, захворюванням центральної нервової системи, наприклад, глутамат У разі використання для або полегшення симптомів такого захворювання, лікування розсіяного склерозу, наприклад, пептид шляхом імплантування іморталізованих клітин був би, типово, трофічним стимулятором людського плода, одержаних з клітин центральної утворення МІЄЛІНОВОГО шару, наприклад, фактором нервової системи Після імплантування таких росту, одержаним з тромбоцитів, або циліарним клітин до центральної нервової системи не було трофічним фактором, який може блокувати продемонстровано відторгнення трансплантату, загибель олігодендроцитів Оскільки ці хвороби є інтенсивного інтрацеребрального запалення та більш генерал ізованими, аніж локальні утворення пухлин Далі, було показано, що клітини ушкодження, бажаними були б альтернативні індукують міграцію нейронів та подовження методи імплантування Наприклад, клітини нейритів Цим демонструється, що клітини можливо б було імплантувати на поверхні, яка функціонують з продукуванням трофічних піддається впливу цереброспінальної рідини факторів, які стимулюють нейронні реакції Після експресування та секретування пептид буде Імплантування іморталізованих клітин змиватись з усієї поверхні головного мозку шляхом людського плода, одержаних з клітин центральної природної циркуляції цереброспінальної рідини нервової системи, надає засіб лікування багатьох До придатних для імплантування ділянок захворювань Наприклад, хворобу Паркінсона належать бокові шлуночки, поперекова можна лікувати шляхом імплантування цих клітин оболонкова дільниця та ІНШІ, При хворобі до базальних ядер ураженого реципієнта Трофічні Альцгеймера клітини можна тран ефекту вати для фактори, які продукуються імплантованими продукування фактору росту нервової тканини з клітинами, можуть пригнічувати загибель метою підтримки нейронів базального допамінерпчних нейронів і навіть індукувати діенцефалону, як описано Розенбергом та іншими, регенерацію допамінерпчних нейронів Підвищена Science, 242 1575 - 1578 (1988) (включено до популяція допамінерпчних нейронів може цього опису, як довідкову літературу) забезпечити клінічне поліпшення стану пацієнтів, які страждають паркінсонізмом Методи цього винаходу можуть також використовуватись для лікування реципієнтів У додаткових варіантах втілення, імплантовані шляхом імплантування клітин до клітини можуть трансфектуватись нуклеїновою екстраневральних центрів Цей варіант втілення кислотою, яка кодує неврологічно ВІДПОВІДНИЙ цього винаходу є особливо придатним для поліпептид Термін "неврологічне ВІДПОВІДНИЙ профілактичного лікування реципієнту пептид", загалом, означає пептид або білок, який Іморталізовані клітини нервової тканини людського каталізує реакцію у тканинах центральної нервової Фіг 18 - вплив трансплантування SVG-TH на щурячі моделі паркінсонізму Функційний дефіцит зазначено КІЛЬКІСТЮ обертів впродовж години у пацюків-моделей Вказана КІЛЬКІСТЬ обертів/годину після введення пацюкам апоморфіну, перед та через 4 тижня після трансплантування клітин SVGTH до ушкодженого смугастого тіла пацюків(представлено у вигляді темних квадратів, темних ромбів, світлих квадратів, світлих ромбів та темних квадратів зі світлою крапкою) Представлено також результати двох трансплантувань SVG(y вигляді темних трикутників та світлих квадратів з темною крапкою) 61058 10 хороідального сплетіння та ІНШІ Утворення іморталізованих ЛІНІЙ КЛІТИН плода може, загалом, здійснюватись ВІДПОВІДНО ДО наступних процедур Фетальні клітини можуть збиратись після елективного аборту Жінок, які абортують плоди, піддають, звичайно, серологічній перевірці на різноманітні інфекційні хвороби, у тому числі, на вірус імунодефіциту людини, вірус гепатиту В, вірус гепатиту С, цитомегаловірус та герпесвіруси типів 1 та 2, Плоди, звичайно, мають внутрішньоутробний вік, який дорівнює 9 - 1 1 тижням(7 - 9 тижнів після зачаття) Вік плода може бути підтверджено ультразвуковою перевіркою Плоди можуть екстрагуватись з ультразвуковим контролем напрямку з метою зведення травми головного мозку плода до мінімального рівня Після екстрагування головний мозок плода ідентифікують та видаляють з абортплода Клітини можна виготовляти наступним чином Тканина головного мозку аспірується за допомогою голки №19 і ДВІЧІ промивається у мінімальному есенціальному середовищі Іглу (Е-МЕМ, компанія Gibco, Нью-Йорк, шт Нью-Йорк) Клітини висівають на культуральні чашки, які було оброблено ПОЛІ-О-ЛІЗИНОМ(0,1МГ/МЛ вподовж 5 хвилин) Клітини вирощують на Е-МЕМ, доповненому 20% сироватки зародку великої Методами цього винаходу можна лікувати рогатої худоби, 75мкг/мл стрептоміцину, широке розмаїття хвороб та синдромів Взагалі, 75одиницями/мл стрептоміцину, 75одиницями/мл хворобою буде неврологічна хвороба, наприклад, пеніциліну, 2%декстрози та 2мкг/мл паркшсонізм(з включенням хвороби Паркінсону), фунпзону(компанія Gibco) Перед іморталізацією хвороба Альцгеймера, хорея Гентінгтону, клітини інкубують при 37°С у зволоженому 5% СОг розсіяний склероз, боковий амютрофічний середовищі Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що склероз, хвороба Гоше, хвороба Тея-Сакса, для виготовлення клітин можна також невропати, пухлини головного мозку та ІНШІ використовувати ІНШІ методи Методи цього винаходу можуть також бути використаними для лікування хвороб, окрім Клітини, призначені для імплантування неврологічних Наприклад, методи цього винаходу методами цього винаходу, можна іморталізувати можна використовувати для імунізування різними способами У типовому випадку клітини реципієнтів проти інфекційних хвороб, наприклад, іморталізують наступним чином КЛІТИННІ культури, вірусних, бактерійних, протозойних та інших, як звичайно, продукують попередників нейронних та описано перед тим Іморталізовані клітини гліальних клітин, а також нейронів, як описано нервової тканини людського плода можуть бути Меджором та Ваканте (Vacante), J Neuropath And трансфектовані ДНК, яка кодує фізіологічно Exp Neurol, 48 425 - 436 (1989) (включено до активні пептиди або пептиди, до складу яких цього опису, як довідкову літературу) При входять імунологічні епітопи Методи цього регулярній "підкормці", клітини головного мозку винаходу можна використовувати для виживають впродовж декількох МІСЯЦІВ, однак з імплантування клітин, які продукують пептиди, та незначною пролітерацією Клітини трансформують забезпечити безперервне in vivo постачання трансфекцією делеційного мутанту SV40(Bipyc реципієнта пептидами інших типів, наприклад, мавп 40) Мутантна ДНК позбавлена сайту гормоном росту ініціювання реплікацм(оп-) і не може розмножуватись Трансфекція ДНК, однак, II Ліни КЛІТИН трансформує клітини до необмеженого потенціалу А Загальна інформація росту, як описано Глузманом (Gluzman), Cell, 23 З метою здійснення вищезгаданих методів 175 - 182 (1981) Після культивування культур лікування, цей винахіднадає також лінії клітин, фетальних клітин впродовж, 3 тижнів, клітини придатні для трансплантування реципієнту або можуть бути трансфектовані ЮОмкг/колбу пацієнту плазмідної ДНК (рМК16), до складу якої входить Взагалі, клітини, які імплантують методами SV40 оп-мутант, за допомогою методу цього винаходу, є іморталізованими клітинами кальційфосфатного преципітування, як описано нервової тканини людського плода Під "нервовою Грехемом (Graham) та ІНШІ, ViroL, 52 456 - 457 тканиною" розуміється, що