Fsн-мутанти

1. Нуклеїнова кислота, яка кодує мутантну субодиницю FSH, де згадана -субодиниця містить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 та ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5. 2. Вектор, який містить нуклеїнову кислоту за п. 1. 3. Вектор за п. 2, який являє собою експресійний вектор. 4. Вектор за п. 2, який додатково містить нуклеїнову кислоту, яка кодує ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3. 2 (19) 1 3 Передумови створення винаходу 1. Галузь техніки, до якої належить винахід [0001] Цей винахід має відношення до розмноження людей. Конкретніше, цей винахід має відношення до лікувальних засобів, що сприяють заплідненню. 2. Опис відомого рівня техніки а. Гонадотропіни [0002] Фолікулостимулювальний гормон (FSH) є членом сімейства гонадотропінів, які відіграють ключову роль у людській фертильності. Гонадотропіни, до яких належить також лютеїнізуючий гормон (LH) та хоріонічний гонадотропін (CG), є гетеродимерами, кожен з яких складається зі спільної -субодиниці (92 амінокислоти) та специфічної -субодиниці (111 амінокислот у FSH). Амінокислотні послідовності зрілих форм - і субодиниць представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ №1 і ПОСЛІДОВНІСТЮ №2, відповідно. [0003] Людський FSH виділили з гіпофізу та з сечі постклімактеричних жінок (ЕР 322438), а також одержали рекомбінантними методами у клітинах ссавців [патент США №5,639,640, патент США №5,156,957, патент США №4,923,805, патент США №4,840,896, патент США №5,767,251, ЕР 211,894 і ЕР 521,586). У останніх згаданих посиланнях розкривають також ген -субодиниці FSH. У патенті США №5,405,945 розкривають модифікований людський ген -субодиниці, що містить лише один інтрон. [0004] Лю (Liu) та інші, J. Biol Chem., 1993, 15; 268(2):21613-21617, Гроссманн (Grossmann) та інші, Моl. Endocrinol., 1996, 10(6):769-779, Рот (Roth) та Діас (Dias), Моl. Cell. Endocrinol., 1995, 1; 109(2): 143-149, Валов (Valove) та інші, Endocrinology 1994; 135(6):2657-2661, Ю (Yoo) та інші, J. Biol. Chem., 1993, 25; 268(18):13034-13042), патент США №5,508,261, Чеппел (Chappel) та інші, 1998, Human Reproduction, 13(3):1835 розкривають різноманітні дослідження структурнофункціональної залежності та ідентифікують амінокислотні залишки, залучені до зв'язування рецепторів, активації та димеризації FSH. b. Застосування гонадотропінів у методиках допоміжної репродукції [0005] Гонадотропіни відіграють ключову роль у репродуктивному циклі, і їх застосування у екзогенних терапевтичних заходах є обов'язковим у методиках допоміжної репродукції (ART), наприклад, у заплідненні in vitro (IVF), IVF у поєднанні з інтрацитоплазматичним введенням сперми (IVF/ICSI) та трансплантації зародка (ЕТ), а також для індукції овуляції (ОІ) у ановуляторних хворих, що зазнають запліднення in vivo природним шляхом або шляхом внутрішньоматкового запліднення (IUI). [0006] Патент США №4,589,402 і патент США №4,845,077 розкривають очищений людський FSH, що не містить LH, та його застосування для запліднення in vitro. ЕР 322438 розкриває білок із активністю FSH (щонайменше 6200 Од/мг), по суті позбавлений активності LH, де -субодиниця і субодиниця FSH можуть бути, відповідно, субоди 93893 4 ницями дикого типу або їхніми специфічними скороченими формами. [0007] Для досягнення терапевтичного ефекту необхідним є тривале лікування, як правило, впродовж 8-10 послідовних днів, а подеколи до 21 дня для стимулювання фолікулогенезу у жінок та майже до 18 місяців у гіпогонадотропних чоловіків для індукування сперматогенезу. Рекомбінантний hFSH, як правило, вводять шляхом внутрішньом'язових або підшкірних щоденних ін'єкцій, що пов'язано з дискомфортом та потенційною можливістю виникнення місцевих реакцій на ділянці ін'єкції. Зменшення частоти введень полегшило б лікування і забезпечило б зручність введення гонадотропінів із більшою стерпністю та легкістю для хворих. с. Глікозилування FSH [0008] Гонадотропіни є глікопротеїнами, кожна субодиниця яких має зв'язані з аспарагіном (Nзв'язані) бічні олігосахаридні ланцюги, які є важливими для їх in vivo активності і функціонування. Додання вуглеводів (глікозилування) до поліпептидів є посттрансляційним явищем, наслідком якого є додання цукрових ланцюгів до специфічних аспарагін-зв'язаних (N-зв'язаних) або серин/треонін-зв'язаних (О-зв'язаних) амінокислот. Вуглеводні структури, у протилежність до інваріантної амінокислотної послідовності білкової частини глікопротеїнів, є варіабельними і цю особливість називають мікрогетерогенністю. Наприклад, сайти N-глікозилування на одному й тому самому білку можуть містити різні вуглеводні структури. Окрім того, навіть на одному й тому самому сайті глікозилування на даному глікопротеїні можна знайти різні вуглеводні структури. Ця гетерогенність є наслідком позаматричного синтезу вуглеводів. [0009] N-глікозилування білків відбувається конкретно на консенсусній послідовності Asn-XaaSer/Thr і, меншою мірою, на консенсусній послідовності Asn-Xaa-Cys, де Хаа може бути залишком будь-якої амінокислоти. Присутність консенсусного трипептиду не є, однак, достатньою умовою для забезпечення глікозилування залишку аспарагіну. Наприклад, N-глікозилування послідовності AsnPro-Ser/Thr відбувається з частотою, у 50 разів меншою за глікозилування інших консенсусних послідовностей Asn-Xaa-Ser/Thr. [0010] Людський FSH містить чотири N-зв'язані сайти глікозилування: два на спільній -субодиниці у положеннях 52 і 78 і два на -субодиниці у положеннях 7 і 24. Вуглеводи, приєднані до субодиниці