Гіпоалергенні різновиди головного алергену пилку betula verrucosa

1. Білок, який є гіпоалергенним варіантом головного алергену пилку Betula verrucosa (Bet v 1), який відрізняється тим, що: а) виявляє знижену, у порівнянні з диким типом алергену Bet v 1 (SEQ ID NO:1) реактивність до C2 2 UA 1 3 ції до інших алергенів, що створює додаткові труднощі у виборі відповідної терапії. Специфічна гіпосенсибілювальна імунотерапія, на відміну від фармакологічної терапії, є єдиним етіологічним лікуванням алергічних хвороб, здатним найкращим чином змінити імунологічні параметри, на базі яких ці хвороби виникають. Гіпосенсибілювальна імунотерапія полягає у застосуванні зростаючих доз стандартизованих екстрактів (вакцин), отриманих з тієї самої речовини, яка викликає хворобу [1]. Таким чином, у пацієнта поступово виникає різновид імунологічної толерантності до зазначеної речовини з подальшим зникненням симптомів алергії. Проте, застосування специфічної гіпосенсибілювальної імунотерапії у лікуванні алергічних хвороб донині обмежувалося ризиком виникнення побічних ефектів [2], незважаючи на те, що цей ризик суттєво знижувався за умови застосування будь-яких повільно діючих вакцин або вакцин, які вводилися позаін'єкційним шляхом. Останніми роками увага головним чином була сконцентрована на розробці ефективної та більш безпечної вакцини. Зокрема, важливою метою була розробка вакцини, що містить мутантні рекомбінантні білки, тобто гіпоалергенні варіанти, що здатні позитивно впливати на природній перебіг хвороби, не викликаючи при цьому небажаних бічних ефектів [3]. Пилок рослин, що належать до таксону Fagales (береза, вільха, ліщина, дуб, граб) є одним з найголовніших факторів виникнення алергічного риніту та астми у регіонах з помірним кліматом. Два головних алергени пилку берези, Bet v 1 (кДНК зберігається у GenBank асе. No. Х15877) і Bet v 2 (асc. No. М65179) являють собою білки з молекулярною масою 17 і 14 кД відповідно [4, 5]. Біля 95 % пацієнтів з алергією на пилок берези продукують антитіла IgE проти Bet v 1 і 60% цих пацієнтів виявляють винятково реакцію проти Bet v 1 [6]. У природі Bet v 1 представлений більш ніж десятьма ізоформами, ідентичність послідовностей між якими складає від 88.4% до 99.4% [7]. Цей алерген належить до родини «патогенно залежних білків», тобто до поширених білків, які продукуються рослинами у відповідь на екологічний або патологічний стрес; вважають, що їхні функції пов'язані із транспортом стероїдів [8, 9]. Висока гомологія послідовностей із алергенами групи 1 з пилку інших рослин порядку Fagales пояснює, чому у пацієнтів з антитілами IgE, специфічними для Bet v 1, виявляються алергічні симптоми під час сезону утворення пилку у різних рослин, що належать до одного й того самого таксономічного порядку [10]. Алергія до пилку берези часто супроводжується побічною дією, викликаною вживанням свіжих фруктів (наприклад, вишні, яблук, груш) або овочів ( наприклад, сельдерею і моркви). Справа в тому, що такі продукти містять білки, що характеризуються високим ступенем гомології послідовностей та структури до Bet v 1 й розпізнаються специфічними IgE, які утворюються під дією головного алергену берези [11]. 93894 4 Імунотерапія із застосуванням алергена Bet v 1 може бути ефективною під час лікування алергії до пилку берези, а також полінозів до інших рослин порядку Fagales та алергії до продуктів, що містять алергени, споріднені з Bet v 1 [12]. Фактором, що корелює зі сприятливими ефектами гіпосенсибілювальної імунотерапії, є введення антитіл IgG, специфічних до сенсибілізуючого алергену. Такі (захисні) антитіла здатні гальмувати зв'язування IgE з антигеном, специфічним до Bet v 1, шляхом зміни тривимірної конформації цієї молекули [13, 14]. Лікування алергенних хвороб можна вдосконалити шляхом розробки вакцин, що містять рекомбінантні білки зі зниженою алергенністю та незміненими імуногенними властивостями, Нині відомо, що за умови заміни або видалення однієї чи