Cd3-зв’язувальна молекула, здатна до зв’язування з cd3 людини і cd3, що не є людським

Реферат: Винахід стосується СD3-зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися з CD3 людини і CD3, що не є людським, фармацевтичної композиції, що містить СD3-зв'язувальні молекули та застосувань таких СD3-зв'язувальних молекул для виробництва лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення або аутоімунного або запального захворювання. UA 115122 C2 (12) UA 115122 C2 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки За даною заявкою вимагається пріоритет заявки на патент США № 61/488716 (поданої 21 травня 2011 р.; що знаходиться на розгляді) і заявки на патент США № 61/530353 (поданої 1 вересня 2011 р.; що знаходиться на розгляді), кожна з яких включена в даний опис як посилання в повному об'ємі. Посилання на список послідовностей Заявка включає один або більше списків послідовностей у відповідності з 1.821 і далі розділу 37 Зведення федеральних правил, які представлені як на паперовому носії, так і на машинозчитувальному носії, і ці документи на паперовому і машинозчитувальному носіях включені в даний опис як посилання в їх повному об'ємі. Передумови створення винаходу Галузь техніки Даний винахід стосується CD3-зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися з CD3 людини і CD3, що не є людським, і, зокрема, таких молекул, які мають перехресну реактивність з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванського макака). Даний винахід також стосується застосування таких антитіл і антигензв'язувальних фрагментів для лікування злоякісних новоутворень, аутоімунних і/або запальних захворювань і інших станів. Опис галузі техніки Імунна система організму служить захистом ряду станів, в тому числі, наприклад, пошкодження, інфекції і неоплазії, і її медіаторами є дві окремі, але взаємозв'язані системи: клітинна і гуморальна імунні системи. Загалом, медіаторами гуморальної системи є розчинні продукти (антитіла або імуноглобуліни), які мають здатність до об'єднання з продуктами, розпізнаваними цією системою як чужорідні для організму, і до їх нейтралізації. Навпаки, клітинна імунна система включає активацію певних клітин, названих Т-клітинами, які виконують ряд терапевтичних ролей. Т-клітини являють собою лімфоцити, які походять з вилочкової залози і циркулюють між тканинами, лімфатичною системою і серцево-судинною системою. Вони діють проти, або у відповідь на, ряд(и) чужорідних структур (антигенів). У багатьох випадках ці чужорідні антигени представлені на клітинах-хазяїнах в результаті неоплазії або інфекції. Хоч самі Т-клітини не секретують антитіла, вони звичайно потрібні для секреції антитіл другим класом лімфоцитів, В-клітинами (які походять з кісткового мозку). Важливо, що Т-клітини виявляють виняткову імунологічну специфічність, щоб бути здатними відрізнити один антиген від іншого. Не піддана впливу Т-клітина, наприклад, Т-клітина, яка ще не зіткнулася зі специфічним для неї антигеном, активується, коли вона уперше стикається з комплексом специфічний пептид:MHC на антигенпрезентуючій клітині. Антигенпрезентуючою клітиною може бути Вклітина, макрофаг або дендритна клітина. Коли не піддана впливу Т-клітина стикається з комплексом специфічний пептид:MHC на антигенпрезентуючій клітині, через Т-клітинний рецептор доставляється сигнал, який приводить до зміни конформації молекул зв'язаних з функціонуванням лімфоцитів - Т-клітин антигенів (LFA) і збільшує їх спорідненість до молекул міжклітинної адгезії (ICAM), присутніх на поверхні антигенпрезентуючої клітини. Сигнал, що породжується при взаємодії Т-клітини з антигенпрезентуючою клітиною, є необхідним, але недостатнім, для активації не підданої впливу Т-клітини. Необхідний другий костимулюючий сигнал. Не піддану впливу Т-клітину може активувати тільки антигенпрезентуюча клітина, що несе як комплекс специфічний пептид:MHC, так і костимулюючу молекулу на своїй поверхні. Розпізнавання антигену не підданою впливу Т-клітиною у відсутність костимуляції приводить до того, що Т-клітина стає анергічною. Необхідність двох сигналів для активації Т-клітин і В-клітин, так що вони досягають адаптивних імунних відповідей, може забезпечити механізм уникнення реакцій на аутоантигени, які можуть бути присутніми на антигенпрезентуючій клітині в місцях в системі, в яких вона може бути розпізнана Т-клітиною. Якщо контактування Т-клітини з антигенпрезентуючою клітиною приводить до породження лише одного з двох необхідних сигналів, Т-клітина не стає активованою, і адаптивна імунна відповідь не має місця. Ефективність, з якою у людей і інших ссавців розвивається імунологічна реакція на патогени і чужорідні речовини, залежить від двох характеристик: високої специфічності імунної реакції відносно розпізнавання антигену і імунологічної пам'яті, яка створює можливість для більш швидких і більш сильних відповідей після повторної активації за допомогою того ж антигену (Portoles, Р. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination, "Current Pharmaceutical Design 15: 3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR: CD3 Complex", Immunol Rev. 232(1): 7-21). Специфічність реакції Тклітин опосередковується розпізнаванням антигену (представленого на антигенпрезентуючих клітинах (APC)) молекулярним комплексом, що включає Т-клітинний рецептор ("TCR") і ліганд 1 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецептора клітинної поверхні, CD3. TCR являє собою ковалентно зв'язаний гетеродимер з α- і β-ланцюгів ("TCRαβ»). Ці ланцюги є мембранними поліпептидами класу I довжиною 259 (α) і 296 (β) амінокислот. Молекула CD3 являє собою комплекс, що містить γ-ланцюг CD3, δ-ланцюг CD3 і два ε-ланцюги CD3, зв'язаних у вигляді трьох димерів (εγ, εδ, ζζ) (Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, " Immunol Rev. 232(1): 7-21; Call, M.E. et al. (2007) "Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors, " Nat. Rev. Immunol. 7: 841-850; Weiss, А. (1993) "Т Cell Antigen Receptor Signal Transduction: А Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases, " Cell 73: 209-212). Комплекс TCR і CD3, нарівні з дзета-ланцюгом - ζ-ланцюгом CD3 (також відомим як дзеталанцюг Т-клітинного рецептора T3 або CD247), включає TCR-комплекс (van der Merwe, P.A. etc. (epub Dec. 3, 2010) "Mechanisms For Т Cell Receptor Triggering, " Nat. Rev. Immunol. 11: 47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, " Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140. Цей комплекс особливо важливий, оскільки він містить велике число (десять) імунорецепторних тирозинових активуючих мотивів (ITAM). У разі зрілих Т-клітин активація TCR/CD3 за допомогою чужорідних антигенних пептидів, зв'язаних з молекулами власного MHC, є першою стадією, необхідною для розмноження антигенспецифічних Т-клітин і їх диференціації в ефекторні Т-лімфоцити або Т-клітини пам'яті. Ці процеси включають фосфорилювання імунорецепторних тирозинових активуючих мотивів (ITAM) TCR-комплексу. Оскільки TCR-комплекс містить таке велике число ITAM (всього 10), і ці ITAM розташовані послідовно один за іншим (завдяки димеризації ланцюгів, що є складовими частинами), фосфорилювання відповідних залишків тирозину в результаті лігування TCR створює спарені місця приєднання білків, які містять домени, гомологічні ділянкам Src-білка 2 (SH2), таких як зв'язаний з ζ-ланцюгом білок з М.м. 70 кДа (ZAP-70), і тим самим ініціює підсилювальний каскад передачі сигналів, який приводить до активації Т-клітин і їх диференціації (Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, " Immunol Rev. 232(1): 7-21). Результат цих процесів регулюється інтенсивністю і якістю антигенного стимулу, а також природою супровідних сигналів, що передаються корецептором і костимулюючими поверхневими молекулами, або рецепторами цитокінів (Portoles, Р. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination, " Current Pharmaceutical Design 15: 32903300; Riha, Р. et al. (2010) "CD28 Co-Signaling In The Adaptive Immune Response, " Self/Nonself 1(3): 231-240). Хоч стимуляція TCR є необхідною умовою для активації Т-клітин, загальновизнано, що входження в контакт з костимулюючими молекулами, такими як CD28, необхідне для повної активації Т-клітин і їх диференціації (Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex, " Immunol Rev. 232(1): 7-21). Внаслідок фундаментальності CD3 в ініціації відповідей на антигени були запропоновані моноклональні антитіла проти цього рецептора, які здатні до блокування або принаймні модулювання імунного процесу, і, таким чином, як засоби для лікування запального і/або аутоімунного захворювання. Дійсно, антитіла проти CD3 були першим антитілом, дозволеним для лікування людей (St. "Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, " Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657). Антитіло проти CD3 (Janssen-Cilag, що продається як TM TM ORTHOCLONE OKT3 ) вводили для зменшення гострого відторгнення у пацієнтів з трансплантатами органів і як лікування лімфобластного лейкозу (Cosimi, A.B. et al. (1981) "Use Of Monoclonal Antibodies To T-Cell Subsets For Immunologic Monitoring And Treatment In Recipients Of Renal Allografts, " N. Engl. J. Med. 305: 308-314; Kung, Р. et al. (1979) Monoclonal antibodies defining distinctive human Т cell surface antigens, " Science 206: 347-349; Vigeral, Р. et al. (1986) "Prophylactic Use Of OKT3 Monoclonal Antibody In Cadaver Kidney Recipients. Utilization Of OKT3 As The Sole Immunosuppressive Agent, " Transplantation 41: 730-733; Midtvedt, K. et al. (2003) "Individualized Т Cell Monitored Administration Of ATG Versus OKT3 In Steroid-Resistant Kidney Graft Rejection, " Clin. Transplant. 17(l): 69-74; Gramatzki, M. et al. (1995) "Therapy With OKT3 Monoclonal Antibody In Refractory Т Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Induces Interleukin-2 Responsiveness, " Leukemia 9(3): 382-390; Herold, K.C. et al. (2002) "Anti-CD3 Monoclonal Antibody In New-Onset Type I Diabetes Mellitus, " N. Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Cole, M.S. et al. (1997) "Human IgG2 Variants Of Chimeric Anti-CD3 Are Nonmitogenic to Т cells, " J. Immunol. 