перед іморталізацією (1973) У альтернативному варіанті, клітини клітини мали фенотип неврологічних клітин або можуть бути трансфектовані електропорацією або були ембріональними клітинами, призначеними до іншим добре відомим способом, як описано у книзі диференціювання до типу неврологічних клітин, Самбрука (Sambrook) та інших, Molecular Cloning, До типів неврологічних клітин належать нейрони, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, астроцити, олігодендроцити, епітеліальні клітини плода можуть бути трансфектовані ДНК, яка кодує антиген, пов'язаний з хворобою, наприклад, поліпептиди др120 ВІЛ, як описано у патенті США №5166050 Ці КЛІТИНИ можуть потім експресувати та секретувати антиген, закодований трансфектованою ДНК Антиген може безперервно секретуватись імплантованими клітинами та викликати сильну імунну реакцію Після ВІДПОВІДНОГО часового інтервалу до повної імунізації реципієнту, клітини можуть бути видалені Як використано у цьому описі, вираз "лікування реципієнта" означає профілактичне, паліативне або лікувальне втручання до хворобливого процесу Таким чином, термін "лікування", який використано у цьому описі, означає, у типовому випадку, терапевтичні методи зниження або ліквідування симптомів певного розладу, для якого призначено це лікування Термін "реципієнт", який використано у цьому описі, означає, взагалі, будь-якого теплокровного ссавця, наприклад, людину, людиноподібних приматів, гризунів та інших, який повинен бути реципієнтом певного лікування У типовому випадку, терміни "реципієнт" та "пацієнт" використовуються у цьому описі взаємозамінно і означають людину 12 11 61058 1988(включено до цього опису, як довідкову фізрозчині, забуференому фосфатом Густина літературу) Після трансфекцм культури клітин, звичайно, складає біля 104 - 107клітин/мл культивують з щотижневою "підкормкою" Через Перед імплантуванням клітинну суспензію м'яко декілька тижнів явною стає проліферація струшують Об'єм клітинної суспензії, призначеної гліальних клітин на окремих ділянках чашок до імплантування, змінюється в залежності від Клітини ПІСЛЯ ЦЬОГО піддають трипсинізацм(0,025%) місця імплантування, мети лікування та густини і переносять до нових культур Трансформовані клітин у розчині У типовому випадку, КІЛЬКІСТЬ клітини можна ідентифікувати пробами на КЛІТИН, трансплантована пацієнтові або флуоресцуючі антитіла з метою виявлення SV40 реципієнтові, буде складати "терапевтично Т-білку, який експресується трансформованими ефективну КІЛЬКІСТЬ" Термін "терапевтично клітинами(Фіг 2) Клітини пересівають кожні 10 ефективна КІЛЬКІСТЬ", ЯКИЙ використано у цьому днів, доки не виявляється зростання КІЛЬКОСТІ Тописі, означає КІЛЬКІСТЬ трансплантованих клітин, білок-позитивних клітин необхідну для здійснення лікування певної хвороби, для якої підшукують метод лікування Трансформовані клітини демонструють Наприклад, у разі лікування паркінсонізму, фенотип стабільної клітинної лінії Зокрема, наслідком трансплантування терапевтично клітини ростуть до високої максимальної густини ефективної КІЛЬКОСТІ клітин, буде зниження обсягу популяції з 18 годинним часом генерації Клітини, та/або тяжкості симптомів, пов'язаних з цією однак, не демонструють трансформованого хворобою, наприклад, ригідності, акінезії та фенотипу або вільного росту, що є характерно для розладів ходи У процесі лікування паркінсонізму, немутантних SV40 трансформованих клітин під час кожного впорскування, буде вводитись від Морфологія клітин також залишається незмінною 5 до бОмкл клітинної суспензії для досягнення цієї впродовж встановлення клітинної лінії Фокуси ефективної КІЛЬКОСТІ Фахівцю зрозуміло, яким клітин, як правило, не виявляється До особливо чином визначати ВІДПОВІДНІ КЛІТИННІ ДОЗИ придатних належать клітини з клітинної лінії SVG, депозитованої у Американській колекції типових У альтернативних переважних варіантах культур, Роквіл, шт Меріленд(АТСС CRL 8621), втілення цього винаходу, клітини, придатні для яку описано у патенті США №4707448(включено трансплантування, можуть бути трансфектовані і до цього опису, як довідкову літературу)(Фіг 1) здатні до експресування ПОСЛІДОВНОСТІ Далі під "Клітинами SVG" або клітинною ЛІНІЄЮ гетеролопчної нуклеїнової кислоти, яка кодує SVG" розуміють клітини або ЛІНІЮ КЛІТИН, одержану неврологічно ВІДПОВІДНИЙ пептид Термін з клітинної лінії АТСС CRL 8621 Під похідними "гетероциклічна", який використовують у цьому розуміють субклон, реплікацію або генетично описі для описання нуклеїнової кислоти, означає, змінений мутант клітинної лінії А Т С С CRL 8621 взагалі, ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка, у цілому, у КЛІТИННІЙ У альтернативному варіанті, клітини можна іморталізувати іншими способами, добре відомими у цій галузі Наприклад, може використовуватись іморталізація за допомогою вірусу ЕпштейнаБарра, як описано у патенті США №4464465 (включений до цього опису, як довідкова література) Особливо придатними є мутанти вірусу Епштейна-Барра, позбавлені сайтів ініціювання реплікації ОпР OnLyt Іншим придатним методом іморталізацм є надекспресування клітинного гену регулювання росту, наприклад, С-тус, як описано Бартлеттом (Bartlrtt) та іншими, Proc Natl Acad Sei USA, 85 3255 - 3259 (1988)(включено до цього опису, як довідкова література) Взагалі, трансформовані клітини, придатні для імплантування, будуть демонструвати клітинний ріст на "якірній" ПІДЛОЖЦІ, не будуть рости у м'якому агарі і у них не буде спостерігатись утворення фокусів Після ЦЬОГО можна визначати гістологічне походження трансформованих клітин Характерно те, що астрогліальні клітини можна розпізнавати за наявністю проміжного філаменту, до складу якого входить гліальний фібрилярний кислотний 6inoK(GFAP) Олігодендрогліальні клітини, з другого боку, є мієлін-продукуючими клітинами і можуть ідентифікуватись за їх синтезуванням галактоцереброзиду, gal C, що є складовою частиною мієліну Після трансформування, клітини готують до імплантування Клітини суспендують у фізіологічно сумісному носи, наприклад, середовищі для культивування клітин (наприклад - Е-МЕМ) або у ЛІНІЇ, трансфектованій цією ПОСЛІДОВНІСТЮ, у натуральному вигляді не зустрічається Таким чином, гетеролопчна ПОСЛІДОВНІСТЬ може включати сегмент, який є цілковито стороннім для цієї клітинної лінії, або навпаки, може включати нативний сегмент, який включається до клітинної лінії не нативним чином, наприклад, зв'язуванням з ненативною промоторною/енхансерною ПОСЛІДОВНІСТЮ, зв'язуванням з ненативним промотором, який, звичайно, не пов'язується з сегментом, або наданням у вигляді множинних копій там, де клітинна ЛІНІЯ, звичайно, надає одну копію, або не надає їх зовсім Загалом, ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти буде у робочому порядку зв'язана з транскрипційним промотором та транскрипційним термінатором Сегмент ДНК є зв'язаним у робочому порядку тоді, коли він знаходиться у функціональному зв'язку з іншим сегментом Наприклад, промотор або енхансер знаходиться зв'язаним у робочому порядку з кодуючою ПОСЛІДОВНІСТЮ, якщо він стимулює транскрипцію ПОСЛІДОВНОСТІ, ДНК для сигнальної ПОСЛІДОВНОСТІ Є зв'язана у робочому порядку з ДНК, яка кодує поліпептид, якщо вона експресується, як передбілок, який приймає участь у секретуванні поліпептиду Загалом ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, зв'язані у робочому порядку, є