декількох амінокислот у складі білкової послідовності алергену Bet v 1 знижується його реактивність до антитіл IgE. Перш за все, винахід стосується гіпоалергенного білку, який є варіантом послідовності алергену Bet v 1, для якого є характерними: 1) зменшена, у порівнянні з диким типом алергену Bet v 1(SEQ ID NO:1), реактивність до антитіл IgE; 2) наявність амінокислотної послідовності, котра: а) є ідентичною до SEQ ID NO:1 принаймні на 87%, оптимально на 94%, ще краще на 97%; б) у послідовності, подібній SEQ ID NO:1, є щонайменше одна заміна або делеція залишку Lys, у позиціях 54, 115 та/або 123 SEQ ID NO:1 Варіанти алергену Bet v 1, які, згідно винаходу, містять заміни та/або делеції 1, 2 чи 3 Lys на зазначених позиціях, віднесені до варіантів одинарної, подвійної або потрійної заміни та\або делеції відповідно. Перевагу надано варіантам заміни, аніж видалення, особливо тим замінам, коли принаймні один залишок Lys на зазначених позиціях замінюється на нейтральну або полярну амінокислоту. Оптимально, аби зазначеними нейтральними чи полярними амінокислотами були Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Не, Ser, Phe; найбільш оптимально Ala, Thr та Ser. У оптимальному варіанті гіпоалергенний білок складається із SEQ ID NO:1, що містить принаймні одну із зазначених замін або делецій залишку Lys на позиціях 54,115 і 123. Згідно винаходу, типові гіпоалегренні білки, що містять 1 або 3 заміни, встановлені у SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 та SEQ ID NO:5. Згідно винаходу, варіанти замін та /або видалень у алергені Bet v 1, порівняно з дикими копіями, виявляють зменшення реактивності IgE принаймні на 25%, оптимально на 50%, краще на 80% щодо сироватки пацієнтів з пилковою алергією на Betula verrucosa. Реактивність IgE до білків SEQ ID NOs:2-5 з вибірки сироватки хворих на алергію було перевірено за допомогою проби ELISA (Fig. 1). Ці результати були підтверджені в експериментах інгібування в системі ELISA, що дозволяє оцінити реактивність гомологічних епітопів різних біл 5 ків. Зв'язування Bet v 1 wt (SEQ ID NO:1) з антитілами IgE із проби сироватки інгібується до 100% у разі, коли сироватка попередньо обробляється тим самим білком, тоді як досліджена інгібування дорівнює лише 40% у разі, коли сироватка попередньо витримується разом з ідентичними кількостями варіанту потрійної заміни (SEQ ID NO:5) (Fig. 2). Ці результати чітко вказують, що заміни амінокислот на позиціях 54, 115 та 123 SEQ ID NO:1 зменшують розпізнавання алергену Bet v 1 антитілами IgE. До того ж, реактивність білків SEQ ID NOs:2-5 на антитіла IgE з сироватки, позитивної до пилку Betula verrucosa, було апробовано за допомогою Вестерн-блотування. Також у проаналізованих сироватках, порівняно з Bet v 1 (SEQ ID NO:1),спостерігалось зменшення реактивності IgE до 88% для SEQ ID NO:2, 67% для SEQ ID NO:3, 47% для SEQ ID NO:4 і 100% для SEQ ID NO:5 (Fig. 3). Крім цього, у дослідах з імунізацією мишей Balb/c алерген Bet v 1 wt та гіпоалергенний білок SEQ ID NO:5 виявилися здатними викликати lgGспецифічну імунну відповідь (Fig. 4). Зокрема, антитіла проти SEQ ID NO:5 були здатні розпізнавати копії SEQ ID NO:1 (Fig. 5), за умови, що заміна залишків Lys на позиціях 54, 115 та/або 123 не призводить до суттєвої зміни імуногенності білків, зокрема їхніх IgG -епітопів. На відміну від цього, антитіла із сироватки миші, імунізованої невідповідним антигеном, виявилися нездатними розпізнавати ані Bet v 1, ані SEQ ID NO:5. У перспективному плані винахід стосується імуногенно активного пептиду, відповідного до фрагменту Bet v 1, який містить від 15 до 35, оптимально від 15 до 20, амінокислотних залишків, і має принаймні одну із зазначених замін та/або видалень. У цьому контексті термін «імуногенно активний пептид» означає пептид, який здатний викликати імунну відповідь, незалежну від антитіл IgE. Згідно винаходу, варіанти замін та/або видалень можливо здобути шляхом мутагенезу із послідовності кДНК Bet