Агоніст аполіпопротеїну а-і (аро а-і), мультимірний аро а-і (варіанти) та їх застосування в лікуванні дисліпідемічних порушень

1. Агоніст аполіпопротеїну A-I (Аро А-І), що включає (і) 15 - 29 членний пептид або аналог пептиду, який утворює амфіпатичну α-спіраль в присутності ліпідів, і який включає структурну формулу (I) Z1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(І) X14-X15-X16-X17-X18-X19-Х20-Х21-Х22-Х23-Z 2 або його фармацевтично прийнятну сіль, де Х1 являє собою Pro (Р), Ala (A), Gl y (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) або D-Pro (p); X2 являє собою аліфатичний залишок; Х3 являє собою Leu (L) або Phe (F); Х4 являє собою Glu (Е); Х5 являє собою аліфатичний залишок; Х6 являє собою Leu (L) або Phe (F); Х7 являє собою Leu (L) або Glu (E); X8 являє собою Asn (N) або Gln (Q); Х9 являє собою Leu (L); Х10 являє собою Leu (L), Trp (W) або Gl y (G); Х11 являє собою кислий залишок; Х12 являє собою Arg (R); Х13 являє собою Leu (L) або Gly (G); X14 являє собою Leu (L), Phe (F) або Gly (G); X15 являє собою Asp (D); 2 (19) 1 3 71552 4 Х6 являє собою Phe(F); X8 являє собою Asn (N) або Gln (Q); X9 являє собою Leu (L); X9 являє собою Leu (L); Х10 являє собою Leu (L), Trp (W) або Gl y (G); Х10 являє собою Leu (L), Trp (W) або Gl y (G); Х13 являє собою Leu (L), Gly (G); Х11 являє собою Glu (E); X14 являє собою Leu (L), Phe (F), Gl y (G); X12 являє собою Arg (R); Х16 являє собою Ala (A); Х13 являє собою Leu (L) або Gly (G); X17 являє собою Leu (L); Х14 являє собою Leu (L), Phe (F) або Gly (G); Х21 являє собою Leu (L); і X15 являє собою Asp (D); принаймні один з Х4, Х7, X8 , Х11, Х12, Х15, X18, X19, Х16 являє собою Ala (A); X22 і Х23 консервативно заміщені іншим залишком. X17 являє собою Leu (L); 6. Агоніст Аро А-І за п.3, який відрізняється тим, X18 являє собою Asn (N) або Gln (Q); що в ньому гідрофобні залишки фіксовані у відпоX19 являє собою Lys (К); відності зі структурною формулою (І), і принаймні X20 являє собою Lys (К); один нефіксований залишок консервативно заміХ21 являє собою Leu (L); щений іншим залишком. Х22 являє собою Lys (К); і 7. Агоніст Аро А-І за п.6, який відрізняється тим, Х23 відсутній або являє собою Lys (К). що в ньому 15. Агоніст Аро А-І за п.14, який відрізняється тим, Х4 являє собою Glu (Е); що Х23 відсутній. Х7 являє собою Glu (Е); 16. Агоніст Аро А-І за п.14, який відрізняється тим, X8 являє собою Asn (N) або Gln (Q); що кожний з Х10, Х13 і Х14 відмінний від Gly (G). Х11 являє собою Asp (D) або Glu (E); 17. Агоніст Аро А-І за п.14, який відрізняється тим, Х12 являє собою Arg (R); що один з Х10, Х13 і Х14 являє собою Gly (G), а інші Х15 являє собою Asp (D); залишки відмінні від Gly (G). X18 являє собою Asn (N) або Gln (Q); 18. Агоніст Аро А-І за п.1, який відрізняється тим, X19 являє собою Lys (К); що має послідовність, вибрану з групи, що складаХ20 являє собою Lys (К); ється з: X22 являє собою Lys (К); Х23 відсутній або являє собою Lys (К); і принаймні один з Х1, Х2 , Х3 , Х5, Х6, Х9 , Х10 , Х13, Х14, Х16, Х17, X21 консервативно заміщений іншим залишком. 8. Агоніст Аро А-І за п.6, який відрізняється тим, що у нього Х3 являє собою Leu (L) або Phe (F), Х6 являє собою Phe (F), Х9 являє собою Leu (L), Х10 являє собою Leu (L), Trp (W) або Gly (G) і принаймні один з Х1, Х2, Х5, Х13 , Х14, Х16 , Х17 і Х21 консервативно заміщені іншим залишком. 9. Агоніст Аро А-І за п.5 або 7, який відрізняється тим, що у нього залишок, що заміняється, відноситься до тієї ж підкатегорії, що і заміщений залишок. 10. Агоніст Аро А-І за п.1, який відрізняється тим, що являє собою делетовану форму структурної формули (І). і ацилована за N-кінцем і/або амідована або есте11. Агоніст Аро А-І за п.10, який відрізняється тим, рифікована за С-кінцем його форма. що у нього один спіральний виток пептиду або 19. Мультим пептидного аналога видалено. ірний агоніст АроА-І, який відрізняє ться тим, що 12. Агоніст Аро А-І за п.1, який відрізняється тим, виявляє принаймні 38% LCAT-активуючої активнощо являє собою 22-23 - членний пептид або пепсті в порівнянні з людським АроА-І і має структурну тидний аналог структурної формули (І). формулу (II) 13. Агоніст Аро А-І за п.12, який відрізняється тим, HH-[LLm-HH]n-LLm-HH (II) що у нього або є фармацевтично прийнятною його сіллю, де: "-" між залишками означає -C(O)NH-, кожний m являє собою незалежно ціле число від 0 Z1 являє собою Н 2N- і до 1; Z2 являє собою -С(O)ОН або його сіль. n являє собою ціле число від 0 до 10; 14. Агоніст Аро А-І за п.13, який відрізняється тим, кожний НН являє собою незалежно пептид або що у нього пептидний аналог за п.1; Х1 являє собою Pro (Р), Ala (A), Gl y (G), Asn (N), кожний LL являє собою незалежно біфункціональAsp (D), Gln (Q) або D-Pro (p); ний лінкер; і Х2 являє собою Ala (A), Val (V) або Leu (L); кожний "-" незалежно означає ковалентний зв'язок. Х3 являє собою Leu (L) або Phe (F); 20. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.19, який відX4 являє собою Glu (E); різняється тим, що біфункціональний лінкер може Х5 являє собою Leu (L); бути розщеплений. Х6 являє собою Phe(F); 21. Мультимірний агоніст АроА-І, за п.19, який відX7 являє собою Leu (L) або Glu (E); різняється тим, що n є 0. 5 71552 6 22. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.21, який відрізняється тим, що m є 0. 23. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.19, який відрізняється тим, що кожний НН являє собою незалежно пептид за п.13. (V) 24. Мультимірнийагоніст Аро А-І за п.19, який відрізняється тим, що кожний НН являє собою незалежно пептид за п.14. 25. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.19, який відрізняється тим, що кожний НН являє собою незалежно пептид за п.18. або є фармацевтично прийнятною його сіллю, де: 26. Мультимірний агоніст АроА-І, який відрізнякожний Х являє собою незалежно HH-[LLm-HH]nється тим, що виявляє принаймні 38% LCATLLm-HH; активуючої активності в порівнянні з людським кожний НН являє собою незалежно пептид або АроА-І і який має структурну формулу (III) пептидний аналог за п.1; X-N ya-X( ya-1)-(N yb-X( yb-1)) p (III) кожний LL являє собою незалежно біфункціональабо є фармацевтично прийнятною його сіллю, де: ний лінкер і кожний Х являє собою незалежно HH-[LLm-HH]nкожний n являє собою незалежно ціле число від 0 LLm-HH; до 1; кожний НН являє собою незалежно коровий пепm являє собою ціле число від 0 до 8; тид структури (І) або аналог, або мутантну, зрізаR1 являє собою -OR або -NRR; і ну, з внутрішніми делеціями або розширену форму кожний R являє собою незалежно -Н, (C1-C6) алкійого, як описано тут; льну, (С1-С6) алкенільну, (С1-С6) алкінільну, (С5кожний LL являє собою незалежно біфункціональС20) арильну, (С6-С26) алкарильну групи, 5-20 ний лінкер; і членну гетероарильну або 6-26 - членну алкгетекожний m являє собою незалежно ціле число від 0 роарильну гр упу. до 1; 34. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.33, який відn являє собою ціле число від 0 до 8; різняється тим, що біфункціональний лінкер може Nya і Nyb являють собою незалежно мультифункцібути розщеплений. ональний зв'язуючий радикал, де У а і У b представ35. Мультимірний агоніст АроА-І, за п.33, який відляють число функціональних груп на Nya і Nyb відрізняється тим, що n є 0. повідно; 36. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.35, який відкожний У а і У b являє собою незалежно ціле число різняється тим, що m є 0. від 3 до 8; 37. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.33, який відр являє собою незалежно ціле число від 0 до 7; різняється тим, що кожний НН являє собою незакожний "-" незалежно означає ковалентний зв'язок. лежно пептид за п.13. 27. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.26, який від38. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.33, який відрізняється тим, що біфункціональний лінкер може різняється тим, що кожний НН являє собою незабути розщеплений. лежно пептид за п.14. 28. Мультимірний агоніст АроА-І, за п.26, який від39. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.33, який відрізняється тим, що n є 0. різняється тим, що кожний НН являє собою неза29. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.28, який відлежно пептид за п.18. різняється тим, що m є 0. 40. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом, який відрі30. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.26, який відзняється тим, що включає агоніст АроА-І і ліпід, різняється тим, що кожний НН являє собою незаде агоніст АроА-І являє собою пептид або пептидлежно пептид за п.13. ний аналог за п.1, мультимірний агоніст АроА-І за 31 Мультимірний агоніст АроА-І за п.26, який відп.19, мультимірний агоніст АроА-І за п.26, або мурізняється тим, що кожний НН являє собою незальтимірний агоніст Аро А-І за п.33. лежно пептид за п.14. 41. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, 32. Мультимірний агоніст Аро А-І за п.26, який відякий відрізняється тим, що агоніст АроА-І являє різняється тим, що кожний НН являє собою незасобою пептид за п.12. лежно пептид за п.18. 42. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, 33. Мультимірний агоніст АроА-І , який відрізняякий відрізняється тим, що агоніст АроА-І являє ється тим, що виявляє принаймні 38% LCATсобою пептид за п.13. активуючої активності в порівнянні з людським 43. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, АроА-І і який має структурні формули (IV) або (V) який відрізняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пептид за п.14. 44. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, який відрізняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пептид за п.18. (IV) 45. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, який відрізняється тим, що ліпід являє собою сфінгоміелін. 7 71552 8 46. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, 58. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що агоякий відрізняється тим, що знаходиться в формі ніст АроА-І знаходиться в формі фармацевтичної ліофілізованого порошку. композиції, причому вказана композиція включає 47. Комплекс агоніста АроА-І з ліпідом за п.40, агоніст АроА-І і фармацевтично прийнятний носій, який відрізняється тим, що знаходиться в формі наповнювач і розчинник. розчину. 59. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 48. Фармацевтична композиція, яка відрізняється агоніст АроА-І знаходиться в формі комплексу аготим, що включає агоніст Аро А-І і фармацевтично ніст АроА-І-ліпід, причому вказаний комплекс прийнятний носій, наповнювач або розчинник, в включає агоніст АроА-І і ліпід. якому агоніст АроА-І являє собою пептид або пеп60. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що тидний аналог за п.1, мультимірний агоніст АроА-І порушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соза п.19, мультимірний агоніст АроА-І за п.26, або бою гіперхолестеринемію. мультимірний агоніст АроА-І за п.33. 61. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 49. Фармацевтична композиція за п.48, яка відрізпорушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пепбою серцево-судинне захворювання. тид за п.12. 62. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 50. Фармацевтична композиція за п.48, яка відрізпорушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пепбою атеросклероз. тид за п.13. 63. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 51. Фармацевтична композиція за п.48, яка відрізпорушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пепбою рестеноз. тид за п.14. 64. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 52. Фармацевтична композиція за п.48, яка відрізпорушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соняється тим, що агоніст АроА-І являє собою пепбою недостатність ЛПВП або АроА-І. тид за п.18. 65. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що 53. Фармацевтична композиція за будь-яким з порушення, пов'язане з дисліпідемією, являє сопп.48-52, яка відрізняється тим, що агоніст АроА-І бою гіпертригліцеридемію. знаходиться в формі комплексу агоніст АроА-І66. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що ліпід, і згаданий комплекс включає агоніст АроА-І і порушення, пов'язане з дисліпідемією, являє соліпід. бою метаболічний синдром. 54. Фармацевтична композиція за п.53, яка відріз67. Спосіб лікування суб'єкта, що страждає на сепняється тим, що комплекс агоніст АроА-І-ліпід тичний шок, причому вказаний спосіб включає знаходиться в формі ліофілізованого порошку. стадію введення суб'єкту е фективної кількості аго55. Спосіб лікування суб'єкта, що страждає на ніста АроА-І за п.1. порушення, пов'язані з дисліпідемією, причому 68. Спосіб за п.67, який відрізняється тим, що вказаний спосіб включає стадію введення суб'єкту вказаний суб'єкт є людиною. ефективної кількості агоніста АроА-І за п.1. 69. Спосіб за п.67, який відрізняється тим, що 56. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що приблизно від 0,5мг/кг до 100мг/кг агоніста АроА-І вказаний суб'єкт є людиною. вводять вказаному суб'єкту. 57. Спосіб за п.55, який відрізняється тим, що приблизно від 0,5 мг/кг до 100 мг/кг агоніста АроА-І вводять вказаному суб'єкту. 1. Вступ Винахід стосується композицій агоністу аполіпопротеїну А-І (Аро А-l) для лікування порушень, пов'язаних з дісліпопротеїнемією, включаючи гіперхолестеринемію, серцево-судинні захворювання, атеросклероз, рестеноз, і інших порушень, таких як септичний шок. 2. Передумови винаходу Циркулюючий холестерин переноситься в ліпопротеїнами плазми крові -частками, що складаються з комплексу ліпіду і білку, які транспортують ліпіди в крові. Ліпопротеїни низької щільності (ЛПНЩ) і ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) є головними переносниками холестерину. Вважають, що ЛПНЩ відповідають за доставку холестерину з печінки (де вони синтезуються або виходять з харчових джерел) до позапечіночних тканин організму. Термін "зворотний транспорт холестерину" описує транспорт холестерину з позапечіноч них тканин до печінки, де вони зазнають катаболізму і виводяться. Вважають, що ЛПВЩчастки грають головну роль в процесі зворотного транспорту, працюючи як прибиральники тканинного холестерину. Зв'язок підвищення рівня холестерину в сироватці з розвитком коронарної серцевої недостатності очевидний. Наприклад, атеросклероз являє собою повільно прогресуючу хворобу, яка характеризується накопиченням холестерину в стінках артерій. Очевидно, що ліпіди, які нагромаджуються в атеросклеротичних пошкодженнях, насамперед, мають походження з ЛПНЩ плазми, і таким чином, ЛПНП стали популярними під назвою "поганий" холестерин. Навпаки, рівень ЛПВЩ в сироватці зворотно корегує з розвитком коронарних захворювань - насправді, припускають, що високий рівень ЛПВЩ в сироватці є негативним чинником ризику. Припускають, що високий рівень 9 71552 10 ЛПВЩ в плазмі є не тільки захистом проти серцерозвитком ішемічної хвороби серця. Наприклад, во-судинних хвороб, але насправді може викликапри атеросклерозі холестерин, отриманий з цирти навіть регресію атеросклеротичних бляшанок кулюючих ЛПНЩ, нагромаджується в стінках арте(напр. див. Badimon et al., 1992, Circulation, 86 рій, приводячи до формування великих бляшанок, (Suppl.Ill): 86-94). Таким чином, ЛПВП стали попуякі ускладнюють кровоток, в результаті приводячи лярними під назвою "хороший" холестерин. до утворення тромбу, що закупорює артерію, що 2.1. Транспорт холестерину викликає серцевий напад або інсульт. Систему транспорту жирів можна поділити на Кількість внутрішньоклітинного холестерину, два шляхи: екзогенний шлях для холестерину і що вивільняється з ЛПНЩ, контролює клітинний тригліцеридів, що всмоктуються з кишечнику, і метаболізм холестерину. Накопичення клітинного ендогенний шлях для холестерину і тригліцеридів, холестерину, отриманого з ЛПДНЩ і ЛПНЩ, контщо попадають в кровоносне русло з печінки і інролює три процеси: по-перше, зменшує синтез ших непечінкових тканин. клітинного холестерину шляхом вимкнення синтеЗа екзогенного шляху харчові жири упаковузу HMGCo A-редуктази - ключового ферменту шляються в ліпопротеїнові частки, звані хіломікронаху біосинтезу холестерину. По-друге, надходження ми, які попадають в кровоносне русло і доставляхолестерину отриманого з ЛПНП запускає накопиють свої тригліцериди до жирових тканин (або чення холестерину шляхом активації АС АТдепо) і до м'я зів (для окислення і виходу енергії). клітинного ферменту, що перетворює холестерин Інші хіломікрони, що містять ефір холестерину, в ефір холестерину, який відкладається потім у видаляються з кровоносного русла за допомогою вигляді накопичувальних крапель. По-третє, накоспецифічних рецепторів, виявлених тільки на кліпичення холестерину всередину клітини керує метинах печінки. Цей холестерин потім знову стає ханізмом зворотного зв'язку, який інгібує клітинний доступним для клітинного метаболізму або для синтез нових ЛПНЩ рецепторів. Таким чином, кліповторного циклу у позапечінкових тканинах у витини ніби-то настроюють компліментарність своїх гляді ліпопротеїнів плазми. ЛПНЩ рецепторів, таким чином, щоб всередину За ендогенного шляху, печінка секретує великі проникала достатня кількість холестерину для ліпопротеїни дуже низької щільності (ЛПДНЩ) в задоволення метаболічних потреб клітини, не прикровоносне русло. Серцевина ЛПДНЩ складаєтьводячи до надмірного накопичення (див. Brown & ся в основному з тригліцеридів, синтезованих в Goldstein, In, The Pharmacological Basis of Theraпечінці, і невеликої кількості ефіру холестерину peutics, 8th Ed., Goodman & Oilman, Pergamon (або синтезованих в печінці або отриманих з хілоPress, NY, 1990, Ch.36, pp.874-896). мікронів). На поверхні ЛПДНЩ переважають два 2.2. Зворотний транспорт холестерину основних білки: апопротеїн В-100 і апопротеїн Е. Периферичні (непечінкові) клітини отримують Коли ЛПДНЩ досягають капілярів жирових тканин свій холестерин шляхом комбінації локального або м'язів, їх тригліцериди екстрагуються, і внаслісинтезу і захоплення раніше сформованого стеридок цього утвориться новий вид частки, яка менну з ЛПДНЩ і ЛПНЩ. Навпаки, зворотний трансшає в розмірі і збагачується ефіром холестерину, порт холестерину (ЗТХ) являє собою шлях, яким але при цьому зберігає два своїх апопротеїни. холестерин з периферичних клітин може повернуТака частка називається ліпопротеїном проміжної тися в печінку для повторного циклу у позапечінщільності (ЛППЩ). кові тканини або для виведення в кишечник в У людини приблизно половина часток ЛППЩ складі жовчі, або в модифікованій або окисленій швидко видаляється з циркуляції (в межах двохформі у вигляді жовчних кислот. Шлях ЗТХ являє шести годин після утворення), оскільки вони добре собою спосіб виведення холестерину з більшості зв'язуються з печінковими клітками, які екстрагупозапечінкових тканин і є дуже важливим для підють їх холестерин, утворюючи нові ЛПДНЩ і жовчтримки структури і функцій більшості клітин в орні кислоти. ЛППЩ частки, не захоплені печінкою, ганізмі. залишаються в кровотоці довше. Апопротеїн Ε ЗТХ складається в основному з 3 кроків: а) видисоціює з циркулюючих часток, таким чином, пехід холестерину, початкове видалення холестериретворюючи їх в ЛПНЩ, які містять апопротеїн Вну з різних пулів периферичних кліток, в) естери100 як єдиний білок. фікація холестерину шляхом впливу лецитин: Спочатку печінка захоплює і руйнує велику чахолестеринацилтрансферази (LCAT), що запобігає стину холестерину до жовчних кислот, які є кінцеповторному входженню в клітини холестерину, що вими продуктами метаболізму холестерину. За ховже вийшов, з) захоплення/доставка ефіру холесплення часток, що містять холестерин, терину ЛПВЩ в клітини печінки. Шлях ЗТХ опосеопосередковано рецепторами ЛПНЩ, які у високій редковується ЛПВЩ. ЛПВЩ являє собою загальконцентрації є на гепатоцитах. Рецептори ЛПНЩний термін для ліпопротеїнових часток, які зв'язують як апопротеїн Е, так і апопротеїн В-100, і характеризуються своєю високою щільністю. Говідповідають за скріплення і видалення як ЛППЩ, ловними ліпідними складовими комплексів ЛПВЩ так і ЛПНЩ з циркуляції. Афінність апопротеїну Ε є різні фосфоліпіди, холестерин (ефір холестеридо рецептору ЛПНЩ більше афінності апопротеїну ну) і тригліцериди. Найбільш значущими компонеВ-100. У результаті ЛПНЩ частки мають велику нтами аполіпопротеїну є А-І і А-ІІ, які і визначають тривалість життя в циркуляторному руслі, чому функціональні характеристики ЛПВЩ; а також ЛППЩ частки - ЛПНЩ циркулюють приблизно 2,5 присутні мінорні кількості аполіпопротеїнів С-І, С-ІІ, дні до скріплення з рецепторами ЛПНЩ в печінці і С-ІІІ, D, Е, J і т.