суміжними, а, у разі сигнальної ПОСЛІДОВНОСТІ, як суміжними, так і на етапі зчитування Енхансерам, однак, не обов'язково бути суміжними з кодуючими послідовностями, транскрипцію яких вони контролюють Зв'язування здійснюється 14 13 61058 змиванням на придатних сайтах рестрикції або на Внаслідок їх здатності до стимулювання адаптерах чи лінкерах, вставлених на місце нейрорегенерацм та продукування і секретування останніх ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК може також бути допаміну, КЛІТИННІ лінії цього винаходу особливо зв'язаною з транскрипційним енхансером придатні для лікування захворювань центральної Експресування ДНК у імплантованих клітинах нервової системи, які пов'язані з втратою може бути конститутивним або індукованим РІЗНІ допамінерпчних клітин у ЦНС реципієнта, вектори експреси, які мають такі характеристики, наприклад, паркінсонізму Подиву гідне, але було можуть переноситись ДНК для трансфекцм клітин, також відкрито, що КЛІТИННІ ЛІНІЇ ЦЬОГО винаходу наприклад, плазмідні вектори рТК2, рНуд та здатні також продукувати додаткові pRSVneo, вектори на основі вірусу мавп 40, нейротрансмітери У особливо переважному вектори на основі папіломавірусу великої рогатої варіанті втілення, наприклад, КЛІТИННІ ЛІНІЇ ЦЬОГО худоби або вектори на основі вірусу Епштейнавинаходу здатні також до експресування Барра, як описано у книзі Самбрука та інших, серотоніну Гадають, що серотонін причетний до Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring клінічної депресії у людей Зокрема, було Harbor Press, 1988(раніш включена до цього встановлено, що підвищені рівні серотоніну у опису, як довідкова література) Вектори можуть тканинах центральної нервової системи вводитись до клітин стандартними методами, полегшують симптоми депресії і утворюють основу наприклад, електропорацією, кальційфосфатцілого ряду антидепресантних лікувальних опосеред кованою трансфекцією, полібреновою засобів, наприклад, Prozac™ КЛІТИННІ ЛІНІЇ ЦЬОГО трансфекцією та іншими винаходу, як такі, можуть бути також особливо придатними у методах лікування захворювань, Пептид, який кодується нуклеїновою кислотою, пов'язаних зі зниженими рівнями серотоніну у може загалом бути безпосередньо терапевтичною ЦНС, наприклад, депресії У типових випадках, ці сполукою, наприклад, інгібітором руху при методи є ті ж самі або, по суті, подібні до методів, лікуванні хореї Гентінгтона У альтернативному які описані тут для лікування інших захворювань варіанті, пептид, закодований нуклеїновою нервової системи кислотою, може обиратись для доповнення або заміщення недостатнього продукування пептиду Для потерпаючих на паркінсонізм КЛІТИННІ ЛІНІЇ ендогенною тканиною реципієнту, де ця цього винаходу, таким чином, мають подвійну недостатність є причиною симптомів конкретного привабливість, оскільки полегшують симптоми захворювання У цьому випадку КЛІТИННІ ЛІНІЇ хвороби шляхом секретування допаміну та ДІЮТЬ, як штучне джерело пептиду У нейрорегенерацм, а також лікують депресію, альтернативному варіанті, пептид може бути пов'язану з цією хворобою, шляхом секретування ферментом, який каталізує продукування серотоніну терапевтичних або неврологічно ВІДПОВІДНИХ III Імплантування клітинних ЛІНІЙ сполук І, знову таки, такі сполуки можуть бути Клітини КЛІТИННИХ ЛІНІЙ ЦЬОГО винаходу, у екзогенними відносно системи реципієнту, або це типовому випадку, можуть бути імплантовані до може бути ендогенна сполука, шлях синтезу якої паренхіми головного мозку, у простір, де був якимось чином порушений У останньому знаходиться цереброспінальна рідина, наприклад, випадку, продукування пептиду у межах ЦНС субарахноідальний простір або шлуночки, або реципієнту забезпечує додаткові шляхи екстраневрально Як використано у цьому описі, продукування сполуки Наприклад, у переважному терміт "екстраневрально" означає ділянки варіанті втілення, іморталізовані лінії клітин реципієнта, які знаходяться за межами нервової тканини людського плода трансфектують центральної нервової системи або периферійної нуклеїнової кислотою, яка кодує фермент нервової тканини, наприклад, черевний ганглій тирозшпдроксилазу Тирозшпдроксилаза каталізує або сідничний нерв "Екстраневральні" ділянки синтез допаміну з тирозину Було можуть включати периферійні нерви Термін продемонстровано, що допамін відіграє ефективну "центральна нервова система" охоплює всі роль при лікуванні паркінсонізму структури у межах твердої мозкової оболонки У особливо переважних аспектах, іморталізовані лінії клітин нервової тканини людського плода, трансфектовані нуклеїновою кислотою, яка кодує тирозшпдроксилазу, будуть ЛІНІЄЮ клітин SVG, тобто похідними лінії клітин SVG, депозитованої у Американській колекції типових культур(АТСС CRL 8621), описаної у патенті США №4707448(включено до цього опису, як довідкова література)(Фіг 1) Такі лінії клітин називаються у цьому описі клітинними ЛІНІЯМИ SVG-TH У ще більш переважних аспектах, клітинна ЛІНІЯ SVG трансфектується плазмідою phTH/Neo Нуклеїнова кислота може також кодувати трофічний фактор, наприклад, фактор росту нервової тканини, фактор пригнічення росту або цитокін, придатний для лікування пухлин головного мозку У разі імплантування клітин до головного мозку, стереотаксичні методи використовують, у цілому, як описано Лекселом (Leksell) та Иєрнбергом (Jernberg), Acta Neurochir , 5 2 1 - 7 (1980) та Лекселом та іншими, J Neurosurg , 66 626 - 629 (1987) (включено до цього опису, як довідкова література) Визначення місцезнаходження цільових ділянок включає, як правило, проведення передімплантаційної ЯМРтомографм, як описано Лекселом та іншими, J Neurol Neurosurg Psychiatry 48 1 4 - 1 8 (1985) (включено до цього опису, як довідкову літературу) Координати ЦІЛІ визначаються за даними передімплантаційної ЯМР-томографм Перед імплантуванням життєздатність клітин може оцінюватись, як описано Брандіном (Brundm) та іншими, Brain Res, 331 251 - 259 (1985)(включено до цього опису, як довідкову 16 15 61058 літературу) Стисло, аліквоти клітинної суспензм(1 конкретних випадків, легко підібрати найбільш - 4мкл) змішують на предметному склі з Юмкл ВІДПОВІДНИЙ метод імплантування клітин суміші акридину оранжевого та етидія Клітини перед імплантуванням, можуть бути броміду(3,4мкг/мл кожного компоненту у 0,9% шкапсульованими до мембран Інкапсулювання фізрозчині, компанія Sigma) Суспензію забезпечує перепону для імунної системи переносять до гемоцитометру, живі та неживі реципієнту та пригнічує відторгнення клітини підраховують за допомогою трансплантату і запалення Може флуоресцентного мікроскопу з освітленням на використовуватись декілька методів непрозорій ПІДЛОЖЦІ при 390нм у поєднанні з інкапсулювання клітин У деяких випадках може трансмісивним освітленням білим світлом з метою провадитись індивідуальне Інкапсулювання клітин візуалізування сітки рахункової камери Акридин У інших випадках однією мембраною може бути оранжевий забарвлює живі ядра у зелений колір, у шкапсульовано багато клітин Коли клітини будуть той час, як етидія бромід проникає до мертвих видалятися після імплантування, відносно великий клітин, наслідком чого є оранжево-червона розмір структури, яка шкапсулює багато клітин у флуоресценція КЛІТИННІ суспензії, як правило, межах однієї мембрани, забезпечує зручний засіб більш ніж на 98% складаються з живих клітин видалення імплантованих клітин У цій галузі