v 1 (SEQ ID NO:6), використовуючи засоби і способи, відомі кожному практику. Послідовності кДНК, що кодують варіанти одинарних і потрійних замін SEQ ID NO:2-5 ідентифіковано у SEQ ID NO:7-10, відповідно. У перспективному плані винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, що кодує згаданий гіпоалергенний або похідний білок Bet v 1 і вектору експресії, що містить зазначену молекулу нуклеїнової кислоти, що функціонально приєднана до генетичних елементів, які контролюють експресію позначеного білку або пептиду в еукаріотичних чи прокаріотичних клітинах, таких як промотори транскрипції, енхансери, сигнальні або лідерні послідовності чи інші послідовності, що задіяні у регуляції транскрипції. Також можуть бути використані зразки векторів, що містять плазміди, віруси або фаги, чи будьякі інші вектори, які зазвичай використовуються у генетичній інженерії. 93894 6 Подальше використання винаходу стосується прокріотичної або еукаріотичної хазяйської к літини, що зазнала трансформації або трансфекції за допомогою зазначеного вектора. Прокаріотичні клітини, як Escherichia coli, або Bacillus subtilis, чи еукаріотичні клітини, як Saccharomyces cerevisiae, зазвичай використовуються з метою клонування вектора або експресії кДНК. Крім цього, згідно винаходу, гіпоалергенні варіанти можуть бути створені у вигляді fusion proteins. Згідно заявленому винаходу, завдяки зменшеній реактивності до антитіл IgE варіанти Bet v 1 можуть успішно використовуватися для виготовлення фармацевтичних композицій (наприклад, таблеток або капсул) з метою превентивного або терапевтичного лікування осіб із алергією на пилок Betula verrucosa. У перспективному плані винахід спрямовано на створення фармацевтичної композиції, що містить дієву кількість гіпоалергенного варіанту Bet v 1, за умови оптимального поєднання з іншими алергенами Betula verrucosa та/або з фармацевтично прийнятними засобами і наповнювачі У оптимальному варіанті винаходу фармацевтична композиція є формою вакцини, що використовується для профілактики або терапії алергенних хвороб, у тому числі бронхіальної астми, алергічних ринітів, алергічних дерматитів та алергічних коньюктивітів. Теорія та практика вакцинації відома будь якому практику [15, 16]. Наступні приклади ілюструють винахід. Якщо відсутні інші вказівки, то методики, використані у прикладах, описані у Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular cloning. A laboratory manual" Il ed. Vol. 1-2-3 CSH Lab Press 1989. Приклад 1. Сайт-специфічний мутагенез кДНК, що кодує алерген Bet v 1 Сайт-специфічний мутагенез кДНК, що кодуює алерген Bet v 1 SEQ ID NO:6, було здійснено шляхом клонування кДНК у прокаріотичному векторі (pBluescript, GenBank асc. п. Х52327) з подальшою ПЛР-ампліфікацією. Олігонуклеотиди, використані у якості праймерів у ПЛР (Таблиця), містили відповідні заміни основ. У кожному випадку мутагенезу було використано приєднання комплементарного олігонуклеотиду до відповідної ділянки ланцюгу ДНК [17]. Після ампліфікації незмінену оригінальну матрицю було вибірково послаблено шляхом ферментативного гідролізу за допомогою ферменту рестрикції Dpnl, після чого клітини Escherichia coli були трансформовані мутантними молекулами. Клони, отримані з однієї бактеріальної колонії були секвеновані за Sanger з метою визначення типових модифікацій основ та відсутності неспецифічних мутацій в кДНК. Таблиця. Послідовності олігонуклеотидів, що використовувались у якості праймерів під час сайт-специфічного мутагенезу. Мутовані основи виділено напівжирним шрифтом. 