Спосіб отримання пептид/ліпідного комплексу шляхом спільної ліофілізації (варіанти), фармацевтичні препарати на їх основі (варіанти)

1. Спосіб одержання ліофілізованого пептид/ліпідного продукту, що включає ліофілізацію одного або більше пептидів або аналогів пептиду, що здатні приймати амфіпатичну конформацію, і одного або більше ліпідів у системі розчинників з утворенням пептид/ліпідного продукту, причому зазначений продукт може бути регідратований з утворенням пептид/ліпідного комплексу, і де зазначена система розчинників є органічним розчинником або сумішшю водного/органічного розчинника. 2. Спосіб за пунктом 1, де зазначений пептид є білком. 3. Спосіб за пунктом 1, де зазначений пептид є білком, що зв'язує ліпід. 4. Спосіб за пунктом 1, де зазначений аналог пептиду є аналогом АроА-І, АроА-ІІ, Apo A-IV, ApoC-I, АроС-ІІ, АроС-ІІІ або АроЕ. 5. Спосіб за пунктом 1, який додатково включає відбір аліквот зазначеного розчину пептиду/ліпіду в окремі контейнери перед ліофілізацією з одержанням лікарської форми, що містить одиницю дози. 6. Спосіб за пунктом 1, який далі включає стерилізацію зазначеного продукту перед, під час або після ліофілізації. 7. Спосіб за пунктом 1, де вказаний ліпід є насиченим ліпідом, ненасиченим ліпідом або їх сумішами. 8. Спосіб за пунктом 7, де вказаний ліпід є природним ліпідом, синтетичним ліпідом або їх сумішами. 9. Спосіб за пунктом 8, де зазначений ліпід вибирається з групи, що складається з простих ефірів 2 (19) 1 3 71551 4 15. Спосіб за пунктом 1, де розчинник є неполярдипальмітоїлфосфатидилхіноліну, диміристоїлфоним, полярним, апротонним або протонним. сфатидилхоліну, дистеароїлфосфатидилхоліну, 116. Спосіб за пунктом 1, де розчинником є етанол, міристоїл-2-пальмітоїлфосфатидилхоліну, 1метанол, циклогексан, 1-бутанол, ізопропанол, пальмітоїл-2-міристоїлфосфатидилхоліну, 1ксилол, ТГФ, діетиловий ефір, метиленхлорид, пальмітоїл-2-стеароїлфосфатидилхоліну, 1бензол або хлороформ. стеароїл-2-пальмітоїлфосфатидилхоліну, діолеої17. Спосіб за пунктом 1, де розчинником є суміш, лфосфа тидилхоліну, діолеоїлфосфатидилетанощо містить етанол, метанол, циклогексан, 1ламіну, дилауроїлфосфатидилгліцерину, ди фосбутанол, ізопропанол, ксилол, ТГФ, діетиловий фатидилгліцерину, ефір, метиленхлорид, бензол або хлороформ і диміристоїлфосфатидилгліцерину, дипальмітоїлводу. фосфа тидилгліцерину, дистеароїлфосфатидилг18. Спосіб одержання ліофілізованого пепліцерину, діолеоїлфосфа тидилгліцерину, диміристид/ліпідного продукту, що може бути регідратоватоїлфосфатидної кислоти, ний з утворенням пептид/ліпідного комплексу, задипальмітоїлфосфатидної кислоти, диміристоїлзначений спосіб включає: фосфа тидилетаноламіну, дипальмітоїлфосфати(і) солюбілізацію щонайменше одного амфіпатичдилетаноламіну, диміристоїлфосфатидилсерину, ного пептиду або амфіпатичного аналога пептиду дипальмітоїлфосфатидилсерину, сфінгомієліну, в першому розчиннику з утворенням першого роздипальмітоїлсфінгомієліну, дистеароїлсфінгомієчину, ліну, фосфатидної кислоти, галактоцереброзиду, (іі) солюбілізацію щонайменше одного ліпіду в друдилаурилфосфатидилхоліну, (1,3)-D-манозилгому розчиннику без застосування детергенту з (1,3)дигліцериду, амінофенілглікозиду, 3утворенням другого розчину, причому зазначений холестерил-6'-(глікозилтіо)гексилефірних гліколіпідругий розчин є таким, що змішується з зазначедів і їх сумішей. ним першим розчином, 30. Спосіб за пунктом 29, у якому зазначений ліпід (ііі) об'єднання зазначеного першого розчину з являє собою 3-холестерил-6'зазначеним другим розчином з утворенням пеп(глікозилтіо)гексилефірний гліколіпід. тид/ліпідного розчину і 31. Спосіб за пунктом 18, у якому молярне відно(iv) ліофілізацію зазначеного пептид/ліпідного розшення пептид:ліпід або молярне відношення аначину так, що утворюється ліофілізований пеплог пептиду:ліпід складає приблизно від 2:1 притид/ліпідний продукт. близно до 200:1. 19. Спосіб за пунктом 18, у якому перший розчин32. Спосіб за пунктом 31, у якому молярне відноник і другий розчинник є органічним розчинником шення пептид:ліпід або молярне відношення анаабо сумішшю водного/органічного розчинника. лог пептиду:ліпід складає приблизно від 2:1 при20. Спосіб за пунктом 18, у якому зазначений пепблизно до 50:1. тид є білком. 33. Спосіб за пунктом 32, у якому молярне відно21. Спосіб за пунктом 18, у якому зазначений пепшення пептид:ліпід або молярне відношення анатид є білком, що зв'язує ліпід. лог пептиду:ліпід складає приблизно від 5:1 при22. Спосіб за пунктом 18, де зазначений аналог близно до 50:1. пептиду є аналогом АроА-І, АроА-ІІ, Apo A-IV, 34. Спосіб за пунктом 18, де зазначений перший АроС-І, АроС-ІІ, АроС-ІІІ або АроЕ. розчинник вибирається з групи, що складається з 23. Спосіб за пунктом 18, у якому перший і другий води, метанолу, 1-бутанолу і їх сумішей. розчинники однакові. 35. Спосіб за пунктом 18, де зазначений другий 24. Спосіб за пунктом 18, який далі включає відбір розчинник вибирається з групи, що складається з аліквот зазначеного розчину пептиду/ліпіду в ксилолу, бензолу, метанолу, хлороформу і їх суокремі контейнери перед ліофілізацією з одержанмішей. ням лікарської форми, що містить одиницю дози. 36. Пептид/ліпідний комплекс, одержаний спосо25. Спосіб за пунктом 18, який далі включає стебом, що включає: рилізацію зазначеного продукту перед, під час або (і) солюбілізацію одного або більше амфіпатичних після ліофілізації. пептидів або амфіпатичних аналогів пептидів і 26. Спосіб за пунктом 18, де зазначений ліпід є щонайменше одного ліпіду в системі розчинників насиченим ліпідом, ненасиченим ліпідом або їх без застосування детергенту з утворенням пепсумішами. тид/ліпідного розчину, 27. Спосіб за пунктом 26, де зазначений ліпід є (іі) ліофілізацію зазначеного пептид/ліпідного розприродним ліпідом, синтетичним ліпідом або їх чину з утворенням дегідратованого пепсумішшю. тид/ліпідного продукту і 28. Спосіб за пунктом 27, де зазначений ліпід ви(ііі) регідратацію зазначеного дегідратованого пепбирається з групи, що складається з простих ефітид/ліпідного продукту з утворенням зазначеного рів фосфоліпідів, фосфоліпідів з короткими ланпептид/ліпідного комплексу. цюгами, холестерину, похідних холестерину, 37. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де фосфа тидилхолінів, фосфатидилетаноламінів, зазначений пептид є білком, що зв'язує ліпід. фосфа тидилсеринів, фосфа тидилінозитів, сфінго38. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де ліпідів, фосфатидилгліцеринів, гангліозидів і церезазначений пептид є аналогом АроА-І. брозидів. 39. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, який 29. Спосіб за пунктом 28, де зазначений ліпід вимає діаметр приблизно від 50 приблизно до 120 бирається з групи, що складається з яєчного фосангстрем. фатидилхоліну, фосфатидилхоліну із соєвих бобів, 5 71551 6 40. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де в 51. Ліофілізована композиція за пунктом 49, де зазначеному способі використовується система пептид є пептидом, що зв'язує ліпід, або аналогом розчинників, що складається з єдиного розчинниАроА-І, Аро А-II, Apo A-IV, АроС-І, АроС-ІІ, АроС-ІІІ ка. або АроЕ. 41. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, який 52. Ліофілізована композиція за пунктом 49, де практично дорівнює за розміром ліпопротеїнам зазначений амфіпатичний пептид або амфіпатичвисокої щільності. ний аналог пептиду здатний приймати конформа42. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де цію a -спіралі. зазначений комплекс є стерильним. 53. Ліофілізована композиція за пунктом 49, де в 43. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де зазначеному способі використовують систему роззазначений комплекс сформований у вигляді стечинників, що включає єдиний розчинник. рильної форми, що містить одиницю дози. 54. Спосіб одержання ліофілізованої пеп44. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 36, де тид/ліпідної композиції, зазначений спосіб вклюзазначений ліпід є насиченим ліпідом ненасичечає: ним ліпідом, або їх сумішами. (і) солюбілізацію щонайменше одного амфіпатич45. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 44, де ного пептиду або амфіпатичного аналога пептиду зазначений ліпід є природним ліпідом, синтетичв першому розчиннику з утворенням першого розним ліпідом або їх сумішшю. чину, 46. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 45, де (іі) солюбілізацію щонайменше одного ліпіду в друзазначений ліпід вибирається з групи, що складагому розчиннику без застосування детергенту з ється з простих ефірів фосфоліпідів, фосфоліпідів утворенням другого розчину, причому зазначений з короткими ланцюгами, холестерину, похідних другий розчин є таким, що змішується з зазначехолестерину, фосфатидилхолінів, фосфатидиленим першим розчином, таноламінів, фосфатидилсеринів, фосфатидиліно(ііі) об'єднання зазначеного першого розчину з зитів, сфінголіпідів, фосфатидилгліцеринів, ганглізазначеним другим розчином з утворенням пепозидів і цереброзидів. тид/ліпідного розчину і 47. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 46, де (iv) ліофілізацію зазначеного пептид/ліпідного роззазначений ліпід вибирається з групи, що складачину з утворенням дегідратованої пептид/ліпідної ється з яєчного фосфатидилхоліну, фосфатидилкомпозиції. холіну із соєвих бобів, дипальмітоїлфосфатидил55. Спосіб за пунктом 54, у якому молярне віднохіноліну, диміристоїлфосфа тидилхоліну, шення пептид:ліпід або молярне відношення анадистеароїлфосфатидилхоліну, 1-міристоїл-2лог пептиду:ліпід складає приблизно від 2:1 припальмітоїлфосфатидилхоліну, 1-пальмітоїл-2близно до 200:1. міристоїлфосфатидилхоліну, 1-пальмітоїл-256. Спосіб за пунктом 54, у якому молярне відностеароїлфосфатидилхоліну, 1-стеароїл-2шення пептид:ліпід або молярне відношення анапальмітоїлфосфатидилхоліну, діолеоїлфосфа тилог пептиду:ліпід складає приблизно від 2:1 придилхоліну, діолеоїлфосфатидилетаноламіну, диблизно до 50:1. лауроїлфосфатидилгліцерину, дифосфатидилглі57. Спосіб за пунктом 54, де зазначений перший церину, диміристоїлфосфатидилгліцерину, розчинник вибирається з групи, що складається з дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, дистеароїлводи, метанолу, 1-бутанолу і їх сумішей. фосфа тидилгліцерину, діолеоїлфосфатидилгліце58. Спосіб за пунктом 54, де зазначений другий рину, диміристоїлфосфатидної кислоти, дипальмірозчинник вибирається з групи, що складається з тоїлфосфатидної кислоти, ксилолу, бензолу, метанолу, хлороформу і їх судиміристоїлфосфатидилетаноламіну, дипальмітомішей. їлфосфатидилетаноламіну, диміристоїлфосфати59. Спосіб одержання пептид/ліпідного комплексу, дилсерину, дипальмітоїлфосфатидилсерину, сфінзазначений спосіб включає: гомієліну, дипальмітоїлсфінгомієліну, (і) солюбілізацію щонайменше одного амфіпатичдистеароїлсфінгомієліну, фосфатидної кислоти, ного пептиду або амфіпатичного аналога пептиду галактоцереброзиду, дилаурилфосфа тидилхоліну, в першому розчиннику з утворенням першого роз(1,3)-D-манозил-(1,3)дигліцериду, амінофенілглікочину, зиду, 3-холестерил-6'-(глікозилтіо)гексилефірних (іі) солюбілізацію щонайменше одного ліпіду в другліколіпідів і їх сумішей. гому розчиннику без застосування детергенту з 48. Пептид/ліпідний комплекс за пунктом 47, де утворенням другого розчину, причому зазначений зазначений ліпід являє собою 3-холестерил-6'другий розчин є таким, що змішується з зазначе(глікозилтіо)гексилефірний гліколіпід. ним першим розчином, 49. Ліофілізована композиція, одержана способом, (ііі) об'єднання зазначеного першого розчину з що включає: зазначеним другим розчином з утворенням пеп(і) солюбілізацію амфіпатичного пептиду або амтид/ліпідного розчину і фіпатичного аналога пептиду і ліпіду в системі (iv) ліофілізацію зазначеного пептид/ліпідного розрозчинників без застосування детергенту з утвочину з одержанням дегідратованої пептид/ліпідної ренням пептид/ліпідного розчину, і композиції, і (іі) ліофілізацію зазначеного солюбілізованого пеп(v) гідратацію висушеної пептид/ліпідної композиції тид/ліпідного розчину з утворенням зазначеної з одержанням пептид/ліпідного комплексу. ліофілізованої композиції. 60. Спосіб за пунктом 59, у якому молярне відно50. Ліофілізована композиція за пунктом 49, що є шення пептид:ліпід або молярне відношення стерильною. 7 71551 8 аналог пептиду:ліпід складає приблизно від 2:1 65. Фармацевтична композиція, що містить одиниприблизно до 200:1. цю дози, яка включає стійкий ліофілізований пеп61. Спосіб за пунктом 59, де зазначений перший тид/ліпідний продукт, одержаний за пунктом 36 розчинник вибирається з групи, що складається з або 43. води, метанолу, 1-бутанолу і їх сумішей. 66. Фармацевтична композиція, що містить одини62. Спосіб за пунктом 59, де зазначений другий цю дози, яка включає стійкий ліофілізований пепрозчинник вибирається з групи, що складається з тид/ліпідний продукт, одержаний за пунктом 49. ксилолу, бензолу, метанолу, хлороформу і їх су67. Фармацевтична композиція, що містить одинимішей. цю дози, яка включає стійкий ліофілізований пеп63. Лікарська форма, що містить одиницю дози, тид/ліпідний продукт, одержаний за пунктом 56. яка включає ліофілізований пептид/ліпідний про68. Фармацевтична композиція, що містить одинидукт, одержаний за одним із пунктів 1, 2 або 6. цю дози, яка включає стійкий ліофілізований пеп64. Фармацевтична композиція, що містить одинитид/ліпідний продукт, одержаний за пунктом 59. цю дози, яка включає стійкий ліофілізований пептид/ліпідний продукт, одержаний за пунктом 18. Цей винахід стосується утворення пептид/ліпідних везикул і комплексів за допомогою спільної ліофілізації пептидів, переважно тих, які здатні приймати амфіпатичну конформацію альфа-спіралі, і одного або більше ліпідів. Можна ліофілізувати єдиний розчин, який солюбілізує як пептиди, так і ліпіди, або два окремих розчини. Використовують способи отримання стабільних пептид/ліпідних везикул і комплексів, включаючи, але не обмежуючись ними, міцелярні, сферичні і дископодібні комплекси в препаратах великої маси і меншого розміру, що може бути застосовано для дозованих форм. Ліпосоми являють собою везикули, утворені, щонайменше, однією ліпідною двошаровою мембраною, що містять в собі водне ядро. Звичайно фосфоліпіди входять в склад ліпідного бішару, але бішар може бути утворений і іншими ліпідуми. Водний розчин в ліпосомі називається «захопленим об'ємом». Ліпосоми, серед інших способів застосування, були розроблені як носії для доставки лікарських речовин, косметичні препарати, біологічно активні речовини. Ліпідний бішар інкапсулює лікарську речовину, косметичний препарат, біологічно активну сполуку і тому подібне в захопленому об'ємі ліпосоми, і лікарська речовина викидається з ліпосомного ядра, коли ліпідний бішар приходить в контакт з мембраною поверхні клітини. Ліпосома виділяє свій вміст в клітку за допомогою ліпідного обміну, злиття, ендоцитоза або адсорбції. Ostro et al., 