д. ЛПВЩ мають широку різноманітінших тканинах. Високий рівень ЛПНЩ (поганого ність різних розмірів і існують в різних сполученнях холестерину) в сироватці позитивно пов'язаний з вищезазначених складових в залежності від стану 11 71552 12 реконструкції протягом метаболічного касксильні залишки холестерину, виробляючи таким каду ЗТХ. чином ефір холестерину (що залишаються в Ключовим ферментом, що бере участь в ЗТХ, ЛПВЩ) і лізолецитин. Для LCAT реакції АроА-l є LCAT. LC AT в основному утворюється в печінці і потрібний як активатор; тобто АроА-l є натуральциркулює в плазмі, пов'язаним з фракцією ЛПВЩ. ним спів фактором LCAT. Перетворення холестеLCAT перетворює отриманий з клітин холестерин рину в його ефір обмежене просторово в частках в ефір холестерину, який потім секвеструється в ЛПВЩ, що запобігає зворотному входу холестериЛНВЩ, призначених для видалення. Білкину до клітини, внаслідок чого ефір холестерину переносники ефіру холестерину (БПЕХ) і білкипризначений для видалення. Ефір холестерину в переносники фосфоліпідів (БПФЛ) також роблять зрілих частках ЛПВЩ в А1-ЛПВЩ фракції (тобто внесок в подальше ремоделювання циркулюючій утримуючої Аро А-l і не утримуючої АроІІ) видаляпопуляції ЛПВЩ. БПЕХ можуть переміщувати ефір ються в печінці і виводяться з жовчю більш ефекхолестерину, зроблений LCAT, на інші ліпопротеїтивно чим такі з ЛПВЩ, що містять і АроА-l і АроАни, що зокрема містять АроВ ліпопротеїни, такі як ІІ(АІ/АП-ЛПВП фракція). Це можливе завдяки ЛПДНЩ і ЛПНЩ. БПФЛ постачають лецитин до більш ефективному скріпленню А1-ЛПВП з мемЛНВЩ. Тригліцериди ЛПВЩ можуть бути катаболібраною гепатоцитів. Припускають наявність зовані позаклітинною печінковою тригліцерид ліпаЛПВЩ-рецептору, і нещодавно як рецептор ЛПВЩ, зою, а холестерин ліпопротеїнів видаляється печібуло виявлено рецептор-сміттяр SR-BI. (Acton et нкою за допомогою декількох механізмів. al, 1996, Science, 271: 518-520; Xu et al, 1997, Кожна частка ЛНВЩ містить, принаймні, одну J.Lipid Res, 38:1289-1298). SR-BI експресується копію (зазвичай 2-4 копії) АроА-l. АроА-l синтезунайбільш рясно в стероїдогенних тканинах, наприється печінкою і тонким кишечником у вигляді преклад, (в надниркових залозах) і в печінці (Landпроаполіпопротеїну, який потім секретується у shuiz et al., 1996, J.Clin. Invest. 98:984-995; Riggotti вигляді пропротеїну, який швидко розщеплюється, et al., 1996, J.Biol. Chem. 271: 33545-33549). при цьому виходить зрілий поліпептид, що вклюВважають, що БПЕХ не відігрівають важливої чає 243 амінокислотних залишки. АроА-l в основролі в ЗТХ, і, навпаки, беруть участь в метаболізмі ному складається з 6-8 різних 22-амінокислотних ліпідів, отриманих з ЛПДНЩ і ЛПНЩ. Але зміна повторів, розділених лінкером, який часто являє активності БПЕХ або їх акцептор ЛПДНЩ і ЛПНЩ собою пролін, а в деяких випадках являє собою має значення в ремоделюванні ЛПВЩ популяції. ланцюжок, що складається з декількох залишків. Наприклад, у відсутність БПЕХ, частки ЛПВЩ збіАроА-l формує стабільні комплекси з ліпідами, які льшуються в розмірах, які потім не виводяться. бувають 3 типів: малі, бідні ліпідами комплекси, що Огляди за ЗТХ і ЛПВЩ наведено в Fielding & Fieldвідносяться до пре-бета-1 ЛПВЩ, сплощені дискоing, 1995, J.Lipid Res, 36: 211-228; Barrans et al, видні частки, що містять полярні ліпіди (фосфолі1996, Biochem. Biophis. Acta, 1300: 73-85; Hirano et під і холестерин), що відносяться до пре-бета-2 al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol, 17 (6): ЛНВЩ, і сферичні частки, що містять як полярні, 1053-1059). так і неполярні ліпіди, що відносяться до сферич2.3. Сучасні способи лікування дисліпідопротених або зрілих ЛПВЩ (ЛПВЩ3 і ЛПВЩ2). Більшість їнемій ліпопротеїнів ЛПВЩ в циркулюючій популяції місВ наш час існ ує ряд способів лікування для тять і Аро А-І і АроА-ІІ (др угий великий білок зниження рівня сироваточного холестерину і триЛПВЩ) і названі тут як АІ/АП-ЛПВЩ фракція гліцеридів. (Brown & Goldstein, supra). Але кожний ЛПВЩ. Фракція ЛПВЩ, що містить тільки АроАз них має свої недоліки і обмеження відносно ефеl(А1-ЛПВЩ фракція), схоже, є найбільш ефективктивності, наявності побічних ефектів і визначення ною в ЗТХ. Епідеміологічні дослідження підтвергрупи пацієнтів. джують гіпотезу, що А1-ЛПВЩ фракція є протиСмоли, зв'язуючі жовчні кислоти, являють соатерогенною. (Parra et al., 1992, Arterosclrer. бою клас ліків, які порушують повторний транспорт Thromb. 12, 701-707; De-cossin et al., 1997, Eur. J. жовчних кислот з кишечнику до печінки (наприClin. Invest. 27, 299-307) клад, холестирамін (Ques-tran Lighto, Bristol-Myers Попри те, що механізм перенесення холестеSquibb), колестіполу гідрохлорід) (Colestido, The рину з клітинної поверхні, тобто (холестериновий Up John Company). За перорального застосування, вихід) невідомий, передбачають, що бідний ліпітакі позитивно заряджені смоли зв'язують негатидами комплекс пре-бета-1 ЛПВЩ є переважним вно заряджені жовчні кислоти в кишечнику. Оскільакцептором для холестерину, що переноситься з ки смоли не можна адсорбувати з кишечнику, вони периферичних тканин, що беруть участь в ЗТХ виводяться, виносячи жовчні кислоти з собою. (Davidson et al, 1994, J.Biol. Chem, 269:22975Застосування таких смол, проте, знижує рівень 22983; Bielicki et al, 1992, J.Lipid Res, 33:1699-1709; холестерину в сироватці щонайбільше приблизно Rothblant et al, 1992, L. Lipid Res. 33: 1091-1097, на 20%, і має побічні ефекти в кишечнику, вклюKawano et al, 1993, Biochemistry, 36:9816-9825). В чаючи запори і певні авітамінози. Оскільки смоли процесі збору холестерину з клітинних поверхонь, зв'язують і інші ліки, застосування інших перорапре-бета-1 ЛПВЩ швидко перетворюється в прельних лікарських засобів повинно відбуватися, бета-2 ЛПВЩ. БПФЛ можуть збільшувати швидпринаймні, за одну годину або через чотири-шість кість утворення пре-бета-2 дисків, але опубліковагодин після вживання смоли, що ускладнює режим них результатів, що вказують на роль БПФЛ в ЗТХ, прийому ліків у кардіологічних хворих. немає. LCAT переважно реагує з дисковидними і Статіни являють собою агенти, що понижують сферичними ЛПВЩ, переносячи 2-ацильні групи рівень холестерину, які блокують синтез холестелецетину або інших фосфоліпідів на вільні гідрорину шляхом інгібіювання HMGCoA-редуктази 13 71552 14 ключового ферменту, що бере участь в біосинтезі можна екстраполювати результати, отримані в холестерину. Статіни, наприклад, ловастатін цьому випадку на інші групи пацієнтів (напр. на (Me vacoro, Merck & Co., Inc) і правастатин жінок, на чоловіків більше за ранній і пізній вік). Не (Pravachol, Bristol-Myers Squibb Co) іноді викорисотримано ефект у пацієнтів з вже сталою ішемічтовують в комбінації зі смолами, що зв'язують жоною хворобою серця. Із застосуванням фібратів вчні кислоти. Статіни значно зменшують рівень пов'язані серйозні побічні ефекти, включаючи токсироваточного холестерину і ЛПНЩ і уповільнюсичність, і онкогенність (особливо рак шлунковоють прогресування коронарного атеросклерозу. кишкового тракту), хвороби жовчного міхура і збіАле рівень ЛПВЩ холестерину сироватки при льшення випадків некоронарної смертності. Ці ліки цьому збільшується не набагато. Механізм знине рекомендовані для лікування пацієнтів з висоження ЛПНЩ може включати як зменшення концеким ЛПНЩ або низьким ЛПВЩ як тільки ліпідних нтрації ЛПДНЩ, так і індукцію експресії ЛПНЩпорушень (Physician's Desk Reference, 1997, рецептору, що призводить до зменшення продукції Medical Economics Co., Inc. Montvale, N.J.) і/або посилення катаболізму ЛПНЩ. Прийом цих Пероральна заміщувальна терапія естрогеналіків супроводжують побічні ефекти, включаючи ми може бути запропонована для зниження гіперпечінкову і ниркоподібну дисфункції (Physicians холестеринемії у жінок в постменопаузний період. Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Але збільшення ЛПВЩ може супроводитися збіMontvale, N.J., 1997). Нещодавно PDA схвалила льшенням тригліцеридів. Безумовно, лікування аторвастатин (інгібітор HMGCoA редуктази, розестрогенами обмежене особливою групою пацієнроблений Parke-Davis) (Warner Lambert) для лікутів (жінки в постменопаузі) і пов'язане з серйознивання рідких, але важких випадків сімейної гіперми побічними ефектами, включаючи злоякісні нохолестеринемії. (1995, Scrip 20(19): 10). воутворення, хвороби жовчного міхура, Ніацин, або нікотинова кислота являє собою тромбоемболічну хворобу, гепатоаденому, підвиводорозчинний комплекс вітаміну В, що викорисщений кров'яний тиск, знижену толерантність до товується як харчова добавка і антигіперліпідемічглюкози, гіперкальціємію. ний агент. Ніацин зменшує продукцію ЛПДНЩ і є Таким чином, є необхідність створення ліків, ефективним при зниженні рівня ЛПНЩ. У деяких які були б ефективні в зниженні холестерину в випадках він використовується в комбінації зі смосироватці, підвищенні рівня ЛПВЩ, запобіганні лами, що зв'язують жовчні кислоти. Ніацин може ішемічній хворобі серця і/або лікуванні вже існуюпідвищувати рівень ЛПВЩ при використанні в адечої хвороби, особливо атеросклерозу. кватних дозах, але його використання обмежене 2.4. Аро А-l як мішень серйозними побічними ефектами, які виявляються Жодне з нині існуючих ліків, для зниження рівпри таких високих дозах. ня холестерину не збільшує рівень ЛПВЩ і не стиФібрати являють собою клас ліпідомулює ЗТХ - і представляється найбільш відповідпонижувальних ліків, що використовуються для ним для надання впливу на транспорт лікування різних форм гіперліпідемій (наприклад, холестерину, модулюючи його надходження з підвищений рівень тригліцеридів в сироватці), що їжею, повторне використання, синтез холестерину також може бути пов'язано з гіперхолестерінемією. а також на популяцію ЛПДНЩ. Фібрати знижують рівень ЛПДНЩ фракції і помірно Бажано знайти ліки, які стимулюють вихід хозбільшують рівень ЛПВЩ - але ефект цих ліків на лестерину і його видалення; існує декілька потенсироваточний холестерин є різнобічним. У США ційних мішеней на шляху зворотного транспорту фібрати схвалені для використання в якості прохолестерину -наприклад, LCAT, ЛПВЩ або їх різні тиліпідемічних засобів, але не отримали дозволу в компоненти (АроА-І, АроА-ІІ і фосфоліпіди), БПФЛ якості гіперхолестериномічних агентів. Наприклад, і БПХ - і невідомо, яка з цих мішеней буде найклофібрат (Atromid-So, Wyeth-Ayerst Laboratories) є більш ефективною при досягненні бажаного пропротиліпідемичним агентом, який діє (за невідофілю ліпопротеїнів і протективних ефектів. Збумим механізмом), знижуючи тригліцериди сироварення будь-якого окремого компонента в ЗТХ тки за рахунок зменшення ЛПДНЩ фракції. впливає величезний чином на склад циркулюючих Хоч зміст сироваточного холестерину можна популяцій ліпопротеїнів і на ефективність ЗТХ. знизити у деяких груп пацієнтів, біохімічна відпоРезультати, отримані in vivo, призвели до ряду відь на ліки різна, і не завжди представляється висновків, які висувають ЛПВЩ і їх головній скламожливим передбачити у якого саме пацієнта будовій білковому компоненту АроА-І велику роль в де отримано бажаний ефект. запобіганні атеросклеротичним пошкодженням і Не було показано, що артомід-S® є ефективпотенційній регресії бляшанок - і це робить їх приним в профілактиці ішемічної хвороби серця. Хімівабливими мішенями для терапевтичних втручно і фармакологічно родинні ліки гемфіброзил чань. По-перше, існує зворотна залежність між (Лопід®, Parke-Devis) являє собою агент, регулюконцентрацією сироваточного АроА-І (ЛПВЩ) і ючий рівень ліпідів, який помірно знижує рівень атерогенезом у чоловіків (Gordon & Rifkind et al., сироваточних тригліцеридів і холестерину ЛПДНЩ 1989, N. Eng. J.Med, 321: 1311-1316; Gordon et al., і помірно підвищує рівень холестерину ЛПВЩ– 1989, Circulation, 79:8-15). Насправді, наявність ЛПВЩ1 і ЛПВЩ2 субфракцій, а також і АроА-l і А-ІІ специфічних субпопуляцій ЛПВЩ зв'язують із зме(АІ/АП-ЛПВЩ фракція). Але ліпідна відповідь є ншенням ризику розвитку атеросклерозу у людини гетерогенною особливо у різних груп пацієнтів. (Miller, 1987, Amer. Heart 113: 589-597; Cheung et Запобігання ішемічній хворобі серця спостерігали al., 1991, Lipid Res., 32: 383-394; Fruchart & Ailhaud, у чоловіків 40-55 років без випадків вияву ішеміч1992, Clin. Chem, 38:79) ної хвороби серця в анамнезі і незрозуміло, чи 15 71552 16 По-друге, дослідження на тваринах підтверTech (Pharmaprojects, April 7, 1989). Також зробледжують протективну роль АроА-І (ЛПВЩ). При ліні спроби використання АроА-І в лікуванні септичкуванні кролів, що отримують холестеринову дієту, ного шоку (Opal, "Reconstituted HDL as a Treatment АроА-l або ЛПВЩ знижує розвиток і прогресію Strategy for Sepsis" IBC's 7th International бляшанок (жирових смужок) у цих кроликів. Conference on Sepsis, April 28-30, 1997, Washing(KLoizumi et al., 1988, J.Lipid Res, 29: 1405-1415; ton, D.C.; Gouni et al., 1993, J.Lipid Res, 94: 139Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60: 455-461; 146; Levine, WO96/04916). Але існує безліч підводBadimon et al., 1990, J. Clin. Invest, 85:1234-1241). них каменів, пов'язаних з отриманням і викорисАле ефективність змінюється в залежність від танням АроА-І, що робить його далеким від ідеалу джерела ЛПВЩ (Beitz et al., 1992, Prosta-glandins, в якості ліків; наприклад, АроА-І являє собою веLeukotrienes and Essential Fatty Acides 47: 149-152; ликий білок, отримання якого є складним і дороMe zdour et al., 1995, Atheriosclerosis, 113: 237-246). гим; значні проблеми виробництва і репродукції По-третє, очевидний доказ ролі АроА-l отриможуть виникнути відносно стабільності збереманий з експериментів на трансгенних тваринах. ження ліків, доставки активного продукту, а також Експресія людського гена АроА-І у мишей, генетичасу половини-життя in vivo. чно схильних до дієто-залежного атеросклерозу, Враховуючи ці труднощі, були зроблені спроби захищає їх від розвитку пошкоджень на аорті отримання пептидів, які мімікрують Аро А-І. Ключо(Rubin et al., 1991 Nature 353: 265-267). Також пову активність АроА-l зв'язують з наявністю мноказане, що АроА-І трансгени супресують атерожинних повторів унікальної межі повторної струксклероз у АроЕ-дефіцитних мишей і Аро(а) транстури білку - мфіпатичний α-спіралі класу А генних мишей (Paszty et al., 1994, J.Clin. Invest, 94: (Segrest, 1974, FEBS Lett, 38: 247-253); більшість 899-903; Plump et al., 1994, PNAS USA, 91: 9607спроб по створенню пептидів, мімікруючих актив9611; Liu et al., 1994, J.Lipid Res. 35: 2263-2266). ність АроА-l, сфокусовано на створенні пептидів, Такі ж результати отримали у трансгенних кролищо здатні утворювати амфіпатичні α-спіралі ків, експресуючих людський АроА-І (Duverger, класу А. 1996, Circulation, 94: 713-717; Duverger et al, 1996, Амфіпатичні α-спіралі класу А є унікальними Atherioscler. Thromb. Vase. Biol. 16: 1424-1429) і у за внаслідок своїх позитивно заряджених амінокитрансгенних пацюків, у яких підвищений рівень слотних залишків, кластеризованих на гідрофільлюдського АроА-l захищає проти атеросклерозу і но-гідрофобній поверхні, і негативно заряджених інгібує рестеноз, який виникає внаслідок балонної амінокислотних залишків, кластеризованих в центі ангіо-пластики (Burkey et al., 1992, Circulation, гідрофільної поверхні, α-спіральні пептиди класу А Supplement 1, 86: 1-472, Abstract No. 1876; Burkey мають гідрофобний кут менше за 180° (Segrest et et al., 1995,J.LipidRes.,36: 1463-1473). al, 1990, Proteins: Structure, Function and Genetics Виявилося, що фракція А-l-ЛПВЩ більш ефек8: 103-117). Стратегії ініціації de novo для створентивна в ЗТХ ніж Аl/АІІ-ЛПВЩ фракція. Дослідження ня АроА-І мімікруючих пептидів засновані не на на трансгенних для людського АроА-l або АроА-l і первинній послідовності природно існуючих аполіАроА-ІІ (АІ/АІІ) мишах показали, що білковий склад попротеїнів, а швидше на впровадженні цих унікаЛПВЩ значно впливає на їх роль - Аl-ЛПВЩ є більних рис α-спіралей класу А в послідовність пепльше проти-атерогенним, ніж АІ/АІІ-ЛПВП (Schultz тидних аналогів, а також деяких властивостях et al., 1993, Nature 365:762-764). Паралельні додоменів АроА-І (Davidson et al, 1996, PNAS, USA,, слідження, що проводяться на трансгенних мишах, 93: 13605-13610; Rodgers et al., 1997, Biochemistry, експресуючих LCAT генів людини, показали, що 36: 288-300; Lins et al., 1993, Biochem., Biophys. помірне збільшення активності LCAT значно зміActa Biomem-branes 1151:137-142; Ji & Jonas, нює рівень холестерину в ліпо-протеїнах і цей 1995, J. Biol. Chem., 270:11290-11297; Collet et al., LCAT значною мірою переважніше для ЛПВЩ, що 1997, J. Lipid Res., 38: 634-644; Sparrow & Gotto містять АроА-І (Francone et al., 1995, J.Clinic. 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348: 187-211, Sparrow & Invest., 96: 1440-1448; Berard et al., 1997, Nature Gotto, 1982, 187-211, CRC Crit. Rev. Biochem. 13, Medicine 3(7): 744-749). Ці результати підтверджу87-107; Sorci-Thomas et al., 1993, J. Biol. Chem, ють важливу роль АроА-І в активації LCAT і стиму268: 21403-21409; Wang et al., 1996, Biochim. ляції ЗТХ; додаткові дослідження показали ще Biophis. Acta 174-184; Minnich et al., 1992, J. Biol. більш складний сценарій: головним компонентом Chem, 267: 16553-16560; Holvoet et al., 1995, ЛПВЩ, що модулює вихід холестерину з клітин, є Biochemistry 34: 13334-13342; Sorci-Thomas et al., фосфоліпіди (Fournier et al., 1996, J. Lipid. Res., 1997, J.Biol. Chem. 272(11): 7278-7284; Frank et al., 37:1704-1711). 1997, Biochemist Ry, 1798-1806). У зв'язку з потенційною роллю ЛПВЩ, тобто як В одному з досліджень Fukushima et al. синтеАроА-І, так і пов'язаних з ним фосфоліпідів, в зазували 22-членний пептид, що складався в основхисті проти атеросклеротичної хвороби, було поному з Glu, Lys і Leu залишків, які розташовані чаті і продовжуються клінічні випробування на люперіодично таким чином, що формують амфіпатидині, з використанням рекомбінантно отриманого чну α-спіраль з рівними гідрофобною і гідрофільАроА-І компанією UCB (Бельгія) (Pharmaprojects, ною поверхнями ("ELK пептид") (Fukushima et al., Oct. 27 1995; IMS R&D Focus, June 30, 1997, Dmg 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13) 3703-3704; Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6): 261-265), Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem, 255, 10651також "М. Eriksson (Congress The Role of HDL in 10657). ELK пептид має послідовність з 41% гомоDisease Prevention" Nov. 7-9 1996, Fort Worth; логії з 198-219 фрагментом АроА-І. Дослідження з Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38: 1267-1273, WO допомогою кількісної ультрафільтрації, гель94/13819), а також почато і продовжуються Bioпроникаючою хроматотрафією і кругового дихрої 17 71552 18 зму показали, що ELK пептид ефективно зв'язуний пептид, "18А" пептид, був створений для того, ється з фосфоліпідами і мімікрує деякі фізичні і щоб бути моделлю α-спіралі класу A (Segrest et al., хімічні властивості АроА-І (Kaiser et al, 1983, PNAS 1990, supra). Вивчення цих і інших пептидів, що USA 80: 1137-1140; Kaiser et al, 1984, Science 223: мають звернений розподіл заряду, подібно "18R" 249-255; Fuku-shima et al., 1989, supra; Nakagawa пептиду, показало, що розподіл заряду є надзвиet al, 1985, J.Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092). чайно важливим для активності; пептиди із зверYokoyama et al. на основі цих дослідженьзробили неним розподілом заряду мають зменшення афінвисновок, що надзвичайно важливим чинником ності до ліпідів в порівнянні з 18А миметиками для активації LCAT є наявність достатньої кількоскласу А, а також пониження спіральності в присутті великої амфіпатичної структури (Yokoyama et al, ності ліпідів (Kanellis et al., 1980, J.Biol. Chem. 255: 1980, J.Biol. Chem. 255(15): 7333-7339). Пізніше 11464-11472; Anantharamaiah et al., 1985, J.Biol. виявили, що димер такого 22-членного пептиду Chem. 260: 10248-10255; Chung et al., 1985, J.Biol. мімікрує АроА-І ще в більшій мірі, ніж мономер; на Chem. 260:10256-10262; Epand et al., 1987, J.Biol. основі цих результатів припустили, що такий 44Chem. 262: 9389-9396; Anantharamaiah et al, 1991, мер, вміщений в середину за допомогою зломщиAd v. Exp. Med. Biol, 285:131-140). ка спіралі (або Gly або Pro) являє собою мінімальІнші синтетичні пептиди, що не мають гомолоний функціональний домен в АроА-І (Nakagawa et гії з аполіпопротеїнами, створені з метою включати al., 1985, supra). димери і тримери 18А пептиду (Anantharamaiah et В іншому дослідженні використали модель al., 1986, Proteins of Biological Fluids 34:63-66), амфіпатичних пептидів, названих "LAP пептидами" GAL A і EAL A пептидів (Subbarao et al., 1988, (Pownall et al., 1980, PNAS USA 77(6):)( 3154-3158; PROTEINS: Structure, Function and Genetics 3:187Sparrow et al., 1981, In:) Peptides: Synthesis198) і ID пептидів (Labeur et al., 1997, ArterioscleroStructure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce sis, Thrombosis, and Vascular Biology 17: 580-588) і Chem. Co., Rockford, IL, 253-256). На основі ви18АМ4 пептид (Brasseur et al., 1993, Biochim. Bioвчення скріплення ліпідів з фрагментами нативних phys. Acta 1170:1-7). аполіпопротеїнів, були розроблені декілька LAP Також був створений "консенсусний" пептид, пептидів, названі LAP-16, LAP-20 і LAP-24 (утрищо містить 22 амінокислотних залишки на основі муючих 16, 20 і 24 амінокислотних залишків відпопослідовності спіралі людського АроА-І (Ananвідно). Це модель амфіпатичних пептидів, посліtharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis, 10(1), 95довності яких не мають гомології з 105;)( Venkatachalapathi et al.,) 1991. Моl. Conforаполіпопротеїнами, модель була створена, щоб mation and Biol. Interaction, Indian Acad Sci. B: 585отримати гідрофільні поверхні, організовані іншим 596). Його послідовність сконструйована за допочином, ніж у амфіпатиних спіральних доменів кламогою ідентифікації найбільш переважаючих засу А, пов'язаних з аполіпопротеїнами (Segrest et лишків в кожному положенні гіпотетичних спіралей al., 1992, J.Lipid Res. 33: 141-166). Ha основі цих людського АроА-І. Подібно до пептидів, описаних досліджень автори дійшли висновку, що для мовище, спіраль, що формується цими пептидами, делі амфіпатичних пептидів повинна бути мінімамає позитивно заряджені амінокислотні залишки, льна довжина в 20 залишків, необхідна для підкластеризованi в гідрофільно-гідрофобні поверхні, тримки ліпід озв'язуючих властивостей. негативно заряджені амінокислотні залишки, класДослідження з мутантами LAP20, що містять теризованi в центрі гідрофільної поверхні і гідрозалишок проліну в різних положеннях послідовнофобний кут менше за 180°. Димер такого пептиду сті визначили, що існує прямий зв'язок між скріпявляє собою щось таке, що ефективно в активації ленням ліпіду і активацією LCAT, але сам по собі LCAT, а мономер має слабі ліпід-зв'язуючі властипотенціал спіралі пептиду не призводить до активості (Venkatachalapathi et al.,1992. supra). На освації LCAT. (Ponsin et al., 1986, J. Biol. Chem, нові насамперед досліджень in vitro з пептидами, 261(20): 9202-9205). Більш того присутність злоописаними вище, було встановлене зведення прамщика спіралі (Pro) близько до середини пептиду вил для створення пептидів, мімікруючих функцію зменшує його афінність до фосфоліпідних поверАроА-І. Вважається важливим, що амфіпатична αхонь, а також його здібність до активації LCAT. спіраль має позитивно заряджені залишки, класКрім того, показано, що певні LAP пептиди зв'язутеризовані на гідрофільно-гідрофобній поверхні і ють фосфоліпіди (Sparrow et al., supra) і існує коннегативно заряджені амінокислотні залишки, кластраверсія, що LAP пептиди спіральні в присутності теризовані в центрі гідрофільної поверхні, необліпідів (Buchko et al., 1996, J.Biol. Chem, 271(6): хідна для афінності до ліпідів і активації LCAT 3039-3045; Zhong et al., 1994, Peptide Research (Venkatachalapathi et al., 1991, supra). 7(2): 99-106). Anantharamaiah et al. визначили так само, що неSegrest et al., синтезували пептиди, що склагативно заряджений залишок Glu в положенні 13 даються з 18-24 амінокислотних залишків, гомолоузгодженого 22-членного пептиду, розташований в гичні спіралі АроА-І (Kannelis et al., 1989, J.Biol. межах гідрофобної поверхні α-спіралі, грає важлиChem, 255(3): 11464-11472; Segrest et al., 1983, ву роль в активації LCAT (Anantharamaiah et al., J.Biol. Chem. 258:2290-2295). їх послідовності 1991, supra). Крім того Brasseur визначив, що гідстворені специфічним чином, щоб мімікрувати рофобний кут (pho кут) менше за 180° необхідний амфіпатичних спіральних доменів класу А відповідля оптимальної стабільності ліпіддних аполіпопротеїнів відносно гідрофобного моаполіпопротеїнового комплексу і роблять внесок в менту (Eisenberg et al., 1982, Nature 299: 371-374) і формування дисковидних часток, в яких пептиди розподіли заряду (Segrest et al., 1990, Proteins розташовуються по краю ліпідного бішару 8:103-117; U.S.PatentNo 4,643,988). Один 18 член(Brasseur 1991, J.Biol. Chem. 66(24): 16120-16127). 19 71552 20 Одно літерн ий Зага льнопр ийняте скороRosseneu et al., також стверджують, що гідрофобАмінокислота симв ол чення ний кут менше за 180° необхідний для активації Аланін А Ala LCAT (WO93/25581). Аргінін R Arg Але, незважаючи на ці правила, доки нікому не Аспарагін N Asn Аспарагінов а вдалося створити пептид такої ж активності, як D Asp кислота АроА-І - найкращий з тих, що мав активність менЦистеїн З Cy s ше за 40% в порівнянні з АроА-І, що було перевіГлу тамін Q Gln рено в тесті активації LCAT, описаному тут. У літеГлу тамінов а кисΕ Glu ратурі не наведено жодного пептиду-миметика, лота Гліцин G Gly придатного в якості ліків. Гістидин Η His Тому необхідно створити стабільний агоніст Ізолейци н І IIe АроА-І, який мімікрує активність АроА-І, і який відЛейцин L Leu носно простий і дешевий в отриманні. Однак, Лізин ДО Ly s Меті онін Μ Met принципи створення ефективних АроА-І миметиків Феніла ланін F Phe не визначені, і принципи створення органічних Пролін Ρ Pro молекул з функцією АроА-І невідомі. Серин S Ser 3. Короткий опис винаходу Треон ін N Thr Винахід стосується агоністів АроА-І, здатних Трипт о фан W Trp Тиро зин Y Ty r до формування амфіпатиних а-спіралей, яки міміВалін V Val крують активність АроА-І, що мають специфічну активність, тобто одиниці активності (активація Скорочення, що використовуються для DІХАТ)/одиниця маси), або перевершуючу активенантомерів амінокислот, що генетично кодуютьність нативної молекули, що наближається. У ся, являють собою велику прописну літеру одноліпринципі, агоністи АроА-І винаходу являють собою терних символів. Наприклад, "R" означає L-Аргінін пептиди або аналоги пептидів, які: формують амі "г" означають D-Аргінін. фіпатичні спіралі (в присутності ліпідів), зв'язують 3.2. Визначення ліпіди, формують пре-β-подібні або ЛПВЩ-подібні Терміни, що використовуються тут мають накомплекси, активують LCAT, збільшують рівень ступні значення: ЛПВЩ в сироватці і посилюють вихід холестерину. "Алкіл" стосується насиченого розгалуженого Винахід заснований, зокрема, на створенні і прямого ланцюга або циклічного вуглеводневого відкритті заявниками пептидів, які мімікрують фунрадикалу. Типові алкільні групи включають настукцію АроА-І. Пептиди винаходу були створені на пні групи, не обмежуючись ними: метил, етил, основі передбачуваної спіральної структури і ампропіл, ізопропіл, бутил, ізобутил, третбутил, пенфіпатичних властивостей 22-амінокислотних узготил, ізопентил, гексил і т.п.В переважних втіленнях джених послідовностей, отриманих із спіральних алкільна група являє собою (C1-С6) алкіл. повторів АроА-І. Дивно, але пептиди винаходу "Алкеніл" стосується ненасиченого розгалужемають специфічну активність набагато вище, ніж ного прямого ланцюга або циклічного вуглеводнепептиди, отримані з АроА-І, вже описані в літеравого радикала, що має принаймні один подвійний турі. Насправді, деякі втілення винаходу наближазв'язок. Радикал може знаходитися або в цис- або ються до 100% активності нативного АроА-І, а сув транс-конформації по відношенню до подвійного перагоністи, описані тут, навіть перевершують зв'язку(ам). Типові алкенильні групи включають, не специфічну активність АроА-І. обмежуючись ними: етеніл, пропеніл, ізопропеніл, Винахід проілюстровано робочими прикладабутенил, ізобутенил, третбутенил, пентеніл, гексеми, які описують структур у, отримання і викорисніл і т.п.В переважних втіленнях алкенільна група тання окремих амфіпатичних пептидів, які формупредставляє собор (C1-С6) алкеніл. ють спіралі (в присутності ліпідів), зв'язують ліпіди, "Алкініл" стосується ненасиченого розгалужеутворюють комплекси і підвищують активність ного прямого ланцюга або циклічного вуглеводнеLCAT. На основі структури і активності втілених вого радикала, що має, принаймні, один потрійний прикладів, заявники визначили ряд принципів, які зв'язок. Типові алкинільні групи включають, не можуть бути використані для створення альтернаобмежуючись ними: етиніл, пропиніл, бутинил, тивних або мутантних форм, які також входять до ізобутинил, пентинил, гексиніл і т.п.В переважних області даного винаходу. втіленнях алкінільна група являє собою (C1-С6) Винахід також стосується фармацевтичних алкініл. композицій, що містять такі агоністи АроА-І (пепти"Арил" відноситься до ненасиченого циклічноди або пептидо-ліпідні комплекси) в якості активго вугле водневого радикала, що має кон'юговану ного інгредієнту, а також способів отримання таких π-електронну систему. Типові арильні групи вклюскладів і їх використання в лікуванні захворювань, чають, не обмежуючись ними: пента-2,4-діен, фепов'язаних з дисліпопротеїнемією (наприклад, сеніл, нафтил, антрацил, азуленіл, хризеніл, коронерцево-судинні хвороби, атеросклероз, метаболічніл, флуорантеніл, індеценил, іденил, оваленіл, ний синдром), рестенозу або ендотоксемії (напр. периленил, феналенин, фенантреніл, піценил, септичного шоку). плейаденіл, піреніл, пірантреніл, рубеценіл, і т.п.В 3.1. Скорочення переважних втіленнях арильна група являє собою Скорочення, що використовуються тут для L(С5-С20) арил, і особливо переважний (С5-С10) енантіомерів амінокислот, що генетично кодуютьарил. ся такі, що звичайно використовуються, і являють собою наступні: 21 71552 22 "Алкарил" стосується прямоланцюгової алкіі заштриховані кільця представляють гідрофобні льної, алкенильной або алкинільной груп, де один амінокислотні залишки. з атомів водню пов'язаний з кінцевим вуглеводом, На Фіг.1В представлено діаграму спіральної заміщений на арільний залишок. Типові алкарильмережі ідеальної амфіпатичної спіралі Фіг.1А. ні групи включають, не обмежуючись ними: бенНа Фіг.1С представлено діаграму спірального зил, бензиліден, бензилідин, бензолобензил, нафциліндру ідеальної амфіпатичної спіралі Фіг.1 А. толобензил і т.п.В переважних втіленнях арильна На Фіг.2А представлено діаграму спірального група являє собою (С6-С26) алкарил, тобто алкільколеса Шиффера-Едмундсона корового пептиду на, алкенильна або алкинільна половина алкариструктури (І), яка показує амфіпатичність спіралі льної групи являє собою (C1-С6), а арильна части(незаштриховані кільця представляють гідрофільні на являє собою (С5-С20) і особливо переважний амінокислотні залишки, заштриховані кільця пред(С5-С10) арил. У особливо переважному втіленні ставляють гідрофобні амінокислотні залишки і чаалкарильна група являє собою (С6-С13) алкарил, стково заштриховані кільця представляють або тобто алкільну, алкенільну або алкинільну частину гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки. алкарильної групи являє собою і (C1-С3) а арильна На Фіг.2В представлено діаграму спіральної частина це (С5-С10). мережі корового пептиду структури (І), яка показує "Гетероарил" стосується арильної частини, де гідрофобну поверхню спіралі. один або більше атомів вуглеводу заміщені іншим На Фіг.2С представлено діаграму спіральної атомом, таким як N, Р, О, S, As, Se, Si, Те і т.д. мережі корового пептиду структури (І), яка показує Типові гетероарильні групи включають, не обмегідрофільну поверхню спіралі. жуючись ними: акридарзин, акридин, арсантридин, На Фіг.3А представлено діаграму спіральної арсиндол, арсиндолін, карбазол, β-карболін, хромережі, ілюструючу гідрофільну поверхню узгоміни, цинолин, фуран, імідазол, індазол, індол, дженого 22-членного пептиду Сегреста індолизін, ізоарсіндол, ізоарсинолін, ізобензофу(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75). ран, ізохромен, ізоиндол, ізофосфоіндол, ізофосНа Фіг.3В представлена діаграма спіральної фінолін, ізохінолін, iзотиазол, ізоксазол, нафтиримережі, показуюча гiдрофiльну поверхню ілюстрадин, перимідин, фенантридин, фенантролин, тивного корового пептиду 146 феназин, фосфоиндол, фосфінолин, фталазин, (PVLELFENLLERLLDALQKKLK/SEQ ID NO: 146). птеридин, пурин, пуран, піразин, піразол, пірідаНа Фіг.4А представлена діаграма спіральної зин, піридин, піримідин, пірол, пірролізин, хіназомережі, що ілюструює гідрофобну поверхня узголин, хінолин, хінолізин, хіноксалин, селенофен, дженого 22-членного пептиду Сегреста - SEQ ID теллурофен, тиофен, і ксантен. У переважному NO:75). втіленні гетероарильні групи являє собою 5-20 На Фіг.4В представлена діаграма спіральної членний гетероарил, причому 5-10 членний гетемережі, що ілюструює гідрофобну поверхня ілюстроарил найбільш переважний. ративного корового пептиду 146 SEQ ID NO: 146). "Алкгетероарил" стосується прямоланцюгової На Фіг.5А представлена діаграма спірального алкильної, алкенильної або алкинільної груп, де колеса Шиффера-Едмундсона узгодженого 22один з атомів водню, пов'язаний з кінцевим вуглечленного пептиду Сегреста SEQ ID NO:75). водом, заміщений на гетероарильну частину. У На Фіг.5В представлено діаграму спірального переважному втіленні алкгетероарильні групи явколеса Шиффера-Едмундсона корового пептиду ляють собою 6-26 членну алкгетероарильну гр упу, 146 SEQ ID NO: 146). тобто алкильна, алкенильна або алкинільна часНа Фіг.6 представлено комп'ютерну модель тина алкгетероарильної групи являє собою (C1-С6), двох пептидів 146 (SEQ ID NO: 146), організованих а гетероарильна частина це 5-20 членна гетероанти паралельно, в яких залишки Glu-7 і Gin-18 арильна група. У особливо переважному втіленні виділені, щоб показати здатність цих двох пептидів алкгетероарильна група є 6-13 членним алкгетеутворювати міжмолекулярні водневі зв'язки, перероарилом, тобто алкил-, алкенили алкинільна часбуваючи в стані, пов'язаному з ліпідами. тина алкарильної групи являє собою 5-10 членну На Фіг.7А представлено тетрамірну структур у гетероарильну групу. винаходу. "Заміщений алкіл, алкенил, алкиніл, арил, алНа Фіг.7В представлено сумарно розгалужену карил, гетероарил або алкгетероарил" стосуються структура винаходу. алкильної, алкенильної або алкинільної групам, На Фіг.7С представлено змішану розгалужену арильної, алкарильної, гетроарильної або алкгеструктура винаходу. тероарильної групам, де один або більше атоми На Фіг.7D представлено приклад ("Lysводня заміщені іншими групами. Переважні заміндерево") розгалуженої мережі структури винаходу. ники включають -OR, -SR, -NRR, -NO2, -CN, галоНа Фіг.8А представлено графік, що ілюстр ує ген, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR, де кожний R являє різницю між тим, що спостерігається На хімічним собою незалежно водень, алкильну, алкенільну, зміщенням і випадковим табульованим На хімічалкинільну, арильну, алкарильну, гетероарильну ним зміщенням для пептиду 146 (SEQ ID NO: 146) або алкгетероарильну групи. і для узгодженого пептиду Сегреста (SEQ ID 4. Короткий опис фігур NO:75). На Фіг.1А представлено діаграма спірального На Фіг.8В представлено графік, що ілюстр ує колеса Шиффера-Едмундсона ідеальної амфіпарізницю між хімічним зміщенням амідного протону, тичної α-спіралі, в якій незаштриховані кільця що спостерігається і табульованим випадковим представляють гідрофільні амінокислотні залишки хімічним зміщенням амідного протону для пептиду 23 71552 24 146 (SEQ ID NO: 146) і узгодженого пептиду Сег5.1. Структура і функція пептидів реста (SEQ ID NO:75). Агоністи АроА-І винаходу це в основному пепНа Фіг.8С представлено графік порівняння хітиди або їх аналоги, які здатні утворювати амфіпамічного зсуву повторного амідного протону для тичні α-спіралі в присутності ліпідів, і які мімікрують пептиду 146 (SEQ ID NO: 146) з таким для ідеальриси корового пептиду, що складається з 15-29 ної α-спіралі (в ідеальній спіралі гідрофільні залиамінокислотних залишків, переважно 22 амінокисшки - незаштриховані кільця, гідрофобні - заштрилотних залишки, або аналоги таких пептидів, у ховані кільця). яких принаймні один амідний зв'язок в пептиді заНа Фіг.9 представлено графік, що показує мінено заміщеним амідом, ізостером аміду або профіль ліпопротеїнів у кроля, якому ввели в дозі амідомиметиком. 8мг/кг тіла пептид 146 (SEQ ID NO: 146) (в формі Агоністи Аро А-І винаходу засновані, зокрема, комплексу пептид/DPPC). на несподіваному відкритті заявників, що зміна На Фіг.10 представлено фігуру, що показує ріпевних амінокислотних залишків в первинній позні стани агрегації і ліпідопептидних комплексів, які слідовності 22-членних узгоджених послідовностях можна отримати з агоністами АроА-І винаходу. (Verikatachalapathi et al., 1991 Моl. Conformation Зліва: Процес мультемерізації пептидів, є резульand Biol. Interaction, Indian Acad. ScL, B: 585-596 татом взаємодії декількох пептидних спіралей і що (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75, призводить до формування олігомерів за умови далі будемо називати "консенсусний 22-мір Сегрепевної концентрації пептиду, рН і іонної сили. ста", або "консенсусний 22-заходів", які, як вважаУ центрі: Взаємодія пептидів (в будь-якому ють, є надзвичайно важливими для отримання стані агрегації) з ліпідними об'єктами (наприклад з синтетичних пептидів, що мають активність що SUV), що призводить до реорганізації ліпідів. наближається до активності, а іноді і перевершуюПраворуч: Шляхом зміни молярного відношенчу активність нативного АроА-1. Зокрема, заявники ня ліпід:пептид можна отримати різні типи пептидвідкрили, що внаслідок заміщення трьох заряджелипідних комплексів, від ліпід-пептидних коміцел них амінокислот в послідовності 22-міра Сегреста за низьких співвідношень ліпід:пептид до дископо(Glu-5, Lys-9 і Glu-13) на гідрофобний Leu, виходібних часток, і нарешті, до великих мультиламедять пептиди, які мімікрують структурні і функціолярних комплексів за дуже великих ліпіднальні властивості АроА-1 із мірою, несподіваною пептидних співвідношень. в даній області. На Фіг.10В представлено загальноприйняту Вважають, що спіраль, сформована АроА-Імодель дисковидних пептид-ліпідних комплексів, агоністами винаходу може сильно нагадувати що утворюється в певних межах ліпід:пептидних структурні і функціональні властивості амфіпатичспіввідношень. Кожний пептид, навколишній край них спіральних дільниць нативного АроА-І, які вадиска, знаходиться в близькому контакті з двома жливі для ефективного скріплення з ліпідами, висвоїми найближчими сусідами. ходу холестерину і активації LCAT, те ж саме 5. Докладний опис винаходу робить α-спіраль, сформована з пептидівАгоністи АроА-І винаходу мімікрують функцію і миметиків АроА-І, вже описана в літературі, але активність АроА-І. Вони утворять амфіпатичні співиходить, що пептиди винаходу мають значно ралі (в присутності ліпідів), зв'язують ліпіди, утвобільш високу АроА-І-подібну активність, чим вже рять пре-β-подібні або ЛПВЩ подібні комплекси, описані інші пептиди. Насправді, багато які агонісактивують LCAT, збільшують сироваточну конценти АроА-I винаходи наближаються до активності трацію ЛПВЩ і посилюють вихід холестерину. БіоАроА-І і навіть перевищують її; кращим пептидомлогічна функція пептидів корелює з їх спіральною миметиком АроА-І, описаним в літературі, є пептид структурою або з перетворенням в спіральну стру18АМ4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID NO: 246) ктуру в присутності ліпідів. (Corinjn et al., 1993, Biochim., Biophis. Acta 1170:8Агоністи Аро А-І винаходу можуть бути отри16; Labeur et al., 1994, мані в стабільній масі або в дозованих формах, Arteriosclerosis; Abstract Nos 186 and 187) і Nнаприклад, ліофілізоровані продукти, які можуть ацетильваний, С-амідований пептид 18AM4 (SEQ бути відновлені перед вживанням in vivo або пеID NO: 239) (Brasseur, 1993, Biochim., Biophis. Acta реформульовані. Винахід включає фармацевтичні 1170:1-7), ці пептиди показали активність 4% і 7% склади і їх використання в лікуванні гіперліпідемії, відповідно від активності АроА-І в тесті активації гіперхолестеринемії, коронарних порушень, атероLCAT, описаному тут. склерозу і інших випадків, наприклад, ендотоксеУ одному ілюстративному втіленні винаходу мії, що викликає септичний шок. корові пептиди (або їх аналоги), які формують агоВинахід проілюстрований робочими прикланістів АроА-І винаходу, мають наступну структурну дами, які показують, що АроА-агоністи винаходу формулу (І): високо ефективні як активатори LCAT і таким чиХ1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14ном, посилюють ЗТХ. Застосування агоністів -Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-X22 АроА-І винаходу in vi vo в моделях на тваринах де Х1 являє собою Pro (Ρ), Ala (A), Gl y (G), Gin призводить до збільшення концентрації сировато(Q), Asn (N), Asp або D-Pro (p) чних ЛПВЩ. X2 являє собою аліфатичну амінокислоту Більш детально винахід описаний нижче в 4 Х3 являє собою Leu (L) або Phe (F) розділах, які описують склад і структуру пептидних Х4 являє собою Glu (E) агоністів АроА-І, їх стр уктурну і функціональну хаХ5 являє собою аліфатичну амінокислоту рактеристику, способи отримання в обсязі і в раХ6 являє собою Leu (L) або Phe (F) зових дозах і способи застосування. Х7 являє собою Glu (Ε) або Leu (L) 25 71552 26 Χ8 являє собою Asn (E) або Gln (Q) 24:4401-4404 (-CH(OH)CH2-,), Hruby, 1982, Life Sci. X9 являє собою Leu (L) 31:189-199 ((-CH2-S-). Χ10 являє собою Leu (L), Trp (W) або Gl y (G) Крім того, один або більше амідних зв'язків X11 являє собою кислу амінокислоту може бути заміщений пептидомиметиками або Х12 являє собою Arg (R) амідомиметиками, які незначно впливають на Х13 являє собою Leu (L) або Glu (E) структур у або активність пептидів. Зручні частини Х14 являє собою Leu (L), Phe (F) або Gly (E) амідомиметиків описані, наприклад, Olson et al, Χ15 являє собою Asp (D) 1993, J.Med. Chem. 36: 3039-3049. Х16 являє собою Ala (A) Надзвичайно важливою рисою корових пептиX17 являє собою Leu (L) дів структури (І) є їх здатність утворювати амфіпаΧ18 являє собою Asn (N) або Gln (Q) тичні α-спіралі в присутності ліпідів. Під амфіпатиX19 являє собою основну амінокислоту чністю розуміють те, що α-спіраль має протистоячі Х20 являє собою основну амінокислоту гідрофобну і гідрофільну поверхні, орієнтовані Х21 являє собою Leu (L) вздовж своєї довгої осі, тобто одна поверхня спіХ22 являє собою основну амінокислоту ралі проектує в основному гідрофільні бокові ланКорові пептиди структури (І) визначають за цюги, а протилежна поверхня проектує в основноамінокислотами, позначених класів. Визначення му гідрофобні ланцюги. Фіг.1А і 1В показують два різних позначених класів амінокислот представлевигляди протистоячих гідрофільної і гідрофобної ні нижче в зв'язку з описом мутантних або змінеповерхонь на прикладі ідеальної амфіпатичної αних втілень структури (І). спіралі. Фіг.1А це діаграма спірального колеса У корових пептидів структури (І) символ "-" між Шиффера-Едмундсена (Schiffer & Edmundson, амінокислотними залишками Хп загалом означає 1967, Biophys. J. 7:121-135). В колесі, довга вісь наявність структурного постійного зв'язку. Т.