відомо декілька методів інкапсулювання клітин, Впорскування, звичайно, здійснюють наприклад, описані у публікації Європатенту стерилізованими Юмкл гамільтонівськими №301777 або Патентах США №№4353888, шприцами з голками - №23 - 27 Шприц, 4744933, 4749620, 4814274, 5084350 або 5089272, заповнений клітинами, закріплюють кожний з яких включено до цього опису, як безпосередньо у головній частині стереотаксичної довідкову літературу рамки Впорскувальну голку опускають до попередньо визначених координат через невеликі Один з методів інкапсулювання клітин має трепанаційні отвори у черепі, 40 - 50мкл суспензії наступний вигляд Трансформовані клітини вводять зі швидкістю, приблизно, 1 - 2мкл/хвилину, змішують з альгінатом натрію(поліанюнний втримують голку впродовж 2 - 5 хвилин з метою екстракт морських водоростей) та вносять до дифундування, потім її повільно виймають Часто розчину дівалентних катіонів, наприклад, хлориду роблять два окремі відкладення під час одного кальцію, який утворює комплекс з альгінатом проникнення голки з 1 - Змм розривом по глибині, натрію з утворенням гелю, наслідком чого є під час проведення однієї операції легко може утворення драглистих зерен або краплин, у яких бути зроблено до 5 відкладень, розсіяних по усій знаходяться клітини Драглисті зерна інкубують з ЦІЛЬОВІЙ ДІЛЯНЦІ Впорскування може поліамшокислотою великої молекулярної маси(60 здійснюватись вручну або за допомогою - 500 х 103), наприклад, ПОЛІ-І_-ЛІЗИНОМ(РІ_І_) у інфузійного насосу На завершення хірургічного концентрацм(0,03 - 0,1% у відношенні маси до втручання, після виймання голки, реципієнта об'єму) на протязі короткого періоду часу(3 - 20 видаляють з рамки і рану зашивають хвилин) з утворенням мембрани Внутрішня порожнина утвореної капсули знову Профілактично, за необхідністю, може бути перетворюється на рідину шляхом обробки проведена імуносупресивна або цитратом натрію Одиночна мембрана навкруги антибютикотерапія клітини має високу проникливість(обмежена смуга Для лікування більш генералізованих пропускання молекулярної маси 200 - 400 х 103) неврологічних захворювань, клітини можна Одиночну мембранну капсулу, яка включає тран ефекту вати для експресування терапевтичної клітину, інкубують у фізрозчині впродовж 1 - З сполуки та імплантувати до шлуночків або годин для того, щоб дати можливість захопленому люмбальної оболонки У міру того, як альгінату натрію дифундувати з капсули та терапевтична сполука секретується клітинами, розтягти и до стану рівноваги Утворена природна циркуляція цереброспінальної рідини безальпнатна капсула вступає до реакції з змиває згадану терапевтичну сполуку і переносить поліамшокислотою низької молекулярної маси(10 и по всій центральній нервовій системі, 3 виступаючи, як засіб генералізованого лікування ЗО х 10 ), наприклад, PLL або Імплантування до шлуночків може здійснюватись хітозаном(деацетильований хітин, молекулярна 3 відкритим способом, наприклад, як описано маса 240 х 10 ), з утворенням, внаслідок взаємодії, Мадразо (Madrazo) та іншими, New Engl J Med , мембрани з меншою проникливістю(обмежена 316 831 - 834 (1987) або Пенном (Репп) та смуга пропускання молекулярної маси 40 - 80 х іншими, Neurosurgery, 22 999 - 1004 (1988)(обидві 10) Після ЦЬОГО КЛІТИНИ, шкапсульовані до включено до цього опису, як довідкову літературу) подвійної мембрани, культивують у Е-МЕМ Імплантування клітин до люмбарної оболонки впродовж 2 - 3 тижнів, як описано перед тим найкраще здійснювати за допомогою стандартних Незважаючи на те, що посилання робилось методів, подібних до інсталяції радіографічних конкретно на зерна альгінату натрію, досвідченому контрастних речовин або протипухлинних фахівцю у цій галузі зрозуміло, що можна лікарських засобів пункцією використовувати будь-яку нетоксичну водорозчинну речовину, яку можна перетворювати У деяких випадках може виникнути на гель з утворенням маси, яка зберігає форму у необхідність імплантування клітин середовищі, у якому вона опиняється, шляхом екстраневрально у ВІДПОВІДНОСТІ ДО ЦЬОГО зміни умов До таких гелеутворюючих матеріалів винаходу Клітини можна імплантувати належить декілька ХІМІЧНИХ сполук, які легко черезшкірно за допомогою голки або ендоскопу, іонізуються з утворенням аніонних або катіонних або ж відкритим способом Фахівцям, у кожному з 18 17 61058 груп, завдяки чому поверхневі шари можуть шприци з голками №23 На правій стороні структуризуватися з утворенням постійної головного мозку було трасплантовано клітини мембрани під дією протилежно заряджених SVG За допомогою шприців у лушпині було полімерів БІЛЬШІСТЬ полісахарид НИХ СМОЛ, ЯК зроблено два відкладення Одне відкладення було природних, так і синтетичних, можна здійснено у латеральній лушпині, друге - у структуризувати за допомогою полімерів, до медіальній лушпині Голки заглиблювали на 18мм складу яких входять позитивно заряджені від кори головного мозку, після чого, за допомогою реакційні групи, наприклад, аміногрупи До мікроін'єктору компанії Kopf, імплантували Юмкл структуризуючих бюсумісних полімерів, які можуть клітинної суспензії Після першого імплантування реагувати зі смолоподібним альгінатом натрію, голку виймали на Змм зі швидкістю 1мм/хвилину, належать ПОЛІЛІЗИН та ІНШІ поліамшокислоти після чого здійснили друге впорскування Юмкл Ступінь проникливості утвореної мембрани може клітинної суспензії Після другого впорскування регулюватись старанним підбором голку видаляли зі швидкістю 1мм/хвилину Другу імплантацію було здійснено до протилежної поліамшокислоти, яка має потрібну молекулярну лушпини з такими ж координатами та таким же масу Переважним полімерним матеріалом є PLL, самим способом до інших належать хітозан та поліакрилат Молекулярна маса, у типовому випадку, Після впорскування до лушпини, ту ж саму коливається, приблизно, від 104до 106 клітинну суспензію було імплантовано до хвостатого ядра Було здійснено два впорскування Цей винахід далі ілюструється наступними - латерально та медіально Глибини впорскування прикладами Ці приклади призначені просто для складала 15мм, було імплантовано Юмкл Шприц ілюстрування аспектів цього винаходу, а не для вийняли на Змм(зі швидкістю 1мм/хвилину), після його обмеження чого було здійснено друге впорскування Юмкл Приклад І - Виготовлення клітин SVG клітинної суспензії До лушпини було У цьому прикладі описано виготовлення клітин трансплантовано нетрансфектовані клітини SVG, SVG(ATCC CRL 8621) для імплантування макакамдо хвостатого ядра було імплантовано клітини резус Клітини перевіряли на інфікованість SVG, трансфектовані геном тирозшпдроксилази мікоплазмами, ВІЛ-1, вірусом гепатиту В, вірусом Концентрація клітин складала 2x10 6 клітин/мл SV40, вірусом простого герпесу, цитомегавірусом та вірусом JC 2 На додаток до використання шприців з голками для здійснення імплантування, були Клітини SVG культивували до злиття Клітини сконструйовані канюлі з гнучкими пластиковими росли на "якірній" ПІДЛОЖЦІ Утворення центрів не трубками, до яких приєднувались голки №22 До спостерігалось, клітини мали гомогенну трубок, за допомогою сполучників з нульовим морфологію Клітини видаляли з культуральних мертвим об'ємом, підключали туберкул инові чашок шляхом обробки розчином 0,05% трипсину шприци(1см3) Голки, після заглиблення до у 0,01 М ЕДТФ(буфер Версена) у збалансованому цільових ділянок, перед початком інфузм фізрозчині Хенкса