159(7): 36133621; Cole, M.S. et al. (1999) "Hum29l, А Humanized Anti-CD3 Antibody, Is Immunosuppressive To Т Cells While Exhibiting Reduced Mitogenicity in vitro, " Transplantation 68: 563-571; патенти США №№ 6491916, 5585097 і 6706265). Однак лікування такими антитілами проти CD3 не було визнане в достатній мірі специфічним щоб уникнути побічних ефектів (Ludvigsson, J. (2009) "The Role of 2 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Immunomodulation Therapy in Autoimmune Diabetes, " J. Diabetes Sci. Technol. 3(2): 320-330). Багаторазове щоденне введення OKT3 приводить до сильної імуносупресії і забезпечує ефективне лікування відторгнення після трансплантації нирки. In vivo введення OKT3 приводить як до активації Т-клітин, так і до пригнічення імунних відповідей. Однак застосуванню OKT3 перешкоджав синдром реакції на першу токсичну дозу, який пов'язаний з подіями первинної активації Т-клітин і із забезпеченням викиду цитокінів, який має місце до імуносупресії Тклітинних реакцій. Описані в літературі побічні ефекти, які слідують за першою, а іноді другою ін'єкцією цього мишачого моноклонального антитіла, включають "грипоподібний" синдром, що складається з високої температури, ознобу, головного болю і шлунково-кишкових симптомів (блювоти і діареї), а у важких випадках відмічається набряк легень в межах часу лікування (Thistlethwaite, J.R. Jr. et al. (1988) "Complications and Monitoring of OKT3 Therapy, " Am. J. Kidney Dis. 11: 112-119). Цей синдром, як вважають, служить відображенням OKT3опосередковуваного перехресного зшивання комплексу TCR/CD3 на поверхні Т-клітин і результуючого викиду цитокінів (наприклад, фактора альфа некрозу пухлин (TNFα), інтерферону-γ, інтерлейкінів IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10 і гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (Masharani, U.B. et al. (2010) "Teplizumab Therapy For Type I Diabetes, " Expert Opin. Biol. Ther. 10(3): 459-465; Abramowicz, D. et al. (1989) "Release Of Tumor Necrosis Factor, Interleukin-2, And Gamma-Interferon In Serum After Injection Of OKT3 Monoclonal Antibody In Kidney Transplant Recipients, " Transplantation 47: 606-608; Ferran, С. et al. (1990) "Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody: Further Evidence For Transient In Vivo Т Cell Activation, " Eur. J. Immunol. 20: 509-515; Hirsch, R. et al. (12989) "Effects Of In Vivo Administration Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody On Т Cell Function In Mice. II. In Vivo Activation Of Т Cells, " J. Immunol. 142: 737-743)). Застосування антитіл проти CD3 описане в патентах США №№ 7883703, 7728114, 7635472, 7575923 і 7381903 і в публікаціях заявок на патенти США №№ 2010/0150918, 2010/0209437, 2010/0183554, 2010/0015142, 2008/0095766, 2007/0077246 і публікаціях РСТ-заявки № WO2008/119567. Особливим недоліком колишніх антитіл є їх специфічність відносно тільки CD3 людини. Цей недолік є значною перешкодою в розробці таких антитіл, як терапевтичні засоби для лікування захворювань у людини. Для отримання дозволу на збут будь-який новий лікарський засібкандидат повинен пройти ретельну перевірку. Цю перевірку можна поділити на преклінічну і клінічну фази. Тоді як клінічну перевірку, що додатково поділяється на загальновідомі клінічні фази I, II і III, виконують на пацієнтах, що є людьми, преклінічну перевірку виконують на тваринах. Метою преклінічної перевірки є підтвердження того, що лікарський засіб-кандидат має бажану активність і, найбільш важливе, є безпечним. Тільки у разі встановлення при преклінічній перевірці безпеки для тварин і можливої ефективності лікарського засобукандидата відповідним регулюючим органом буде дозволена клінічна перевірка на людях цього лікарського засобу-кандидата. Безпека лікарських засобів-кандидатів може бути перевірена на тваринах трьома наступними шляхами: (i) на релевантному виді, тобто виді, в якому лікарські засоби-кандидати можуть розпізнати ортологічні антигени, (ii) на трансгенній тварині, що містить антигени людини, і (iii) за допомогою використання замінника лікарського засобу-кандидата, який може зв'язуватися з ортологічними антигенами, присутніми у тварини. Недоліками трансгенних тварин є те, що ця технологія типово приурочена до гризунів. Однак гризуни і люди мають значні відмінності в фізіології, які можуть утруднювати екстраполяцію отриманих на гризунах даних, що стосуються безпеки, для прогнозу безпеки для людей. Недоліками замінника лікарського засобу-кандидата є відмінна хімічна сполука в порівнянні з фактичним лікарським засобом-кандидатом, і тваринами, що часто використовуються, є гризуни з недоліками, що обговорювалися вище. Отже, преклінічні дані, отримані на гризунах, мають обмежену прогнозуючу здатність, що стосується лікарського засобу-кандидата. Переважним підходом до перевірки безпеки є використання релевантного виду, переважно нижчого примату. Тепер недоліком CD3-зв'язувальних молекул, що підходять для терапевтичного впливу на людину, описаних в даній галузі техніки, є те, що релевантними видами є вищі примати, зокрема, яванські макаки. Відповідно, у високій мірі бажаним є антитіло проти CD3, здатне зв'язуватися як з CD3 людини, так і CD3 приматів. Такі антитіла описані в публікації заявки на патент США з № 20100150918 і в публікації РСТ-заявки з № WO2008/119567. Незважаючи на такі успіхи, зберігається потреба в антитілах проти CD3 людини і їх