1989, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576. Альтернативно, лікарська речовина, косметична речовина, біологічно активна речовина і тому подібне можуть бути пов'язані з ліпідним бішаром мембрани або включені в ліпідну бішарову мембрану везикули. У доповнення до везикул, комплекси, що містять ліпід були використані для доставки речовин в дисперсній формі. Наприклад, багато які дослідники виявили, що корисно виготовляти частки або комплекси що відтворюються, схожі на ліпопротеїн, які мають схожий розмір і щільність, як у часток ліпопротеїну високої щільності (ЛПВЩ). Ці комплекси, що відтворюються звичайно складаються з очищених апопротеїнів (звичайно апопротеїну А-І) і фосфоліпідів, таких як фосфатіділхолін. Іноді також включається неетерифікований холестерин. Найбільш загальноприйнятими способами отримання цих часток є: (1) спільна обробка складових ультразвуком, або в ультразвуковій бані або за допомогою ультразвукового зонда, (2) спонтанна взаємодія білкової складової із заздалегідь сформованими ліпідними везикулами, (3) опосередковане детергентом відтворення з подальшим видаленням детергенту шляхом діалізу. Jonas, 1986, Meth. in Enzymol. 128: 553-582, Lins et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta, 1151: 137-142; Brouillette & Anantharamaiah, 1995, Biochimica et Biophysica Acta, 1256: 103-129; Jonas, 1992, Structure & Function of Apoproteins, Chapter 8:217250. Схожі комплекси були також сформовані шляхом заміни апопротеїнових компонентів амфіпатичними утворюючими спіраль пептидами. На жаль, кожний з цих способів представляє серйозні проблеми для утворення великих кількостей чистих комплексів на основі помірної ціни і ефективності. Крім того, ні в одній з цих публікацій не описана спільна ліофілізація (соліофілізація) пептидів/ або пептидних аналогів, які здатні приймати конформацію амфіпатичної альфа-спіралі, і ліпіду. Відомий ряд технологій отримання ліпідних везикул і комплексів. Везикули, або ліпосоми, були отримані при використанні ряду методик з утворенням різних типів везикул. Різні типи ліпосом включають: багатошарові везикули, невеликі одношарові везикули і великі одношарові везикули. Гідратування фосфоліпідів (або інших ліпідів) водним розчином може також приводити до диспергування ліпідів і спонтанному утворенню багатошарових везикул («МСВ»). МСВ є ліпосомою з багатьма ліпідними бішарами, що оточують центральне водне ядро. Ліпосоми цих типів більше, ніж невеликі одношарові везикули (НОВ) і можуть бути діаметром 350-400нм. МСВ були 9 71551 10 спочатку отримані шляхом солюбілізації ліпідів в великих витрат часу, і видалення детергенту звихлороформі в круглодонній колбі і випаровування чайно є неповним. Присутність детергенту в кінцехлороформу доти, доки не утворювався тонкий вому препараті може приводити до деякої токшар на стінці колби. Додавали водний розчин, і сичності ліпосомного препарату і/або ліпідному шару давали регідратуватися. Коли рімодифікації фізико-хімічних властивостей ліпосодину в колбі примушували обертатися або струмного препарату. шували, утворювалися везикули. Deamer et al., По методиці випаровування із звертанням фа1983, in Liposomes (Ostro, ed,.), Marcel Dekker, Inc. зи ліпід солюбілізують у водних-неполярних розNew York (citing Bangham et al., 1965, J. Моl. Biol. чинах з формуванням звернених міцел. Неполяр13:238). Johnson et al. потім повідомили, що цей ний розчинник випаровують, і міцели доводять до спосіб дозволяє отримати також і одношарові веутворення BOB. Цей спосіб звичайно вимагає везикули. Johnson et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta ликої кількості ліпіду. 233: 820. За інфузійним методом солюбілізований в неНевеликі одношарові везикули (HOB) являють полярному розчині ліпід інжектують у водний розсобою ліпосоми з одним ліпідним бішаром, який чин, який треба інкапсулювати. По мірі того, як оточує водне ядро. У залежності від способу, винеполярний розчин випаровується, ліпіди збиракористаного для отримання НОВ, вони можуть ються на поверхні розділу газоподібної і водної мінятися по розміру від 25 до 110нм по діаметру. фаз. Ліпідні плівки утворять BOB і оліголамелярні Перші НОВ були отримані шляхом висушування ліпосоми у вигляді газових пухирців по водному фосфоліпідного препарату в хлороформі в атмосрозчину. Розмір ліпосом створюється фільтруванфері азоту, додання водного шару до отримання ням. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, ed.). концентрації ліпіду мілімолярного порядку і обробMarcel Dekker, Inc. New York (цитування Deamer et ки розчину ультразвуком при 45°С до прозорості. al., 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:629 і Schieren Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, ed.). et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 542:137). ІнфузіMarcel Dekker, Inc. New York. HOB, отримані таким онні процедури вимагають досить високої темпечином, представляли ліпосоми діаметром в інтерратури для інфузії і можуть давати відносно низьку валі 25-50нм. ефективність інкапсулювання. Deamer et al., 1983, Іншим способом виготовлення НОВ є швидка in Liposomes (Ostro, ed.), Marcel Dekker, Inc. New інжекція етанол/ліпідного розчину у водний розчин, York. який повинен інкапсулюватися. Deaner et al., 1983, Метою досліджень по ліпосомам була розробin Liposomes (Ostro, ed.), Marcel Dekker, Inc. New ка ліпосомних препаратів, які можна зберігати проYork (citing Batzri et al., 1973, Biochim. Biophys. Acta тягом великих періодів часу до використання. На298:1015). HOB, отримані цим способом, мають приклад, в патенті США №4229360, Schneider et розміри в інтервалі 30-110нм по діаметру. al., розкривається спосіб дегідратування ліпосом НОВ можуть бути також отримані шляхом прошляхом додання гідрофільної сполуки до колоїдпущення багатошарових везикул через French ної дисперсії ліпосом у водній рідині і дегідратупрес чотири рази при 1,38.108н/м 2 вання розчину, переважно шляхом ліофілізації. (20000фунт/дюйм 2). НОВ, що отримуються будуть Прикладами гідрофільних сполук є гідрофільні мати розміри в інтервалі від 30 до 50нм по діаметполімери з високою молекулярною вагою або спору. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, ed.), луки з низькою молекулярною вагою, такі як Marcel Dekker, Inc. New York (citing Barenholz et al., сахароза. 1979, FEBS Letters 99:210). У патенті США №4411894, Schrank et al., розБагатошарові і одношарові фосфоліпідні везикривається застосування високих концентрацій кули можуть бути також сформовані шляхом екстсахарози в препаратах ліпосом, що обробляються рузії водних препаратів фосфоліпідів при високому ультразвуком. Ліпосоми містять розчинні в жирі тиску через дрібнопористі мембрани (Hope et al., продукти в захопленому об'ємі, хоча препарати 1996, Chemistry and Physics of Lipids, 40: 89-107). можуть бути ліофілізовані, за цим способом не Великі одношарові везикули (BOB) схожі на можна було запобігти втратам значної кількості НОВ тим, що вони мають один ліпідний бішар, вмісту, що захоплюється, незважаючи на високі який оточує центральне водне ядро, але BOB знаконцентрації сахарози. чно більше НОВ. У залежності від складаючих їх Crowe et al., в патенті США. №4857319 розчастин і способу, використаного для їх отримання, крив застосування дисахаридів, таких як сахароза, BOB можуть мінятися по розміру від 50 до 1000нм мальтоза, лактоза і трегалоза, для стабілізації в діаметрі. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, ліпосом, коли ліпосоми заморожують і сушать. ed.). Marcel Dekker, Inc. New York. BOB звичайно Кількість дисахариду по відношенню до змісту ліотримують, використовуючи один з трьох способів: підного компонента (вага/вага) знаходиться в інрозбавлення детергентом, випаровування із звертервалі від 0,1:1 до 4:1. Crowe досяг більшого успітанням фази, та інфузії. ху в збереженні цілісності ліпосом, При методиці розбавлення детергентом, виковикористовуючи цей спосіб, ніж отриманий за спористовуються розчини детергентів, таких як холат, собом, описаному Schrank в патенті США дезоксихолат, октилглікозид, гептилглікозид і три№4441894. тон Χ-100, для формування міцел з ліпідного преJanoff et al., в патенті США №4880635 розкрипарату. Розчин потім діалізують для видалення ває спосіб дегідратування ліпосом, за якого ліподетергенту, що дає в результаті утворення ліпосоми ліофілізують в присутності захищаючи х цуксом, Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, ed.). рів, таких як трегалоза і сахароза, переважно, як із Marcel Dekker, Inc. New York. Цей спосіб вимагає зовнішньої, так і з внутрішньої сторони ліпідного 11 71551 12 бішару. По методу Janoff et al. залишається досить ліпід білка/фосфоліпіду і/або комплексів пептидноводи, так що регідратація висушених ліпосом дає го аналога АроАI/фосфоліпіду. Ліофілізований ліпосоми з істотним структурним збереженням. матеріал може бути отриманий для об'ємних преОднак в техніці існує потреба в простому і паратів або, альтернативно, змішаний пепефективному по вартості способі отримання ліотид/ліпідний розчин може бути розділений по нефілізованих пептид/ліпідних комплексів, які можуть великих контейнерах (наприклад, для одиничних бути потім регідратовані. Спосіб даного винаходу доз) перед ліофілізацією, і такі препарати з неведає пептид/ліпідні суміші в стабільному ліофілізоликою кількістю можуть бути отримані у вигляді ваному порошку, які можна зберігати, використостерильних одиничних дозованих лікарських вувати у вигляді порошку, або використати після форм. регідратації для формування пептид/ліпідних Ліофілізований порошок, отриманий за спосокомплексів. бом цього винаходу, може бути регідратований до Цей винахід представляє спосіб отримання вільного від часток стерильного розчину безпосепептид- або протеїн-(фосфо)ліпідних комплексів редньо перед ін'єкцією, або альтернативно, з ліоабо везикул, які можуть мати властивості, схожі з філізованого порошку може бути виго товлена твевластивостями ліпопротеїнів високої щільності рда дозована лікарська форма, і застосовуватися (ЛПВЩ). При цьому способі використовується сисбезпосередньо. тема розчинників, в якій, щонайменше, один пепЦей спосіб може бути також придатний для тид солюбілізується в одному розчині, і, щонаймезберігання сполук, які в іншому випадку можуть нше, один ліпід солюбілізується в іншому розчині. бути нестабільні або нерозчинні у відсутність Два розчини вибираються так, що вони є такими, ліпідів. що змішуються один з одним. Потім розчини з'єдСпосіб можна використати для отримання лінують і отриманий розчин ліофілізують. карських форм продуктів для лікування або профіЦей спосіб може бути також здійснений за долактики захворювань у людей, включаючи таке помогою другого типу системи розчинників, що застосування, як спільну присутність антигенів у складається з розчину, в якому можуть бути солювакцинах, лікування або профілактику дисліпопробілізовані як білок або пептид, так і ліпід. Цей розтеїнемі, включаючи, але не обмежуючись ними, чин може бути єдиним розчином, або може бути гіперхолестеринемію, гіпертригліцеридемію, низькомпозитним розчином, отриманим шляхом об'єдкий рівень ЛПВЩ і дефіцит аполіпопротеїну А-I, нання двох або більше розчинів перед доданням серцево-судинні захворювання, такі як атеросклепептидів і ліпідів. Пептиди і ліпіди солюбілізують в роз, септичний шок або інфекційні захворювання. розчині або композитному розчині і потім пепСпосіб може використовуватися для отримантид/ліпідний розчин ліофілізують. ня комплексів, які могли б використовуватися як Переважно, пептиди даного винаходу є пептиносії для ліків, як переносників (для доставки ліків, дами, які здатні приймати конформацію амфіпатиДНК, генів), наприклад, в печінку або екстрапечінчної спіралі. В одному з конкретних втілень цього кові клітини, або як засоби для захоплення і вивевинаходу пептид є білком, зв'язуючим ліпід. В індення токсинів (наприклад, пестицидів, ЛПС і т.д.). шому втіленні використовуються пептидні аналоги Так, як використано тут, «система розчинниАроА-І, АроА-ІІ, ApoA-IV, АроС-І, АроС-ІІ, АроС-ІII, ків» стосується одного або більше розчинників, які АроЕ, інші аполіпопротеїнові аналоги і тому подібздатні до солюбілізації пептидів і/або ліпідів і, якне замість або в поєднанні з пептидами. В іншому що їх більше за один, які змішуються один з конкретному втіленні цей спосіб використовується одним. для отримання АроАI аналога/(фосфо)ліпідних Так, як використано тут, під «пептид/ліпідними комплексів, схожих на ЛПЗП. АроАI/ліпідні комплекомплексами» мається на увазі агрегація ліпідних кси застосовні для лікування порушень, пов'язаних фрагментів і пептидів, утворюючих частки в межах з дисліпопротеїнеміями, включаючи, але не обмерозмірів ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ). жуючись ними, гіперхолестеринемію, гіпертригліТак, як використано тут, «спільно ліофілізовацеридемію, низький рівень ЛПВЩ і дефіцит аполіний» стосується ліофілізації, висушуванню із запопротеїну А-I, септичного шоку, для мороженого стану або вакуумного висушування діагностичних досліджень in vitro як маркери для більш, ніж однієї сполуки (наприклад, пептиду, популяцій з ЛПВЩ і для використання при технобілка, ліпіду, фосфоліпіду) в розчині в одній і тій логіях з отриманням оптичного зображення. же судині. Наприклад, ліпідний розчин може бути Спосіб цього винаходу робить можливим об'єднаний з пептидним розчином в одній і тій же отримання пептид/ліпідних комплексів для паренсудині, і отриману комбінацію розчинів ліофілізутерального введення, включаючи, але не обмежують разом, тим самим ліофілізуючі пептиди і ліпіди ючись цим, внутрішньовенні, внутрішньочеревні, одночасно. підшкірні, внутрішньом'язові і болюсні ін'єкції тваТак, як використано тут, «амфіпатичний пепринам і людям. Крім того, пептид/ліпідні комплекси тид» або «амфіпатичні альфа-спіральні пептиди» можуть бути також виготовлені у вигляді лікарсьозначає пептиди, які здатні приймати амфіпатичну ких форм для перорального, ректального введенабо амфіпатичну спіральну конформацію, відповіня, введення через слизову оболонку (наприклад, дно. Амфіпатична альфа спіраль є вторинним в порожнині рота) або місцевого застосування у структурним типом у біологічно активних пептидів і тварин і людей, або для експериментів in vitro. білків, що часто зустрічається. Див. Amphipathic Спосіб може використовуватися для великоhelix motif: classes and properties by Jere P. Segrest, масштабного виробництва комплексів амфіпатичHans de Loof, Jan G. Dohlman, Christie G. ного пептида/фосфоліпіду, комплексів зв'язуючого Brouillette, and G.M. Anantharamaiah. PROTEINS: 13 71551 14 Structure Functions and Genetics 8: 103-117 (1990). препаратів певних кількостей або одиничних доз, Амфіпатична альфа-спіраль є альфа-спіраллю з які можуть бути відтворені шляхом регідратації протилежними полярними і неполярними поверхстерильною водою або відповідного стерильного нями, орієнтованими вздовж довгої осі спіралі. буферного