Клітини збирали витримували у такому стані впродовж 15 хвилин центрифугуванням, тричі промивали і Після ЦЬОГО включали інфузійний насос(компанія ресуспендували у фізрозчині, забуференому Harvard) на подачу 0,2мкл/хвилину Після інфузм фосфатом Кінцева густина клітин дорівнювала впродовж 15 хвилин з подачею 0,2мкл/хвилину, 106клітин/мл Суспензію клітин зберігали при 4°С швидкість подачі підвищували до 0,4мкл/хвилину і до трансплантування підтримували на цьому рівні впродовж 100 хвилин Приклад 2 - Імплантування клітин SVG Після завершення інфузм голки, до виймання, У цьому прикладі описано імплантування залишали на МІСЦІ впродовж ЗО хвилин Після клітин SVG до базальних ядер 6 макак-резусів завершення цього періоду голки дуже повільно Імплантацію було здійснено стереотаксичними видаляли з головного мозку методами без хірургічних ускладнень Тварин спочатку анестезували кетаміном, під час хірургічного втручання анестезування забезпечували за допомогою газоподібного ізофлюорина Тварин вміщували до стереотаксичної рами(компанія Kopf) і за допомогою стереотаксичних координат встановлювали позначки для імплантування Для проведення серединної лінії було оголено верхній сагітальний синус Позначки наносили на череп(хвостате ядро та лушпина) з обох боків Координати було визначено таким чином передньозадні - +24мм перед 0, бокові координати - 5мм від середньої лінії для хвостатого ядра та 10мм від середньої лінії для лушпини Було зроблено 5 трепанаційних отворів Один - над верхнім сагітальним синусом, два - над хвостатим ядром, два - над лушпинами Було використано два різних способи імплантування 1 Було використано Юмкл гамільтонівські шприци з голками №26 або 25мкл гамільтонівські Рану промивали, потім шари закривали у анатомічній ПОСЛІДОВНОСТІ Тварин пробуджували з анестезування і переводили до їх клітин через 20 хвилин після хірургічного втручання Приклад 3 - Приживлення клітин SVG-y мавп Цей приклад демонструє вдале приживлення імплантованих клітин SVG у двох мавп, яких було забито через місяць після імплантування Трансплантовані клітини були ГІСТОЛОГІЧНО здоровими Ознаки запалення або утворення пухлин були відсутні Мозкову тканину на ДІЛЯНЦІ імплантувань перевіряли наступним чином Для гістопатологічних досліджень тварин забивали передозуванням пентобарбіталу(460мг, внутрішньовенно) Перфузію здійснювали через висхідну аорту за допомогою 15мл льодяного фізрозчину, забуференого фосфатом(РВЗ), потім 10% формаліну Головний мозок швидко видаляли, нарізали на 6мм вінцеві шари, 20 19 61058 постфіксували впродовж ЗО хвилин тим же самим цитоплазматичного білку астроцитарної лінії фіксатором Тканинні зрізи промивали впродовж дифенціювання Астроцитарне походження 48 годин у розчині 30% цукрози у PBS, після чого демонструється інтенсивним забарвленням швидко заморожували до -70°С Тканину, за цитоплазми Походження клітин також допомогою крюмікротому, нарізали 40мкм зрізами ілюструється на Фіг 8, яка ясно показує і серії зрізів заливали PBS Зрізи, для проведення імплантовані клітини, пофарбовані анти-Тімунопстохімічних досліджень, обробляли білковим антитілом антитілами проти тирозшпдроксилази (ТИ), GFAP Трансплантовані клітини у хвостатому ядрі та та Т-білку Зрізи, прилеглі до перевірених на ТНлушпині були живі і легко ідентифікувались анти-ТIR, фарбували за допомогою гематоксиліну та білковим антитілом, як описано перед тим Клітини еозину 3 деяких блоків тканин, у яких знаходився SVG було також ідентифіковано на стінках бокових імплантат, робили 5мкм парафінові зрізи і шлуночків усіх мавп Допамінерпчні нейрони фарбували їх, як описано перед тим демонстрували проростання нейритів у напрямі імплантованих КЛІТИН(ФІГ 10 демонструє ТН Фіг 3 ілюструє слід голки у базальному ядрі нейрон, пофарбований анти-ТН-антитілом у шарі однієї з мавп з невеликим збільшенням При дещо клітин SVG in vivo) Допамінерпчні нейронні тільця сильнішому збільшенні слід голки(Фігури 4 - 5) також були присутні на ДІЛЯНЦІ імплантованих демонструє живі клітини SVG Клітини легко клітин SVG Проростання нейритів та присутність ідентифікуються завдяки великому ядру, до складу нейронних тілець вказують нате, що клітини SVG якого входять численні ядерця, яке демонструють продукували нсйротропні фактори, які визивали клітини SVG in vitro Морфологія імплантованих міграцію нейронів та подовження нейронних клітин вражаюче відрізняється від морфології відростків навколишніх клітин Ідентичні тести було проведено на мавпах, яких було забито через 9 МІСЯЦІВ ПІСЛЯ трансплантування Трансплантати було ідентифіковано і ознаки запалення або утворення пухлин були відсутні, це свідчило про те, що клітини прижились і не відторгались реципієнтом Приклад 4 - Оцінка приживлених клітин SVG за допомогою ЯМР-томографм Цей приклад описує церебральне ЯМРтомографування 4 останніх мавп через місяць після трансплантування Жодна з мавп не мала ознак утворення пухлин Після анестезування мавп вміщували до стандартних рамок для проведення ЯМРтомографування За допомогою магніту(1,5 Тесла, компанія Sigma) було зроблено Ті та Тг зважені томограми без контрасту та Ті зважені томограми з гадолінієм Під час сканування ознак утворення пухлин або вузлів виявлено не було(Фіг 9) Приклад 5 Цей приклад демонструє функціонування трансплантованих клітин SVG у ЦНС Нейтрони реципієнта мігрували у напрямі імплантованих клітин, нейронних допамшерпчних тілець, а допамінерпчні відростки реципієнтного походження подовжувались до імплантованих клітин Двох мавп, які одержали клітини SVG, як імплантати, згідно до опису у вищенаведеному Прикладі 2, і які вижили, було забито, як описано Головний мозок видаляли інтактно, як описано перед тим, і секцюнували Кожний зріз вкладали на предметні скельця, вкриті желатином Репрезентативні зрізи фарбували гематоксиліном та еозином для визначення анатомм(Фіг 6) Імплантовані клітини демонстрували характерну морфологію SVG з великими ядрами, до складу яких входили численні ядерця Прилеглі зрізи фарбували або моноклональними антитілами, до GFAP, SV 40 Тбілку, або НТ Після ЦЬОГО зрізи піддавали контрастному фарбуванню з використанням тільки гематоксиліну Фіг 7 ілюструє прилеглий зріз, пофарбований антитілом до GFAP, Жоден зріз не мав ознак запалення, відторгнення трансплантату або утворення пухлин або вузлів Приклад 6 - Інкапсулювання клітин SVG Цей приклад описує індивідуальне інкапсулювання клітин SVG та підготовку клітин до трансплантування Клітини інкапсулюються до гранул альгінату натрію Клітини SVG культивують до злиття на чашках для культивування Клітини видаляли з чашок для культивування за допомогою 0,05% трипсину та 1мм ЕДТФ у PBS Клітини суспендували у PBS, доповненому МдСЬ, СаСЬ, 0,1% глюкози та 5% FBS Клітини збирали центрифугуванням, ДВІЧІ промивали у суспензійному розчині, як описано перед тим, і центрифугували до утворення осаду Клітинний осад, який залишився на дні центрифужного стакану, ресуспендували у 5мл 1,5%(маса/об'єм) розчину альгінату натрію (Keltone LV®, компанія Kelco, Ltd , Чикаго, шт Ілінойс) Альпнатну клітинну суспензію вносили до 50мл 1,5%(маса/об'єм) розчину СаСЬ Сферичні краплини суспензії утворювали за допомогою пневматичного шприц-насосу-краплеутворювача За допомогою цього пристрою суспензія клітин у альгінаті натрію пропускається через голку №22 Ця голка знаходиться у трубі з оболонкою(внутрішній діаметр Змм), через