антигензв'язувальних фрагментах, які здатні перехресно реагувати з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванська макака). Даний винахід задовольняє цю потребу і потребу в поліпшених терапевтичних засобах від злоякісного новоутворення, аутоімунних і запальних захворювань. Короткий виклад суті винаходу 3 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується CD3-зв'язувальних молекул, здатних до зв'язування з CD3 людини і CD3, що не є людським, і, зокрема, таких молекул, які мають перехресну реактивність з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванська макака). Даний винахід також стосується застосувань таких антитіл і антигензв'язувальних фрагментів для лікування злоякісних новоутворень, аутоімунних і/або запальних захворювань і інших станів. Детально, даним винаходом забезпечується CD3-зв'язувальна молекула, що включає антигензв'язувальний фрагмент антитіла, причому антигензв'язувальний фрагмент включає CD3-специфічний VL-домен антитіла і CD3-специфічний VH-домен антитіла, причому CD3специфічний VL-домен і CD3-специфічний VH-домен утворюють антигензв'язувальний домен, здатний до імуноспецифічного зв'язування як з епітопом CD3 людини, так і з епітопом CD3 ссавця, що не є людиною, причому: (I) CD3-специфічний VL-домен вибирають з групи, що складається з VL-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 16), VL-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 18), VL-3 h-mab2 (SEQ ID NO: 20), VL-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 22), VL-5 h-mab2 (SEQ ID NO: 24), VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26), VL-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 28), VL-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 30), VL-9 h-mab2 (SEQ ID NO: 32) і VL-10 h-mab2 (SEQ ID NO: 34), а вказаний CD3-специфічний VH-домен вибирають з групи, що складається з VH-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 36), VH-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 38), VH-3 h-mab2 (SEQ ID NO: 40), VH-4 h-mab2 (SEQ ID NO: 42), VH-5 h-mab2 (SEQ ID NO: 44), VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46), VH-6L h-mab2 (SEQ ID NO: 54), VH-7 h-mab2 (SEQ ID NO: 48), VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50), VH-8L h-mab2 (SEQ ID NO: 55), VH-8 di-1 h-mab2 (SEQ ID NO: 56), VH-8 di-2 h-mab2 (SEQ ID NO: 57), VH-6M h-mab2 (SEQ ID NO: 72), VH-8M h-mab2 (SEQ ID NO: 74), VH-2k h-mab2 (SEQ ID NO: 87) і VH-5k h-mab2 (SEQ ID NO: 88); або (II) CD3-специфічний VL-домен вибирають з групи, що складається з VL-1 h-mab1 (SEQ ID NO: 10) і VL-2 h-mab1 (SEQ ID NO: 12), а CD3-специфічним VH-доменом є VH h-mab1 SEQ ID NO: 14). Даний винахід, зокрема, стосується варіанту здійснення описаної вище CD3-зв'язувальної молекули, в якому CD3-специфічним VL-доменом є VL-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 26). Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаної вище CD3-зв'язувальної молекули, в якому CD3-специфічним VH-доменом є VH-8 h-mab2 (SEQ ID NO: 50), VH-6 h-mab2 (SEQ ID NO: 46) або VH-2k h-mab2 (SEQ ID NO: 87). Даний винахід, зокрема, стосується варіанту здійснення описаної вище CD3-зв'язувальної молекули, в якому молекулою є антитіло і, зокрема, в якому в антитілі відсутня Fc-область, або воно включає Fc-область, яка: (А) зазнає нестачі ефекторної функції або має зменшену ефекторну функцію; або (В) піддана модифікуванню, яке ослабляє здатність Fc-ділянки антитіла до зв'язування з Fcрецептором; причому зменшення ефекторної функції і ослаблення зв'язувальної здатності має місце відносно такої Fc-ділянки дикого типу. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул, в якому молекулою є CD3-зв'язувальне діатіло, яке включає перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг, при цьому ланцюги ковалентно зв'язані один з одним, причому: I. перший поліпептидний ланцюг включає аміно-кінець і карбоксильний кінець і від N-кінця до С-кінця: (i) домен (А), що включає CD3-специфічний VL-домен; (ii) домен (В), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (VH2); і (iii) домен (С); причому домени (А) і (В) не асоціюються один з одним з утворенням епітопзв'язувального сайта; і (II) другий поліпептидний ланцюг включає аміно-кінець і карбоксильний кінець і від N-кінця до С-кінця: (i) домен (D), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (VL2); (ii) домен (Е), що включає CD3-специфічний VH-домен; і (iii) домен (F); причому домени (D) і (Е) не асоціюються один з одним з утворенням епітопзв'язувального сайта; і причому: (1) домени (А) і (Е) асоціюються з утворенням антигензв'язувального домену, який здатний до імуноспецифічного зв'язування як з CD3 людини, так і з CD3 ссавця, що не є людиною; 4 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2) домени (В) і (D) асоціюються з утворенням сайту зв'язування, який імуноспецифічно зв'язується з другим епітопом, при цьому другий епітоп відрізнений від епітопу CD3, з яким зв'язується антигензв'язувальний домен, утворений внаслідок асоціації доменів (А) і (Е); і (3) домени (С) і (F) ковалентно зв'язані разом. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вищеCD3-зв'язувальних молекул, в якому другим епітопом не є епітоп CD3. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул, в якому другим епітопом є епітоп CD3, який відрізнений від епітопу CD3, з яким зв'язується антигензв'язувальний домен, утворений внаслідок асоціації доменів (А) і (Е). Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або антитіл або діатіл, в якому така молекула є гуманізованою. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або антитіл або діатіл, в якому така молекула здатна до імуноспецифічного зв'язування з CD3 і флуоресцеїном. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або діатіл, в якому така молекула здатна до імуноспецифічного зв'язування як з (i) CD3, так і з (ii)(a) пухлиноспецифічним антигеном, або (ii)(b) антигеном клітинної поверхні, рецептором або лігандом рецептора клітинної поверхні. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або діатіл, в якому молекула або діатіло здатні до імуноспецифічного зв'язування з CD3 і пухлиноспецифічним антигеном, представленим на пухлинній клітині, причому пухлинною клітиною є клітина злоякісного новоутворення, що вибирається з групи, що складається з раку молочної залози, раку передміхурової залози, раку шлунка, раку легені, раку шлунка, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку підшлункової залози, раку печінки, раку яєчника, раку ротової порожнини, раку глотки, раку стравоходу, раку гортані, раку кістки, раку шкіри, меланоми, раку матки, раку яєчок, раку сечового міхура, раку нирки, раку головного мозку, гліобластоми, раку щитовидної залози, лімфоми, мієломи і лейкозу. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або діатіл, в якому молекула або діатіло здатні до імуноспецифічного зв'язування з CD3 і антигеном клітинної поверхні, рецептором або лігандом рецептора клітинної поверхні, причому антигеном клітинної поверхні, рецептором або лігандом рецептора клітинної поверхні є HER2/neu, B7-H3, CD20, PSMA, IGF-1R, Ep-CAM, або є молекула, яка залучена до асоціації Тклітини з В-клітиною, яка приводить до активації Т-клітини або В-клітини в ході адаптивної імунної відповіді. Даний винахід, крім того, стосується варіанту здійснення описаних вище CD3-зв'язувальних молекул або діатіл, в якому молекула або діатіло здатні до імуноспецифічного зв'язування з CD3 і з молекулою, яка залучена до асоціації Т-клітини з В-клітиною, і молекули, яка залучена до асоціації Т-клітини з В-клітиною, вибирають з групи, що складається з CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD32B, CD38, CD40, CD79a, CD79b, CD80, CD86, LFA-I, LFA-3 і CFA-I. Даний винахід, крім того, стосується фармацевтичної композиції, що включає будь-яку з описаних вище CD3-зв'язувальних молекул, антитіл або діатіл і фармацевтично прийнятний носій, ексципієнт або розріджувач. Даний винахід, крім того, стосується описаної вище фармацевтичної композиції для застосування для лікування злоякісного новоутворення або аутоімунного або запального захворювання. Даний винахід, крім того, стосується описаної вище фармацевтичної композиції для застосування для лікування аутоімунного або запального захворювання, що вибирається з групи, що складається з інсулінозалежного діабету типу I, ревматоїдного артриту, системного червоного вовчака, розсіяного склерозу, запального захворювання кишечника, злоякісної міастенії, глютенової хвороби, синдрому Гужеро-Шегрена, хвороби Грейвса, хвороби Крона, аутоімунного гепатиту, псоріазу, псоріатичного артриту, астми, алергічного риніту, ефектів внаслідок трансплантації органу або гомологічної хвороби (GVHD). Даний винахід, зокрема, стосується описаної вище фармацевтичної композиції для застосування для лікування інсулінозалежного діабету типу I. Короткий опис креслень На Фіг.1A-1B представлені результати ELISA із захопленням, у разі якого здатність антитіла проти CD3 mAB1 (Фіг. 1A) або химерного похідного антитіла mAB1 (ch-mAb1) (Фіг. 1B) оцінювали, використовуючи розчинний CD3 людини ("shCD3"). На Фіг. 2А-2B представлені результати ELISA із захопленням, у разі якого здатність антитіла проти CD3 mAB2 (Фіг. 2A) або химерного похідного антитіла mAB2 (ch-mAb2) (Фіг. 2B) 5 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оцінювали, використовуючи розчинний CD3 людини ("shCD3") або розчинний CD3 яванського макака ("scCD3"). На Фіг. 3 представлені результати аналізів для визначення ефекту варіацій пронумерованих згідно Kabat залишків 41-46 каркасних ділянок легкого ланцюга mAb2. На Фіг. 4 представлені результати аналізів для визначення ефекту варіацій пронумерованих згідно Kabat залишків 36, 38, 44 і 46 каркасних ділянок легкого ланцюга mAb2. На Фіг. 5 представлені результати аналізів для визначення ефекту варіацій пронумерованих згідно Kabat залишків 36, 38 і 46 каркасних ділянок легкого ланцюга mAb2. На Фіг. 6 представлені результати аналізів для визначення ефекту варіацій пронумерованих згідно з Kabat залишків 30, 49 і 93 каркасних ділянок важкого ланцюга mAb2. На Фіг. 7 представлені результати додаткових аналізів, проведених для визначення ефекту варіацій пронумерованих згідно з Kabat залишків 30, 49 і 93 каркасних ділянок важкого ланцюга mAb2. На Фіг. 8A-8B представлені результати аналізів, проведених