7 93894 Таблиця ОлігонукПослідовності леотиди Bet v 1 54 cct gga acc att gcg aag ate age ttt ccc Bet v 1 115 ggt tec ate ttg gcg ate aac aac aag tac с Bet v 1 123 aag tac cat acc gca gga gac cat gag Приклад 2. Отримання білку Bet v 1 та його похідних варіантів. Дикий (SEQ ID No 6) і мутантний (SEQ ID No 710) типи кДНК Bet v 1, фланковані послідовностями, кодуючими шість гістидинів, були клоновані та експресовані у Escherichia coli згідно до стандартних процедур [18, 19]. Клітини були зібрані шляхом центрифугування, ресуспендовані у 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCI буферного розчину, рН 8, та лізовані за допомогою ультразвуку. Рекомбінантні білки були відокремлені центрифугуванням. Кульки, що містять сукупність нерозчинних білків були ресуспендовані у 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris-HCI, 8 M сечовини (рН 8) (денатуруючий буфер) та розмішані протягом 60 хвилин. Солюбілізовані рекомбінантні білки були відокремлені від нерозчинних залишків шляхом центрифугування і очищені шляхом афінної хроматографії у денатуруючих умовах із застосуванням агарозних колонок, зв'язананих з хелатами іонів нікелю з нітрилотриоцтовою кислотою взаємодією з 6 гістидиновими залишками, конденсованими з алергеном Очищені білки втратили нативну структуру шляхом діалізу протягом 16 годин за температури 4°С у розчині 0.68% NaCI, 0.275% NaHCO3. Приклад 3. Характеристики сироватки хворих на алергію Було зібрано та далі поєднано сироватку у осіб із клінічним анамнезом сезонної алергії на пилок Betula verrucosa і RAST 4+ специфічною реактивністю на алергени B. verrucosa. Проби сироватки пацієнтів, не хворих на алергію, було використано у якості негативного контролю. Приклад 4. Аналіз реактивності варіантів Bet v 1 на антитіла IgE із проб сироватки у системі ELISA Однакові кількості алергену wt й мутантних варіантів (0.5 мкг) у 50 мМ карбонатно/гідрокарбонатному буфері, рН 9.6, були абсорбовані на лунках поліестерних планшетів для проби в системі ELISA шляхом витримки при 4°С протягом 16 годин. Лунки були промиті миючим розчином (60 мМ фосфатного буферу, рН 6.5, із вмістом 0.05% Tween-20). Аліквоти по 100 мкл серійних розчинів (у розчинюючому буфері) сироватки людини RAST 4+ були додані до кожної проби й витримані при 25°С протягом 2 годин. Після трьох промивань було додано коньюговану з пероксидазою сироватку проти людського IgE, після чого витримано при 25°C протягом 1.5 години. Після трьох промивань було проведено коло 8 риметричну реакцію шляхом додавання 100 мкл реагенту TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) і витримування протягом 15 хвилин при 25°С. Реакцію було зупинено шляхом додавання 100 мкл 1H HCI та зчитування проводили при 450 нм за допомогою мікорпланшетного спектрофотометра. Приклад 5. Проба інгібування ELISA. Інгібування варіантів Bet v 1 шляхом приєднання wt Bet v 1 до антитіл IgE із зразків сироватки Аліквоти по 1 мкг алергену wt у 50 мМ карбонатно/гідрокарбонатного буферу, рН 9.6, було абсорбовано на лунках полістирольних чашок для проби в системі ELISA шляхом витримки при 4°С протягом 16 годин. Лунки було промито промиваючим розчином (60 мМ фосфатного буферу, рН 6.5, що містить 0.05% Tween-20) і заблоковано розчинюючим буфером (25% конячої сироватки, 1 мМ ЕДТА, 0.05% Tween 20, 0.01% тіомерсал у 150 мМ фосфатного буферу, рН 7.4). Аліквоти по 100 мкл RAST 4+ проби сироватки людини, розведеної у співвідношенні 1:3 у розчиняючому буфері, були попередньо витримані при 25°C протягом 2 годин разом із серійними розчинами алергену wt і мутованого варіанту. Отриманий розчин було розміщено в лунках і витримано при 4°С протягом 16 годин. Після трьох промивань 0.06 M фосфатного буферу рН 6.5, Tween-20 0.05%, було додано сироватку проти людського IgE, коньюговану з пероксидазою, у розчині 1.1500 (у розчиняючому буфері) після чого витримано 25°С протягом 1.5 години. Після трьох промивань було проведено колориметричну реакцію шляхом додавання 100 мкл реагенту TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) і витримування протягом 15 хвилин при 25°С. Реакцію було зупинено шляхом додавання 100 мкл 1H HCI, після чого проведено спектрофотометричний аналіз при 450 нм. Процент інгібування було розраховано таким чином: 100х[(А-В)/А], де А - адсорбованість при 450 нм за відсутності інгібітору, а В - адсорбованість за присутності інгібітору. Приклад 