FSH, є критичними для складання димерів, їх цільності, секретування та трансдукції сигналу, у той час як вуглеводи -субодиниці є важливими для складання димерів, їх секретування та виведення гетеродимерів із системи кровообігу. [0011] Гелвей (Galway) та інші, Endocrinology 1990; 127(1):93-100, демонструє, що варіанти FSH, одержані у лінії клітин СНО з Nацетилглюкозамінтрансферазою-І або у лінії клітин СНО, дефективних за перенесенням сіалової кислоти, є активними in vitro такою ж мірою, що і FSH, секретований клітинами дикого типу або очищений 5 гіпофізарний FSH, але їм бракує in vivo активності, ймовірно унаслідок швидкого виведення недостатньо глікозилованих варіантів із сироватки. Д'Антоніо (D'Antonio) та інші, Human Reprod., 1999; 14(5): 1160-1167, описує різні ізоформи FSH, які циркулюють у системі кровообігу. Згадані ізоформи мають ідентичні амінокислотні послідовності, однак різняться за ступенем їх посттрансляційної модифікації. Було встановлено, що менш кисла ізоформна група виводиться in vivo швидше за кислу ізоформну групу, можливо унаслідок різниць у вмісті сіалової кислоти між ізоформами. Більше того, Бішоп (Bishop) та інші, Endocrinology 1995; 136(6):2635-2640, дійшов висновку, що період напіввиведення із системи кровообігу, як видається, є головним визначником активності in vivo. Ці спостереження призвели до виникнення гіпотези, суть якої полягає у тому, що період напіввиведення FSH із кровотоку може бути збільшеним шляхом введення додаткових сайтів глікозилування для підвищення вмісту сіалової кислоти у поліпептиді. d. Варіанти FSH [0012] Агоністи FSH зі збільшеним періодом напіввиведення з кровотоку були одержані шляхом злиття карбоксикінцевого пептиду hCG (CTP) з нативним рекомбінантним людським FSH (rhFSH). Складова СТР містить амінокислоти від 112-118 до 145 з чотирма О-зв'язаними сайтами глікозилування, які знаходяться у положеннях 121, 127, 132 та 138. Патент США №5,338,835 і патент США №5,585,345 розкривають -субодиницю модифікованого FSH, подовжену на С-кінцевому Glu складовою СТР hCG. Стверджують, що одержаний модифікований аналог має біологічну активність нативного FSH, але подовжений період напіввиведення з кровотоку. Патент США №5,405,945 розкриває, що карбоксикінцева ділянка -субодиниці hCG або її варіант виявляють значний вплив на виведення CG, FSH та LH. [0013] Патент США №5,883,073 розкриває одноланцюгові білки, до складу яких входить дві субодиниці, з агоністичною або антагоністичною активністю відносно CG, TSH (тиреотропний гормон), LH та FSH. Патент США N° 5,508,261 розкриває гетеродимерні поліпептиди, які мають зв'язувальну спорідненість до рецепторів LH та FSH, до складу яких входить -субодиниця глікопротеїнового гормону та -субодиничний поліпептид, який не зустрічається за природних умов, де згаданий -субодиничний поліпептид являє собою ланцюг амінокислот, що містить чотири сполучені послідовності, кожна з яких вибрана з переліку специфічних послідовностей. Клейн (Klein) та інші (2003) розкриває одноланцюговий аналог FSH із подовженим періодом напіввиведення з кровотоку, де - і -субодиниці зв'язуються олігопептидом, що містить два N-зв'язаних сайти глікозилування. [0014] WO 01/58493 розкриває 77 мутацій, які можуть бути здійснені на -субодиниці FSH та 51 мутацію, які можуть бути здійснені на -субодиниці FSH для поліпшення періоду напіввиведення FSH з кровотоку in vivo. WO 01/58493 розкриває, що мутантні - і -субодиниці можуть застосовуватись індивідуально (1 додатковий сайт глікозилування) 93893 6 або у поєднанні (2 додаткові сайти глікозилування). 128 мутантів-"кандидатів" ідентифікували шляхом застосування 50 моделей об'ємної структури FSH, які одержали виключно на основі структури hCG та порівняльного аналізу первинної структури FSH та hCG, незважаючи на лише 32 % ідентичність між -субодиницями hCG та FSH. WO 01/58493 не розкриває одержання або випробування жодних - або -субодиниць FSH, де сайт глікозилування було введено шляхом сайтспрямованого мутагенезу. [0015] WO 05/020934 розкриває GM1 з мутаціями як у -, так і у -субодиницях FSH, у тому числі із подвійною мутацією у  E55N/V57T, тобто залишок Е у амінокислотному положенні 55 замінено на N і залишок V у амінокислотному положенні 57 замінено на Т. Амінокислотна послідовність в E55N/V57T представлена ПОСЛІДОВНІСТЮ №3. [0016] Існує клінічна потреба у продукті, який повністю або частково забезпечував би усі терапевтично важливі ефекти FSH і який міг би вводитись рідше, аніж доступні на цей час продукти FSH, і який, відповідно до варіанта, якому віддають перевагу, забезпечував би більш стабільний рівень активності циркулюючого FSH, порівняно з відповідними показниками, які одержують за допомогою сучасних методів лікування. [0017] Цей винахід спрямовано на такі продукти, а також на способи одержання таких продуктів. Суть винаходу [0018] Цей винахід має відношення до молекул-мутантів FSH, де -субодиниця FSH містить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №4-5, і де -субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. FSH може бути N-глікозилованим на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 залишках аспарагіну згаданого FSH-мутанта. За одним із варіантів здійснення глікозилованим може бути N5 мутантної -субодиниці з ПОСЛІДОВНІСТЮ №4. За іншим варіантом здійснення глікозилованим може бути N5 мутантної -субодиниці з ПОСЛІДОВНІСТЮ №5. За одним із варіантів здійснення глікозилованим може бути N55 мутантної субодиниці з ПОСЛІДОВНІСТЮ №3. [0019] Цей винахід має також