для визначення здатності химерного і гуманізованого mAb2 до зв'язування з CD3, що не є людським. TM На Фіг. 9A-9D представлені записи сенсограм аналізів BIACORE , виконаних для визначення кінетики зв'язування ch-mAB2 або h-mAb2 з scCD3 або scCD3. На Фіг. 10A-10D представлені результати ELISA із захопленням, виконаних на діатілах TM DART , що містять здатний до зв'язування з CD3 перший епітопзв'язувальний сайт і другий епітопзв'язувальний сайт, який зв'язується з або Her2/neu, або CD19, або EGFR, або B7-H3. TM На Фіг. 11A-11B показана здатність B7H3 х CD3-біспецифічних діатіл DART до опосередкування перенаправленого знищення пухлинних клітин, що експресують B7H3. TM На Фіг. 12A-12E показана здатність A33 х CD3-біспецифічних діатіл DART до опосередкування перенаправленого знищення пухлинних клітин, що експресують A33. TM На Фіг. 13A і 13B представлені результати порівняння здатності діатіла DART CD19-hmAb2 і CD19 х CD3-біспецифічного діатіла до викликання перенаправленого, опосередкованого TM Т-клітинами знищення. Діатіло DART CD19-h-mAb2 виявляє специфічність відносно CD3 людини, а також CD3, що не є людським; CD19 х CD3-біспецифічне діатіло DART виявляє специфічність відносно тільки CD3 людини. Фіг. 13A: перенаправлене знищення клітин Вклітинної лімфоми людини Raji; Фіг. 13B: перенаправлене знищення клітин лімфоми з клітин тканини JeKo-1. TM На Фіг. 14A і 14B показане, що діатіло DART CD19-h-mAb2 за даним винаходом було здатне до опосередкування цитолізу в присутності Т-клітин-ефекторів або людини, або яванського макака. TM TM На Фіг. 15A і 15B показана здатність діатіла DART ERBITUX -h-mAb2 за даним TM TM винаходом або (ERBITUX -T-клітинний рецептор)-біспецифічного діатіла DART до + + опосередкування збільшення MFI CD69 після інкубації з CD4 або CD8 Т-клітинами. TM Контрольне діатіло ERBITUX -CD3 FN18 DARTTM (здатне до зв'язування з EGFR і з CD3 яванського макака) не спричиняло збільшення MFI CD69. На Фіг. 16A-16D представлені результати досліджень відносно зв'язування або діатіла TM TM TM TM TM DART ERBITUX -h-mAb2, діатіла DART ERBITUX -m-mAb2, або діатіла DART 4420-hmAb2 (в якості негативно контролю) або контрольного другого антитіла з клітинами A498 або A431 (Фіг. 16A і 16C, відповідно) і відносно опосередкування перенаправленого знищення таких клітин (Фіг. 16B і 16D, відповідно). Докладний опис даного винаходу Даний винахід стосується антитіл проти CD3 людини і їх антигензв'язувальних фрагментів і, зокрема, таких антитіл, які мають перехресну реактивність з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванського макака). Даний винахід також стосується застосувань таких антитіл і антигензв'язувальних фрагментів для лікування злоякісних новоутворень, аутоімунних і/або запальних захворювань і інших станів. I. Визначення Термін "CD3-зв'язувальна молекула", що використовується тут, означає молекулу, здатну до імуноспецифічного зв'язування як з CD3 людини, так і з CD3 ссавця, що не є людиною, завдяки принаймні одному сайту розпізнавання антигену (наприклад, антигензв'язувального домену антитіла), що знаходиться у варіабельній ділянці молекули. Як тут використовується, така здатність до імуноспецифічного зв'язування як з CD3 людини, так і з CD3 ссавця, що не є людиною, як передбачається, не означає здатність одного антигензв'язувального домену до одночасного зв'язування обох таких молекул CD3, а точніше означає, що такий антигензв'язувальний домен виявляє перехресну реактивність, так що він буде імуноспецифічно зв'язуватися з CD3 людини при інкубації в присутності CD3 людини і буде імуноспецифічно 6 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуватися з CD3 ссавця, що не є людиною при інкубації в присутності такого CD3 ссавця, що не є людиною. Термін "CD3-зв'язувальна молекула", що використовується тут, охоплює не тільки інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Fab, Fab', F(ab') 2 Fv), одиночний ланцюг (ScFv), їх мутанти, варіанти, що зустрічаються в природі, злиті білки, що включають частину білка з сайтом розпізнавання антигену необхідної специфічності, TM" гуманізовані антитіла, химерні антитіла, "BiTE®", молекули діатіл "DART і будь-яку іншу модифіковану конФігурацію молекули імуноглобуліну, яка включає сайт розпізнавання антигену необхідної специфічності. Термін "BiTE" (біспецифічні рекрутери Т-клітин) стосується одноланцюгової поліпептидної молекули, яка має два антигензв'язувальних домени, один з яких зв'язується з Т-клітинним антигеном, а другий з яких зв'язується з антигеном, присутнім на поверхні мішені (WO 05/061547; Baeuerle, Р. et al. (2008) "BiTE(: А New Class Of Antibodies That Recruit Т Cells, " Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of а Т Cell-Engaging Antibody Science 321: 974-977). TM" Термін діатіло "DART (перенаправляючий реагент з двома афінностями) стосується молекули імуноглобуліну, яка включає принаймні два поліпептидних ланцюги, які асоціюються (головним чином за допомогою ковалентного взаємозв'язку) з утворенням принаймні двох епітопзв'язувальних сайтів, які можуть розпізнавати один і той же епітоп або відмінні епітопи. TM Кожний з поліпептидних ланцюгів діатіла DART включає варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну і варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну, але ці ділянки не взаємодіють з утворенням епітопзв'язувального сайту. Точніше, варіабельна ділянка важкого TM ланцюга імуноглобуліну одного (наприклад, першого) з поліпептидних ланцюгів діатіла DART взаємодіє з варіабельною ділянкою легкого ланцюга імуноглобуліну відмінного (наприклад, TM другого) поліпептидного ланцюга DART з утворенням епітопзв'язувального сайту. Аналогічно, варіабельна ділянка легкого ланцюга імуноглобуліну одного (наприклад, першого) з TM поліпептидних ланцюгів діатіла DART взаємодіє з варіабельною ділянкою важкого ланцюга TM імуноглобуліну відмінного (наприклад, другого) поліпептидного ланцюга DART з утворенням TM епітопзв'язувального сайту. Діатіла DART можуть бути моноспецифічними, біспецифічними, триспецифічними і т.д., таким чином, маючи здатність до одночасного зв'язування одного, двох, трьох або більше різних епітопів (які можуть бути з однакових або різних антигенів). Діатіла TM DART можуть бути, крім того, одновалентними, двовалентними, тривалентними, чотиривалентними, п'ятивалентними, шестивалентними і т.д., таким чином, маючи здатність до одночасного зв'язування одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше молекул. Ці дві TM характеристики діатіл DART (тобто ступінь специфічності і валентності) можуть бути об'єднані, наприклад, з отримання біспецифічних антитіл (тобто здатних до зв'язування двох епітопів), які є чотиривалентними (тобто здатними до зв'язування чотирьох рядів епітопів), і т.д. TM Молекули діатіл DART описані в публікаціях РСТ-заявок №№ WO 2006/113665, WO 2008/157379 і WO 2010/080538. Біспецифічні (або триспецифічні, або поліспецифічні) молекули за даним винаходом будуть здатні до зв'язування як з CD3 людини, так і з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванського макака), а також з другим (або додатковим) і відмінним антигеном(ами) і епітопом(ами). Другим антигеном або епітопом переважно є пухлиноспецифічним антигеном, представленим на пухлинній клітині. Такі пухлинні клітини можуть бути із злоякісних новоутворень, наприклад, раку молочної залози, раку передміхурової залози, раку шлунка, раку легені, раку шлунка, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку підшлункової залози, раку печінки, раку яєчника, раку ротової порожнини, раку глотки, раку стравоходу, раку гортані, раку кістки, раку шкіри, меланоми, раку матки, раку яєчок, раку сечового міхура, раку нирки, раку головного мозку, гліобластоми, раку щитовидної залози, лімфоми, мієломи або лейкозу. Додатковими антигенами або епітопами переважно є пухлиноспецифічні антигени або епітопи на клітинній поверхні (такі як 17-1A, A33, основний антиген I ендодермального походження на еритроцитах дорослої людини, альфа-фетопротеїн, антиген оболонки РНК-вірусу пухлини, онкоембріональний антиген, специфічний для пухлини сечового міхура, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, специфічний для лімфоми Беркіта антиген-38.13, CA125, CD18, CD19, специфічний для В-клітинної лімфоми людини антиген-CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CO17-1A, CTA-1, CTLA-4, рецептор епідермального фактора росту, Ep-CAM, EphA2, антиген I на еритроцитах новонародженого, антиген фібросаркоми, гангліозид GD2, гангліозид GD3, гангліозид GM2, гангліозид GM3, GICA 19-9, gp IIIb/IIIa, gp72, HER1, HER-2/neu, HER3, HER4, специфічний для меланоми антиген з великою молекулярною масою, антиген HLA-DR, специфічний для лейкозу людини Т-клітинний антиген-Gp37, специфічний для карциноми легені людини антиген L20, специфічний для карциноми легені людини антиген L6, антиген у вигляді 7 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глобулярної частки молочного жиру людини, IgE, специфічний для карциноми KS 1/4 pan антиген, LEA, специфічний для аденокарциноми антиген F3, специфічний для злоякісних лімфоцитів людини антиген-АРО-1, специфічний для меланоми антиген gp75, зв'язаний з меланомою антиген p97, неоглікопротеїн, nuC242, специфічний для поліморфного епітелію антиген муцинового типу, специфічний для передміхурової залози антиген, специфічний для передміхурової залози мембранний антиген, специфічний для передміхурової залози кислий фосфат, антиген SK-1, TAG-72, Т-антиген, пухлиноспецифічний антиген CA125, пухлиноспецифічний антиген MUC1, пухлиноспецифічний трансплантаційний антиген клітинної поверхні, фактор росту судинного ендотелію, рецептор фактора росту судинного ендотелію і ανβ3). Альтернативно, такі додаткові антигени або епітопи можуть бути зв'язані з патогеном, таким як вірус гепатиту типу А, вірус гепатиту типу В, вірус гепатиту типу С, вірус грипу, вірус вітряної віспи, аденовірус, вірус простого герпесу типу I (HSV-I), вірус простого герпесу типу II (HSV-II), збудник чуми рогатої худоби, риновірус, ЕСНО-вірус, ротавірус, респіраторносинцитіальний вірус, папіломавірус, паповавірус, цитомегаловірус, ехіновірус, арбовірус, хантавірус, коксакі-вірус, вірус епідемічного паротиту, вірус кору, вірус краснухи, поліовірус, збудник натуральної віспи, вірус Епштейна-Барра, вірус імунодефіциту людини типу I (HIV-I), вірус імунодефіциту