розчину перед введенням суб'єкту. Специфічний розподіл заряджених залишків відНаскільки відомо автору винаходу, цей винахід бувається, очевидно, по полярній поверхні. Амфіє першим прикладом способу спільної ліофілізації патичні спіралі, за визначенням, є комплементарамфіпатичного альфа-спірального пептиду або ними до полярно-неполярної поверхні контакту аналога пептиду з ліпідом для утворення суміші, гідратованого об'ємного фосфоліпіду; ці пов'язані яка може відтворюватися в стерильний пепз ліпідом домени, як було встановлено, взаємодітид/ліпідний комплекс. ють з фосфоліпідом за допомогою свого частковоУ деяких втіленнях може бути переважним виго занурення на стику між жирними ацильними готовляти і вводити аналоги АроА-I, включаючи, ланцюгами і полярними головними групами. Jere але не обмежуючись ними, агоністи АроА-I, у виP. Segrest. Febs letters 1976, 69 (1): 111-114. гляді пептид-ліпідного комплексу. Цей підхід має Термін «пептид» і «протеїн» (білок) можуть видекілька переваг, оскільки комплекс повинен вокористовуватися тут взаємозамінно. Крім того, лодіти збільшеним напівперіодом присутності в пептидні аналоги цього винаходу можуть бути пепкровообігу, особливо коли комплекс має розмір і тидами, білками або непептидами, тобто пептидощільність, схожий з цими показниками у білків кламіметиками. Однак всі аналоги, переважно, є біосу ЛПВЩ, особливо у популяцій пре-бета-ЛПВЩ. логічно активними молекулами. Клас ліпопротеїнів ЛПВЩ може бути розділений на Термін «ліпід», як він використаний тут, вклюряд підкласів на основі таких характеристик, як чає, але не обмежується цим, природні і синтетичрозмір, щільність і електрофоретична рухли вість. ні фосфоліпіди. Крім того, терміни «ліпід» і «фосДеякими прикладами в порядку збільшення розміфоліпід» можуть використовува тися тут ру є міцелярні пре-бета-ЛПВЩ діаметром від 50 до взаємозамінно. 60 Ангстрем, дископодібні ЛПВЩ проміжного розФігура 1: Superose 6 хроматографія ЛПВЩ, міру, тобто з масою 65кДа (приблизно 70 Ангстотриманого шляхом ультрацентрифугування по рем), сферичними ЛПВЩ3 або ЛПВЩ2 діаметром щільності з 200мкл людської сироватки. від 90 до 120 Ангстрем. (J. Капе, 1996 in V. Fuster, Фігура 2 (низ): Superose 6 хроматографія R. Rose and Ε. Topol [eds.] Atherosclerosis and (DPPC: пептид 1) (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; Coronary Artery Disease, p.99; A. Tall and J. SEQ ID №:1) комплексів, отриманих при відношенBreslow, ibid., p.106; Barrans et al., Biochemica et ні 1:1 (вага:вага). Biophysica Acta 1300, p.73-85; and Fielding et al., Фігура 2 (верх): Superose 6 хроматографія 1995, J. Lipid res. 36, p.211-228). Однак пеп(DPPC: пептид 1) комплексів, отриманих при відтид/ліпідні комплекси меншого або більшого розношенні 2:1 (вага:вага). міру, ніж ЛПВЩ також можуть формуватися по Фігура 3 (низ): Superose 6 хроматографія цьому винаходу. (DPPC: пептид 1) комплексів, отриманих при відПептид-ліпідні комплекси даного винаходу ношенні 3:1 (вага:вага). можна зручно отримувати у ви гляді стабільних Фігура 3 (верх): Superose 6 хроматографія препаратів, що мають тривалий термін зберігання, (DPPC: пептид 1) комплексів, отриманих при відшляхом процедури спільної ліофілізації, описаної ношенні 4:1 (вага:вага). нижче. Ліофілізовані пептид-ліпідні комплекси моФігура 4 (низ): Superose 6 хроматографія жуть використовуватися для виготовлення маси (DPPC: пептид 1) комплексів, отриманих при відлікарської речовини, для фармацевтичної перероношенні 5:1 (вага:вага). бки в лікарські форми або для отримання окремих Фігура 4 (верх): Superose 6 хроматографія кількостей або дозованих одиниць, які можуть від(DPPC: пептид 1) комплексів, отриманих при відтворюватися шляхом регідратації стерильною воношенні 7,5:1 (вага:вага). дою або відповідним буферним розчином перед Фігура 5: Superose 6 хроматографія (DPPC: введенням суб'єкту. пептид 1) комплексів, отриманих при відношенні Розроблений простий спосіб отримання пеп10:1 (вага:вага). тиду або протеїн-(фосфо)ліпідних комплексів, які Фігура 6: Superose 6 хроматографія 14Сволодіють характеристиками, подібними характемічених комплексів пептиду 1 при Ri=3:1. ристикам ЛПВЩ. Цей спосіб може бути використаФігура 7: Superose 6 хроматографія 14Сний для отримання АроА-1 пептид-ліпідних коммічених комплексів пептиду 1 при Ri=4:1. плексів і має наступні переваги: (1) Більшість або Фігура 8: Superose 6 хроматографія 14Свсі з інгредієнтів, що включаються використовумічених комплексів пептиду 1 при Ri=5:1 ються для утворення намічених комплексів, і таким Амфіпатичні альфа-спіральні пептиди або білчином виключається втрата початкового матеріаки, зв'язуючі ліпід білки, пептиди-агоністи АроА-1, лу, яка являє собою загальне явище при інших аналоги апопротеїнів і тому подібне, які застосовні способах. (2) Утворюються ліофілізовані сполуки, в даному винаході, можуть бути синтезовані або які дуже стабільні при зберіганні. Отримані комвироблені з використанням будь-якої відомої фаплекси можуть відтворюватися безпосередньо хівцям методики. Стабільні препарати пептидів, які перед використанням. (3) Отримані комплекси мають тривалі терміни зберігання, можуть бути звичайно не вимагають додаткового очищення отримані шляхом ліофілізації пептидів - або з перед виготовленням лікарських форм або перед отриманням маси для подальшого виготовлення використанням. (4) Виключаються токсичні сполулікарської форми, або з отриманням окремих ки, включаючи детергенти, такі як холат. Крім того, 15 71551 16 за цим способом отримання може бути легко збіз'єднували, потім змішували з ксилолом перед льшений масштаб виробництва і він зручний для ліофілізацією. Пептид і ліпід, обидва можуть бути GMP виробництва (тобто в середовищі без додані в суміш двох розчинників. Альтернативно, ендотоксинів). розчин пептиду в метанолі може бути змішаний з За переважним способом пептид і ліпід з'єдрозчином ліпіду в ксилолі. Необхідно бути оберенують в системі розчинників, яка співрозчиняє кожними, щоб уникнути висалювання пептиду. жний інгредієнт. Для цієї мети повинні бути ретеОтриманий розчин, що містить пептид і ліпід, спільно вибрані пари розчинників, щоб забезпечити льно розчинені в метанолі/ксилолі, ліофілізують з спільне розчинення як амфіпатичного пептиду так і утворенням порошку. гідрофобного ліпіду. Ліофілізований продукт може бути відтворений В одному втіленні білок(ки) або пептид(и), які з отриманням розчину або суспензії пептидтреба взяти в частки, можуть бути розчинені у воліпідного комплексу. З цією метою ліофілізований дному або органічному розчиннику або суміші розпорошок повторно гідратують водним розчином до чинників (розчинник 1). (Фосфо)ліпідний компонент відповідного об'єму (часто до приблизно 5мг пепрозчиняють у водному або органічному розчиннику тида/мл, що зручно для внутрішньовенної ін'єкції). або суміші розчинників (розчинник 2), який змішуПри переважному втіленні ліофілізований порошок ється з розчинником 1, і два розчинники об'єднуповторно гідратують фосфа тно-буферним фізіолоють. Альтернативно, (фосфо)ліпідний компонент гічним розчином або фізіологічним розчином солі. розчиняють безпосередньо в розчині пептиду (білСуміш, можливо, треба буде збовтувати, або ка). Або ж пептид і ліпід можуть бути включені в струшувати для полегшення повторного гідратусистему співрозчинників, тобто суміш здатних змівання і, в більшості випадків, стадія відтворення шуватися розчинників. Досвідчені фахівці зрозуміповинна проводитися при