ч. сиспіралі направлено перпендикулярно сторінці. Помвол "-" звичайно показує пептидний зв'язок, або чинаючи з N-кінців наступні один за одним аміноамідний зв'язок, (C(O)NH-). Даний винахід пропокислотні залишки (показані кружками) радіально нує також пептидні аналоги, в яких один або більрозходяться по периметру кола з інтервалами в ше амідних зв'язків необов'язково заміщені не амі100°. Таким чином, залишок n+1 розташований на дним зв'язком, переважно заміщеним амідом або 100° від залишку n, залишок n+2 розташований на ізостером аміду. Різні Хn залишки в структурі (І) 100° від залишку n+1, і т.д. 100° розташування загалом описані як амінокислоти, в переважному означає наявність 3,6 амінокислотних залишків на втіленні винаходу проілюстровані прикладами, і поворот, що звичайно і спостерігається в ідеальній фа хівець в цій області дізнається про ті втілення, а-спіралі. На Фіг.1А протистоячі гідрофільна і гідякі мають неамідні зв'язки; термін "амінокислота" рофобна поверхні спіралі добре видно, гідрофільні або "залишок" використовується тут і для інших амінокислоти показані незаштрихованими кружкабіфункціональних несучи х гр уп, схожих за структуми, гідрофобні - заштрихованими кружками. рою бокових ланцюгів на амінокислоти.) Фіг.1В показує діаграму спірального ланцюга Заміщені аміди загалом включають, не обмеідеальної амфіпатичної спіралі Фіг.1А (Lim, 1978, жуючись ними, групи наступної формули: FEBS Lett. 89:10-14). У типовій діаграмі спіральноC(O)NR-, де R являє собою (С1-С6) алкильну, заго ланцюга α-спіраль представлено у вигляді циліміщену (С1-С6) алкильну, (С1-С6) алкенильну, зандру, який розрізаний вздовж центру своєї гідроміщену (С1-С6) алкенильну, (С1-С6) алкинільну, (С1фільної поверхні і сплющено. Таким чином, центр С6) заміщену алкинільну, (С5-С20) арильну, (С6-С26) гідрофобної поверхні, що визначається гідрофобалкарильну, заміщену (С6-С26) алкарильну, 5-20 ним моментом спіралі (Eisenberg et al., 1982, членну гетероарільну або 6-26 членну алкгетероаNature 299:371-374) лежить в центрі фігури і орієнрільну і заміщену 6-26 членну алкгетероариільну тований таким чином, що ніби-то зростає на плані групи. сторінки. Фігура спірального циліндру, який було Ізостери аміду загалом включають, не обмерозрізано і сплющено показано на Фіг.1С. Різні жуючись ними -CH2NH-, -CH2S-,-СН2СН2-, -СН=СНвиди однієї і тієї ж амфіпатичної спіралі можна (цис, транс), -С(О)СН2-, -СН(ОН)СН 2-, -CH2SO-. отримати, розрізавши циліндр вздовж різних плоЗ'єднання, що мають такі неамідні зв'язки і спосощин і таким чином отримати різну інформацію про би їх отримання добре відомі в даній області властивості спіралі. (Spatola, March 1983, Vega Data Vol. 1, Issue 3; Амфіпатична природа α-спіралі, утвореної коSpatola 1983 "Peptide Backbone Modifications" In: ровими пептидами структури (І) в присутності ліпіChemistry and Biochemistry of Ammo Acids, Peptides дів, зображена на Фіг.2. Фіг.2А показує діаграму and Proteins, Weinstein, ed.. Marcel Dekker, New колеса спіралі Шиффера-Едмундсена, Фіг.2В поYork, 267 (загальний огляд); Morley, 1980 Trends казує діаграму спіральної мережі, що зображають Pharm Sci, 1: 463-468; Hudson et al., 1979, Int. гідрофобну поверхню, і Фіг.2С показує діаграму J.Prot. Res, 14: 177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-,) Spaспірального ланцюгу, що зображають гідрофільну tola et al., 1986, Life Sci 38: 1243-1249 (- CHz-S-,) поверхню. На кожній фігурі 2А, 2В і 2С гідрофільні Hann, 1982 J. Chem. Soc. Perkin Trans.I. 1: 307-314 залишки показані незаштрихованими кружками, (-CH=CH-, цис, транс), Almquist et al., 1980, J.Med. гідрофобні - заштрихованими кружками, і залишки Chem 23: 1392-1398 (-COCH 2-,); Jennings-White et які можуть бути і гідрофобними і гідрофільними, al. Tetrahedron. Lett. 23: 2533 (-COCHz-), European заштриховані не повністю. Далі будуть обговорюPatent Application EP 45665 (1982) CA 97:39405 (ватися більш детально змінені або мутантні форCH(OH)CH2-), Holladay et al., Tetrahedron. Lett ми пептидів структури (І), визначені амінокислотні залишки можуть бути заміщені іншими амінокис 27 71552 28 лотними залишками так, щоб гідрофобна і гідрояк вже була визначена, Νн - загальне число гідрофільна поверхні спіралі, сформованої пептидами, фобних амінокислот в гідрофобної поверхні). Знане складались тільки з гідрофобних або гідрофільчення гідрофобності гідрофобної поверхні Hopho) них амінокислот. Зрозуміло, що для амфіпатичної являє собою Hоpho /Nн, де Nн таке, як визначено спіралі, утвореної коровими пептидами даного вище. Загалом вважають, що корові пептиди, що винаходу, вираз "гідрофільна поверхня" відномають в межах від 0,90 до 1,2, визначене ситься до поверхні спіралі, яка має мережу в цілоза допомогою шкали гідрофобності Ейзенберга му гідрофільного характеру. Вираз "гідрофобна (Eisenberg, 1984, supra; Eisenberg, 1982, supra) поверхня" відноситься до поверхні спіралі, яка має знаходяться в межах даного винаходу, і в мережу в цілому гідрофобного характеру. межах від 0,940 до 1,10 переважно. Вважають, що певні структурні і/або фізичні Гідрофобний кут (pho кут) загалом визначають властивості амфіпатичної спіралі, утвореної корояк кут або arc покритий найдовшим розтягненням вими пептидами структури (І), важливі для вияву гідрофобних амінокислотних залишків, коли пепактивності. Такі властивості включають: міру амтид організований в представленні спірального фіпатичності, загальну гідрофобність, значення колеса Шиффера-Едмундсена (тобто число сумігідрофобності, гідрофобний і гідрофільний кути, жних гідрофобних залишків колеса помножене на гідрофобний момент, значення гідрофобного мо20°). Гідрофільний кут (phi кут) це різниця між 360° менту, заряд мережі α-спіралі. і pho кутом (тобто 360° - pho кут). Фа хівці в цій обДіаграма колеса спіралі на Фіг.2А зручна для ласті знають, що pho і phi кути будуть залежати, розгляду амфіпатичної природи корових пептидів зокрема, від числа амінокислотних залишків в пепструктури (І), міра амфіпатичності (міра асиметрії тиді. Наприклад, на Фіг.5А і 5В видно, що тільки 18 або гідрофобності) можна зручно виміряти за доамінокислот заповнюють одне обертання спіральпомогою підрахунку гідрофобного моменту (μн) ного колеса Шиффера-Едмундсена. При меншій спіралі. Спосіб для підрахунку μ н для окремої покількості амінокислот залишається пролом в колеслідовності пептиду добре відомий в даній області сі; при більшій кількості амінокислот виходить, що і описаний, наприклад, Eisenberg, 1984, Ann. Rev. в певних положеннях колеса знаходиться більше Biochem. 53: 595-623. Істинний μн отриманий для одного амінокислотного залишок. Для пептидів, окремого пептиду, буде залежати від загальної що містять більше 18 амінокислотних залишків, кількості амінокислотних залишків, що складають таку корові пептиди структури (І), суцільне витягпептид. Таким чином, загалом пряме порівняння μн нення гідрофобних амінокислотних залишків ознадля пептидів різних довжин не є інформативним. чає, що, принаймні, один амінокислотний залишок Амфіпатичність пептидів різних довжин можна в положеннях вздовж колеса, зайнятий двома або порівняти прямо за допомогою вимірювання гідбільш амінокислотами, являє собою гідрофобну рофобного моменту (). Значення гідрофобноамінокислоту. Так на Фіг.5В pho кут є arc, перекриго моменту отримують шляхом розділення μн на тий залишками 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 і 14 всучисло залишків в спіралі (тобто =μн/Ν)переч наявності гідрофільного залишку в полоЗагалом вважають, що корові пептиди, що мають женні 20 і залишку в положенні 2, який займає те ж в межах 0,45-0,65, що визначений за допомоположення в колесі що і залишок 20, будучи гідгою нормалізованої узгодженої шкали гідрофобнорофобним залишком. Типово, що корові пептиди, сті Ейзенберга (Eisenberg, 1984, J.МоІ. Віоі. 179: що мають pho кут в межах від 160° до 220° знахо125-142) знаходяться в межах даного винаходу, дяться в межах даного винаходу, і переважний pho причому в межах від 0,50 до 0,60 переважні. кут знаходиться в межах від 180° до 200°. Загальна або тотальна гідрофобність (Но) пепПевні структурні і/або фізичні характеристики тиду зручно підрахувати, взявши алгебраїчну суму корових пептидів структури (І) зображені на Фіг.3 і гідрофобності кожного амінокислотного залишку в 4. Фіг.3В показує спіральну мережеву діаграму ілюстративного корового пептиду даного винахоN пептиді (тобто Н о= å Hi ), де N є числом амінокисду, пептиду 146 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; i=1 SEQ ID NО:146), і показує розподіл заряду вздовж лотних залишків в пептиді і Нi являє собою гідрогідрофільної поверхні спіралі. На Фіг.3В спіральфобність і-того амінокислотного залишку). Значенний циліндр розрізаний вздовж центра гідрофобної ня гідрофобності являє собою гідрофобність, поверхні і сплющено. Три гідрофобних залишки ділену на кількість амінокислотних залишків Leu (L), які заміняють гідрофільні залишки в послі(=Ηо/N). Загалом вважають, що корові пептидовності Сегреста (Фіг.3А) заштриховані. Як покади зі значенням гідрофобності в межах від -0,050 зано на Фіг.3В, позитивно заряджені амінокислотні до -0,070, яка визначена з використанням нормазалишки кластеризовані біля останнього Слізованої шкали Ейзенберга (Eisenberg, 1984, кінцевого повороту спіралі (С-кінець знаходиться J.МоI. Віоі. 179:125-142), знаходяться в межах давгорі сторінки). Вважають, що цей кластер основного винаходу, і значення гідрофобності в межах них залишків з С-кінця (залишки 19, 20 і 22) стабівід -0,030 до -0,055 переважні. лізують спіраль за допомогою зарядів (NH3+ сиЗагальна гідрофобність гідрофобної поверхні раль-дипольних електростатичних взаємодій. (Hopho) амфіпатичної спіралі можна отримати, взяТакож існує думка, що стабілізація здійснюється вши сум у гідрофобностей гідрофобних амінокисчерез гідрофобні взаємодії між лізином бокових лотних залишків, які попадають в гідрофобний кут, ланцюгів і кором спіралі (Groebke et al., 1996, N PNAS USA, 93: 402P 4029; Esposito et al., 1997, pho як визначено нижче (тобто Ho = å Hi ), де Н 1 така, Biopolymers 41: 27-35). i =1 29 71552 30 За винятком позитивно-зарядженого Сявлено, що довжини водневих зв'язків кінцевого кластеру, негативні заряди поширені на гідрофільних і гідрофобних поверхонь варіюють гідрофільній поверхні, що залишилася, принаймні, таким чином, що гідрофобний бік спіралі увігнутий один негативно (кислий) амінокислотний залишок (Barlow & Thornton, 1989, J.МоІ. Biol 201: 601-619; на поворот, що призводить до появи безперервноZhou et al., 1992, J.Am. Chem. Soc. 33: 11174го тяжу з негативних зарядів вздовж гідрофільної 11183; Gesell et al., 1997, J.Biomol. NMR 9: 127поверхні спіралі. Один позитивний заряд розташо135). Вважають, що загальна увігнутість гідрофобваний у залишку 12, він потенційно робить внесок ної поверхні спіралі може бути важливою для скрів стабілізацію спіралі за допомогою формування плення дископодібних комплексів - викривлена сольового містка з кислим залишком через один спіраль дозволяє пептиду прилягати краще навкоповорот по спіралі. ло кромки дисковидних часток, таким чином, посиФіг.4В показує діаграму спірального ланцюга, люючи стабільність комплексу пептид-диск. зображуючи гідрофобну поверхню амфіпатичної У загальноприйнятій структурній моделі АроА-І спіралі, створеної ілюстративним коровим пептиамфіпатичні α-спіралі упаковані навколо краю дисдом SEQ ID NO: 146). На Фіг.4В спіральний циковидного ЛПВЩ (Фіг.10В). В цій моделі передбаліндр розрізано вздовж центру гідрофільної повечається, що спіралі вирівнюється своїми гідрофорхні і сплющено. Гідрофобна поверхня корового бними поверхнями спрямованими до ацильних пептиду складається з двох гідрофобних залишків ланцюгів ліпіду (Brasseur et al., 1990, Bioch. Bioph. на поворот, за винятком останнього С-кінцевого Acta 1043: 245-252). Спіралі організовані антипаповороту, де переважають основні залишки. ЯМР ралельно і вважають, що кооперативний ефект дослідження показали, що амінокислотні залишки між спіралями робить внесок в стабільність диско3, 6, 9, 10 цього корового пептиду утворюють гідвидного ЛПВЩ комплексу. (Brasseur et al., supra). рофобний кластер біля N-кінця спіралі. Phe-6 розПрипустили, що одним з чинників, який робить ташовується в центрі цього кластеру і, як вважавнесок в стабільність ЛПВЩ дисковидного комплеють, грає важливу роль в стабілізуванні ксу, є наявність іонних взаємодій між кислими і гідрофобного кластеру. основними залишками, що веде до утворення внуВважають, що гідрофобний кластер, сформотрішньомолекулярний сольових містків або водневаний залишками 3, 6, 9 і 10 має велике значення вих зв'язків між залишками на суміжних антипарапри ефективному скріпленні ліпідів і LCAT активалельних спіралях. У цій моделі вважають, що ції. Очікують, що амфіпатичні пептиди зв'язують пептиди не є єдиним об'єктом, а важливі у взаємофосфоліпіди, розташовуючи свої гідрофобні поведії з принаймні двома іншими сусідніми пептиднирхні у напрямі до алкильних ланцюгів ліпідної часми молекулами (Фіг.10В). тини. Т.ч. вважають, що цей високо гідрофобний Також загально прийнято, що внутрішньомокластер робить внесок в сильну афінність до ліпілекулярні водневі зв'язки або сольові містки між дів, яка спостерігається у корових пептидів даного кислими і основними залишками, відповідно в повинаходу. Оскільки скріплення з ліпідом є умовою ложеннях і та і+3 спіралі, стабілізують спіральну активації LCAT, вважають, що гідрофобний класструктур у (Marqusee et al., 1985 PNAS USA 84 (24): тер також необхідний і для активації LCAT. 8898-8902). Часто виявляють, що ароматичні залишки ваКрім того, додатковими важливими рисами кожливі в скріпленні пептидів і білків з ліпідами (De рових пептидів структури (І) є їх здатність до утвоKruijff, 1990, Biosci. Rep.10. -127-130, O'Neil De рення внутрішньомолекулярних водневих зв'язків Grado, 1990, Science 250: 645-651; Blondelle et al., один з одним, коли вони витягуються антипарале1993, Biochim. Biophys. Acta 1202: 331-336). Т.ч., льним чином своїми гідрофобними поверхнями далі вважають, що Phe-6, який розташований в спрямованими в один бік, це буде в тому випадку, центрі гідрофобного кластеру, також може відіграколи пептиди пов'язані з ліпідами (тобто між кисвати важливу роль в скріпленні корових пептидів лими залишками в положеннях 4 і 7 і основними структури (І) з ліпідами. залишками в положеннях 19, 20 і 22), і також їх Взаємодія між коровими пептидами винаходу і здатність до утворення внутрішньомолекулярнихліпідами призводить до утворення пептидводневих зв'язків або сольових містків біля N- і Сліпідного комплексу. На Фіг.10А показані види кінців спіралі. комплексів (коміцели, диски, везикули або мульЗдатність корових пептидів структури (І) утвотишари), що отримуються в залежності від лірювати внутрішньомолекулярні водневі зв'язки під:пептидного молярного співвідношення, коміцепоказано на Фіг.6. На Фіг.6 дві ідеальні α-спіралі ли звичайно утворюються при низьких ілюстративного корового пептиду 146 (SEQ ID NO ліпід:пептидних співвідношеннях, диски, везикули і 146) антипераллельно витягнуті, і їх гідрофобні мультишарові комплекси утворюються при збільповерхні відповідно направлені в один бік (від пошенні ліпід:пептидного молярного співвідношення. верхні сторінки). Н-зв'язуючі взаємодії можуть ісТакі характеристики для амфіпатичних пептидів нувати між залишками Е-7 і Q-18 (Huyghuesописані (Epand, The Amphipathic Helix, 1993) і для Despointes et al., 1995, Biochemistry 34 (41):)( АроА-І (Jones, Strucure and Function of 13267-13271). Apolipiproteins, Ch.8: 217-250). Ліпід:пептидне моКрім того, при організації таким антипаралельлярне співвідношення також визначає розмір і ним способом спіралі щільно упаковані, і не існує композицію комплексів (Section 5.3.1., infra). перешкод для близького контакту між спіралями. Довга вісь α-спіралі, утвореної коровими пепЗміни в послідовності корових пептидів, які вплитидами структури (І) має загалом форму, що вигивають на упаковку спіралі, негативно впливають і нається. Для типових амфіпатичних спіралей вина активність корових пептидів. 31 71552 32 Вважають, що здатність корових пептидів трьох заряджених залишків в 22-мірі Сегреста на структури (І) щільно упаковуватися і взаємодіяти гідрофобний Leu (L) приводить до значних змін в іонним чином з утворенням всередині/і міжмолеамфіпатичності, гідрофобності, pho куті і інших кулярних сольових містків і/або водневих зв'язків, властивостях спіралі. при скріпленні з ліпідом антипараллельним чином Порівняння фізичних і структурних властивосявляє собою важливу рису корових пептидів витей пептиду 146 і 22-міра Сегреста навеведено в находу. Таблиці II, приведеній нижче: Також вважають, що здатність корових пептиТаблиця II дів мати бажані внутрішньомолекулярні пептидпептидні взаємодії доречна і при відсутності ліпіПорів няння в ластив остей ілюстратив ного дів. Корові пептиди винаходу є самоорганізуючикоров ого пептиду 146 (SEQ ID NO: 146) і у згодженого 22-міру Сегреста (SEQ ID NO: 75) мися завдяки високим значенням , і гідрофобного кута (Табл.І, infra). Яви ще 22-мір СегВластив ість Пептид 146 самоасоціації залежить від умов рН, концентрації реста пептидів і іонної сили, і призводить до декількох кількість амінокислот 22 22 кількість гідро фі льних амінокис лот 13 10 станів асоціації, від мономірної до декількох мулькількість гідро фо бних 9 12 тимерних форм (Фіг.10А). Гідрофобний кор пепти% гідро фобних амінокис лот 41 55 дних агрегатів сприяє гідрофобним взаємодіям з -0,293 -0,013 ph o ліпідами. Здатність пептидів агрегувати навіть при 0,960 0,990 низьких концентраціях сприяє скріпленню з ліпіда 0,425 0,577 pho ку т 100° 200° ми. Вважають, що в корі пептидних агрегатів пепкількість позитив но заряджених 5 4 тид-пептидні взаємодії також існують і можуть конкількість негатив но заря джених 6 4 курувати з ліпід-пептидними взаємодіями. заряд ла нцюга -1 0 У доповнення до вище перелічених властивостей вважають, що і інші параметри також важливі Потрібно зазначити, що корові пептиди струкдля активності, включаючи загальну кількість гідтури (І) складаються з більшої кількості гідрофоброфобних залишків, загальну кількість заряджених них залишків, мають значно більші значення і залишків і заряд пептидного ланцюгу. і мають в два рази більший кут pho в порівУзагальнення переважних фізичних і структунянні з 22-міром Сегреста (Фіг.5А і 5В). Ці відмінрних властивостей корових пептидів структури (І) ності у властивостях призводять до значних відзібрано в Таблиці І, наведеній нижче: мінностей в активності. Так 22-мір Сегреста має Таблиця І Фізичні в ластив ості перев ажних агоністів АроА-І стру кту ри (І) Властив ість Межі Перев ажні межі % гідро фобних аміно 40-70 50-60 кислот -0,050 - -0,070 -0,030 - -0,055 ph o 0,90-1,2 0,94-1,1 0,45 -0,65 0,50 -0,60 pho ку т 160°-220° 180°-200° Кількість позитив но заря3-5 4 джених амін окислот кількість негатив но заря3-5 4 джених амін окислот заряд ла нцюга -1 до +1 0 положення 3, 6, 9, 10 є гідро фобнигідро фо бний кластер ми амінок ислотами принаймні, 1 кисла аміно кислота на кислий класте р пов орот за в инятко м 5 С-кі нцев их амінокислот принаймні, 3 основ них амінокислоти основ ний кластер останніх 5 С-кінцев их амінокислотах Властивості амфіпатичних α-спіралей, утворених коровими пептидами винаходу значно відрізняються від властивостей амфіпатичних αспіралей класу А узгодженого 22-міру Сегреста. Ці відмінності показано на ілюстративному коровому пептиді 146 (SEQ ID NO: 146) на фігурах 3-5. На Фіг.4А і 4В видно, що гідрофобна поверхня пептиду 146 має значно більше за гідрофобний характер, ніж гідрофобна поверхня 22-міру Сегреста. Зокрема, залишки 5, 9 і 13 (зафарбовані на Фіг.4В) являють собою гідрофобні залишки Leu (L) пептиду 146 в порівнянні із зарядженими залишками 22-міру (SEQ ID NO: 75). Заміщення цих 10% активацію LCAT в порівнянні з нативним АроА-І в теста х, приведених тут, пептид 146 показує 86% активність порівняно з нативним АроА-І в цих же тестах. Пептид 144 (pVLELFENLLERLLDALQKKLK,- SEQ ID NО:144), який відрізняється від 146 тільки наявністю D-Pro(p) в позиції Х1 показує 111% LCAT активацію в порівнянні з нативним АроА-І в цих же тестах. Певні амінокислотні залишки в корових пептидах стр уктури (І) можуть бути заміщені іншими амінокислотними залишками без значних втрат, а в деяких випадках навіть посилюють активність цих пептидів. Т.