відношення до виділених молекул ДНК, які кодують мутантні субодиниці FSH, вибрані з групи, до складу якої входять послідовності №4-5. Цей винахід має також відношення до виділеної ДНК, яка кодує субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. [0020] Цей винахід має також відношення до вектора, який містить ДНК, яка кодує мутантну субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. [0021] Цей винахід має також відношення до вектора, який містить ДНК, яка кодує мутантну субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. [0022] Цей винахід має також відношення до вектора, який містить першу ДНК і другу ДНК, де перша ДНК кодує мутантну -субодиницю FSH, 7 вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де друга ДНК кодує мутантну субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. [0023] Цей винахід має також відношення до клітини, яка містить вектор, який містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згаданою клітиною може бути клітина ссавця, наприклад, клітина СНО (клітина яєчника китайського хом'ячка). [0024] Цей винахід має також відношення до клітини, яка містить вектор, який містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згаданою клітиною може бути клітина ссавця, наприклад, клітина СНО. [0025] Цей винахід має також відношення до клітини, яка містить вектор, який містить першу ДНК і другу ДНК, де перша ДНК кодує мутантну субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де друга ДНК кодує мутантну -субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згаданою клітиною може бути клітина ссавця, наприклад, клітина СНО. [0026] Цей винахід має також відношення до клітини, яка містить перший і другий вектори, де перший вектор містить ДНК, яка кодує мутантну субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де другий вектор містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згадані вектори можуть бути експресійним вектором. Згаданою клітиною може бути клітина ссавця, наприклад, клітина СНО. [0027] Цей винахід також стосується способу одержання FSH-мутанта, який включає культивування клітин ссавців, здатних до глікозилування білків, де згадані клітини містять перший експресійний вектор, який містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і другий експресійний вектор, який містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. За іншим варіантом здійснення цього винаходу згадані клітини містять один вектор, який містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і додатково містить ДНК, яка кодує мутантну -субодиницю FSH, яка містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. [0028] Цей винахід також стосується композиції, яка містить FSH-мутант і фармацевтично прийнятний носій або наповнювач, де -субодиниця FSH містить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. [0029] Цей винахід також стосується способу лікування безплідного ссавця, який включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де -субодиниця FSH міс 93893 8 тить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де -субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. [0030] Цей винахід також стосується способу стимулювання фолікулогенезу у ссавця, який включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де субодиниця FSH містить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять послідовності №4-5, і де -субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Цей винахід також стосується способу індукування гіперстимуляції яєчника у ссавця, який включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де субодиниця FSH містить послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №4-5, і де -субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Короткий опис фігур На Фіг.1 представлено впорядковане розміщення -субодиниць-мутантів GNFT (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4) та GNRT (ПОСЛІДОВНІСТЬ №5) відносно людської -субодиниці FSH (ПОСЛІДОВНІСТЬ №1). Номери залишків мають відношення до людської -субодиниці FSH (ПОСЛІДОВНІСТЬ №1), де 1 означає першу амінокислоту зрілого поліпептиду. [0031] На Фіг.2 представлена крива залежності "доза-ефект" для мутантних -субодиниць FSH порівняно з FSH дикого типу. Клон 10с- GNRT/GMl. Клон 11c- GNFT/GM1. Докладний опис винаходу [0032] Незважаючи не те, що було показано, що наслідком підвищення вуглеводного вмісту FSH може бути збільшення періоду його напіввиведення з кровотоку in vivo, поліпшення періоду напіввиведення FSH із кровотоку є більш складною проблемою, аніж просте додання додаткових сайтів глікозилування. Консенсусна послідовність глікозилування є необхідною умовою додання вуглеводів, однак вона не є достатньою для забезпечення того, що сайт додання вуглеводу буде використаним. Інші фактори, наприклад, місцеве укладання білка та конформація під час біосинтезу, вирішують, чи приєднається олігосахарид на даному сайті консенсусної послідовності. Окрім того, консенсусна послідовність повинна знаходитись у такому положенні, щоб глікозилування згаданого сайту не перешкоджало зв'язуванню рецептора або не погіршувало укладання, конформацію чи стабільність глікопротеїну. До цього моменту аналоги FSH із підвищеним періодом напіввиведення обмежувались, головним чином, гібридними білками, де злита частина поліпептиду включала додаткові ділянки глікозилування. 