яку проходить струмінь повітря з контрольованою швидкістю(9л/хвилину) При появі краплин рідини на КІНЦІ голки(20см /годину), вони зриваються зрізним зусиллям, яке утворюється швидкоплинним струменем повітря Кінець голки знаходиться на відстані 8см від поверхні розчину СаСІ2, завдяки чому утворюються однакові сферичні краплини гелю діаметром, приблизно, 300-100 мікрон Зразок мікрогранул перевіряють на ВІДПОВІДНІСТЬ по розміру та формі за допомогою препарувальної лупи(компанія Wild Heerbrugg, модель М8), обладнаної каліброваним окуляром Гелеві гранули альгінату кальцію, які містять у собі імплантовані клітини, переносили до 50мл пластикового центрифужного стакану з конічним 22 21 61058 дном і промивали розчинами(по 30мл кожного) pRc/RSV, внаслідок чого було утворено плазміду 0,1%(маса/об'єм) СНЕЗ(циклогексил-амшсульфон) pRSV-hTH/Neo Як показано на Фіг 11, до складу та 1,1%(маса/об'єм) СаСЬ Об'єм супернатанту phTH/Neo входить безпосередній ранній промотор після кожного промивання зменшували за CMV, розташований вище за кДНКТН на плазміді, допомогою вакуумного аспіратора Напівпроникна яка наділяє резистентністю до неоміцину До капсульна мембрана утворюється внаслідок с т а д у конструкції на основі pRSV-hTH/Neo реакції гелевих крапель з водним входить RSV LTR, розташований вище за кДНК ТН 0,05%(маса/об'єм) розчином РЩмолекулярна на плазміді, яка наділяє резистентністю до маса PLL = 22000) впродовж 8 хвилин Після неоміцину додавання розчину PLL центрифужний стакан Були підготовлені окремі культури клітин SVG, загвинчували кришкою і вручну струшували кожну з яких було трансфектовано або phTH/Neo, впродовж проходження реакції для запобігання або pRSV-hTH/Neo Після трансфектування злипання капсул Утворені мікрокапсули діаметром клітини культивували у середовищах, до с т а д у 300 - 1000 мікрон промивали розчинами(по ЗОмл яких входив генетицин з розрахунку 500 кожного) 0,1% CHES та 1,1"СаСІ2, а також двома мікрограмів/мл, впродовж 2 МІСЯЦІВ 3 матеріалу, ЗОмл аліквотами ІЗОТОНІЧНОГО фізрозчину трансфсктованого phTH/Neo, було виготовлено 7 Інкапсульованіклітини контактували впродовж 4 тонів, які ПОСТІЙНО демонстрували резистентність хвилин з ЗОмл 0,03% (маса/об'єм) розчину до генетицину Обидва трансфектанти були здатні альгінату контролю до утворення зовнішнього продукувати ТН, однак, з конструкцією на основі шару на капсулах Внутрішній простір мікрокапсул pRSV-hTH/Neo довгострокових стабільних т о н і в перетворювали на рідину шляхом обробки ЗОмл утворити не вдалось внаслідок слабого 0,05 М розчину цитрату натрію впродовж 6 хвилин експресування маркеру резистентності до Мікрокапсули діаметром 400 - 1400 мікрон неоміцину у цієї плазміди На Фіг 12 зображено декілька разів промивали фізрозчином для імуногістохімічне фарбування одного зі стабільних видалення надлишку цитрату, потім розділяли на phTH/Neo трансфектантів на ТН ТН-позитивність п'ять 1мл аліквот Кожну аліквоту шкубували у серед тонів розподілялась у межах ЗО - 60% 10мл середовища ДМЕМ у 25см3 колбі для Один т о н (1В1В), який мав 40 - 60% ТНкультивування при 37°С у ізотермічному ССЬ позитивність, було розмножено і на підтвердження термостаті серії 400(модель 413D, компанія Fisher його імунопстохімічної тотожності було піддано Scientific Co , Непан, Онтаріо) вестерн-блотингу Як зображено на Фіг 13, при проведенні вестерн-блотингу з використанням у Приклад 7 - Обробка клітин SVG методами ролі зонду політональних антитіл до ТН, було генної інженери для експресування виявлено смугу, яка мігрувала, приблизно, на тирозшпдроксилази бОкД, що співпадало з величиною ТН типу 2 Клон Цей приклад описує трансфектування клітин 1В1В у подальшому було позначено, як SVG-TH SVG нуклеїновою кислотою, яка кодує ТН Клітини SVG, які експресували ТН, було ідентифіковано у Супернатант клітинної культури було піддано культурах після трансфектування високоефективному рідинному ЛІНІЮ КЛІТИН SVG було трансфектовано хроматографуванню(НРІ_С) з метою визначення нуклеїновою кислотою, яка кодує фермент ТН присутності біологічно активного ТН у клітинах Плазміда рпТН-63 має кДНК типу 2 для ТН, SVG-TH та секретування L-Дофа цими клітинами тонованої до сайту EcoR1 вектора Bluescnpt KS Перед збиранням супернатанту клітинної культури кДНК ТН було тоновано до двох різних для проведення HPLC аналізу, клітини було евкарютичних векторів експреси, pcDNA/Neo та шкубовано з 1мм бюптерином(ВН4), який є pRCV/Neo(o6nflBa можна отримати від компанії кофактором, необхідним для функціонування ТН Invitrogen, Corp, Сан-Дієго, шт Каліфорнія) До контролю було включено супернатант Фрагмент Hind Ill/Bam H1 phTH-63, до складу якого клітинних культур SVG-TH, які було шкубовано без входить кДНКТН, тонували до сайту Hihdlll/Hindi бюптерину, а також супернатант культур pcDNA/Neo, внаслідок чого було утворено родоначальної лінії клітин SVG, які шкубували як з плазміду phTH/Neo Східним чином, фрагмент бюптерином, так і без нього Результати наведено Hihdlll/Spe1 phTH-63, до с т а д у якого входить у подальшій Таблиці 1 кДНК ТН, тонували до сайту Hihdl I I/Spe1 Таблиця 1 Продукування L-ДОФА у супернатанті культур клітин SVG та SVG-TH, які було шкубовано з та без L-ДОФА Без ВН4 з ВН4(1мкм) Клітини SVG Не виявлено Не виявлено Як показано у Таблиці 1, L-ДОФА не було виявлено ні у родоначальній культурі клітин SVG ні з бюптерином, ні без нього, ні у культурі клітин SVG-TH, яку було шкубовано без бюптерину Однак, коли клітини SVG-TH було шкубовано з бюптерином, до супернатанту клітинної культури Клітини SVG-TH Не виявлено 4 - 6пмоль/мл/хвилину було продуковано, приблизно, 4 - 6пг/мл/хвилину L-ДОФА Цим підтверджується те, що ТН, яку спостерігали при імунопстохімічному аналізі та вестерн-блотингу, була біологічно активною HPLC аналізом супернатанту культури клітин SVG-TH (Фігура 14), незалежно від додавання 23 61058 бюптерину до середовищ, було неочікувано виявлено два ІНШІ значні піки Ці два піки були відсутні у родоначальної лінії клітин SVG За допомогою серії стандартів було визначено, що один з тих двох ПІКІВ представляє серотонін, а другий - 5-пдроксиіндолоцтову кислоту(5-НІАА), яка є продуктом розкладу серотоніну 3 метою підтвердження присутності серотоніну у цих клітинах, їх було піддано імунопстохімічному аналізу з використанням п о л і т о н а л ь н и х антитіл до серотоніну За даними як імунозабарвлення, 24 так і HPLC, клітини SVG-TH були позитивні на серотонін Продукування серотоніну цими клітинними ЛІНІЯМИ є унікальним явищем для клітин гліального походження, оскільки про продукування серотоніну цими клітинами не ПОВІДОМЛЯЛОСЬ Властивості клітин SVG-TH визначали імунопстохімічними методами з використанням тієї ж самої панелі антитіл, яку використовували для визначення властивостей клітин SVG Порівняльні результати наведено у наведеній нижче Таблиці 2 Таблиця 2 SVG + Слабо + + + + Віментин GFAP МНС(головний комплекс пстосумісності) Клас І МНС(головний комплекс пстосумісності) Клас II Тимідин 1 1 Т-білок Серотонін 1-ДОФА(НРІ_С) ІЧЗЕ(неспецифічний фактор супресії) Нейрофіламент Електронним мікроскопіюванням клітин SVGTH було виявлено значне розширення ендоплазматичного ретикулума, відсутнє у родоначальної лінії клітин SVG(irypa 15) Покриті оболонкою заглиблення, мітохондрм та рібосоми знову легко ідентифікувались Приклад 8 - Стимулювання розростання нейритів клітинами SVG-TH Клітини