ч. в даний винахід також входять змінені або мутантні форми корових пептидів структури (І), де принаймні одну певну амінокислоту в структурі замінено іншим амінокислотним залишком. Вважають, що однієї з критичних рис, що впливають на активність корових пептидів винаходу, є їх здатність утворювати α-спіралі в присутності ліпідів, про що говорить їх амфіпатичність і інші властивості описані вище, також буде визначено, що в переважних втіленнях винаходу амінокислотні заміщення консервативні, тобто переважно, щоб заміняюча амінокислота мала ті же фізичні і хімічні властивості, що і заміщена амінокислота. Для визначення консервативних амінокислотних заміщень, амінокислоти були зручно класифіковані на дві головні категорії - гідрофільні і гідрофобні - в залежності, насамперед, від фізикохімічних характеристик бокового ланцюга амінокислоти. Ці дві головні категорії далі можуть бути розділені на субкатегорії, які більш точно визначають характеристики амінокислотного бокового ланцюга. Наприклад, клас гідрофільних амінокислот можна поділити на кислі, основні і полярні аміно 33 71552 34 кислоти. Клас гідрофобних амінокислот можна "Алi фатична амінокислота" стосується гідроподілити на неполярні і ароматичні амінокислоти. фобної амінокислоти, що має алифатичний вуглеВизначення різних категорій амінокислот, які виводневий боковий ланцюг. Алифатическні амінозначають структуру (І), являють собою наступні: кислоти, що Генетично кодуються включають Leu "Гідрофільна амінокислота" стосується аміно(L), Val (V), Ile(I), Ala(A). кислоти, що має гідрофобність менше за 0 за норАмінокислотний залишок Суs (С) є незвичаймалізованою узгодженою шкалою Ейзенберга ним, оскільки є здатним утворювати дисульфідні (Eisenberg et al., 1984, J.МоІ. Biol. 179:125-142). містки з іншими Cys (C) залишками або іншими Гідрофільні амінокислоти, що генетично кодуються амінокислотами, що містять сірку. Здатність Cys включають: Thr (Τ), Ser (S), His (Η), Glu (G), Asn (C) залишків (або інших амінокислот з -SH утри(N), Gin (Q), Asp(D), Lys (K), Arg (R). муючими боковими ланцюгами) існувати в пептиді "Кисла амінокислота" стосується гідрофільної або у відновленому вигляді у вільних -SH або в амінокислоти, що має значення рK бокового ланокисленому вигляді в дисульфідних містках вплицюга менше за 7. Кислі амінокислоти звичайно ває на те, що залишки Cys (С) впливають на гідмають негативно заряджені бокові ланцюги при рофобний або гідрофільний характер ланцюга фізіологічному ph завдяки нестачі іонів водню. пептиду. Cys показує гідрофобність 0,29 за шкаКислі амінокислоти, що генетично кодуються лою Ейзенбергу (Eisenberg, 1984, supra), і зрозумівключають: Glu (G), Asp(D). ле, що з метою даного винаходу C ys (C) привлас"Основна амінокислота" стосується гідрофільнюють категорію полярної гідрофільної ної амінокислоти, що має значення рK бокового амінокислоти, що не входить в загальну класифіланцюга більше за 7. Основні амінокислоти звикацію, описану ви ще. чайно мають позитивно заряджені бічні ланцюги Фахівці в цій області розуміють, що описані при фізіологічному рН завдяки асоціації в іон гідвище категорії не є загальним винятком. Так, аміронію. Кислі амінокислоти, що генетично кодуютьнокислоти з боковим ланцюгом, що має дві або ся включають: His (Η), Arg (R), L ys (K). більш фізико-хімічних властивості можуть бути "Полярна амінокислота" відноситься до гідровключені в декілька категорій. Наприклад, амінофільної амінокислоти, що має боковий ланцюг не кислоти з боковими ланцюгами, що мають аромазаряджений при фізіологічному рН, але яка має тичні частини, які потім заміняються полярними принаймні один зв'язок в якому пара електронів замінниками, такі як Tyr (Y), можуть мати як ароподілена між двома атомами і зміщена до одного з матичні гідрофобні властивості, так і полярні гідатомів. Полярні амінокислоти, що Генетично корофільні властивості, і т.ч. можуть бути включені і дуються включають: Gln (Q), Asn (Ν), Ser(S),Thr(T). в ароматичну і в полярну категорії. Відповідна ка"Гідрофобна амінокислота" стосується амінотегоризація будь-якої амінокислоти очевидна для кислоти, що має гідрофобність більше 0 за нормафа хівців в даній області, особливо в світлі детальлізованою узгодженою шкалою Ейзенберга ного опису, що наводиться тут. (Eisenberg et al, 1984, J.МоI. Biol. 179:125-142). Певні амінокислотні залишки, звані "зломщики Гідрофобні амінокислоти, що генетично кодуються спіралі" мають властивість порушувати стр уктуру включають: Pro (Ρ), Не (І), Phe (Ρ), Val (V), Leu (L), α-спіралі, коли займають внутрішні положення Trp (W), Met (M), Ala (A), Gl y (G), Tyr (Y). всередині спіралі. Амінокислоти, що мають такі "Ароматична амінокислота" стосується гідроспіраль руйнуючі властивості добре відомі в даній фобної амінокислоти, чий боковий ланцюг має області (Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. принаймні одне ароматичне або гетероароматич47:251-276) і включають Pro (Ρ), Gly (G) і потенційне кільце. Ароматичні або гетероароматичні кільця но всі D-амінокислоти (коли містяться в L-пептиді; можуть містити один або більше за заступників, L-амінокислоти порушують спіральну стр уктур у, таких як -ВІН, -SH, -CN, -F, -СІ, -ВR, -І, -NO2, -NO, коли знаходяться в D-пептиді). Такі спіральNHa, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, порушуючі амінокислоти попадають у ви ще переC(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR i т.п., де кожний R лічені категорії за винятком Gly (G) (як вже обговоявляє собою незалежно (С1-С6) алкіл, заміщений рювалося, infra); такі залишки не можна викорис(С1-С6) алкіл, (С1-С6) алкенил заміщений (С1-С6) тати для заміщення амінокислотних залишків у алкенил (С1-С6) алкиніл або заміщений (С1-С6) внутрішніх положеннях в спіралі - їх можна викоалкиніл (С1-С6) арил заміщений (С5-С20) арил (С6ристати тільки для заміщення 1-3 амінокислотних С26) алкарил заміщений (С6-С26) алкарил, 5-20 залишків на N-кінці і/або С-кінці пептиду. членний гетероаріл, 6-26 членний алкгетероаріл Вище перелічені категорії проілюстровано відабо заміщений 6-26 членний алкгетероарил. Ароносно амінокислот, що генетично кодуються, але матичні амінокислоти, що генетично кодуються амінокислотні замінники не обов'язково повинні включають Phe (F), Туr (Y), Trp (W). бути, а в певних переважних втіленнях не повинні "Неполярна амінокислота" стосується гідробути обмежені амінокислотами, що тільки генетичфобної амінокислоти, боковий ланцюг якої не зано кодуються. Насправді, багато які переважні ряджено при фізіологічних значеннях рН, і який пептиди структури (І) містять амінокислоти, що має зв'язок, в якому пара електронів об'єднана у генетично не кодуються. Так в доповненні до придвох атомів і загалом рівномірно розподілена між родно існуючих амінокислот, що генетично кодуцими двома атомами (тобто боковий ланцюг не є ються, амінокислотні залишки в корових пептидах полярним). Неполярні амінокислоти, що генетично структури (І) можуть бути заміщені природно існукодуються включають Leu (L), Val (V), Ile(I), Met(M), ючими амінокислотами, що не кодуються і синтеGly(G), Ala (A). тичними амінокислотами. 35 71552 36 Певні загальновідомі амінокислоти, які являна D-Arg) або D-амінокислотою з тієї ж категорії ють собою зручні заступники для корових пептидів або субкатегорії (L-Arg на D-Lys) або навпаки. Наструктури (І), включають, не обмежуючись ними: справді, в певних переважних втіленнях, які зручні (β-аланін (β-Ala) і інші омега-амінокислоти, такі як для перорального застосування для тваринних 3-амінопропіонова кислота, 2,3-діамінопропіонова об'єктів, пептиди можуть складатися з, принаймні, кислота (Dpr), 4-амінобутирова кислота і т.д., αодного D-енантомеру амінокислоти. Вважають, що аміноізобутирова кислота (Aib), ε-аміногексанова пептиди, що містять таку D-амінокислоту будуть кислота (Aha), δ-аміновалерова кислота (Ava), Nбільш стабільні від деградації при пероральнім метилгліцин або сакрозин (MeGly), орнитин (Оrn), застосуванні в ротовій порожнині, кишечнику або цитрулін (Cit), t-бутилаланін (t-BuA), t-бутилгліцин сироватці в порівнянні з пептидами, що перебува(t-BuG), N-метилизолейцин (Melle), фенілгліцин ють виключно з L-амінокислот. (Phg), циклогексилаланін (Cha), норлейцин (Me), Як зазначено вище, D-амінокислоти мають тенафтилаланін (Nal), 4-хлорфенілаланін (Phe (4нденцію порушувати стр уктуру α-спіралей, коли Cl)), 2-фторфенілаланін (Phe(2-F)), 3розташовуються у вн утрішніх положеннях αфтор фенілаланін (Phe(3-F)), 4-фторфенілаланін спіралі L-пептиду. Крім того, зазначено, що певні (Phe(4-F)), пеніцилламін (Pen), 1,2,3,4мутантні форми корових пептидів структури (І), які тетрагідроізоквінолін-3-карбонова кислота (Tic), βповністю складаються з D-амінокислот показують 2-тієнілаланін (Тhi), метионін сульфоксид (MSO), значно меншу активацію LCAT в тесті, що привогомоаргінін (hArg), N-ацетилізин (AcLys), 2,4диться тут, в порівнянні з ідентичними пептидами, діамінобутірова кислота (Dbu), 2,3- діамінобутірова що складаються виключно з L-амінокислот. Як кислота (Dab), p-амінофенілаланін (Phe(pNH2), Nнаслідок, D-амінокислоти не повинні використовуметіл валін (MeVal), гомоцистеїн (hCys), гомофеніватися для заміщення внутрішніх L-амінокислот, лаланін (hPhe), гомосерин (hSer), гідроксипролін D-амінокислотні замінники повинні обмежуватися (Hyp), гомопролін (hPro), N-метиліровані амінокис1 - 3 амінокислотними залишками на N-кінці або/і лоти і пептоїди (N-заміщені гліцини). на С-кінці пептиду. Класифікація амінокислот, що не кодуються, і Як вже обговорювалося, амінокислота Gly (G) загальновживаних, що генетично кодуються, відзагалом діє як зломщик спіралі, якщо знаходиться повідно до категорій, визначених ви ще, підсумоу вн утрішні х положеннях пептиду. Разюче, заявнивана в Таблиці III, показаній нижче. Зрозуміло, що кам вдалося відкрити, що спіральна структура коТаблиця III призначена для ілюстративних цілей і рових пептидів винаходу порушується у відсутносне має на увазі вичерпний перелік амінокислотних ті ліпідів, якщо внутрішні амінокислотні залишки залишків, які можна використати для заміщення заміщені Gly (G), в присутності ж ліпідів такі Gly (G) корових пептидів, описаних тут. Інші амінокислотні містячі пептиди показують значну міру спіральносзалишки, не згадані тут, легко можуть бути класиті структури, також як і активності. Наприклад, пепфіковані на основі фізичних і хімічних властивостид 154 (PVLELFENLLERGLDALQKKLK; SEQ ID тей, що спостерігаються, в світлі визначень, даних NO: 154) має тільки 13% спіральну стр уктур у в тут. буфері, і 76% спіральної структури спостерігається в присутності міцел. Помітимо, що декілька короТаблиця III вих пептидів що містять внутрішній Gly (G) залишок, мають активацію LCAT рівну або навіть більКласи фікація на йбі ль ш в жив аних амінокислот ше за 38%. Хоч загалом вважають, що Gly (G) Що гене тично Що гене тично не коду єтьзалишок є зломщиком спіралі, Gly (G) можна викоКласи фікація коду ються ся ристати для заміщення амінокислот у вн утрішніх Гідро фобні положеннях корових пептидів структури (І). ПереАрома тичні F.Y.W Phg, Nal, Тhi, Tic, важно, щоб внутрішні залишки розташовані тільки Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), в межах ±1 повороту спіралі в центрі пептиду hPhe (особливо для пептидів амінокислот, що складаНеполярні L, V, І, М, G, А, Р t-BuA, t-BuG, Melle, Nie, ються з цілого ряду) були заміщені Gly (G). Крім MeVal, Cha, McGly , Aib того, переважно, щоб тільки один внутрішній аміАлі фатичні А, V, L, І b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly , t-BuA, t-BuG, нокислотний залишок в пептиді був заміщений Gly Melle, Cha, Nie, MeVal (G). Переважні втілення агоністів АроА-І винаходу Гідрофільні утримуючі внутрішні гліцини описані в секції 5.1.2. Кислі D,E infra. Основ ні H,K,R Dpr, Orn, hArg, Phe(pNH 2), Dbu, Dab Використання класифікацій амінокислотних Полярні З, Q, N, S, Τ Cit, AcLy s, MSO, bAla, залишків, описаних вище, на основі спірального hSer колеса Шиффера-Едмундсена і діаграми спіральЗло мщики спі- P,G D-Pro і інші Dного ланцюжка корових пептидів структури (І), а ралі амінокислоти (в Lпептиди також детальний опис бажаних властивостей, що представляються тут, змінені або мутантні форми У більшості випадків, амінокислоти корових корових пептидів структури (І), які в істотній мірі пептидів структури (І) будуть заміщені Lзалишаються амфіпатичними, і інші властивості енантомерами амінокислот, але змінники не обспіралі, і все що входить в сферу даного винаходу, межуються L-енантомерами амінокислот. У понятможе бути легко отримане. тя "мутантні" або "змінені" форми також включені У переважному втіленні винаходу змінені або такі ситуації за яких принаймні одна L-аміно кисломутантні форми корових пептидів структури (І) та заміщена ідентичною D-амінокислотою (L-Arg отримують фіксуванням гідрофільних або гідро 37 71552 38 фобних залишків у відповідності зі структурою (І), і тури (І) отримують фіксуванням всіх амінокислотзаміщенням принаймні одного нефіксованого заних залишків, розташованих в межах гідрофобної лишку іншою амінокислотою, переважно консерваабо гідрофільної поверхні спіралі, і заміщенням тивно, тобто іншою амінокислотою з тієї ж категорії іншим амінокислотним залишком, переважно конабо субкатегорії. Залишки, що складають основні сервативно, принаймні одного амінокислотного або гідрофобні кластери, також можуть бути фікзалишку, що знаходиться на іншій поверхні. Залисовані у відповідності зі структурою (І), і, принаймшки, що складають гідрофобний кластер і/або осні, один нефіксований залишок заміщений, переновний кластер, можуть також бути необов'язково важно консервативно. фіксовані у відповідності зі структурою (І), як обгоУ іншому переважному втіленні змінені або ворювалося раніше. мутантні форми корових пептидів структури (І) У іншому втіленні винаходу змінені або мутанотримали шляхом фіксування гідрофільних амінотні форми корових пептидів структури (І) отримукислотних залишків, розташованих в межах гідроють заміщенням принаймні одного амінокислотнофільної поверхні спіралі у відповідності зі структуго залишку неконсервативною амінокислотою. рою (І), і заміщення принаймні одного Фахівці в даній області зрозуміють, що таке замінефіксованого залишку іншою амінокислотою, пещення трохи змінює амфіпатичні і/або структурні реважно консервативно, тобто іншою амінокисловластивості спіралі (supra). Так іноді бажано замістою з тієї ж категорії або субкатегорії. На Фіг.2А тити одну або більше пар амінокислот таким чиможна побачити, що залишки 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, ном, щоб оберегти властивості ланцюга спіралі. 18, 19, 22, розташували в межах гідрофільної поПодальший посібник для вибору відповідних аміверхні амфіпатичної спіралі, утвореної коровими нокислотних замінників надане пептидними посліпептидами структури (І). Всі ці залишки гідрофільні довностями, перерахованими в Таблиці X (Секція за винятком залишку 1, який може бути або гідро8.3, infra). фільним або гідрофобним. Так, в переважному У ще одному переважному втіленні винаходу втіленні залишки 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19, 22 фіквід однієї до чотирьох амінокислотних залишків на совані у відповідності зі структурою (І), і принаймні N-кінці і/або на С кінці корових пептидів структури один із залишків 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, (І) заміщені одним або більше амінокислотними 20, 21 заміщений іншою амінокислотою з цієї ж залишками або одним або більше за пептидними категорії, переважно іншою амінокислотою з тієї ж сегментами, для підтримки стабільності районів субкатегорії. Інакше, залишок 1 також фіксований (Х-спіральної повторної структури (залишки або у відповідності зі структурою 1, і принаймні один із сегменти кінцевого кепу). Такі залишки або сегмезалишків 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21 занти кінцевого кепу добре відомі в даній обласміщений. ті.)((Richardson & Richardson, 1988, Science, У особливо переважному втіленні С-кінцевий 240:)(1648-1652;)(Harper et al., 1993, Biohcem основний кластер (залишки 19, 20 і 22) також фік32(30):7605-7609; Dasgupta & Bell, 1993, Int, J.Pept. сований у відповідності зі структурою (І), і тільки Prot. Res. 41: 499-511; Seale et al., 1994, Prot, залишки 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16 і/або 17 заScience, 3:1741-1745; Doig & Baldwin, 1995, Prot. міщені. Science, 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochem, У іншому особливо переважному втіленні і ос34:12820-12829, Petrukhov et al., 1996, Biochem, новний і гідрофобний кластери фіксовані, і тільки 35:387-397; Doig et al, 1997, Prot. Science 6:147залишки 2, 5, 13, 14, 16 і/або 17 заміщені. 155). Інакше, перші від одного до чотирьох аміноУ іншому переважному втіленні винаходу змікислотних залишків на N-кінці і/або на С-кінці конені або мутантні форми корових пептидів винахорових пептидів структури (І) заміщені пептидомиду отримують шляхом фіксування гідрофобних метиками, які мімікрують структуру і/або амінокислотних залишків, розташованих в межах властивості залишків або сегментів кінцевого кепу. гідрофобної поверхні спіралі і заміщенням приВідповідні миметики кінцевого кепу добре відомі в наймні одного нефіксованого залишку іншою аміданій області і описані, наприклад, Richardson & нокислотою, переважно консервативно, тобто інRichardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et шою амінокислотою з тієї ж категорії або al., 1993, Biohcem., 32 (30):7605-7609; Dasgupta & субкатегорії. Bell, 1993, Int. J.Pept. Prot. Res. 41:499-511; Seale На Фіг.2А можна побачити, що залишки 2, 3, 5, et al., 1994, Prot. Science, 3: 1741-1745; Doig et al., 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21 розташовані в межах 1994, Biochem, 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, гідрофобної поверхні. Ці залишки всі гідрофобні за Proteins, 18, 1-7, Doig SBaldwin, 1995, Prot. Science винятком залишку 20, який є гідрофільним. Так в 4: 1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochem, переважному втіленні залишки 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 34:12820-12829, Petrukhov et al., 1996, Biochem., 14, 16, 17, 20, 21 фіксовані у відповідності зі струк35: 387-397; Doig et al., 1997, Prot. Science 6: турою (І), і принаймні один із залишків 1, 4, 7, 8, 11, 147-155. 