1. Мутантний FSH [0033] Пропонується FSH-мутант, який був модифікований з метою утворення додаткових ділянок розпізнавання глікозилування. -субодиниця FSH-мутанта може мати одну з наведених нижче мутацій, порівняно з -субодиницею дикого типу: вставка амінокислотної послідовності GNFT між амінокислотними залишками 3 та 4 -субодиниці дикого типу або вставка амінокислотної послідов 9 ності GNRT між амінокислотними залишками 3 та 4 -субодиниці дикого типу. Мутантний FSH може містити будь-яку з вищезгаданих мутантних субодиниць у комбінації з мутантною субодиницею, наприклад,  GM1, яка містить наведену нижче мутацію: E55N/V57T. Одна або декілька додаткових ділянок глікозилування рекомбінантного FSH можуть бути глікозилованими. Одна або декілька додаткових ділянок глікозилування мутантного FSH можуть бути глікозилованими in vitro або in vivo. Термін "GNFT-мутант", що вживається у цьому описі, означає мутантний FSH, який містить -субодиницю, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №4, і -субодиницю, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №3. Термін " GNRT-мутант", що вживається у цьому описі, означає мутантний FSH, також стосується містить -субодиницю, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №5, і -субодиницю, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №3. [0034] FSH-мутант можна одержати за допомогою будь-якого відповідного способу, відомого у цій галузі. До цих способів належить конструювання нуклеотидних послідовностей, що кодують відповідні FSH-мутанти та експресія амінокислотної послідовності у відповідному трансфікованому хазяїні. FSH-мутант можна також одержати шляхом хімічного синтезу або комбінуванням хімічного синтезу та методів рекомбінантних ДНК. [0035] FSH-мутант може містити - та субодиниці FSH у формі двох окремих поліпептидних ланцюгів, де два згадані ланцюги димеризуються in vivo таким чином, що утворюють димерний поліпептид, або він може містити одноланцюгову генно-інженерну конструкцію, що містить дві субодиниці, ковалентно зв'язані пептидним зв'язком або пептидним лінкером. Амінокислотні залишки лінкерного пептиду можуть демонструвати властивості, які суттєво не перешкоджають активності FSH-мутанта. [0036] FSH-мутант може мати збільшений період напіввиведення порівняно з FSH дикого типу. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може також мати підвищену стабільність порівняно з FSH дикого типу. FSH-мутант може містити олігосахариди на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 N-зв'язаному сайтах глікозилування. FSH-мутант може містити один або декілька ізоформ FSH-мутанта, де кожна ізоформа містить олігосахариди на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 N-зв'язаному сайтах глікозилування. [0037] Нуклеотидна послідовність, що кодує або -субодиниці FSH-мутантів, може конструюватись шляхом виділення або синтезування нуклеотидної послідовності, що кодує субодиницю батьківського FSH, наприклад, hFSH-альфа або hFSHбета, з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНІСТЯМИ №1 і №2, відповідно. Нуклеотидна послідовність у подальшому може змінюватись таким чином, щоб забезпечити можливість заміни відповідних амінокислотних залишків. Згадана нуклеотидна послідовність може модифікуватись сайт-спрямованим мутагенезом. Як альтернатива, нуклеотидна послідовність може бути одержана шляхом хімічного синтезу, де 93893 10 олігонуклеотиди конструюються на основі специфічної амінокислотної послідовності FSH-мутанта. [0038] Нуклеотидна послідовність, яка кодує поліпептид, може вставлятись до рекомбінантного вектора і функціонально зв'язуватись із контрольною послідовністю, необхідною для експресії поліпептиду у бажаній трансфікованій клітині-хазяїні. Контрольними послідовностями може бути будьяка складова, яка є необхідною або придатною для експресії поліпептиду. Приклади відповідних контрольних послідовностей для спрямування транскрипції у клітинах ссавців включають ранні й пізні промотори SV40 і аденовірусу, наприклад, головний пізній промотор аденовірусу 2, промотор МТ-1 (ген металотіонеїну) і передранній промотор цитомегаловірусу (CMV) людини. [0039] Фахівець у цій галузі може зробити вибір серед цих векторів, контрольних послідовностей експресії і хазяїв без зайвого експериментування. Рекомбінантним вектором може бути автономний реплікаційний вектор, тобто вектор, який існує як позахромосомна одиниця, реплікація якої не залежить від реплікації хромосом, наприклад, плазміда. За альтернативним варіантом згаданим вектором може бути вектор, який у разі введення до клітини-хазяїна інтегрується до геному клітини-хазяїна і розмножується разом із хромосомою(-ами), до якої(-их) його було інтегровано. [0040] Згаданим вектором може бути експресійний вектор, у якому нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид відповідно до цього винаходу, є функціонально зв'язаною з додатковими сегментами, необхідними для транскрипції нуклеотидної послідовності. Згаданий вектор можна одержати з плазмідної або вірусної ДНК. Ряд придатних експресійних векторів для експресії у клітинах-хазяях, які були згадані у цьому описі, є комерційно доступними або описаними у літературі. [0041] Згаданий рекомбінантний вектор може додатково містити послідовність ДНК, яка надає можливість реплікування згаданого вектора у відповідній клітині-хазяїні. Прикладом такої послідовності (у разі, коли клітиною-хазяїном є клітина ссавця) є точка початку реплікації SV40. Згаданий вектор може також містити селективний маркер, наприклад, ген, продукт якого доповнює дефект клітини-хазяїна, наприклад, ген, що кодує дигідрофолатредуктазу (DHFR) або ген, який забезпечує стійкість до лікарського препарату, наприклад, ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну, хлорамфеніколу, неоміцину, гігроміцину або метотрексату. [0042] Згаданий вектор може містити також ампліфікувальний ген, наприклад, DHFR, завдяки чому клітини, які мають численні копії ампліфікувального гена та фланкувальні послідовності, у тому числі ДНК мутантного FSH, можуть відбиратись на відповідних живильних середовищах. [0043] Також пропонується ДНК, яка кодує субодиницю FSH-мутанта. Нуклеотидна послідовність, що кодує - та -субодиниці FSH-мутанта, незалежно від того, чи вони одержані сайтспрямованим мутагенезом, синтезом, ПЛР або іншими способами, може за факультативним варіантом також включати нуклеотидну послідовність, що кодує сигнальний пептид. Сигнальний пептид мо 11 же бути присутнім, коли поліпептид повинен секретуватись з клітин, у яких він експресується. Таким сигнальним пептидом у разі його присутності може бути пептид, який розпізнається клітиною, вибраною для експресії поліпептиду. Сигнальний пептид може бути гомологічним (наприклад, бути пептидом, який, як правило, пов'язується із субодиницею hFSH) або гетерологічним (тобто походити з іншого джерела, аніж hFSH) відносно згаданого поліпептиду, або може бути гомологічним чи гетерологічним відносно клітини-хазяїна, тобто бути сигнальним пептидом, який, як правило, експресується клітиною-хазяїном, або бути сигнальним пептидом, який, як правило, не експресується клітиною-хазяїном. [0044] Для продукування поліпептидних субодиниць може застосовуватись будь-який придатний хазяїн, у тому числі клітини або лінії клітин бактерій, грибів (у тому числі дріжджів), рослин, комах, ссавців або клітини чи лінії клітин інших придатних тварин, а також трансгенні тварини або рослини. Прикладами придатних клітин-хазяїв ссавців є лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) (наприклад, CHO-KL; АТСС (Американська колекція типових культур) CCL-61), лінії клітин зеленої мавпи (COS) (наприклад, COS 1 (АТСС CRL1650), COS 7 (АТСС CRL-1651); клітини мишей (наприклад, NSIO), лінії клітин нирок хом'ячка (ВІЕК) (наприклад, АТСС CRL-1632 або АТСС CCL10) і людські клітини (наприклад, ВЕК 293 (АТСС CRL-1573)), а також клітини рослин у культурі клітин тканини. У цій галузі відомі додаткові придатні лінії клітин, доступні з колекцій, наприклад, з Американської колекції типових культур, США Способи введення екзогенної ДНК до клітин-хазяїв ссавців включають трансфекцію, опосередковану фосфатом кальцію, електропорацію, трансфекцію, опосередковану DEAE (діетиламіноетил)-декстраном, трансфекцію, опосередковану ліпосомами та застосування векторів на основі вірусних геномів. [0045] Клітини можуть культивуватись у живильному середовищі, придатному для продукування поліпептиду із застосуванням способів, відомих у цій галузі. Клітина, наприклад, можуть культивуватись у хитальних колбах, шляхом ферментації у лабораторних або промислових масштабах (у тому числі шляхом безперервної ферментації, періодичної ферментації, періодичної ферментації з підживленням або твердофазної ферментації) у лабораторних або промислових ферментерах у придатному середовищі або за умов, які забезпечують можливість експресії та/або виділення поліпептиду. Культивування відбувається у придатному живильному середовищі, що містить джерела вуглецю і азоту та неорганічні солі, за методами, відомими у цій галузі. Придатні живильні середовища є доступними від комерційних постачальників або можуть готуватись за опублікованими прописами (наприклад, у каталогах Американської колекції типових культур). Якщо поліпептид секретується до живильного середовища, його можна виділяти безпосередньо зі згаданого середовища. Якщо поліпептид не секретується, його можна виділяти з клітинних лізатів. Один зі способів високоефективного продукування FSH-мутантів за цим 93893 12 винаходом полягає у застосуванні ампліфікації дигідрофолатредуктази (DHFR) у дефіцитних на DHFR клітинах СНО шляхом застосування послідовно зростаючих рівнів метотрексату, як описано у патенті США №4,889,803. [0046] Одержаний мутантний поліпептид FSH може виділятись способами, відомими у цій галузі. Наприклад, він може виділятись із живильного середовища традиційними способами, у тому числі (але без обмеження) центрифугуванням, фільтруванням, екстрагуванням, сушінням розпилюванням, випарюванням або осадженням. Мутантні поліпептиди FSH можуть очищатись різноманітними способами, відомими у цій галузі, у тому числі (але без обмеження) хроматографуванням (іонообмінним, афінним, гідрофобним, хроматофокусувальним та гель-хроматографуванням), методами електрофорезу (наприклад, препаративним ізоелектричним фокусуванням), завдяки різниці розчинності (наприклад, осадженням сульфатом амонію), SDS-PAGE або екстрагуванням. [0047] Пропонується також фармацевтична композиція, яка містить FSH-мутант. Така фармацевтична композиція може застосовуватись для стимулювання фолікулогенезу, наприклад, разом з індукцією овуляції або методиками допоміжної репродукції (ART). Оскільки FSH-мутант за цим винаходом може бути ефективним щодо індукування численних фолікулів до розвитку й визрівання, він може бути особливо придатним для застосування у ART, у яких є бажаним збирання численних овоцитів. [0048] FSH-мутант може застосовуватись для індукування монофолікулогенезу для ОІ або нечисленного фолікулогенезу (до приблизно трьох фолікулів) для IUI, для запліднення in vivo. Монофолікулогенез можна також забезпечити застосуванням зменшеної дози FSH-мутанта або рідшим уведенням доз, порівняно з традиційними