SVG-TH, як і клітини SVG, згадані раніше, також перевіряли на здатність до стимулювання розростання та виживання нейритів з первинних нейронів або нейронних клітинних ЛІНІЙ А Співкультивування клітинної лінії hNT Раніш описану клітинну ЛІНІЮ, одержану з тератокарциноми людини, було використано у експериментах по співкультивуванню клітин SVG та SVG-TH Цю ЛІНІЮ КЛІТИН було одержано з родоначальної лінії тератокарциномних клітин обробкою родоначальної лінії клітин рстиноєвою кислотою та комбінацією антимітотичних речовин Після обробки родоначальна клітинна ЛІНІЯ буде диференціюватись на лінії постмітотичних нейронів Ендрюс П В (Andrews P W ) , Retmoic Acid Induced Neuronal Differentiation of a Cloned Human Embryonal Carcinoma Cell Line In Vitro Dev Biol (1984) 103 285 - 293 Ці клітини, які було названо hNT нейронами і використано у експериментах по співкультивуванню, опис яких наводиться далі, зберігають багато феногалових властивостей нейронів, у тому числі, експресування нейрофіламенту та секретування нейротрансмітерів Підтримка цих клітин потребує того, щоб вони висівались на чашки, покриті ламшіном або матригелем та підкормлювались кондицюнованим середовищами У трьох окремих експериментах клітини SVG, SVG-TH або Cos висівали на планшети з 6 лунками, які не було вкрито ніякими SVG-TH + + + + + + екстрацелюлярними матрицями(1 х 10 клітин на лунку) Через 48 годин після висіву клітин SVG, SVG-TH або Cos, коли рівень їх злиття досяг 30%, у ті ж самі лунки було висіяно 1 х 10 5 клітин hNT Клітини hNT було висіяно також у четверту лунку, яка не мала жодної з вищезгаданих 3 клітинних ЛІНІЙ і яка не була покрита екстрацелюлярною матрицею Культури підкормлювали тільки DМЕМ, яке доповнювали 2% сироватки плода великої рогатої худоби Через 24 години після висіву, деякі клітини hNT прикріплювались на ділянках, на яких не було клітин SVG та SVG-TH, a також прикріплювались безпосередньо до цих клітин КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН hNT та клітин SVG та SVG TH була, приблизно, рівною Клітини hNT, співкультивовані з клітинами SVG та SVG-TH, мали численні невеликі відростки У разі співкультивування клітин hNT та Cos, клітини hNT кріпились безпосередньо до клітин Cos, і були відсутні там, де не було клітин Cos Додатково, лише приблизно, 1 % клітин Cos мав прикріплені до них клітини, hNT і ці клітини hNT відростків не мали На контрольному планшеті, де клітини hNT було висіяно самостійно на необроблену поверхню, прикріпленими виявились тільки деякі з них Через 72 години клітини hNT підняли клітини Cos, на контрольному планшеті клітин hNT виявлено не було У протилежність цьому, клітини hNT, які було співкультивовано з клітинами SVG та SVG-TH, залишались прикріпленими і викинули довгі відростки, які дотикались довколишніх клітин SVG та SVG-TH(0>irypa 16A) Деякі з культур фіксували у ацетоні/метанолі і піддавали імуногістохімічніи перевірці на Т-протеїн для однозначного розрізнення двох клітинних популяцій(Фігура 16А) Ці культури зберігали життєздатність впродовж 2 тижнів, після чого клітини SVG та SVG-TH зливались Співкультури пересівали на нові планшети і знову спостерігали 26 25 61058 те ж саме явище Ще через 2 тижні експерименти наступного однозначною ідентифікацією 5 було припинено трансплантату, 5 х 10 клітин SVG або SVG-TH було трансплантовано до смугастого тіла пацюків В Співкультивування РС12 лінії Sprague Dawley за допомогою У цій серії експериментів клітини РС12 стереотаксичної головної рамки, яку було співкультивували або з клітинами SVG, SVG-TH, використано під час проведення процедури 10 Cos, або висівали самостійно Як і у експерименті тваринам трансплантували клітини SVG і 10 з hNT, клітини SVG, SVG-TH або Cos висівали на 5 SVG-TH Через 3 або 7 днів після планшети з 6 лунками(1 х 10 лунку), не піддаючи трансплантування тварин забивали і головний пластикові планшети НІЯКІЙ обробці Через 48 мозок піддавали обробці для проведення годин клітини РС12 висівали на усі три клітини імуногістохімічного аналізу 5 тварин з обох груп лінії, а також самостійно на необроблений системно піддавали перфузм 4% пластик Через 48 годин співкультивування з параформальдегідом під час забиття Зрізи клітинами SVG або SVG-TH, клітини РС12 були головного мозку тварин, фіксованих прикріплені на ділянках, позбавлених клітин або параформальдегідом, використовували для безпосередньо до клітин SVG та SVG-TH Клітини імуногістохімічного забарвлення поліклопальними РС-12 викинули нейтритні відростки, які через 92 антитілами, у той час, як зрізи нефіксованого години дотикались довколишніх клітин SVG та головного мозку використовували для SVG-TH Деякі з культур фіксували у забарвлення моноклональними антитілами ацетоні/метанолі і піддавали імунопстохімічній Трансплантовані клітини SVG та SVG-TH можна перевірці на Т-протеш для однозначного було однозначно відрізняти від довколишньої розрізнення двох клітинних популяцій(Фігура 16В) паренхіми, виходячи з забарвлення на SV40 ТЧерез 17 днів культури переросли і експеримент білок, який знаходився тільки у трансплантованих було припинено У протилежність цьому, клітини клітинах Більш ТОГО, трансплантовані клітини РС12, які було співкультивовано з клітинами Cos експресували in vivo ті ж самі антигени, що й m або у ізоляції, не викинули ніяких відростків vitro, що підтверджувалось імунопстохімічним У окремій серії експериментів, клітини РС12 забарвленням До них належали віментин, було висіяно самостійно на планшети, покриті серотонін, МНС людини, клас І, Т-білок та ТН noni-d-лізином, після чого їх підкормлювали Подібно тому, що спостерігалось in vitro, тільки некондицюнованими середовищами або 40% клітин SVG-TH було ТН-позитивними in vivo середовищами, кондицюнованими від культур Довколишню паренхіму реципієнта також клітин SVG або SVG-TH Через 72 години у клітин піддавали імунофарбуванню на віментин, а також РС12 на кондицюнованих середовищах розвились на ТН Клітини SVG-TH залишались GFAP-, у той нейтритні виступи, у той час, як у клітин, які час, як довколишня паренхіма реципієнту одержували некондицюновані середовища, однозначно мала GFAP+ астроцити При морфологія залишилась незмінною забарвленні на МНС пацюків класу І, фарбувались С Первинні культури нейронів середнього довколишні паренхіматозні кровоносні судини та мозку плодів пацюків випадкова судина реципієнту, яка спостерігалась у З метою визначення того, чи підтримують трансплантаті, але трансплантовані клітини не клітини SVG та/або SVG-TH виживаність фарбувалось, як очікувалось Під час первинних нейронів, серединний мозок плодів Е13 електронного мікроскоп і ювання трансплантованих пацюків вирізали, розділяли і висівали З клітин SVG-TH було виявлено, що повторами на планшети з 6 лунками Через 24 трансплантовані клітини зберегли години у лунки вміщували камери Костара і до них 5 вносили клітини SVG або SVG-TH(1 x 10 клітин) характеристичний розтягнутий ендоплазматичний Одну серію культур середнього мозку, яку ретикулюм та покриті пухирці, як було видно на використовували як негативний контроль, не Фігурі 15 співкультивували ні з якими клітинами Через 7 Подібні результати було одержано для клітин днів камеру з клітинами видаляли, культури SVG, за виключенням того, що клітини SVG були середнього мозку у лунках фіксували ацетоном та GFAP позитивними та ТН негативними метанолом і фарбували для проведення