12, 15, 18, 19, 20, 22 заміщений іншою амінокислоОскільки структура (І) містить 22 специфічних тою з цієї ж категорії, переважно іншою амінокисположення амінокислотних залишків, зрозуміло, лотою з тієї ж субкатегорії. що корові пептиди винаходу можуть містити менУ особливо переважному втіленні С-кінцевий ше 22 амінокислотних залишків. Насправді, усічені основний кластер (залишки 19, 20 і 22) також фікабо видалені зсередини форми структури (І), що совані у відповідності зі структурою (І), і тільки замістять всього 18 або навіть 15 амінокислотних лишки 1, 4, 7, 8, 11, 12 і/або 15 заміщені. залишків, які в істотній мірі підтримують загальні У іншому переважному втіленні винаходу зміхарактеристики і властивості амфіпатичної спіралі, нені або мутантні форми корових пептидів струк 39 71552 40 утвореної коровими пептидами структури (І), також лі, такі розширення стабілізують спіральну повторвходять до сфери даного винаходу. ну структур у в присутності ліпідів, наприклад, аміУсічені форми структури (І) отримують виданокислоти кінцевого кепу і сегменти, описані ленням однієї або більше амінокислот з N- або Сраніше. кінця структури (І). Форми з діленням зсередини В особливо переважному втіленні, корові пепотримують шляхом видалення однієї або більше тиди структури (І) розширені з С-кінця єдиним осамінокислот з внутрішніх положень пептиду стр укновним амінокислотним залишком, перетури (І). Видалені зсередини залишки амінокислот важне Lys (К). можуть стояти один за одним, а можуть і не До сфери даного винаходу також входять стояти. "блоковані" форми агоніста АроА-І, тобто форми Фахівцям в цій області буде зрозуміло, що виАроА-І агоністів, в яких N- і/або С-кінці блоковані далення внутрішніх амінокислотних залишків з мотивом, здатним реагувати з N-кінцевий -NH2 або корових пептидів структури (І) приведе до випрямС-кінцевий -С(О)ОН групою. Виявили, що видалення гідрофільно-гідрофобної поверхні спіралі і лення N- і/або С-кінцевих зарядів у агоністів АроА-І повороту на 100° в точці делеції. Оскільки таке винаходу, що містять 18 або менш амінокислотних обертання може значно змінити амфіпатичні власзалишків (шляхом синтезування N-ациліьованих тивості спіралі, що вийшла, в переважному втіленамідів пептидів/ефіру/гідразідів/спирту або їх зані винаходу амінокислотні залишки віддаляються міщень) приводить до отримання агоністів, які натаким чином, щоб в значній мірі зберегти вирівнюближаються, а в деяких втіленнях навіть перевервання площини гідрофобно-гідрофільній поверхні шують, активність неблокованих форм агоністів. У вздовж головної довгої осі спіралі. деяких втіленнях, що містять 22 або більше аміноЦе досягається за допомогою видалення знакислот, блокування N-або С-кінців приводить до чного числа послідовних або непослідовних амінопояви АроА-l агоністів, які мають більш низьку аккислотних залишків, наприклад, вилучаючи повний тивність, ніж неблоковані форми. Чекають, що поворот спіралі. Ідеальна α-спіраль містить 3,6 блокування і N-, і С-кінця агоністів АроА-І, що залишки на поворот. Тому, в переважному втіленні складаються з 22 або більше амінокислот, відновидаляють групи з 3-4 послідовних або непослідовить активність. Так, в переважному втіленні винавних амінокислотних залишків. Чи видаляти 3 або ходу, або N- і /або С-кінець (переважно обидва) 4 амінокислоти залежить від положення першого корових пептидів, що містять 18 або менше амінозалишку, який буде видалено, всередині спіралі. кислот блоковані, a N- і С-кінці пептидів, що місВизначення відповідної кількості послідовних або тять 22 і більше амінокислот або обидва блоковані непослідовних амінокислотних залишків, які склаабо обидва неблоковані. Типові групи, ті, що блодають один повний оборот спіралі з будь-якої стакують N-кінець включають RC(O)-групу, де R являє ртової точки в межах аліфатичної спіралі, знахособою -Н, (С1-С6) алкильну, (С1-С6) алкенильную, диться в межах можливостей фахівців в даній (С1-С6) алкинільну, (С5-С20) арильну, (С6-С26) алкаобласті. рильну групи, 5-20 членну гетероарильну або 6-26 Оскільки припускається, що основний кластер членну алкгетероарильну групу. Переважні Nна С-кінцях корових пептидів структури (І) важликінцеві блокуючі групи включають: ацетильну, фовий для стабілізування спіралі, і гідрофобний клармільну і дансильну гр упи. Типові С-кінцеві блокустер важливий в ефективності скріплення ліпідів і ючі групи включають -C(O)NRR і -C(O)OR гр упи, де активації LCAT, в переважних втіленнях винаходу, кожний R незалежно визначений, як вище. Перезалишки, що складають основний і гідрофобний важні С-кінцеві блокуючі групи включають такі, де кластери не видаляють. Так, в переважних втіленкожний R являє собою незалежно метальну гр упу. нях, залишки 19, 20 і 22 (основний кластер) і заВважають, що такі кінцеві блокуючі групи стабілілишки 3, 6, 9 і 10 (гідрофобний кластер) не визують α-спіраль в присутності ліпідів. даляють. (Venkatachelapathi et al., 1993, PROTEINS: Корові пептиди структури (І) також можна розStructure, Function and Genetics 15:349-359). ширити з одного або обох кінців, або шляхом ввеНативна структура Аро А-І містить вісім спірадення додаткових амінокислотних залишків, які не льних одиниць, які, як вважають, узгоджено діють значно впливають на, а в деяких втіленнях навіть для скріплення з ліпідами (Nakagawa et al., 1985, посилюють, структурні і функціональні властивості J.Am. Chem. Soc. 107:7087-7092; Anantharamaish пептидів. Насправді вважають, що розширені коet al., 1985, J.Biol. Chem 260:10248-10262; Vanloo рові пептиді, що містять 23, 25, 26, 29 або навіть et al., 1991, J.Lipid Res. 32: 1253-1264; Mendez et більше амінокислот, входять до сферу даного виal., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16:328находу. Переважно, щоб такі розширені пептиди 338; Demoor et al., 1996, Eur. J.Biochem. 239:74значною мірою зберігали амфіпатичність ланцюгу і 84). Таким чином, також включені до даного винаінші властивості пептидів структури (І). Звичайно, ходу агоністи АроА-І, складають дімери, тримери, про це дізнаються, коли додані у внутрішні полотетрамери і навіть полімери більш високого порядження амінокислоти будуть обертати площину ку ("мультимери") корових пептидів, описаних тут. гідрофобно-гідрофільної поверхні в точці введення Такі мультимери можуть знаходитися в формі тану спосіб, схожий, на описаний вище для внутрішніх демних повторів, розгалуженій мережі або їх комделецій. Тому, положення, описані вище у віднобінацій. Корові пептиди можуть бути прямо приєдшенні внутрішніх делецій, також підходять і для нані один до одного або за допомогою одного або внутрішніх додатків. більше лінкерів. В одному з втілень, корові пептиди розширені Корові пептиди, що включають мультимери, з N-/ або С- кінця на, принаймні, один оберт спіраможуть бути пептидами структури (І), аналогами 41 71552 42 структури (І), мутантними формами структури (І), розрізнюються протеазами, олігонуклеотиди, які усіченими або з внутрішніми діленнями формами розщеплюються ендонуклеазами, і органічні речоструктури (І), розширеними формами структури (І) вини, які можна розщепити хімічними способами в і/або їх комбінаціями. Корові пептиди можна з'єдкислих, основних або інших умовах. Переважно, нувати способом голова-хвіст (Ν-кінець з Сщоб умови розщеплення були відносно м'якими, кінцем), голова-голова (N-кінець з N-кінцем), хвістщоб не викликати денатурірації або деградації хвіст (С-кінець з С-кінцем) або їх комбінаціями. іншим способом спіральних сегментів і/або лінкеВ одному з втілень винаходу, мультимери яврів, що не розщеплюються, що входять до складу ляють собою тандемні повтори з двох, трьох, чомультимерних агоністів АроА-І. тирьох і т.д. до десяти корових пептидів. ПереважПептидні і олігонуклеотидні лінкери можуть буно, щоб мультимери являли собою тандемі: ти селективно розщеплені добре відомими спосоповтори з 2-8 корових пептидів. Так, в одному з бами для розщеплення лінкерів, і фахі вці в даній втілень агоністи АроА-І винаходи включають мульобласті легко знайдуть їх. Відповідні органічні ретимери, що мають наступну стр уктурн у формулу: човини лінкери, які можна селективно розщепити, НН[LLm-HH]n-LLm-HH (II) доступні для фахівців в даній області і включають, де: наприклад ті, що описані в WO94/08051 а також в кожний m являє собою незалежно ціле число посиланнях, наведених тут. від 0 до 1; У переважному втіленні, лінкери, що викорисn являє собою ціле число від 0 до 10, переватовуються являють собою пептиди, які є субстражно від 0 до 8; тами для ендогенних циркуляторних ферментів, кожний "НН" являє собою незалежно коровий що дозволяє мультимерним агоністам АроА-І бути пептид або пептидний аналог структури (І) або селективно розщепленими in vivo. Ендогені фермутантну, усічену, з внутрішніми діленнями або менти, відповідні для розщеплення лінкерів, вклюрозширену його форму, як описано тут; чають, наприклад, проаполіпопротеїн А-І пропепкожний "LL" являє собою незалежно лінкер і тідази. Відповідні ферменти а також пептидні кожну "-" незалежно означає ковалентний зв'язок. сегменти, які виступають в ролі субстратів для У структурі (II) лінкер LL може бути будь-якою кожного ферменту, добре відомі в даній області біфункціональною молекулою, здатною ковалент(Edelstein et al., 1983, J.Biol.Chem 258: 11430но зв'язувати два пептиди між собою. Так, відпові11433; Zanis 1983 PNAS USA 80: 2574-2578). дні лінкери являють собою біфункціональні молеЯк описано вище, ключовою рисою корових кули, в яких функціональні групи здатні бути пептидів винаходу є їх здатність формувати внутковалентно приєднані до N і/або С-кінця пептиду. рішньомолекулярні водневі зв'язки або сольові Функціональні групи, відповідні для скріплення з Nмістки, при організації антипаралельним образом. або С-кінцем пептидів добре відомі в даній обласТак, в переважному втіленні винаходу, лінкери ті, і існують відповідні способи для підвищення значної довжини і рухливості використовують так, ефективності утворення таких ковалентних що вони дозволяють, спіральним сегментам (НН) зв'язків. структури (II) лягти антипераллельно і утворити Лінкери можуть бути жвавими, твердими або внутрішньомолекулярні водневі зв'язки або сольонапівтвердими в залежності від бажаних властиві містки в присутності ліпідів. востей мультимеру. Відповідні лінкери включають, Лінкер значної довжини і рухливості включанаприклад, амінокислотні залишки, такі як Pro або ють, не обмежуючись ними: Pro (Ρ), Gly (G), CysGly або сегменти пептиду, що містять від 2 до 5, Cys, H2N-(CH2)n- C(O)OH, де n від 1 до 12, перева10, 15 або 20 і навіть більше амінокислот, біфункжно від 4 до 6, Н2Н-арил-С(O)ОН і вуглеводні. ціональні органічні речовини, такі як H2N Інакше, оскільки нативні аполіпопротеїни да(СН2)nСООН де n являє собою ціле число від 1 до ють можливість кооперативного скріплення між 12 і т.п.Приклади таких лінкерів, а також способи їх антипаралельними спіральними сегментами, пепстворення, і пептиди, що включають такий лінкер, тидні лінкери, які за первинною структурою відподобре відомі в даній області (Hunig et al., 1974, відають пептидним сегментам, зв'язуючим сусідні Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak et al., 1994, спіралі в нативних аполіпопротеїнах, включаючи, Bioconjug. Chem. 5(4): 301-305). наприклад, АроА-І, АроА-ІІ, ApoA-IV, ApoC-I, ApoCУ переважному втіленні винаходу, тандемні II, ApoC-III, ApoD, ApoE і ApoJ можна використати повтори являють собою внутрішні вставки єдиного відповідним чином для скріплення корових пептизалишку проліни. У тих випадках, коли корові пепдів. Ці послідовності добре відомі в цій області тиди закінчуються на N-кінці або С-кінці проліном, (Rosseneu et al., "Analysis of the Primary and of the наприклад, де X1 в структурі (І) являє собою Pro Secondary Structure of the Apolipopro-teins" in: (P) або D-Pro (p), m в структурі (І) являє собою Structure and Function of Lipoproteins, Ch. 6 159переважно 0. В випадках, коли корові пептиди не 183, CRC Press, Inc., 1992). містять N- або С-кінцевого проліну, LL-переважно Інші лінкери, які дають можливість утворення являє собою Pro (P) або D-Pro (p), і m певнутрішньомолекулярних водневих зв'язків або реважно є 1. сольових містків між тандемними повторами антиУ певних втіленнях винаходу може бути бажапаралельних спіральних повторів, включають звоним використання лінкерів, що розщеплюються, ротні оберти пептиду, оскільки β-повороти і γщо дають можливість виходу одного або більше повороти, а також органічні молекули, які мімікруспіральних сегментів (НН) за певних умов. Відпоють структури пептидних β-поворотів і/або γвідні лінкери, що розщеплюються включають: пепповоротів. Загалом, зворотні повороти являють тиди, що мають амінокислотні послідовності, що собою сегменти пептиду, які повертають напрям 43 71552 44 поліпептидного ланцюга таким чином, щоб дозвоТакі мережі зручно отримувати з використанням лити одиночному поліпептидного ланцюгу вибирамультифункціональних зв'язуючих дільниць, які ти дільниці антипаралельних β-смуг або антипадають можливість більше двох спіральних одиралельної α-спіральної структури, β-повороти ниць приєднатися до єдиної зв'язуючої частини. загалом складаються з чотирьох амінокислотних Т.ч. в розгалужених мережах використовують мозалишків і γ-повороти загалом складаються з лекули, що мають три, чотири і навіть більш функтрьох амінокислотних залишків. ціональних груп, які здатні ковалентно зв'язуватиКонформації і послідовності безлічі пептидних ся з N- або С-кінцем пептиду. Відповідні зв'язуючі р-поворотів добре описані в даній області і вклюдільниці включають, наприклад, амінокислотні чають, наприклад без обмежень, тип-І, тип-l', типзалишки, що мають бокові частини, несучі гідроІІ, тип-І', тип-III, тип-lll', тип-IV, тип-V, тип-V, тип-Vla, ксильні, сульфанільні, аміно, карбоксильні, амідні тип-VIb, тип-VII і тип-VIII (Richardson, 1981 Adv. і/або ефірні функціональності, наприклад, Ser (S), Protein. Chem. 34:167-339; Rose et al., 1985, Ad v. Thr (T), Cys (С), Туr (У), Asn (N), Gin (Q), Lys (K), Protein Chem. 37:1-109, Wilmot et al., 1988, J.Моl. Arg (R), Orn, Asp (D) і Glu (E) або інші органічні Biol. 203:221-232; Tramontano et al., 1989, Proteins: молекули, що містять такі функціональні групи. Struct. Funct. Genet. 6:382-394). Sibanda et al., Спіральні сегменти, приєднані до єдиної зв'я1989, J.Моl. Biol. 206:759-777; зуючої дільниці, не обов'язково повинні бути приСпецифічні конформації коротких пептидних єднані по кінцю. Насправді, в деяких втіленнях поворотів, наприклад β-поворотів, залежить наспіральні сегменти прикріплені до єдиної зв'язуюсамперед, від положень певних амінокислотних чої дільниці так, що вони організовані антипаралезалишків в повороті (звичайне Gly, Asn Pro). Загальним чином, тобто деякі спіралі прикріплені через лом β-поворот типу І сумістимо з будь-яким аміноN-кінці, інші через С-кінці. кислотним залишком в положеннях від 1 до 4 поСпіральні сегменти можуть бути приєднані вороту, за винятком Pro, який не може прямо до зв'язуючої дільниці або можуть бути прознаходиться в положенні 3. Gly переважає в полосторово відділені від зв'язуючої дільниці одним женні 4 і Pro переважає в положенні 2 поворотів або більш біфункціональними лінкером (LL), як типу 1 і типу 11. Залишки Asp, Asn, Ser і Cys часто описано раніше. розташовуються в положенні 1, де їх бічні ланцюги На Фіг.7А і 7В видно, що розгалужений ланцюг часто утворюють водневий зв'язок з NH залишку 3. можна описати за числу "вузлів", включених в цю У поворотах типу II, Gly і Asn найчастіше існумережу, де кожна мультифункціональна зв'язуюча ють в положенні 3, оскільки вони сприймають недільниця складає вузол. На Фіг.7А і 7В спіральні обхідні кути кістяка найбільш легко. У ідеалі, повосегменти (тобто корові пептиди винаходу) зобрароти типу l' мають Gly в положеннях 2 і 3 і жені у вигляді циліндрів, і мультифункціональні повороти типу Іl' мають Gly в положенні 2. Поворозв'язуючі дільниці (або вузли) у вигляді кружків (•), ти типу-Іll звичайно можуть мати найбільшу кільі кількість, що виходять з кружка означає порядок кість амінокислотних залишків, а повороти типу III' (число функціональних груп) мульти функціональвимагають Gly в положеннях 2 і 3. Повороти Vla ної зв'язуючої дільниці. VIb типів звичайно мають циспептидний зв'язок і Число вузлів в ланцюгу звичайно залежить від Pro як внутрішній залишок. Огляд різних типів і загальної бажаної кількості спіральних сегментів, і послідовностей β-поворотів в білках і пептидах звичайно складає від 1 до 2. можна прочитати у Wilmot et al., 1988, J.Моl. Biol. Зрозуміло, за даної кількості бажаних спіраль203:221-232 них сегментів, мережа зі зв'язуючими дільницями Конформації і послідовності багатьох пептидвисокого порядку буде мати меншу кількість вузних γ-поворотів також добре описані в даній облалів. Наприклад, на Фіг.7А і 7В мережа третинного сті (Rose et al., 1985 Adv. Protein. Chem. 37:1-109; порядку (тобто мережа, що має трифункціональну Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. зв'язуючу дільницю) з семи спіральних одиниць 12:189-192, Wilmot et al., 1988, J.Моl. Biol. 203:221має три вузли (Фіг.7А), і ланцюг з четвертичним 232, Sibanda et al., 1989, J.Моl. Biol. 206:759-777; порядком (тобто ланцюг, що має чотирифункциоTramontane et al., 1989 Proteins: Struct. Fund Genet. нальну зв'язуючу дільницю) з семи спіральних 6: 382-394). Всі ці типи структур β-поворотів і γодиниць має тільки два вузли. (Фіг.7В). поворотів і їх відповідних послідовностей, а так Мережі можуть бути єдиного порядку, тобто само пізніше відкриті структури пептидних βмережі, в яких всі вузли являють собою, наприповоротів і γ-поворотів і послідовностей, також клад, трифункціональні або чотирифункціональні специфічно очікуються у винаході. зв'язуючі дільниці, або може бути змішаного поІнакше, лінкер (LL) може включати органічну рядку, наприклад мережі, в яких вузли являють молекулу або мотив, який мімікрує структуру βсобою суміш, наприклад, трифункціональних і чоповороту пептиду або γ-повороту пептиди. Такі тирифункціональних зв'язуючи х дільниць). Зрозумотиви-миметики β- і/або γ-поворотів, а також споміло, що навіть в ланцюгу єдиного порядку зв'язусоби синтезування пептидів, що містять такі мотиючі дільниці не зобов'язані бути однаковими. У ви, добре відомі в даній області, і серед інших мережі четвертинного порядку можуть бути виковключають ті, які описані Giannis & Kolter, 1993, ристані, наприклад, два, три, чотири і навіть більш Angew, Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn et різних трифункціональних зв'язуючи х дільниць. al., 1988, J.Molecular. Recognition. 1:75-79; Kahn et Подібно до лінійних мультимерів, спіральні сеal., 1987, Tetrahedron Lett., 28:1623-1626. гменти, включені до розгалуженої мережі, можлиУ ще одному втіленні винаходу, мультимери во, а можуть і не бути однаковими. знаходяться в формі розгалуженої мережі (Фіг.7). 45 71552 46 Приклад такої розгалуженої мережі змішаного кожний R являє собою незалежно -Н, (С1-С6) порядку приведений на Фіг.7С. На Фіг.7С спіральні алкильну, (С1-С6) алкенильну, (С1-С6) алкинільну, сегменти (тобто корові пептиди винаходу) зобра(С5-С20) арильну, (С6-С26) алкарильну групи, 5-20 жені у вигляді циліндрів і мультифункціональні членну гетероарильну або 6-26 членну алкгетерозв'язуючі частини у вигляді кружків (•), де кількість арильну груп у. ліній, що виходять з кружка визначає "порядок" 5.1.1. Аналіз структури і функції (або кількість функціональних груп) м ультифункціСтруктуру і функцію корових пептидів або пепональної зв'язуючої дільниці. Лінії, що з'єднують тидних аналогів, а також агоністів АроА-І, що скласпіральні сегменти, представляють біфункціонадаються з цих корових пептидів, включаючи мульльний лінкер LL, як було описано раніше. Спіральтимерніе форми, описані вище, можна ні сегменти, включені до розгалуженої мережі мопроаналізувати, щоб вибрати активні агоністи або жуть бути тандемними повторами корових миметики АроА-І. Наприклад, корові пептиди або пептидів, як описано раніше. пептидні аналоги можна перевірити на їх здатність У одному ілюстративному втіленні розгалужені формувати α-спіралі в присутності ліпідів, зв'язумережі винаходу описані формулою: вати ліпіди, формувати комплекси з ліпідами, акХ-N ya-Х( ya-l) -(Nyb=Х( yb-l) )p (III) тивувати LCAT, запускати вихід холестерину і т.