препаратами FSH. Наприклад, у разі ОІ, препарат FSH за цим винаходом може вводитись у дозі 225400 МОд через три дні або у нижчих дозах, у залежності від реакції хворого. Реакція хворого може відслідковуватись за допомогою ультразвукової ехографії. [0049] FSH-мутант відповідно до цього винаходу може застосовуватись у схемах контрольованої гіперстимуляції яєчників (СОН). Стандартні схеми СОН включають фазу регуляції за типом негативного зворотного зв'язку, впродовж якої виділення ендогенного лютеїнізуючого гормону (LH) інгібується введенням агоніста гонадотропінвивільнювального гормону (GnRH), з подальшою стимуляторною фазою, на якій розвиток фолікулів (фолікулогенез) індукується щоденним введення фолікулостимулювального гормону (FSH), як правило, у дозі приблизно 150-225 МОд/доба. Як альтернатива, стимулювання розпочинають FSH після спонтанної або індукованої менструації, з подальшим введенням GnRH-антагоніста (із започаткуванням, як правило, приблизно на шостий день стимуляторної фази). У разі появи щонайменше 3 фолікулів >16 мм (одного 18 мм), вводять разову ударну дозу hCG (5-10000 МОд) для імітації імпульсного викиду природного LH і індукування ову 13 ляції. Виділення овоцитів відбувається через 3638 год. після ін'єкції hCG. [0050] FSH-мутант може застосовуватись також для ОІ та IUI. Наприклад, FSH-стимуляцію розпочинають після спонтанної або індукованої менструації у добовій дозі 75-150 МОд. Коли 1 фолікул або 3 фолікули досягнуть діаметра щонайменше 16 мм, вводять разову ударну дозу hCG для індукування овуляції. Запліднення здійснюють in vivo шляхом регулярних статевих зносин або IUI. [0051] Оскільки FSH-мутант може мати збільшений період напіввиведення порівняно з препаратами FSH дикого типу, у схемах, опис яких було наведено вище, можуть застосовуватись нижчі (у МОд) дози FSH та/або вони можуть модифікуватись шляхом скорочення FSH-стимуляторного періоду з досягненням такої самої або кращої реакції з точки зору кількості та життєздатності фолікулів. Наприклад, у разі застосування препарату FSH відповідно до цього винаходу, адекватного фолікулогенезу можна досягти з добовими дозами, що дорівнюють або приблизно дорівнюють 50150 МОд, 50-100 МОд, 50-75 МОд FSH. Введення FSH здійснюють, як правило, на добовій або напівдобовій основі. Період введення може бути меншим або становити приблизно 14 днів, 12 днів, 11 днів або 10 днів. У разі ОІ, препарати FSH-мутанта можуть вводитись у дозах 25-150 МОд FSH/доба або 50-125 МОд FSH/доба. Для лікування безпліддя у чоловіків, препарат FSH-мутанта може вводитись у дозі 3150-300 МОд/тиждень, доки сперматогенез не досягне рівнів, адекватних для запліднення шляхом регулярних статевих зносин або шляхом застосуванням методик допоміжної репродукції. [0052] Завдяки довшому періоду напіввиведення мутантного FSH він може вводитись як препарат пролонгованої дії. Традиційний FSH може вводитись у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 300 МОд через день із досягненням таких самих результатів, як і у разі введення кожного дня у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 150 МОд. Мутантний FSH може вводитись через три дні, через чотири дні, через п'ять днів, через шість днів або через сім днів із досягненням подібних або кращих результатів, порівняно з щоденним введенням традиційного FSH. [0053] FSH-мутант може застосовуватись для виготовлення лікарського препарату для лікування захворювань, розладів або станів. Відповідно до іншого аспекту поліпептид або фармацевтична композиція відповідно до цього винаходу застосовуються у способі лікування ссавця, зокрема, людини, що включає введення ссавцю, який цього потребує, такого поліпептиду або фармацевтичної композиції. [0054] Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що ефективна кількість поліпептиду, препарату або композиції залежить, inter alia, від захворювання, дози, схеми введення лікарського засобу, незалежно від того, вводять поліпептид, препарат або композицію незалежно або у поєднанні з іншими лікарськими засобами, періоду напіввиведення згаданої композиції із сироватки та від зага 93893 14 льного стану здоров'я хворого. За типовим варіантом ефективна доза препарату або композиції відповідно до цього винаходу є достатньою для забезпечення терапевтичного ефекту. [0055] FSH-мутант може вводитись у композиції, яка містить один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв або наповнювачів. "Фармацевтично прийнятний" означає носій або наповнювач, який не викликає жодних небажаних ефектів у хворих, яким він вводиться. Такі фармацевтично прийнятні носії та наповнювачі є добре відомими у цій галузі і поліпептид може вводитись до складу фармацевтичних композицій добре відомими способами (дивись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 видання, під редакцією А.