Приклад 10 - Приживлення клітин SVG-TH та імуногістохімічного аналізу на тирозингідроксилазу SVG-TH v смугастому ТІЛІ пацюків лінії Sprague з метою визначення КІЛЬКОСТІ нейронів середнього Dawlev, пошкодженому 6-пдроксидопаміном мозку, що вижили Як видно на Фігурі 17, культури Після ТОГО, ЯК було визначено, чи можна середнього мозку, які було співкультивовано з ідентифікувати клітини SVG та SVG-TH у клітинами SVG, мали у 2 - 3 рази вищу смугастому ТІЛІ, наступним етапом було виживаність тирозинпдроксилазних нейронів у визначення здатності цих клітин до коректування порівнянні до контрольного планшету Подібні ж функційного дефіциту при хворобі Паркінсону на результати було виявлено і з ЛІНІЄЮ КЛІТИН SVGтваринній моделі TH РІЗНИЦІ у морфології ТН-позитивних нейронів Сім пацюків лінії Sprague Dawley було піддано ні на контрольних, ні на співкультиваційних односторонньому хімічному пошкодженню чорної планшетах не спостерігалось речовини 6-пдроксидопаміном з використанням стереотаксичної головної рамки для направлення Приклад 9 - Приживлення та ідентифікація хімічної речовини до відповідної анатомічної клітин SVG-TH та SVG-TH у смугастому ТІЛІ ділянки Через п'ять тижнів після пошкодження гризунів тваринам вводили апоморфін з метою КІЛЬКІСНОГО Для визначення можливості трансплантування визначення ступеню денервацм На Фігурі 18 клітин SVG або SVG-TH до смугастого тіла з 28 27 61058 показано, що вихідна ротаційна швидкість всіх віментин, серотонін та ТН Трансплантат, однак, семи тварин дорівнювала 400обертам/годину або був значно меншим від того, який спостерігався на більше Через 6 тижнів після пошкодження п'ятьом третій або сьомий день після трансплантування тваринам до пошкодженого смугастого тіла Трансплантат піддавали імунозабарвленню на трансплантували клітини SVG-TH(npn6nH3HO, 5 х великий Т-білок, серотонін та віментин, 5 10 клітин) ДВОМ ІНШИМ тваринам до смугастого імунозабарвленням, однак, не вдавалось виявити тіла трансплантували клітини SVG Впродовж 4 ТН ні у трансплантаті, ні у довколишньому тижнів після трансплантування, з тижневим денервованому смугастому ТІЛІ Трансплантат, інтервалом, тваринам вводили апоморфін для далі, можна було ідентифікувати за відсутністю визначення будь-яких відхилень від їх вихідної забарвлення на тимідин 1 1 пацюків, тобто, активності На Фігурі 18 показано, що через антиген, який сильно експресується у довколишній тиждень після трансплантації, у п'яти тварин, яким паренхімі реципієнту Паренхіма реципієнту було трансплантовано клітини SVG-TH, демонструє явно виявлений астроцитоз навкруги спостерігалось значне послаблення рівня трансплантату Коли зрізи фарбували на CD4 та ротаційної поведінки У протилежність цьому, CD8 пацюків, у самому трансплантаті та довкола тварини, яким було трансплантовано клітини SVG, нього було виявлено численні позитивні клітини демонстрували деякі незначні зміни, що й Це дозволяє зробити припущення, що очікувалось, виходячи з того, що ці пацюки були трансплантат піддавався імунологічному повністю денервовані, втратили здатність відторженню Вищенаведені дані свідчать про те, відновлювати допамшерпчні нейрони, а клітини що клітини у ЦНС гризунів є ксенотрансплантатом, SVG були нездатні до секретування допамшу у той час, як виживаність клітин у ЦНС приматів Впродовж наступних 3 тижнів, однак, тварини, впродовж більш ніж 9 МІСЯЦІВ вказує на те, що ці яким було трансплантовано клітини SVG-TH, клітини у цій системі є алотрансплантатом поступово повернулись до Приклад 12 - Вплив приживлених клітин SVGTH на показник неповноцінності при хворобі передтрансплантаційної ротаційної поведінки, що Паркінсона показано на Фігурі 18 Приклад 11 - Визначення властивостей Експериментальні умови, які дуже нагадували приживлених клітин через місяць після хворобу Паркінсона у людей, можна було трансплантування відтворити у макак-резус шляхом введення 1метил-4-феніл-1,2,3,6-тетрапдропіридину(МРТР) Сім тварин, яких було описано у Прикладі 10, з На Фігурах 1 9 - 2 1 показано вплив клітин SVG-TH, пошкодженнями, спричиненими 6приживлених у хвостатому ядрі та смугастому ТІЛІ пдроксидопаміном, було забито через місяць після З макак-резус, яких піддавали обробці МРТР з трансплантування Три тварини з приживленими метою індукування симптомів хвороби Паркінсону клітинами SVG-TH та одну тварину з До приживлення мавпам впорскували МРТР, доки приживленими клітинами SVG під час евтаназм не було досягнуто показника неповноцінності при було піддано системній перфузм з використанням хворобі Паркінсону, який дорівнював 10(найвищий 4% параформальдегіду Три ІНШІ тварини під час рівень), який підтримували впродовж декількох евтаназм фіксувались без перфузм Зрізи МІСЯЦІВ після впорскувань головного мозку тварин, фіксованих параформальдегідом, було використано для Під час трансплантування у кожну з 4 ділянок імунопстохімічного фарбування політональними хвостатого ядра та смугастого тіла кожної тварини антитілами, у той час, як нефіксовані зрізи було введено 750000 клітин у об'ємі Юмкл На головного мозку використовувались для графіках представлено показник неповноцінності імунопстохімічного фарбування моноклональними при хворобі Паркінсона проти часу(у днях) після антитілами Приживлені клітини було можливо операції Впродовж одного тижня у всіх трьох мавп ідентифікувати впродовж місяця після спостерігалось поліпшення, що відображалось трансплантування за допомогою зниженням показника неповноцінності імунопстохімічного фарбування на SV40 Т-білок, Н002 Н005 Т022 Показник неповноцінності Перед операцією 10 10 10 Спостереження за мавпою Н002(результати 21-денного спостереження за нею представлені на Фіг 19) вели впродовж 90 днів після трансплантування Цю мавпу сшеметом(стандартний лікарський засіб при хворобі Паркінсона) не лікували Показник неповноцінності у цієї мавпи, який дорівнює 2 - 3, є подібним рівню, якого можна було б очікувати у пацієнта, хворого на паркінсонізм, і якого лікують Цей показник свідчить про кращий результат, аніж той, який отримують при лікуванні мавп сінеметом Після операції 3 75 3 У протилежність стану перед операцією, мавпа здатна годувати себе, є доволі активна і рухлива, добре реагує на довколишнє середовище і набула ваги Як показано на Фігурах 2 0 та 21, у мавп РН005 та Т022 також спостерігалось поліпшення показника неповноцінності і він продовжує поліпшуватись, незважаючи на те, що час спостереження за ними був коротшим Таким чином, наслідком трансплантування клітин SVG-TH було суттєве поліпшення стану 61058 ЗО 29 хворих на паркінсонізми, який було індуковано Незважаючи на те, що для ясності розуміння шляхом ушкоджень за допомогою МРТР суті цього винаходу було детально описано переважний варіант здійснення винаходу, цілком Всі публікації, патенти та заявки на патенти, зрозуміло, що фахівцями в даній галузі можуть згадані у цьому описі, включено до нього як бути внесені певні зміни та доповнення, що не посилання у такому ж обсязі, у якому їх було б виходять проте за межі обсягу формули винаходу, включено сюди у разі конкретного та що наведена нижче індивідуального вказання на їх включення як посилання 31 61058 32 33 61058 34 35 61058 36 II. 2! Комп'ютерна верстка І. Вихованець Підписне Тираж39 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м. Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Сім'ї Хохлових, 15, м. Київ, 04119