д. де: Способи і тести для аналізу структури і/або кожний X являє собою незалежно HH-[LLmфункції пептидів добре відомі в даній області. ПеHH]n-LLm-HH кожний "НН" являє собою незалежно реважні способи надані в робочих прикладах, infra. коровий пептид структури (І) або його аналог, або Наприклад, тести круговий дихроїзм (CD) і ядермутантну, скорочену, з внутрішніми діленнями або ний магнітний резонанс (ЯМР), описані в Секції 7., розширену форму його, як описано тут; кожний infra, можуть бути використані для аналізу струк"LL" являє собою незалежно біфункціональний тури пептидів або пептидних аналогів - особливо лінкер; і кожний m являє собою незалежно ціле міри спіральності в присутності ліпідів. Здібність число від 0 до 1; n представляє ціле число до скріплення з ліпідами можна визначити за довід 6 до 8; помогою методу флуоресцентної спектроскопії, Nya і N yb являють собою незалежно мультифуописаного в Секції 7, infra. Здатність пептидів або нкціональний зв'язуючий мотив, де У а і У b предпептидних аналогів активувати LCAT можна виставляють число функціональних груп на Nya і Nyb значити за допомогою тесту LCAT активації, опивідповідно; саного в Секції 8, infra. Тести in vivo in vitro, описані кожний У а і У b являють собою незалежно ціле в Секції 9, 10 і 11, infra, можна використати для число від 3 до 8; визначення часу напів-життя, розподілу, ви ходу p являє собою незалежно цілі числа від 0 до 7; холестерину і ефектів на ЗТХ. кожна "-" незалежно означає ковалентний зв'яЗагалом вважають, що корові пептиди і/або зок. У переважному втіленні, розгалужена мережа, пептидні аналоги даного винаходу, які мають влавключає "Lys-дерево", тобто мережа, де мультистивості, перераховані в Таблиці IV infra, є активфункціональна частин являє собою один або біними. льше за Lys (K) залишків (див. Фіг.7D). Таблиця IV У одному ілюстративному втіленні, "Lysдерево" розгалужена мережа винаходу описана Властив ості актив них пептидів формулами (IV) і (V): Властив ість % спіральності в прису тності ліпідів (Ri=30) (неблоков ані пептиди з 22 амінокислотних % спіральності в прису тності ліпідів (Ri=ЗО) ( неблоков ані пептиди з 18 амінокислотних зали шків ) % спіральності в прису тності ліпідів (Ri=30) (блоков ані пептиди з 1 8 амінокислотн их зали шків або ще біль ш короткі пептиди) Скріплення з ліпі дами (в прису тності SUVs) в яких: кожний X являє собою незалежно HH-[LLmHH]n-LLm-HH кожний "HH" являє собою незалежно коровий пептид структури (І) або його аналог, або мутантну, скорочену, з внутрішніми діленнями або розширену його форму, як описано тут; кожний "LL" являє собою незалежно біфункціональний лінкер; і кожний m являє собою незалежно ціле число від 0 до 1; n являє собою ціле число від 0 до 8; RI являє собою -OR або -NRR; і Актив ація LCAT Межі Перев ажні межі ³60% ³80% ³40% ³60% ³60% ³80% 0,5-μΜ пептиду R i=1-50 ³38% ³80% Ri являє собою ліпід: пептид молярне співвідношення. Як показано в робочих прикладах, infra, корові пептиди, які мають високу міру активації LCAT (>38%) загалом володіють значною α-спіральною структурою в присутності ліпідних малих уніламелярних везикул (SUVs) (>60% спіральної структури у разі неблокованих пептидів, що складаються з 22 і більше амінокислот і блокованих пептидів, що містять 18 і менш амінокислотних залишків; >40% спіральної структури у разі неблокованих пептидів, 47 71552 48 що містять 18 і менше амінокислот), ті пептиди, які залишків, у відповідності зі структурою (І) або їх мають малу або не мають взагалі здібності до акформи, ацильовані по N-кінцю і/або амідовані або тивації LCAT, володіють меншою α-спіральною естерифійовані по С-кінцю, в яких: структурою. Але в певних випадках, пептиди, що Х1 являє собою Pro (Ρ), Ala (A), D-Pro (p), Gly володіють значною спіральною структурою в при(G), Asn (Ν), сутності ліпідів, не значно впливають на LCAT. X2 являє собою Ala (A), Leu (L) або Val (V); Схожим чином, корові пептиди, які мають знаX5 являє собою Leu (L); чну активацію LCAT, звичайно зв'язують ліпіди, Х6 являє собою Phe (F); але в певних випадках пептиди, що зв'язують ліпіХ11 являє собою Glu (Ε); ди, не впливають значно на активацію LCAT. X19 являє собою Lys (К); Внаслідок цього, як зрозуміють фахівці в даній X20 являє собою Lys (К); і/або області, здатність корових пептидів, описаних тут, Х22 являє собою Lys (К); утворювати α-спіралі (в присутності ліпідів) і зв'яі кожний з Х3, Х4 , Х7 Х8 , Х9, Χ10 , Х12, Х13, Х14 , зувати ліпіди є критичною для вияву активності, Х15, Х16, Х17, Х18 , Х21 такі, як були раніше визначені хоч в багатьох випадках ці властивості і не є знадля структури (І). чущими. Т.ч., в переважному втіленні корові пепОсобливо переважні агоністи АроА-І по цьому тиди винаходу піддавали серії випробувань для пункту винаходу, в яких Х2 являє собою Val (V) вибору корових пептидів, що мають значну фарі/або X18 являє собою Gin (Q). макологічну активність. У ще одному переважному втіленні агоністи На першому етапі, корові пептиди перевіряли АроА-І являють собою пептиди з 22 амінокислотна їх здатність утворювати а-спіралі в присутності них залишків за формулою (І) або їх форми, ациліпідів, використовуючи метод CD, описаний в Сельовані по N-кінцю і/або амідовані або естерифікції 7, infra. Ті пептиди, що мали принаймні 40% йовані по С-кінцю, в яких: один з Х10, Х11, Х14 являє спіральності (неблоковані пептиди, що містять 18 собою Gly (G), а інші залишки крім Х10, Х11 і Х14 є або менше амінокислот) або 60% спіральності іншими, ніж Gly (G). Якщо Х10 являє собою Gly (G), (блоковані пептиди, що містять 18 або менше аміпереважно, щоб Х7 являв собою Glu (E). нокислот, і неблоковані пептиди, що містять 22 і Особливо переважними агоністами АроА-І за більше амінокислот) в присутності ліпідів (в концецим аспектом винаходу є пептиди, вибрані з групи, нтрації приблизно 5мкМ і при ліпід:пептид молярщо складається з ному співвідношенні біля 30) потім перевіряли на їх здатність до скріплення з ліпідами, використовуючи флуоресцентний метод, описаний в Секції 7, infra. Звичайно, тільки ті корові пептиди, які місабо їх форми, ацильовані по N-кінцю і/ амідотили залишки флуоресцентного Trp (W) або Nal вані або естерифійовані по С-кінцю. перевіряли на скріплення з ліпідами за допомогою Втілення, що містять внутрішні залишки гліцифлуоресценції. Але, для ти х пептидів, які не місну, можуть бути синтезовані з високим виходом тять флуоресцентних залишків, скріплення з ліпішляхом конденсації сегментів, таким чином преддами вважається значущим, якщо їх спіральність ставляючи значні переваги для виробництва у зростає в присутності ліпідів. великих кількостях. Конденсація сегментів, тобто Корові пептиди, що показують скріплення з ліз'єднання разом малих складових пептидиних лапідами в присутності SUVs (0,5-10мкМ пептиду; нцюгів для утворення великого пептидного ланцюліпід:пептид молярне співвідношення в межах від га, використовують для отримання великої біологі1 до 50) потім перевіряли на фармакологічну актично активних пептидів, включаючи 44 вність. Звичайно, фармакологічна активність буде амінокислотні миметики АроА-І (Nakagawa et al., залежати від бажаного використання агоністів 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara et АроА-І. У переважному втіленні, корові пептиди al., 1989. Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordoimier перевіряли на їх здатність до активації LCAT, оскіet al., 1990, Int. J.Pept. Protein Res. 35:527-538), льки пептиди, які здатні активувати LCAT, знаховважають, що це найбільш оптимальний спосіб у дять найбільше застосування в способі, описановідношенні ціна:ефективність для синтезу великому тут. Корові пептиди, що мають, принаймні, біля го об'єму продукту з великим виходом для пепти38% активації LCAT в порівнянні з нативним люддів винаходу. ським АроА-І (що визначено в тесті активації Переваги синтезу за допомогою конденсації LCAT, описаному в Секції 8, infra) є переважними, і сегментів включають доступність конденсованих корові пептиди, що мають 50%, 60%, 70%, 80% преформованих сегментів в розчинній фазі і просабо навіть 90% або більш, особливо переважні. тоту очищення кінцевого продукту. Недоліки спо5.1.2. Переважні втілення собу включають низьку ефективність скріплення і Агониісти АроА-І винаходу далі можуть бути виходу на стадії конденсації і низьку розчинність визначені за допомогою переважних втілень. певних пептидних послідовностей. В одному переважному втіленні, агоністи Ефективність приєднання на стадії конденсації АроА-І являють собою пептиди з 22 амінокислотможе бути значно збільшена шляхом збільшення них залишків, в часу приєднання. Звичайно, збільшення часу привідповідності до структури (І), або їх форми, єднання приводить до підвищення рацемізації ацильовані по N-кінцю і/або амідовані або естерипродукту. (Seiber et al., 1970, Helv. Chim. Acta фійовані по С-кінцю. 53:2135-2150). Але, так як гліцин не має хиральноВ іншому переважному втіленні, агоністи го центру, він не зазнає рацемізації (пролінові заАроА-І являють собою пептиди з 22 ацильованих лишки завдяки стеричному зв'язку також слабо 49 71552 50 або взагалі не рацемізуються при тривалому часі та їх форми, ацильовані по N-кінцю і/або аміприєднання). Тому, втілення, що містять внутрішні довані або естерифійовані по С-кінцю. залишки гліцину також можна синтезувати у велиУ ще одному переважному втіленні агоністи кому об'ємі і з великим виходом за допомогою АроА-І вибрані з групи пептидів, наведених нижче: конденсації сегментів, шля хом синтезування, складових сегментів, які мають перевагу завдяки факту наявності залишку гліцину, який не зазнає рацемізації. Т.ч., втілення, що містять залишки гліцину, представляють значні переваги в синтезі для отримання великих об'ємів продукту. У ще одному втіленні, агоністи АроА-І являють собою пептиди з 22 амінокислотними залишками по структурі (І) або їх формі, ацильовані по Nкінцю і/або амідовані або естерифійовані по Скінцю, де кожний Х10 , Х13 і Х14 не є Gl y(G). У ще одному переважному втіленні, агоністи АроА-І являють собою змінені або мутантні форми пептидів, у відповідності зі структурою (І) або їх та їх форми, ацильовані по N-кінцю і/або аміформи, ацильовані по N-кінцю і/або амідовані або довані або естерифійовані по С-кінцю. естерифійовані по С-кінцю, в яких: У ще одному переважному втіленні, агоністи Х4 не є Asp (D); АроА-І являють собою мультимерні форми у відХ5 не є Phe (F); повідності до структур II, III і/або IV, в яких кожний Х6 не є Trp (W); НН незалежно являє собою пептид за формулою Х7 не є Leu (L) або Asp (D); (І) або його форми, ацильовані по N-кінцю і/або Х9 не являє собою Gly (G) або Trp (W); амідовані або естерифійовані по С-кінцю, або Х12 не є L ys (К); будь-який з переважних пептидів за структурою (І), Х13 не є Trp (W); описаних тут. Х14 не є Trp (W); У ще одному переважному втіленні, корові пеХ15 не є Glu (E); птиди, що складають агоністи АроА-1, не є будьХ16 не є Trp (W) або Leu (L); і/або яким з наступних пептидів Х17 не є Tip (W). У ще одному переважному втіленні, агоністи АроА-І являють собою пептиди, що складаються з 22 амінокислот, у відповідності до структури (І) або їх форми, ацильовані по N-кінцю і/ амідовані або естерифійовані по С-кінцю, в яких Х7 являє собою Leu (L), Х10 являє собою Tip (W), Χ1 не є Gl y (G) і/або Х14 не є Gly (G). Особливо переважний пептид по цьому аспекту винаходу являє собою пептид 155 ((PVLELFLNLWERLLDALQKKLK, SEQ ID NO: 155) У ще одному переважному втіленні агоністи АроА-І являють собою пептиди з 22 амінокислотних залишків за формулою (І) або їх форми, ацилильовані по N-кінцю і/або амідовані або естерифійовані по С-кінцю, в яких: жоден з Х19 , Х20 або Х22 не є Оrn. Більш переважно, щоб принаймні два з Х19, Х20 або Х22 не був Оrn. Найбільш переважно, щоб кожний з Х19, Х20 або Х22 не був Оrn. У остаточному переважному втіленні, агоністи У ще одному переважному втіленні агоністи АроА-І не є будь-яким з пептидів, перелічених в АроА-І вибрані з групи пептидів, наведених нижче: Таблиці X (Секція 8.3. infra), який має активність при активації LCAT менш ніж 38% порівняно з нативним людським АроА-І. 5.2. Синтез і очищення пептидів-агоністів АроА-І Корові пептиди винаходу можна отримати, використовуючи будь-яку відому в даній області методику для отримання пептидів. Наприклад, пептиди можна отримати, використовуючи загальноприйняті синтези пептидів в рідкій фазі або твердій фазі або методики рекомбінантних ДНК. 5.2.1. Хімічний синтез Корові пептиди можна отримати використовуючи загальноприйняті синтези в розчині і в твердій фазі (Chemical Approaches to the Synthesis of 51 71552 52 Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., 1997, al., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt and Andreu, CRC Press, Boca Raton Florida, і посилання, навеEds, ESCOM Leiden, The Netherlands. Додаткова дені тут; Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical альтернатива описана Kamber et al., 1980, Helv. Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Chim. Acta 63:899-915. Спосіб, що проводиться на Press, Oxford, England, і посилання, наведені тут). твердих носіях, описаний Albericio, 1985, Int. J.PepІнакше, пептиди винаходу можна отримати tide Protein Res. 26:92-97. Будь-який з цих способів шляхом конденсації сегментів, як описано, наприможна використати для утворення дисульфідних клад, Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7): 933зв'язків в пептидах винаходу. 936; Baca, et al., 1995, J.Am. Chem. Soc. 117:18815.2.2. Рекомбінантний синтез 1887; Tarn et al.,1995, Int. J.Peptide Protein Res. Якщо пептид складається повністю з аміноки45:209-216;Schnolzer and Kent, 1992, Science слот, що кодуються, або якщо тільки його частина 256:221-225; Liu and Tarn, 1994, J. Am. Chem. Soc. складається з таких амінокислот, то частину, що 116(10):4149-4153; Liu and Tarn, 1994, Proc. Natl. залишилася можна синтезувати за допомогою Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, загальноприйнятих методик рекомбінантної генної 1988, Int. J.Peptide Protein Res. 31:322-334). інженерії. Конденсація сегментів особливо зручний споДля рекомбінантного отримання, полінуклеосіб для синтезування втілень, що містять вн утрішні тидну послідовність, що кодує пептид, вбудовують залишки гліцину. Ін ші способи, придатні для сину відповідний носій що експресується, наприклад, тезування пептидів винаходу описані Nakagawa et у вектор, який містить всі необхідні елементи для al., 1965, J.Am. Chem. Soc.107:7087-7092. транскрипції і трансляції вбудованої послідовності, Агоністи АроА-І, що містять Ν- і С-кінцеві блощо кодується, або, у разі РНК вірусного вектору, куючі гр упи, можна отримати, використовуючи необхідні елементи для реплікації і трансляції. стандартні методики органічної хімії. Наприклад, Носій, що експресується потім переносять у відпоспособи для ацилювання N-кінців пептиду або відну клітку-мішень, яка буде експресувати пептид. амідування або естерефіювання С-кінців пептидів У залежності від системи експресії, що використодобре відомі в даній області. Способи проведення вується, пептид, що експресується потім ізолюють інших модифікацій по Ν- і С-кінцям буде очевидні за допомогою методик, що використовуються в цій для фахівців в даній області, а також способи заобласті. Способи продукції рекомбінантних білків і хисту будь-якої бокової функціональності при непептидів також добре відомі в цій області обхідності приєднати кінцеву блокуючу групи. (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning a Фармацевтично прийнятні солі (квантер іони) Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, можна отримати загальноприйнятими способами з N.Y.Ausubel et al., 1989, Current Protocols in допомогою іон обмінної хроматографії або інших Molecular Biology, Greene Publishing Associates and способів, які добре відомі в даній області. Wiley Interscience, N.Y. кожний з яких наведено тут Речовини винаходу, які знаходяться в формі у вигляді посилань). тандемних мультимерів можуть бути синтезовані Для підвищення ефективності отримання мозагальноприйнятими способами шляхом додання же бути створений полінуклеотид для кодування лінкеру(ів) до пептидного ланцюгу на відповідному множинних одиниць пептиду, розділених дільниетапі синтезу. Інакше, можна синтезувати спіральцями ферментативного розщеплення - таким чині сегменти, і кожний сегмент з'єднати з лінкером. ном можуть бути сконструйовані або гомополімери Звичайно, актуальний спосіб синтезу буде залежа(пептидні одиниці, що повторюються ) або гетероти від композиції лінкеру. Відповідні схеми захисту полімери (різні пептиди, пов'язані один з одним). і їх хімія добре відомі, і фахівці в даній області Отриманий пептид може бути розщеплений (назнайдуть їх. приклад, шляхом обробки відповідним ферменРечовини винаходу, які знаходяться в формі том) для відновлення пептидних одиниць. Це морозгалуженої мережі, можна синтезувати загальже збільшити вихід пептидів, керованих одним ноприйнятими способами, використовуючи гримупромотором. У переважному втіленні поліцистровальні або тетрамірні смоли і хімізм, описану Tarn, ний полінуклеотид можна створити таким чином, 1988, PNAS USA 85:5409-5413, Demoor et al., 1996, щоб транскрибіювалась єдина мРНК, яка кодує Eur. J. Biochem. 139:74-84. Зміни синтетичних безліч пептидів (наприклад, гомополімери або смол і стратегію синтезування розгалуженої мерегетерополімери), кожна кодуюча дільниця операжі більш високого і більш низького порядків, а тативно приєднана до кеп-незалежної послідовності, кож той, який містить комбінації різних спіральних контролюючої трансляцію; наприклад, внутрішній сегментів корових пептидів знаходяться в межах сайт входження рібосоми (IRES). При використанні знань фахівців в даній області пептидної хімії і/або відповідної вірусної системи експресії, трансляція органічній хімії. кожного пептиду закодованого в мРНК, спрямовуУтворення дисульфідних зв'язків, при необхідється прямо до транскрипту, наприклад, IRES. Так, ності, загалом проводять в присутності м'яких окиполіцистронна конструкція спрямовує транскрипслювачів. Можна використати хімічні окислювачі, цію єдиної великої поліцистронної мРНК, яка, в або речовини можна надавати атмосферному киссвою чергу, спрямовує трансляцію безлічі індивіню для посилення цих зв'язків. У даній області дуальних пептидів. Такий підхід усуває отримання відомі різні способи, включаючи описані наприі ферментативний процесінг поліпротеїнів і може клад. Tarn et al., 1979, Synthesis 955-957; Stewart et значно збільшити вихід пептидів, керованих єдиal., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2r Ed., ним промотором. Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed et Для експресії пептидів, описаних тут можна al., 1975, J.Biol.Chem. 250:8477-8482; Pennington et використовува ти різних господарів для експресії 53 71552 54 векторних систем. Вони включають, не обмежуюWeissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant чись ними: мікроорганізми, такі як бактерії, трансMolecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, формовані рекомбінантною ДНК бактеріофагу або 421-463; Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular векторами, що експресуються плазмідною ДНК, Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch.7-9. що містять відповідну кодуючу послідовність; дріВ одній з систем експресії у комах, яка може жджі або філаментозні гриби, трансформовані бути використана для отримання пептидів винахорекомбінантними векторами, що експресуються, ду, Autographs califomica, вірус ядерного поліедродріжджів або грибів, що містять відповідну кодуючу зу (AcNPV) використовується як вектор для експослідовність; системи клітин комах, інфіковані пресії чужинних генів. Вірус росте в клітинах рекомбінантними вірусними векторами, що ексSpodoptera frugiperda. Кодуюча послідовність може пресуються (бакуловірус), що містять відповідну бути клонована до неосновних дільниць (наприкодуючу послідовність; системи рослинних клітин, клад, ген поліедрину) вірусу і вміщена під контроль інфіковані рекомбінантними вірусними векторами, FcNPV промотору (наприклад, промотор гену пощо експресуються (мозаїчний вірус цвітної капусти ліедрину). Вдала вставка кодуючої послідовності або мозаїчний вірус тютюну) або трансформовапризводить до інактивації гену поліедрину і продуними рекомбінантними плазмідними векторами, кції непокритого рекомбінантного вірусу (тобто, що експресуються (Ті плазміду), що містять відповірусу, що втратив білкове покриття, яке кодується відну кодуючу послідовність або клітинні системи геном поліедрину). Такі рекомбінантні віруси потім тварин. використовують для інфікування клітин Spodoptera Елементи, систем експресії, що експресуютьfrugiperda, в яких експресуються вбудовані гени ся, розрізнюються за своєю силою і специфічніс(Smith et al., 1983, 584, Smith, U.S., Patent тю. В залежності від системи, що використовуєтьNo.4,215,051). Подальші приклади систем експреся господар/ вектор, будь-який з ряду відповідних сії можна знайти в Current Protocols in Molecular транскрибціоних і трансляційних елементів, вклюBiology, Vol 2 Ausubel et al., eds.. Green Publish. чаючи конститутивні і індуцибільні промотори, моAssoc. & Wiley Interscience. же бути використаний для експресії вектору. НаВ клітинах ссавців як господарів може бути виприклад, при клонуванні в бактерійних системах, користаний ряд експресуючих систем, заснованих індуцибільні промотори, такі як pL або промотор на вірусах. Коли використовується аденовірус в баклеріофагу лямбда, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac гібякості вектору, що експресується, що кодує посліридний промотор) і т.п.