Р. Геннаро - (A.R. Gennaro), Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, під редакцією С. Фрокер (S. Frokjaer), Л. Хогаард (L. Hovgaard), Taylor&Francis (2000); Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 видання, під редакцією А. Кібб (A. Kibbe), Pharmaceutical Press (2000)). Фармацевтично прийнятними наповнювачами, які можуть застосовуватись у композиціях, що містять поліпептид, є, наприклад, буферні агенти, стабілізувальні агенти, консерванти, ізотонічні агенти, неіонні поверхнево-активні речовини або детергенти, змочувальні компоненти, антиоксиданти, заповнювачі або наповнювачі, хелатоутворювачі і співрозчинники. [0056] Фармацевтичні композиції, які містять FSH-мутант, можуть виготовлятись у різноманітних формах, у тому числі у формі рідин, наприклад, готових до застосування розчинів або суспензій, гелів, у ліофілізованій або будь-якій іншій придатній формі, наприклад, у формі порошку або кристалів, придатних для виготовлення розчину. Форма композиції може залежати від конкретного показання, за яким її застосовують і буде очевидною для фахівця у цій галузі. [0057] Фармацевтична композиція, яка містить FSH-мутант, може вводитись внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочеревинним, внутрішньошкірним, підшкірним, під'язиковим, букальним, інтраназальним, черезшкірним, інгаляційним або будь-яким іншим прийнятним шляхом, наприклад, за методом PowderJect або ProLease або за допомогою шприца-ін'єктора. Спосіб введення може залежати від конкретного показання, за яким композиція застосовується, і буде очевидним для фахівця у цій галузі техніки. Композиція може вводитись підшкірним шляхом, оскільки це може надати можливість хворому здійснення самостійного введення. [0058] Фармацевтичні композиції можуть вводитись у поєднанні з іншими лікарськими засобами. Ці лікарські засоби можуть включатись як складова частина тієї самої фармацевтичної композиції або можуть вводитись окремо від поліпептидів, одночасно або відповідно до будь-якої іншої прийнятної схеми введення лікарського засобу. На додаток до цього, поліпептид, препарат або фармацевтична композиція може застосовуватись як допоміжний засіб з іншими способами лікувального впливу. 15 93893 [0059] Цей винахід має численні аспекти, які ілюструються наведеними нижче необмежувальними прикладами. Приклад 1 FSH-мутанти [0060] Об'ємну кристалічну структуру людського FSH застосовували для ідентифікування ділянок молекули FSH, на які могла б бути введена ділянка-кандидат глікозилування. У кожній асиметричній одиниці кристалічної структури присутні дві молекули FSH (чотири субодиниці). Дві молекули FSH взаємонакладали і порівнювали, причому кожен залишок піддавали візуальній перевірці для ідентифікування потенційних ділянок, до яких могла б бути вставлена ділянка N-глікозилування, яка б не руйнувала відповідного вкладання поліпептиду FSH або не зменшувала б активності FSH. Кристалографічну структуру FSH об'єднували зі знанням взаємодії FSH/рецептора FSHR для надання додаткової допомоги при виборі потенційних ділянок N-глікозилування. Основними критеріями конструювання було мінімальне руйнування об'ємної структури, мінімальне порушення прогнозованого зв'язування і ділянок активації та прогнозована сумісність об'ємної структури з глікозилуванням. Виходячи з вищезазначених критеріїв, одержали два наведені нижче інсерційні мутанти -субодиниці FSH: № 1 2 Мутації Вставка GNFT Вставка GNRT ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 5 Приклад 2 Морфологічний аналіз FSH-мутантів [0061] Аліквоти концентрованих культуральних супернатантів тимчасової експресії -субодиницьмутантів 1-2 FSH аналізували за допомогою SDSPAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) за невідновних умов, що надає можливість розділення інтактних гетеродимерів FSH від вільних - і субодиниць. Шляхом порівняння середньої молекулярної маси кожного гетеродимеру-мутанта із середньою молекулярною масою FSH дикого типу можна визначити, чи є мутантний FSH гіперглікозилованим порівняно з FSH дикого типу. Стисло, після електрофорезу білки електрофоретичним шляхом переносили до PVDF (полівініліденфторид) і візуалізували за допомогою антитіла Serono 9-14, спрямованого проти -субодиниці FSH. Як контроль аналізували також людський FSH дикого типу, мутантний GM1, FSH-CTP та Gonal F. У Таблиці 1 наведена середня молекулярна маса (обчислена за допомогою стандартів молекулярної маси) гетеродимеру, утвореного -субодиницямимутантами і -субодиницею дикого типу. Таблиця 1 Зразок FSH-CTP Gonal F Вставка GNFT Мг (кДа) 45,244 38,482 49,375 Конц. укладання 37 36 16 Вставка GNRT GM1 FSH дикого типу 49,172 46,202 45,083 35 40 36 [0062] Як показано у Таблиці 1, кожен із двох експресованих FSH-мутантів, тобто вставки GNFT та GNRT, продемонстрував підвищений рівень глікозилування, про що свідчить зсув розподілу середньої молекулярної маси гетеродимеру порівняно з людським FSH дикого типу. Приклад 3 In vitro функціонування FSH-мутантів [0063] 3 метою визначення активності FSHмутантів кожен мутант перевіряли на здатність до стимулювання продукування цАМФ у лінії клітин СНО, які рекомбінантним чином експресують рецептор людського FSH (FSHR). Клітини CHOFSHR підтримували у середовищі для вирощування FSHR [MEM (мінімальне підтримувальне середовище) (-) (компанія Gibco, номер за каталогом 12561-056) + 10 % діалізованої FBS (сироватка зародка великої рогатої худоби) (компанія Gibco, номер за каталогом 26300-020) + 600 мкг/мл генетицину (компанія Gibco, номер за каталогом 10131-035) + 0,02 мкМ МТХ (метотрексат)]. Клітини CHO-FSHR висівали з густиною 2104 клітин/лунка у 100 мкл/лунка (2106 клітин/10 мл=1 планшет) та інкубували при температурі 37°С впродовж 24 год. перед проведенням аналізу. Клітини застосовували для аналізу у разі щонайменше 70 % злиття. [0064] Серійне розведення (1:3) до 12 точки здійснювали, розпочинаючи з 67,5 нМ для усіх зразків і внутрішнього стандарту (як внутрішній стандарт застосовували Gonal F). Усі розведення здійснювали у аналітичних середовищах [DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла)/F12 (без фенолу, компанія Gibco, номер за каталогом 11039-021) + 1 мг/мл BSA (компанія Sigma, A-6003) + 0,1 мМ ІВМХ (інгібітор 