6. Вестерн-блот-аналіз реактивності варіантів Bet v 1 на антитіла IgE з проби сироватки Рівні кількості алергену дикого типу і мутованих форм (1.5 мкг) були проаналізовані шляхом електрофорезу на поліакріламідному гелі, після чого проведено електроблотінг на нітроцелюлозній мембрані, як описано Towbin (20). Спершу мембрану було витримано протягом однієї години у TBST (TBS, 0.05% Tween-20), що містила 5% нежирного сухого молока (буфер насиченості), а напередодні витримано разом із пробою сироватки осіб, хворих на алергію до Betula verrucosa, із 4+ реактивністю, у розчині з концентрацією1:3 у TBST 2% нежирного сухого молока. Після витримки протягом однієї години мембрану було тричі промито за допомогою TBST. Антитіла, пов'язані з мембраною, контактували із коньюгованою з пероксидазою сироваткою проти людських IgE, й після кількох промивань були виявлені за допомогою хемілюмінесцентного детектора із застосуванням люміналу в якості субстрату 9 для пероксидази (ECL, Amersham). Приклад 7. Процедура імунізації мишей Balb/c Дві групи мишей Balb/c із п'яти особин жіночої статі (Charles River) зазнали підшкірної імунізації за допомогою 200 мкл емульсії, що містила 100 мкл повного адьюванту Фрейнда і 20 мкг антигену (SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:5) у 100 мкл фізіологічного розчину. З тижневим інтервалом було здійснено три допоміжні імунізації при цьому повні адьюванти були замінені неповними. У якості контролю, п'ятьом мишам було введено невідповідний антиген. Через сім днів після імунізації з хвоста було взято пробу крові, яку використали в ELISA з метою контролю вироблення антитіл проти кожного імуногенного агента. Також на мишах, імунізованих SEQ ID NO:5, була проаналізована здатність розпізнавати білок дикого типу. Приклад 8. Аналіз в системі ELISA lgGспецифічної відповіді в імунізованих мишей Ті ж кількості wt Bet v 1 і варіанту SEQ ID NO:5 (0.25 мкг) у 50 мМ карбонатно/гідрокарбонатного буферу, рН 9.6, були адсорбовані на лунках полістирольних планшетів для аналізу в системі ELISA шляхом витримки протягом 16 годин при 4°C. Лунки було промито промивним розчином (60 мМ фосфатного буферу, рН 6.5, що містить 0.05% Tween-20) і заблоковано розчинюючим буфером (25% конячої сироватки, 1 мМ EDTA, 0.05% Tween 20, 0.01% тіомерсал у 150 мМ фосфатного буферу, рН 7.4). Аліквоти по 100 мкл серійних розчинів ( у розчинюючому буфері) сироватки з кожної миші були розміщені в лунках і витримані протягом 2 годин при 25°C. Після трьох промивань коньюговану з пероксидазою сироватку проти мишачого IgG, було розчинено у концентрації 1:2000 у розчинюючому буфері та додано до лунок, після чого витримано протягом 1.5 години при 25°C. Після трьох промивань було проведено колориметричну реакцію шляхом додавання 100 мкл реагенту TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) і витримування протягом 15 хвилин при 25°С. Реакцію було зупинено шляхом додавання 100 мкл 1H HCI, а потім спектроскопією при 450 нм. Фігури 4 і 5 показують середню реактивність, отриману шляхом аналізу сироваток 5 мишей з кожної групи. Короткий опис фігур. Fig. 1: Аналіз системою ELISA реактивності антитіл IgE на алерген Bet v 1 та гіпоалергенні варіанти Bet v 1; Fig. 2: Інгібування зв'язування антитіл IgE з алергеном Bet v 1; Fig. 3: Аналіз Вестерн-блотінгом реактивності антитіл IgE на алерген Bet v 1 та похідні варіанти; Fig. 4: Відповідь мишиних антитіл IgG на відповідні імуногенні білки; Fig. 5: Відповідь антитіл IgG у мишей, імунізованих SEQ ID NO:5. Література 1) Mailing H.J., (1998) "Immunotherapy as an effective tool in allergy treatment". Allergy, 53:461. 93894 10 2) Toubi E., Kessel A., Blant A., Golan T.D., (1999) "Follow-up after systemic adverse reactions of immunotherapy". Allergy, 54(6): 617-620. 3) Akdis C.A., Blaser K., (2000) "Regulation of specific immune response by chemical and structural modifications of allergens". Int. Arch. Allergy lmmmunol., 121(4): 261-269. 