температурі, рівній темють, що в залежності від здатності пептиду або пературі фазового переходу ліпідного компонента білка зв'язуватися з ліпідуми може бути необхідна комплексів, або більшої за неї (Тm). Протягом депосилена або навіть повна солюбілізація (і/або кількох хвилин виходить розчин відтворених ліпідпосилене перемішування) перед ліофілізацією; но-протеїнових комплексів (прозорий розчин, коли таким чином, можуть бути відповідно вибрані комплекси невеликі). розчинники. В аліквотного зразка, отриманого відновленого Відповідне відношення пептиду (білка) до ліпіпрепарату, можна визначити властивості для піддів спочатку визначається емпірично, так що твердження того, що комплекси в препараті мають отримані комплекси володіють відповідними фізибажаний розподіл по розмірах, наприклад, розмірчними і хімічними властивостями, звичайно, але ний розподіл ЛПВЩ. З цією метою може застосоне завжди, такими, що означають схожість по розвуватися гель-фільтраційна хроматографія. У роміру з ЛПВЩ2 або ЛПВЩ3. Молярне відношення бочих прикладах, описаних нижче, використали ліпіду до білка/пептиду повинне бути в інтервалі систему для гель-фільтраційної хроматографії від приблизно 2 до приблизно 200, і переважно, рідинної експрес-хроматографії білків (РЕХБ; від 5 до 50, в залежності від бажаного типу комFPLC) Pharmacia Superose 6. Елюент, що викорисплексів. Приклади таких класів по розміру пептовується містить 150мМ NaCl в деіонізованій воді. тид/ліпідних або протеїн/ліпідних комплексів вклюЗвичайний об'єм зразка рівний 20-200мікролітрам чають, але не обмежуються ними, міцелярні або розчину комплексів, що містить 5мг пептиду/мл. дископодібні частки (звичайно менші, ніж ЛПВЩ3 Швидкість потоку через колонку рівна 0,5мл/хв. Як або ЛПВЩ2), сферичні частки розміру, схожого з стандарти для калібрування колонки використоЛПВЩ2 або ЛПВЩ3, і великі комплекси, які більше вуються серії білків з відомою молекулярною ваЛПВЩ2. ЛПВЩ, що використовуються як стандарт гою і діаметром Стокса, а також людський ЛПВЩ. при хроматографії (фігура 1), є, в основному, сфеБілки і ліпопротеїнові комплекси контролюють по поглинанню або розсіюванню світла при довжині ричними зрілими ЛПВЩ2. Пре-b1 ЛПВЩ є міцеляхвилі 254 або 280нм. рними комплексами аполіпопротеїну і декількох Розчинники, які можуть використовуватися за молекул фосфоліпідів. Пре-b2 ЛПВЩ є дископодіспособом даного винаходу, включають, але не бними комплексами аполіпопротеїну і молекул обмежуються ними, неполярні, полярні, апротонні і фосфоліпідів. Чим більше включено ліпідів (трипротонні органічні розчинники і тому подібне, такі гліцеридів, холестерину, фосфоліпідів), тим більяк: етанол, метанол, циклогексан, 1-бутанол, ізошого розміру буде ЛПВЩ, і його форма змінюєтьпропіловий спирт, ксилол, ТГФ, ефір, дихлормеся. (Пре-b1 ЛПВЩ (міцелярний комплекс) Þ Πретан, бензол і хлороформ. Винахід також включає b2 ЛПВЩ (дископодібний комплекс) Þ ЛПВЩ3 використання сумішей розчинників, так само як (сферичний комплекс) Þ ЛПВЩ2 (сферичний одного розчинника. Крім того, перед використанкомплекс). ням в даних способах органічні розчинники можуть Коли розчинник вибраний і пептид і ліпід бути осушені для видалення води; однак, для девключені, отриману суміш заморожують і ліофіліяких ліпідів, пептидів або білків можуть використозують до сухого залишку. Іноді до суміші для полевуватися гідратовані розчинники або вода. Іншими гшення ліофілізації додають додатковий розчинсловами, відповідним розчинником може бути воник. Цей ліофілізований продукт можна зберігати да, або можна використати гідратовані розчинники протягом тривалих термінів, і він буде залишатися або суміші органічного розчинника/води, однак, стабільним. якщо використовується вода, вона повинна бути В робочих прикладах, описаних нижче, пепвільна від детергенту. Як згадано вище, розчиннитид PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID №:1) і ки, переважно, повинні бути найвищої чистоти (фосфо)ліпід розчиняли окремо в метанолі, 17 71551 18 (щоб уникнути концентрування домішок після ліоконтейнери (наприклад, на дози для одного ввефілізації), і розчинники повинні бути вільні від содення) перед ліофілізацією, і такі невеликі порції лей і часток. Однак немає необхідності в тому, можуть бути вигото влені у вигляді стерильних щоб розчинники були стерильними, оскільки отриодиничних дозованих форм. маний продукт може бути простерилізований пеКомпозиції даного винаходу, висушені під варед або після ліофілізації відомими в фармації куумом, можуть бути представлені в одиничній методами, такими, як способи, описані в дозі або у вигляді контейнера для багаторазового Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th введення дози шляхом асептичного заповнення eds., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania відповідних контейнерів стерильним розчином (1980 і 1990), включених сюди у вигляді посилання перед вакуумною сушкою до передбаченого змісповністю, і в Фармакопеї США /National Formulary ту, приготування бажаних для вакуумної сушки (USP/NF)XVII, включених сюди у вигляді посиланкомпозицій і потім герметичного закупорювання ня повністю. контейнера з одиничною дозою або контейнера Ліпіди, які можуть використовуватися за сподля багаторазового введення дози. Передбачасобом отримання даної композиції, включають, ється, що буде можливість швидкого розчинення але не обмежуються ними, природними і синтезосухої композиції при відтворенні відповідними стеваними (синтетичні) ліпіди і фосфоліпіди, включарильними розчинниками в цих заповнених контейючи фосфоліпіди з невеликими алкільними ланцюнерах in situ з отриманням відповідного стерильногами, яєчний фосфатіділхолін, фосфатіділхолін з го розчину бажаної для введення концентрації. Як соєвих бобів, дипальмітоїлфосфатіділхолін, димивін використаний тут, термін «відповідні контейнеристоїлфосфа тіділхолін, дистеароїлфосфатіділри» означає контейнер, здатний до збереження холін, 1-миристоїл-2-пальмітоїлфосфатіділхолін, стерильної середи, такий як судина, в яку можна 1-пальмітоїл-2-миристоїлфосфатіділхолін, 1вміщувати висушений під вакуумом продукт, що пальмітоїл-2-стеароїлфосфатіділхолін, 1-стеароїлгерметично запечатується корком. Крім того, «від2-пальмітоїлфосфатіділхолін, диолеоїлфосфатідіповідні контейнери» має на увазі відповідність лхолін, діолеоїлфосфатіділетаноламін, дилауроїрозміру, вра ховуючи об'єм розчину, який він повилфосфа тіділгліцеринфосфатіділхолін, фосфатідінен вмістити при відтворенні висушеної під вакуулсерин, фосфатіділетаноламін, фосфатіділінозит, мом композиції; і відповідність матеріалу контейсфингомієлінсфинголіпіди, фосфатіділгліцерин, нера, звичайно скло типу І. Повинно бути дифосфатіділгліцерин, димиристоїлфосфа тіділгзрозуміло, що корки, що використовуються, наприліцерин, дипальмітоїлфосфа тіділгліцерин, дистеаклад, стерильні гумові корки або рівноцінні ним, роїлфосфатіділгліцерин, діолеоїлфосфатіділгліцеповинні бути такими, які забезпечують вищеназварин, димиристоїлфосфатидна кислота, не закупорювання, але які також дають можливість дипальмітоїлфосфатидна кислота, димиристоїлпроникнення з метою введення розчинника, нафосфа тіділетаноламін, дипальмітоїлфосфатіділеприклад, стерильної води для ін'єкцій, USP, нортаноламін, димиристоїлфосфа тіділсерин, дипальмального фізіологічного розчину, USP, або 5% мітоїлфосфатіділсерин, фосфатіділсерин декстрози у воді, USP, для відтворення бажаного головного мозку, сфингомієлін головного мозку, розчину. Ці і