3-ізобутил1-метилксантонфосфодіестерази, компанія Sigma, номер за каталогом I-7018)]. Середовище для вирощування видаляли з аналітичного планшета, додавали 25 мкл аналітичного середовища (яке постачається з набором МА6000 cAMP MSD kit Meso Scale Discovery, Gaithersburg, штат Меріленд), планшети відновлювали та інкубували при температурі 37°С впродовж 15 хв. Після цього до лунок вносили експериментальний зразок (25 мкл/лунка), перемішували, планшети відновлювали й інкубували впродовж 1 год. при температурі 37 °С. Після інкубування впродовж 1 год. зразок і середовище з лунок видаляли. Після цього до кожної лунки додавали 25 мкл стандартного лізисного буфера (який постачається з набором МА6000 Meso Scale Discovery kit), планшети заклеювали за допомогою пристрою для заклеювання планшетів (компанія Packard, номер за каталогом 6005185) і струшували впродовж 5 хв. Після 5 хв. лізисного інкубування 25 мкл лізованого клітинного матеріалу переносили на планшет цАМФ Meso Scale Discovery (який постачається з набором МА6000 MSD kit) та інкубували з обережним перемішуванням при кімнатній температурі впродовж 30 хв. До кожної лунки додавали 25 мкл кон'югата цАМФ-АР (лужна фосфатаза), і перемі 17 93893 шували. Після цього до кожної лунки додавали 25 мкл антитіла проти цАМФ, планшети заклеювали за допомогою пристрою для заклеювання планшетів і струшували впродовж 30 хв. при кімнатній температурі. Після цього планшети шість разів промивали (350 мкл на лунку) промивним буфером на автоматизованій машині для миття планшетів. Після цього до кожної лунки додавали енхансер субстрату Sapphire II RTU (готовий до застосування), планшети заклеювали за допомогою пристрою для заклеювання планшетів та інкубували впродовж 30 хв. у темряві при температурі 25°С. Після цього планшети зчитували зі швидкістю 1 с/лунка з низькими рівнями цАМФ, які демонстрували сигнал високого рівня, і високими рівнями цАМФ, які демонстрували сигнал низького рівня. Криві залежності "доза-ефект" FSH-мутантів наведені на Фіг.2. Були обчислені наведені у Таблиці 2 значення ЕС50. [0065] Як показано на Фіг.2 і у Таблиці 2, кожен з FSH-мутантів має in vitro активність, порівнянну з активністю FSH дикого типу. Таблиця 2 Зразок FSH дикого типу Клон ЮС- a GNRT/p GM1 Клон 11С- а GNFT/p GM1 ЕС50М 2Д6Е-10 2,58Е-10 2,78Е-10 Приклад 4 In vivo період напіввиведення FSH-мутантів Дві різні партії GNFT-мутанта та GNRTмутанта аналізували при проведенні окремих фармакокінетичних (РК) досліджень. Два дослідження здійснювали за однаковою схемою: 33 нестатевозрілі пацюки-самиці лінії SD віком приблизно 21 день (приблизна маса тіла 40 г; компанія Charles River Laboratories, Wilmington, штат Массачусетс) довільно розподіляли на 5 експериментальних груп (n=6) і 1 основну групу (n=3). Вибір нестатевозрілих пацюків-самиць обумовлювався застосуванням цього віку і статі для in vivo біологічної оцінки активності FSH. Тварини у експериментальних групах одержували підшкірні (s.c.) ін'єкції 4 мкг GM1 (контроль), GNFT-мутанта, GNRT-мутанта або 8 мкг Gonal-F rhFSH (контроль). Кров відбирали з ретроорбітального синусу у 0 год. у основній групі і через 1 год., 2 год., 4 год., 6 год., 10 год., 18 24 год., 48 год. та 72 год. від тварин в експериментальних групах (n=3 / часова точка; пацюків міняли таким чином, щоб не знекровлювати тварин впродовж 2 наступних точок відбирання проб). Під час кожного відбирання проб від кожного пацюка брали приблизно 0,1 мл крові, плазму збирали й зберігали при температурі -80 °С до проведення ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз). Для визначення білків FSH у сироватці під час обох досліджень вдавались до DSL FSH Coated Well ELISA (компанія Diagnostics Systems Laboratories, Webster, штат Техас). Кожну пробу сироватки аналізували три рази. Період напіввиведення GNFT-мутанта і GNRTмутанта становить приблизно 17 год., у той час як період напіввиведення контрольних сполук GM1 та Gonal-F становить приблизно 12 год. і 8 год., відповідно. Це вказує на те, що GNFT-мутант і GNRTмутант мають довший період напіввиведення, аніж FSH дикого типу. Приклад 5 In vivo біологічна активність In vivo моделлю, яка застосовувалась для оцінки біологічної активності GNRT- та GNFTмутантів, був аналіз приросту маси яєчника пацюків. Обробка нестатевозрілих пацюків-самиць віком 21 день FSH або молекулами із FSH-подібною активністю, наприклад, GNRTта GNFTмутантами, ініціювала ріст фолікул яєчника й продукування овоцитів. Цей ріст легко виявляється визначенням маси яєчників у кінці періоду обробки. У разі застосування цієї моделі речовину, призначену для перевірки, вводять шляхом ін'єкцій впродовж трьох днів, яєчники збирають і зважують після введення останньої дози. Цей аналіз застосовували впродовж декількох десятиріч як основу визначення активності FSH клінічних продуктів із метою етикетування. За його допомогою визначають відносну фізіологічну дію FSH, і він має чітко виражену кореляцію з активністю продуктів у клінічній практиці. In vivo активність GNRT- та GNFT-мутантів порівнювали з активністю FSH дикого типу. Усі дози визначали виходячи з прогнозованої еквівалентності FSH з прийняттям до уваги in vitro активності й періоду напіввиведення у пацюків. Було встановлено, що GNRT- і GNFT-мутанти мають високий рівень активність FSH з зі значенням, подібним до відповідної активності FSH дикого типу. 19 93893 20 21 93893 22 23 93893 24 25 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 93893 Підписне 26 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601