4) Breiteneder H., Pettenburger K., Bito A et al. (1989). "The gene coding for the major birch pollen allergen Bet v 1, is highly homologous to a pea disease resistance response gene". EMBO J, 8: 1935-1938. 5) Valenta R., Duchene M., Pettenburger K., Sillaber C., Valent P., Bettelheim P., Breitenbach M., Rumpold H., Kraft D., Scheiner O. (1991). "Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuals." Science 253:557-560. 6) Batard T., Didierlaurent A., Chabre H., et al., (2005). "Characterization of wild-type recombinant Bet v 1a as a candidate vaccine against birch pollen allergy". Int Arch Allergy Immunol. 136: 239-249. 7) Swoboda I., Jilek A., Ferreira F., Engel E., Hoffmann-Sommergruber K., Scheiner O., Kraft D., Breiteneder H., Pittenauer E., Schmid E., Vicente O., Heberle-Bors E., Ahorn H., Breitenbach M. (1995). "Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning". JBC 270 (6): 26072613. 8) Swoboda I., Scheiner O., Heberle-Bors E., Vicente O., (1992). "cDNA cloning and characterisation of three genes in the Bet v 1 gene family that encode pathogenesis-related proteins". Plant Cell Environ. 18: 865-874. 9) Markovic-Housley Z., Degano M., Lamba D., von Roepenack-Lahaye E., Clemens S., Susani M., Ferreira F., Scheiner O., Breiteneder H. (2003). "Crystal structure of a hypoallergenic isoform of the major birch pollen allergen Bet v 1 and its likely biological function as a plant steroid carrier. J MoI Biol, 325: 123-133. 10) Niederberger V., Pauli G., Gronlund H. et al. (1998). "Recombinant birch pollen allergens (rBet v 1 and rBetv 2) contain most of the IgE epitopes present in birch, alder, hornbeam, hazel, and oak pollen: a quantitative IgE inhibition study with sera from different populations". J Allergy Clin Immunol. 102: 579-591. 11) Neudecker P, Lehmann K, Nerkamp J, Haase T, Wangorsch A, Fotisch K, Hoffmann S, Rosch P, Vieths S, Scheurer S. (2003). "Mutational epitope analysis of Pru av 1 and Арі g 1, the major allergens of cherry (Prunus avium) and celery (Apium graveolens): correlating IgE reactivity with threedimensional structure". Biochem J. 376(Pt 1):97-107. 12) Asero R. (1998). "Effects of birch pollenspecific immunotherapy on apple "allergy in birch pollen hypersensitive patients". Clin Exp Allergy. 28: 1368-1373. 13) Visco V, Dolecek C, Denepoux S, Le Mao J, Guret C, Rousset F, Guinnepain MT, Kraft D, Valenta R, Weyer A, Banchereau J, Lebecque S. (1996). "Human IgG monoclonal antibodies that modulate the binding of specific IgE to birch pollen Bet v 1". J. 11 Immunol. 157: 956-962. 14) Vrtala S, Ball T, Spitzauer S, Pandjaitan B, Suphioglu C, Knox B, Sperr WR, Valent P, Kraft D, Valenta R. (1998). "Immunization with purified natural and recombinant allergens induces mouse IgGI antibodies that recognize similar epitopes as human IgE and inhibit the human IgE-allergen interaction and allergen-induced basophil degranulation". J Immunol 160: 6137. 15) Paul, (1989), "Fundamental Immunology", Raven press, New York. 16) Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft. 17) Wang W., Malcolm BA. (2002). "Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions, and 93894 12 insertions, using QuikChange site-directed mutagenesis". Methods MoI Biol.; 182: 37-43. 18) Younghee Kim. (2004). "Cloning and Expression of a Lipase Gene from Rice (Oryza sativa cv. Dongjin)". Моl. Cells, 18 (1): 40-45. 19) Asturias JA, lbarrola I, Eseverri JL, Arilla MC, Gonzales-Rioja R, Martinez A. (2004). "PCR-based cloning and immunological characterization of Parietaria judaica pollen profilin". J Investig Allergol Clin Immunol, 14: 43-48. 20) Towbin J., Staehelin T., Gordon J., (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354. 13 93894 14 15 93894 16 17 93894 18 19 93894 20 21 93894 22 23 93894 24 25 93894 26 27 93894 28 29 93894 30 31 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 93894 Підписне 32 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601