інші аспекти придатності контейнерів дипальмітоїлсфингомієлін, дистеароїлсфингомієдля фармацевтичних продуктів, таких як продукти лін, фосфа тидна кислота, галактоцереброзид, винаходу, що розглядається, добре відомі фахівгангліозиди, цереброзиди, дилаурилфосфатіділцям, досвідченим в практичній роботі в області холін, (1,3)-D-манозіл (1,3)дигліцерид, амінофенілфармації. При конкретному втіленні розміри одиглікозид, 3-холестерил--6'ничних доз продукту можуть бути в інтервалі від (гликозілтіо)гексилефирні гліколіпіди і холестерин і приблизно 10мг до 2г пептиду, переважно, в інтерйого похідні. валі від приблизно 100мг до 1г, і з концентрацією Пептиди, які придатні для використання в дапісля відтворення від приблизно 1 до приблизно ному винаході, включають, але не обмежуються 50мг/мл, переважно, від приблизно 2 до 25мг/мл. ними, ті, які описані в трьох заявках, що одночасно Спосіб цього винаходу робить можливим розглядаються [серійні №№, визначені по №№ отримання білково- або пептид/ліпідних комплекреєстру повіреного 9196-0004-999, 9196-0005-999 і сів для парентерального введення, включаючи 9196-0006-999], кожна з яких включена сюди у вивнутрішньовенні, внутрішньочеревні, підшкірні, гляді посилання повністю. внутрішньом'язові і болісні ін'єкції тваринам і люПереважно, хоч в цьому немає необхідності в дям, або для перорального, ректального введення кожному випадку, то, що осадки повинні бути розабо для введення через слизову (наприклад, в чинені або видалені перед змішуванням або перепорожнині рота) і місцевого застосування у тварин мішуванням розчином ліпіду і пептиду або перед і людей, або для експериментів in vitro. ліофілізацією. Ліофілізований порошок, отриманий за спосоСпосіб може використовуватися для великобом цього винаходу може бути регідратований масштабного виробництва пептид/ліпідних комбезпосередньо перед ін'єкцією або, альтернативплексів, амфіпатичних пептид/(фосфо)ліпідних но, може вводитися сам ліофілізований порошок, комплексів, зв'язуючий ліпід білок/(фосфо)ліпідних безпосередньо. Ліофілізований порошок включає, комплексів і/або АроАI пептидний анаале не обмежується цим, ліпіди і пептиди, які здалог/(фосфо)ліпідних комплексів. Ліофілізований тні утворювати комплекси у вигляді везикул, ліпоматеріал може бути отриманий у вигляді об'ємного сом, часток, включаючи сферичні або дископодібні препарату, або ж змішаний пептид/ліпідний розчин частки, міцели і тому подібне. Щоб відтворити або може бути розділений на порції в невеликі регідратувати ліофілізований порошок, розчин 19 71551 20 вибирається в залежності від бажаного кінцевого додавали ксилол до кінцевої концентрації, рівної застосування. Для фармацевтичного застосування 36%. Відбирають зразки отриманого розчину для може бути використаний будь-який стерильний подальшого аналізу з допомогою гельрозчин. Крім того, для деяких випадків застосуфільтраційнії хроматографії. Розчини заморожування переважні буферні розчини, і ці розчини ють в рідкому азоті і ліофілізують до сухого залишвключають, але не обмежуються ними, фосфат, ку під вакуумом. Зразок, що містить 20мг пептиду 1 цитрат, трис, барбітал, ацетат, гліцин-НСІ, сукци(SEQ ID №:1) і 50мг ДПФХ розчиняли в стерильнат, какодилат, борну кислоту-бур у, аммедіол і ному фізіологічному розчині солі (0,9% NaCl), пекарбонат. ремішували і нагрівали до 41°С протягом декільЛіофілізований порошок даного винаходу мокох хвилин до отримання прозорого розчину же бути сформований із застосуванням будь-якого відтворених отриманих пептид/фосфоліпідних способу ліофілізації, відомого фахівцям, включаюкомплексів. чи, але не обмежуючись цим, сушку із заморожеПРИКЛАД: ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ ВИКОРИСТАНного стану, при якій утримуючий пептид/ліпід розНЯ ФОСФОЛІПІДУ чин піддають заморожуванню з подальшим З метою визначення умов отримання комплеквипаровуванням при зниженому тиску. сів часто зручно отримати невеликі кількості комСпосіб може також бути відповідним для зберіплексів для вивчення властивостей. Ці препарати гання сполук, які, в іншому випадку, можуть бути містили один мг пептиду і були отримані таким нестабільні або нерозчинні у відсутність ліпідів. чином. Один мг пептиду 1 (SEQ ID №:1) розчиняли Цей спосіб може застосовуватися для виготов 250мкл метанолу марки для ВЕРХ (Perkin Elmer) влення продуктів для лікування або профілактики в 1,0мл прозорій скляній судині з кришкою (Waters захворювань людини, включаючи таке застосуttWAT025054). Розчиненню пептиду сприяє перівання, як спільне представлення антигенів у вакодичне струшування протягом 10 хвилин при кімцинах, лікування або профілактику дисліпопротеїнатній температурі. Після цього часу ще можна немій, включаючи, але не обмежуючись ними, було побачити невелику кількість нерозчинених гіперхолестеринемію, гіпертригліцеридемію, низьчасток речовини, але це не надавало несприятликий рівень ЛПВЩ, дефіцит аполіпопротеїну А-I, вого впливу на результати. До цієї суміші додавасерцево-судинних захворювань, таких як атероли зразок основного розчину 100мг/мл в метанолі, склероз, септичного шоку, або інфекційних защо містить одну з кількостей 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10 хворювань. або 15мг ДПФХ (Avanty Polar Lipids, 99% чистоти, Спосіб можна застосовувати для отримання продукт #850355). Об'єм суміші доводять до комплексів, які могли б використовуватися як носії 400мкл доданням метанолу, і суміш додатково для лікарських речовин, таких як переносники (веперіодично перемішують стр ушуванням протягом ктори) (для доставки лікарських речовин, ДНК, 10 хвилин при кімнатній температурі. У цей час в генів), наприклад, в печінку або екстрапечінкові пробірках можна було бачити дуже невелику кільклітини, або як засоби для захоплення і виведення кість нерозчиненого матеріалу. У кожну пробірку токсинів (наприклад, пестицидів, ЛПС і т.д.). Або ж, додавали 200мкл ксилолу (Sigma-Aldrich 99% чисспосіб може бути використаний для отримання тоти, марки для ВЕРХ), і пробірки струшували прокомплексів для систем дослідження in vitro або для тягом 10 секунд кожну. Вгорі кожної пробірки провикористання в те хнології отримання зображень. бивали два маленьких отвори голкою для шприца При конкретних втіленнях спосіб може викори2Q, пробірки заморожували протягом 15 секунд стовуватися для отримання комплексів аналогів кожну в рідкому азоті, і пробірки ліофілізували АроА-I (включаючи агоністи, але не обмежуючись протягом ночі під зниженим тиском. У кожну пробіними), які можуть використовуватися при діагносрку додавали 200мкл 0,9% розчину NaCl. Пробірки тичних дослідженнях in vitro і як маркери для пострушували протягом 20 секунд кожну. У цей час пуляцій і субпопуляцій ЛПВН. В інших конкретних розчини в пробірках ставали на вигляд молочнивтіленнях комплекси агоністів АроА-I можуть викоми. Потім пробірки інкубували на водяній бані прористовуватися для іммунодосліджень або для техтягом 30 хвилин при 41°С. Розчини у всіх пробірнології отримання зображень (наприклад, досліках ставали прозорими (тобто на вигляд схожими дження КАТ, і ЯМР-томографією). на воду), за винятком розчину в пробірці, що місНаступні приклади призначені для ілюстрації тить 15мг ДПФХ, який залишався молочним. даного винаходу і не повинні жодним образом Щоб визначити, чи всі фосфоліпіди, які викотлумачитися як його обмеження. ристали в комплексних препаратах, дійсно з'явиПРИКЛАД: ОТРИ МАННЯ ПЕПТИД-ЛІПІДНОГО лися у фракціях з колонки, відповідних пікам