можуть бути використані; довність, можна приєднати до аденовірусного конпри клонуванні систем клітин комах можуть бути трольного комплексу транскрипції/ трансляції, тобвикористані такі промотори як полігедрон промото до пізнього промотору і лідерної послідовності, тор бакуловірусу; при клонуванні систем клітин що складається з трьох частин. Цей химерний ген рослин можуть бути використані промотори, отрипотім можна вбудувати в геном аденовірусу за мані з геному рослинних клітин (наприклад, білок допомогою рекомбінації in vivo або in vitro. Вставка теплового шоку; промотор для малої суб'одиниці в неосновну дільницю вірусного геному (район Е1 RUBISCO; промотор для хлорофіл а/в зв'язуючого або ЕЗ) призведе до появи рекомбінантного вірубілка) або з рослинних вірусі в (35S РНК промотор су, який є життєздатним і здатним експресувати CaMV, поверхневий білок, промотор TMV) можна пептид в інфікованих господарях (Logan Shenk, використовува ти; при клонуванні в системах клітин 1984, PNAS USA, 81; 3655-3659). Інакше, можна ссавців, можна використати промотори, що отривикористати промотор вакциніа 7.5К (McKkett et мують з геному клітин ссавців (промотор металлоal., 1984, J Virol. 49:857-864; PamcaU et al., 1982, протеїну) або з вірусів ссавців (пізній промотор PNAS, 79: 4927-4931). Фахівці в даній області аденовірусу, вакцинія вірус 7.5.К промотор), при знайдуть і інші системи експресії для отримання запуску клітинних ліній, які містять множинні копії пептидів винаходу. продукту, що експресується можна використати 5.2.3. Очи щення пептидів SV40-, BPV- EBV-засновані віруси в якості зручноПептиди винаходу можуть бути очи щені відого селективного маркеру. мими в даній області методами, такими t як хромаПри використанні векторів з експресією в ростографія із зверненою фазою, високорозрішаюча линах, експресія послідовності, що кодує пептиди ліпідна хроматографія, іонообмінна хроматогравинаходу, може керуватися будь-ким з ряду профія, гель-електрофорез, афінна хроматографія і моторів. Наприклад, можна використати вірусні т.п.Необхідні умови, що використовуються для промотори, такі як 35S РНК і 19S РНК промотори очищення окремого пептиду, будуть залежати, CaMV (Brisson et al., 1984 Nature 310:511-514), або зокрема, від стратегії синтезу, і від таких чинників, промотор поверхневого білку TMV (Takamatsu et як заряд ланцюга, гідрофобність, гідрофільність і al., 1987 EMBO J. 6: 307-311); ще можна використ.д. фахі вці в даній області виявлять їх. Мультитати рослинні промотори, такі як мала суб'ониця мерні розгалужені пептиди можна очистити, наRUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671приклад, за допомогою іонообмінної хроматографії 1680; Broglie et al., 1984, Science, 224: 838-843) або хроматографії за розміром. або промотор білка теплового шоку, наприклад, Для очищення з допомогою афінної хроматогсоєвий hspl7.5-E або hspl7.3-B (Guriey et al., 1986, рафії можна використати будь-яке антитіло, яке МоL. Cell.Biol. 6: 559-565). Ці конструкти можна специфічно зв'язує пептид. Для отримання антиввести до рослинної клітини, використовуючи Ті тіл, різні тваринні господарі можуть бути імунізоплазміди, Ri плазміди, вірусні вектори рослин, вані шляхом введення пептиду, включаючи але не пряму трансформацію ДНК, мікроін'єкцію, електобмежуючись ними: кролики, миші, пацюки і т.д. ропорацію і т.д. Огляди з такими методиками див. Пептид можна приєднати до відповідного носія, 55 71552 56 наприклад, BSA, за допомогою бокової функціонаАгоністи АроА-І винаходу можна використати льної групи або лінкер, прикладеного до бокової для лікування будь-якого порушення у тварин, функціональної групи. Можна використати різні особливо ссавців, включаючи людину, для яких ад'юванти для збільшення імунної відповіді, в зазбільшення концентрації сироваточного ЛПВЩ, лежності від вигляду тваринного господаря, вклюактивації LCAT і посилення виходу холестерола і чаючи але не обмежуючись ними: ад'ювант ФрейЗТХ є корисним. Такі умови включають не обменда (повний і неповний), мінеральні гелі, такі як жуючись ними: гіперліпідемію, і особливо, гіперхогідроксид алюмінію, поверхово активні речовини, лестеринемію і сердечно судинні хвороби, такі як, такі як лізолецитин, багатотомні спирти Pluronic, атеросклероз (включаючи лікування і профілактику поліаніони, пептиди, масляні емульсії, KLH, динітатеросклерозу), рестеноз (наприклад, профілактирофенол і людські ад'юванти, що потенційно викока або лікування атеросклеротичних бляшанок, які ристовуються такі як BCG і Corynebacterium розвиваються внаслідок медичних процедур, таких parvum. як балона ангіопластика), і інших порушень, таких Багатоклональні антитіла до пептиду можна як ендотоксемія, яка часто переходить в сепотримати за допомогою будь-якої методики для тичний шок. отримання молекул антитіл шляхом ведення кліАгоністи Аро А-І можна використати самі по тинної лінії в культурі. Ці методики включають, не собі або в комбінаційній терапії з іншими ліками обмежуючись ними: гібридомні технології, спочатдля лікування згаданих вище порушень. Така теку описані Kohler & Milstein, 1975 Nature, 256: 495рапія включає, не обмежуючись: одночасне або 497, Kaprowakski, U.S. Patent No.4, 376, 110 які послідовне застосування ліків. наведено тут в посиланнях, гібридомні технології Наприклад, при лікуванні гіперхолестеринемії людських В-клітин (Kosbor et al., 1983, Immunology або атеросклерозу склади агоністу АроА-І можуть Today, 4: 72; Cote et al., 1983, PN AS USA, 80: 2026вживатися з будь-якою іншою або іншими холес2030) і EBV-гібримдомні методики (Cole et al., теринпоніжаючими терапіями, яки застосовується 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, в даний момент, наприклад, жовчнокислими смоAlan R. Liss, Inc, 77-96 (1985). Крім того, можуть лами, ніацином, і/або статинами. Така комбінована бути використані методики, розроблені для отритерапія може викликати особливо корисні терапемання "химерних антитіл" Morrison et al., 1984, втичні ефекти, так як кожні ліки діють на різні міPNAS USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, шені холестеринового синтезу і транспорту, наNature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, приклад, жовчнокислі смоли впливають на розпад 314: 452-454, Boss, US Patent No.4 816 397; Cabilly, холестерину на хіломікронову і ЛПНЩ популяції, US Patent No.4816 567, які наведено тут посиланніацин переважно впливає на ЛПДНЩ і ЛПНЩ понями) шляхом сплаїсінгу генів з молекули антитіла пуляції, статини ингібують синтез холестерину, миші до відповідної антигенної специфічності з знижуючи популяцію ЛПНЩ (і можливо підвищуюгенами молекули антитіла людини, відповідної чи експресію рецептору ЛПНЩ), а агоністи АроА-І біологічної активності. Або можна отримати "гумадіють на ЗТХ, збільшення популяції ЛПВЩ, збільнізовані" антитіла (Queen, U.S. Patent No.5 585 089 шення активності LCAT і посилення виходу хоякі наведено тут у вигляді посилань). Інакше, мелестерину. тодики, що описують отримання одиничного ланВ іншому втіленні агоністи АроА-І можна викоцюгу антитіл (U.S. Patent No.4 946 778) можна ристати разом з фібратами для лікування гіперліадаптувати для отримання пептид специфічних підемії, гіперхолестеринемії і/або серцевоантитіл, специфічних до пептидів, з єдиним лансудинних захворювань, таких як атеросклероз. цюгом. У ще одному втіленні агоністи АроА-І винаходу Фрагменти антитіл, що містять делеції специможна використати в комбінації з антимікробними і фічних зв'язуючи х сайтів, можна отримати за доантизапальними агентами для лікування септичнопомогою відомих методик. Наприклад, такі фрагго шоку, індукованого ендотоксином. менти включають, не обмежуючись ними: F(ab')2 Агоністи АроА-І винаходу можуть бути складефрагменти, які можна отримати розщепленням ні як пептиди або пептид-ліпідні комплекси, при молекули антитіла пепсином і Fab фрагменти, які прийомі яких використовуються різноманітні шляхи можна отримати видаленням дисульфідних містків надходження агоністу АроА-І до кровотоку. ЗразF(ab')2 фрагментів. Інакше, можна сконструювати кові склади і режим лікування описані нижче. Fab експресуючі бібліотеки (Huse et al., 1989, 5.3.1. Агоністи Аро А-І і пептид/ліпідні комплекScience, 246: 1275-1281), для швидкої і легкої ідеси як активний інгредієнт нтифікації багатоклональних Fab фрагментів, Пептиди агоністи АроА-І можна синтезувати створених специфічно для цікавлячих пептидів. або зробити за допомогою будь-якої технології, Антитіла або фрагменти антитіл, специфічні описаної в Секції 5.2. і її підпунктах. Стабільні подо бажаного пептиду можна ввести, наприклад, до хідні, що мають довгий термін життя, можна отриагарози, і антитіло-агарозний комплекс можна вимати за допомогою ліофілізації пептидів - або для користати для імунохроматографії для очищення отримання великого об'єму для подальшого перепептидів винаходу. (Scopes, 1984, Protein Purificaскладання або для отримання індивідуальних аліtion: Principles and Practice, Springer-Verlag New квот або одиниць дози, які можна відновити регідYork, Inc., N Y, Li vingstone, 1974, Methods in Enzyратацією стерильною водою або відповідним mology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins, стерильним буферним розчином перед за34: 723-731). стосуванням. 5.3. Фармацевтичні склади і способи лікування У певних втіленнях можливо є переважним складати і приймати агоніст АроА-I у ви гляді пеп 57 71552 58 тид-ліпідного комплексу. Такий підхід має декілька пептид(и), які будуть включені в частки, можна переваг, оскільки комплекс збільшує час напівжитрозчиняти у водному або органічному розчиннику тя в системі кровообігу, зокрема, коли комплекс або суміші розчинників (розчинник 1) (Фосмає такі ж розміри і щільність як ЛПВЩ, і особливо фо)ліпідний компонент розчиняють у водному або як пре-β-Ι або πρε-β-2 ЛПВЩ популяції. Пептидорганічному розчиннику або суміші розчинники ліпідні комплекси можна зручно отримати будь(розчинник 2) який може змішуватися з розчиннияким з цілого ряду способів, описаних нижче. Стаком 1, і два розчини змішують. Інший спосіб: пепбільні похідні, що мають довгий термін життя, мотид і ліпід можна ввести в корозчинну систему: жна отримати за допомогою ліофілізації або колісуміш розчинників, що змішуються. Відповідна офілізації, які описані нижче і є переважним пропорція пептиду (білку) до ліпіду спочатку випідходом. Ліофілізоровані пептид-ліпідні комплекзначається емпірично, щоб комплекси, що утвоси можна використати для отримання об'єму для рюються володіли відповідними фізичними і хімічфармацевтичного перескладання або для отриними властивостями, наприклад, звичайно (але не мання індивідуальних аліквот або дозових одиобов'язково) розміром, схожим з ЛПВЩ. Отриману ниць, які можуть бути відновлені регідратацією, суміш заморожують і ліофілізують до зневоднення. стерильною водою або відповідним буферним Іноді додатковий розчинник необхідно додати до розчином перед застосуванням. суміші для полегшення ліофілізації. Цей ліофілізоРізноманітні способи, добре відомі фахівцям в ваний продукт можна зберігати протягом довгого даній області, можна використати для отримання періоду, і він залишиться стабільним. пептид-ліпідних везикул або комплексів. Для цього У робочих прикладах, описаних infra, пептид можна використати цілий ряд доступних способів 146 (SEQ ID NO: 146) і фосфоліпіди розчиняли в для отримання ліпосом або протеоліпосом. Наметанолі, об'єднували, і потім змішували з ксилоприклад, пептид можна озвучити (використовуючи лом перед ліофілізацією. Пептид і ліпід обидва сонікатор) разом з відповідним ліпідом для форможуть бути додані до суміші двох розчинників. мування комплексу. Ще пептид можна об'єднати з Ще розчин пептиду, розчиненого в метанолі, можпреформованими ліпідними везикулами, що прина змішати з розчином ліпіду, розчиненого в ксизводить до спонтанного формування пептидлолі. Обережно видаляють сіль їх системи розліпідних комплексів. Ще пептид-ліпідні комплекси чинників, щоб уникнути висолювання пептиду. можуть бути утворені з допомогою діалізу в детерОтриманий розчин, що містить пептид і ліпід, корогенті, наприклад, суміш пептитду, ліпіду і детергезчинені в метанолі/ксилолі ліофілізують, отринту діалізуется для видалення детергенту і відномуючи порошок. влення або утворення пептид-ліпідних комплексів. Ліофілізований продукт можна відновити для (Jonas et al., 1986, Methods in Enzy-mol. 128: отримання розчину або суспензії пептид-ліпідного 553-582). комплексу. Для цього ліофілізований порошок деВсі вищезазначені способи можуть бути здійсгідратують водним розчином до відповідного об'неними, кожний спосіб має свої тр уднощі отриєму (часто 5мг пептиду на мл, що зручно для внумання відносно ціни, виходу, продуктивності і збетрішньовенного введення). У переважному реження. Заявники розробили простий спосіб для втіленні ліофілізований порошок регідратують фоотримання пептиду або пептид-фосфоліпідних сфатним буфером або фізіологічним розчином. комплексів, що мають характеристики, схожі з Суміш можна струсити для полегшення регідратаЛПВЩ. Цей спосіб можна використати для отриції, в більшості випадків відновний етап можна мання АроА-І пептид-ліпідних комплексів, він має провести при температурі, що дорівнює або вище наступні переваги: температури фазового переходу ліпідного компо1) більшість всіх включених інгредієнтів виконенту комплексу. Протягом декількох хвилин ясно ристовуються для створення бажаного комплексу, видно відновлення ліпід-білкових комплексів. що запобігає марному використанню стартових Аліквоту отриманого відновленого похідного матеріалів, які є загальними і для інших способів; можна охарактеризувати для підтвердження, що 2) створюються ліофілізовані компоненти які є комплекси в похідному мають бажаний розподіл вельми стабільними під час зберігання. Отримані розміру, наприклад, розподіл розміру ЛПВЩ. Можкомплекси можна відновити негайно перед застона використати гель-фільтрацію. У робочих присуванням; кладах, описаних infra, використали систему гель3) Отримані комплекси звичайно не потребуфільтрації Pharmacia Superose 6 PPLC. Буфер, що ють подальшого очищення після отримання і певикористовується містив 150мМ NaCI в 50мМ форед використанням; сфатному буфері рН7,4 Звичайний об'єм зразка 4) Уникають токсичних складових, включаючи 20-200мкл комплексів, що містять 5мг пептиду/мл. детергенти, такі як холати. Крім того, способом Швидкість проходження по колонці 0,5 мл/хв. Серії отримання легко оволодіти і застосовувати його білків відомої молекулярної ваги і діаметру Стокса, для отримання GMP (наприклад, в ендотоксин а також людські ЛПВЩ використовують як стандавільному оточенні). рти для калібрування колонки. Білки і ліпопроВідповідно до переважного способу, пептид і теїнові комплекси спостерігають за поглинаням ліпід об'єднують в системі розчинники, яка розчиабо світлорозсіюванням при довжині хвилі 254 або няє кожний інгредієнт і може бути повністю вида280нм. лена з допомогою ліофілізації. Тому розчини поАгоністи Аро А-І винаходу можуть утворювати винні бути ретельно підібрані таким чином, щоб комплекси з безліччю ліпідів, включаючи насичені, бути впевненим в корозчинності і амфіпатичного ненасичені, природні і синтетичні ліпіди і/або фопептиду і ліпіду. У одному з втілень білок(ки) або сфоліпіди. Відповідні ліпіди включають, не обме 59 71552 60 жуючись ними: малі з алкільним ланцюгом фосАроА-І вина ходу, пов'язані з ЛПВЩ компонентом, фоліпіди, яєчний фосфатиділхолін, соєвий фосмають передбачуване напівжиття в організмі люфатиділхолін, дипалмитоїл фосфатиділхолін, дидини приблизно 5 днів. Таким чином, в одному з меристоїл фосфатиділхолін, дістероїл втілень агоністи АроА-І вводять за допомогою ін'єфосфа тиділхолін, 1-міристоїл-2-палмітоїл фосфакції в дозі від 0,5мг/кг до 100мг/кг раз на тиждень. У тидилхолін, 1-палмітоїл-2-мірістоїл фосфатидиліншому втіленні бажаний рівень в сироватці можна холін, 1-палмітоїл-2-стероїл фосфатиділхолін, 1досягти постійним введенням або переривистим палмітоїл-2-стероїл фосфатиділхолін, 1-стероїл-2введенням, приблизно від 0,5мг/кг/годину до палмітоїл фосфатиділхолін, діолеоіл фосфатиділ100мг/кг/годину. холін, діолео фосфатиді-летаноламін, ділауроїл Токсичність і терапевтична ефективність різфосфа тиділгліцерин фосфатиділхолин, фосфа тиних агонистів АроА-І може бути визначено за доділсерин, фосфатиділетаноламін, фосфатиділипомогою стандартних фармацевтичних методик в нозітол, сфингомієлін, сфинголіпіди, фосфатиділгклітинній культурі або на експериментальних тваліцерин, дифосфатиділгліцерин, димерістоїл форинах для визначення LD 50 (доза, летальна для сфатиділгліцерин, дипалмітоїл 50% популяції) і ED 50 (доза, терапевтично ефекфосфа тиділгліцерин, дистероїл фосфатиділгліцетивна для 50% популяції). Відношення доз між рин, диолеоїл фосфа тиділгліцерин, димерістотоксичним і терапевтичним ефектом являє собою ілфосфацідова кислота, дипалмітоїл фосфатидотерапевтичний індекс і може бути виражене як ва кислота, димерістоїлфосфатиділетаноламін, відношення LD50/ED50. Пептиди-агоністи АроА-І, дипалмітоїл фосфатиділетаноламін, димерістоїл що показують високі терапевтичні індекси, пефосфа тиділсерин, дипалмітоїл фосфати-ділсерин, реважні. фосфа тиділсерин мозку, сфінгомієлін мозку, ди5.3.3. Фармацевтичні склади палмітоєл сфінгомієлін, дистероїл сфіингомієлін, Фармацевтичні склади винаходу, що містять фосфа тидная кислота, галактоцереброзід, гангліоагоніст АроА-І пептиду або пептид-ліпідний комзіди, цереброзіди, дилаурілфосфатиділхолін, (1,3)плекс в якості активного інгредієнту в фармацевD-маннозил-(1,3) дигліцерид, аміно-фенілглікозід, тично прийнятному носії, відповідним для застосу3-холестеріл-6'-гликозілтіо-гексіл ефір гліколіпідів і вання і доставки in vivo. Так як пептиди можуть холестерин і його похідні. містити кислі і/або основні кінцеві і/або бічні ланЗаявники відкрили, що коли агоністи АроА-І цюги, пептиди можна включати до складу або в винаходу утворюють комплекс із сфінгомієліном, формі вільних кислот або основ, або в формі фавсі ЛПВЩ πρε-β-подібні частки видалено. Відповірмацевтично прийнятних солей. дно до цього в переважному втіленні винаходу, Похідні для ін'єкцій включають стерильні суагоністи АроА-І приймають в комплексі зі сфінспензії, розчини або емульсії активного інгредієнту гомієліном. у воді або масляних носіях. Склади також можуть 5.3.2. Способи лікування включати складаючі агенти, такі як суспендуючі, Пептиди-агоністи АроА-І або пептид-ліпідні що стабілізують і/або диспергіруючі агенти. Склакомплекси винаходу можна приймати будь-яким ди для ін'єкцій можуть бути в формі одиниці дози, шляхом, який веде до біодоступності в циркуляції. наприклад, в ампулах або мультидозових контейЦе найкращим образом може бути досягнуто панерах, і можуть містити додані запобіжники. рентеральним введенням, включаючи внутрішньоКрім того, склади для ін'єкцій можуть бути у венне (ВВ), внутрішньом'язове (ВМ), внутрішньовигляді порошку для відновлення перед застосушкірне, підшкірне (ПШ) і інтраперітональне (ІП) ванням у відповідному носії, включаючи, але не введення. Але можуть бути використані і інші спообмежуючись: стерильну, вільну від пірогенів воду, соби введення. Наприклад, всмоктування в шлунбуфер, розчин декстрану і т.д. Тоді агоніст АроА-І ково-кишковому тракті може бути досягнуто при можна ліофілізувати або отримати коліофілізовапероральному застосуванні (включаючи але не ний пептид-ліпідний комплекс. Похідні, що зберіобмежуючись: ковтання, і під'язичне застосувангаються можна представити у формі одиничної ня), за умови, що для уникнення або мінімізації дози і відновити перед використанням in vivo. руйнування активного інгредієнту, наприклад, в Для пролонгованої доставки активний інгредікислому оточенні слизової ротової порожнини, єнт можна скласти у вигляді базового запасу, для шлунку і/або малого кишечнику застосовують відзастосування у вигляді інплантанту, наприклад, повідні склади (наприклад, ентеросолюбільні попідшкірна, внутрішньошкірна або внутрішньом'язокриття). Ще можна використати введення через ва ін'єкція. Так, наприклад, активний інгредієнт слизові оболонки, наприклад, вагінальним або може бути складений з відповідними полімерними ректальним шляхом для уникнення або зменшенабо гідрофобними матеріалами (наприклад, емуня руйнування в ШКТ. Ще, склади винаходу можна льсії в маслі), або іонообмінними смолами, або у застосовувати черезшкірно (трансдермально) або вигляді помірно розчинних похідних, наприклад, в за допомогою інгаляції. Треба зазначити, що переформі помірно розчинної солі агоністу АроА-І. важне застосування можна змінювати в залежносКрім того, можна використовувати системи ті від умов, віку і складності стану пацієнта. трансдермальної доставки, вироблені у вигляді Дійсну дозу агонистів АроА-І або пептидадгезивних дисків або петчів, які повільно виділяліпідних комплексів можна змінювати в залежності ють активний інгредієнт для черезшкірної адсорбвід способу введення, вона має бути доведена ції. У цьому випадку можна використати підсилютаким чином, щоб концентрація, що досягається в вачі проникнення для полегшення плазмі крові була від 100мг/л до 2г/л. Результати трансдермального проникнення активного інгредіна тваринах, описані тут, показали, що агоністи єнту. Особливо вдалий ефект можна отримати