поКОМПЛЕКСУ ШЛЯХОМ СПІЛЬНОЇ ЛЮФІЛІЗАЦІЇ глинання на хроматограмі, елюат з колонки з Для отримання пептид/ліпідних комплексів вивідтворених пептид/ліпідних комплексів збирали у користовується наступна методика. фракціях по 1 або 2мл, і фракції піддавали ферПептид 1 (PVDLLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ментативному дослідженню на вміст фосфоліпіду ID №:1) (22,4мг) розчиняли в метанолі до концентза допомогою набору BioMerieux Phospholipides рації 3,5мг/мл шляхом інкубації протягом декількох Enzymatique PAP 150 (#61491) у відповідності до хвилин і перемішування шляхом періодичного інструкцій, прикладених виробником. струшування. До цього розчину додавали дипальПрепарати комплексів можуть бути також вимітоїлфосфатіділхолін (ДПФХ) в метанолі (основготовлені у великому масштабі. Приклад одного ний розчин 100мг/мл), так що кінцеве відношення такого препарату описаний вище. Ці комплекси ДПФХ/пептид становило 2,5:1 (вага/вага). Цей використали для експериментів in vivo. розчин перемішують струшуванням. До розчину 21 71551 22 Фігура 1: Superose 6 хроматографія зрілих Зразок, що містить комплекси з 15:1 HDL2, отриманих шляхом ультрацентрифугування ДПФХ:пептид 1 (вага/вага) не піддавався Superose з 200мкл людської сироватки. Хроматограф пока6 хроматографії, оскільки він був каламутним, що зує поглинання при 254нм. Об'єм елюювання передбачає присутність великих часток. =14,8мл, який відповідає діаметру по Стоксу, рівДля кожного з вищенаведених експериментів ному 108 Ангстрем (див. таблицю 1). не спостерігалося значної кількості фосфоліпіду в Фігура 2 (низ): Superose 6 хроматографія комякій-небудь інший з фракцій, крім фракцій, що місплексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при відношенні тять матеріал, елюйований відповідно до піків пов інкубаційній суміші (Ri, що визначається як відглинання (див. фіг.2-8). Це свідчить про те, що ношення всієї кількості фосфоліпіду до всієї кільфактично всі фосфоліпіди (в межах помилки екскості пептиду в початковій суміші), рівному 1:1 (ваперименту при дослідженні) були включені в комга/вага), як описано вище (невеликий об'єм плекси. Цей експеримент показує, що шля хом зміпрепарату). Об'єми елюювання піків поглинання ни первинного відношення фосфоліпідів до =16,2мл і 18,1мл, які відповідають часткам з діапептидів, можна формувати гомогенні комплекси метрами Стокса, рівним 74 і 82 Ангстрем, які були різних розмірів (менших або великих ЛПВЩ). меншим, ніж у ЛПВЩ. 87% фосфоліпіду, нанесеноВизначення характеристик комплексів з викого на колонку, знаходили у фракціях, відповідних ристанням міченого 14с пептида 1 пікам поглинання (див. таблицю 1). Пептидофосфоліпідні комплекси, що містять 14 Фігура 2 (верх): Superose 6 хроматографія С-мічений пептид 1 (специфічна активність комплексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рів159000роз./хв/мг пептиду по вазі, приймаючи зміст ному 2:1 (вага/вага), як описано вище. Об'єм елюпептиду, рівний 50%) отримували шляхом спільної ювання піка поглинання =16,4мл (77 Ангстрем), що ліофілізації, як описано вище. Препарати, кожний, відповідає часткам меншим, ніж ЛПВЩ. 70% фосмістили 1мг пептиду і 3, 4 або 5мг ДПФХ по вазі. фоліпіду, нанесеного на колонку, знаходили у Після відтворення комплексів в 200мкл 0,9% NaCl, фракціях, відповідних піку поглинання (див. 20мкл (100мкг) комплексів наносили на колонку таблицю 1). Pharmacia Superose 6, використовуючи 0,9% NaCl Фігура 3 (низ): Superose 6 хроматографія комв якості рідкої фази при швидкості потоку, рівної плексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рівному 0,5мл/хв. Після витримки з 5мл (вільний об'єм ко3:1 (вага/вага), як описано вище. Об'єм елююванлонки =7,7мл) збирали 1мл фракції. Зразки, що ня піка поглинання=16,0мл (80 Ангстрем), відмістять 20мкл фракцій, досліджували на зміст фоповідаючи часткам меншим, ніж ЛПВЩ. 79% сфоліпідів, використовуючи ферментативне досліфосфоліпіду, нанесеного на колонку, знаходили дження BioMerieux. Залишок кожної фракції досліу фракціях, відповідних піку поглинання (див. джували протягом 3 хвилин в рідинному таблицю 1). сцинтиляційному лічильнику Wallach 1410 Фігура 3 (верх): Superose 6 хроматографія (Pharmacia), використовуючи програму Easy Count. комплексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рівРезультати цих аналізів показані на фіг.6-8. Можна ному 4:1 (вага/вага), як описано вище. Об'єм елюпобачити, що переважаюча більшість як фосфоліювання піка поглинання =15,7мл, (90 Ангстрем), піду, так і пептида виявляються разом в декількох відповідаючи часткам меншим, ніж ЛПВЩ. фракціях з піками в приблизно 16, 16 і 15мл для 106% фосфоліпіду, нанесеного на колонку, знакомплексів, що отримуються при відношенні ходили у фракціях, відповідних піку поглинання ДПФХ:пептиду, рівного 3:1, 4:1 і 5:1, відповідно. (див. таблицю 1). Характеристики УΦ поглинання для цих зразків Фігура 4 (низ): Superose 6 хроматографія компоказують, що комплекси елююються з колонки в плексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рівному об'ємах 15,1, 14,7 і 14,4мл для комплексів, отри5:1 (вага/вага), як описано вище. Об'єм елююванманих з відношеннями ДПФХ:пептид, рівними 3:1, ня піка поглинання =15,1мл, (104 Ангстрем), відпо4:1 і 5:1, відповідно (мертвий об'єм трубопроводу відаючи часткам меншим, ніж ЛПВЩ. 103% між колектором фракцій і проточним осередком фосфоліпіду, нанесеного на колонку, знаходили для реєстрації УФ поглинання рівний 1,3мл, що у фракціях, відповідних піку поглинання (див. пояснює легку невідповідність між об'ємами елютаблицю 1). ювання, які виміряні за допомогою дослідження Фігура 4 (верх): Superose 6 хроматографія радіоактивності/фосфоліпіду і УФ поглинання). комплексів ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рівОб'єми елюювання відповідають діаметрам Стокному 7,5:1 (вага/вага), як описано вище. Об'єм са, рівним 106, 114 і 120 Ангстрем для комплексів елюювання піка поглинання =13,6мл, (134 Ангстз Ri 3:1, 4:1 і 5:1, відповідно. рем), відповідаючи часткам більшим, ніж ЛПВЩ. 92% фосфоліпіду, нанесеного на колонку, знахоТаблиця 1 дили у фракціях, відповідних піку поглинання (див. таблицю 1). % нанесеноВідношення Відносний го фосфоліФігура 5: Superose 6 хроматографія комплексів Об'єм ДПФХ:пептид елюювання розмір ДПФХ:пептид 1, отриманих при Ri, рівному 10:1 піду в піку 1 часток* (вага/вага), як описано вище. Об'єм елюювання поглинання піка поглинання =13,4мл, (138 Ангстрем), знову 1 2 3 4 відповідаючи часткам більшим, ніж ЛПВЩ. ЛПВЩ 14,8 103% фосфоліпіду, нанесеного на колонку, зна1:1 16,2 і 18,1 Менше 87% ходили у фракціях, відповідних піку поглинання 2:1 16,4 Менше 70% (див. таблицю 1). 3:1 16,0 Менше 79% 23 71551 Продовження табл.1 1 4:1 5:1 1,5:1 10:1 15:1 2 15,7 15,1 13,6 13,4 НЗ** 3 Менше Менше Більше Більше НЗ * Відносний до розміру часток ЛПВЩ **НЗ, не здійснювалося 4 106% 103% 92% 103% НЗ 24 Даний винахід не обмежується об'ємом описаних конкретних втілень, які призначені тільки в якості ілюстрації окремих аспектів цього винаходу, і функціонально еквівалентні методи і компоненти входять в об'єм цього винаходу. Безумовно, різні модифікації цього винаходу в доповнення до представлених і описаних тут, стануть очевидними досвідченим фахівцям з попереднього опису і супроводжуючих малюнків. Мається на увазі, що такі модифікації попадають в об'єм 25 Комп’ютерна в ерстка О. Воробей 71551 Підписне 26 Тираж 37 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601