людини типу II (HIV-II), збудник вірусного менінгіту, збудник вірусного енцефаліту, збудник денге, збудник натуральної віспи; мікобактерії, рикетсії, мікоплазма, нейсерії, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi, Bacillus anthracis, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, збудник правця, збудник коклюшу, збудник холери, збудник чуми, збудник дифтерії, хламідії і легіонели; лейшманія, збудник кокцидіозу, трипаносома або збудник малярії; хламідії і рикетсії. Термін "моноклональне антитіло" стосується гомогенної сукупності антитіл, причому моноклональне антитіло складається з амінокислот (що зустрічаються в природі і що не зустрічаються в природі), які беруть участь у вибірковому зв'язуванні антигену. Моноклональні антитіла є у високому ступені специфічними, будучи направленими проти однієї ділянки детермінанти. Термін "моноклональне антитіло" охоплює не тільки інтактні моноклональні антитіла і повнорозмірні моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Fab, Fab', F(ab')2 Fv), одиночний ланцюг (ScFv), їх мутанти, злиті білки, що включають частину антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла і будь-яку іншу модифіковану конФігурацію молекули імуноглобуліну, яка включає сайт розпізнавання антигену необхідної специфічності і зі здатністю зв'язуватися з антигеном. Воно, як передбачається, не обмежується джерелом антитіла або способом, яким його отримують (наприклад, з використанням гібридоми, відбору фагів, експресії рекомбінантних молекул, трансгенних тварин і т.д.). Термін включає повні імуноглобуліни, а також фрагменти і т.д., описані вище при визначенні "антитіла". Термін "гуманізоване антитіло" стосується химерної молекули, звичайно приготованої, використовуючи методи з використанням рекомбінантних ДНК, що має антигензв'язувальний сайт, що походить з імуноглобуліну виду, що не є людиною, а інша структура молекули імуноглобуліну заснована на структурі і/або послідовності імуноглобуліну людини. Антигензв'язувальний сайт може включати або цілі варіабельні домени, вставлені в константні домени, або лише ділянки (CDR), що визначають комплементарність, пересаджену у відповідні каркасні ділянки варіабельних доменів. Антигензв'язувальні сайти можуть бути дикого типу або бути модифікованими внаслідок однієї або більше амінокислотних замін. Це виключає функціонування константної ділянки як імуногену у індивідуумів, що є людьми, але зберігається можливість імунної відповіді на чужорідну варіабельну ділянку (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224). Інший підхід зосереджений не тільки на забезпеченні константних ділянок, що походять від людини, але також на модифікації варіабельних ділянок, щоб надати їм нової форми, по можливості близької до людської форми. Відомо, що варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів містять три ділянки, що визначають комплементарність (CDR), які варіюють у відповідь на відповідні антигени і визначають здатність до зв'язування, фланкованих чотирма каркасними ділянками (FR), які є відносно консервативними у конкретного виду і які приблизно забезпечують каркас для CDR. При приготуванні надлюдських антитіл до конкретного антигену варіабельних ділянок можна "надати нової форми" або "піддати їх гуманізації" за допомогою пересадки CDR, що походять з надлюдського антитіла, в FR, присутні в антитілі людини, які модифікують. Про застосування цього підходу до різних антитіл було повідомлено в Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53: 851-856; Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy, " Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, " 8 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Science 239: 1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) "Humanization Of А Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, " Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, Н. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, " Human Antibodies Hybridoma 2: 124-134; Gorman, S.D. et al. (1991) "Reshaping А Therapeutic CD4 Antibody, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping А Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, " Bio/Technology 9: 266-271; Co, M.S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2869-2873; Carter, Р. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4285-4289; і Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, " J. Immunol. 148: 1149-1154. У деяких варіантах здійснення в гуманізованих антитілах збережені всі послідовності CDR (наприклад, в гуманізованому мишачому антитілі, яке містить всі шість CDR з мишачих антитіл). В інших варіантах здійснення гуманізовані антитіла містять один або більше CDR (один, два, три, чотири, п'ять, шість), які змінені відносно вихідного антитіла, які також називають одним або більше CDR, "що походять від" одного або більше CDR вихідного антитіла. Як описано нижче, переважні антитіла за даним винаходом містять специфічні ідентифіковані CDR. У даному винаході, однак, передбачаються еквівалентні антитіла, що містять змінені CDR. Кажуть, що антитіло або поліпептид, як тут використовується, "імуноспецифічно" або, що еквівалентно, "специфічно" зв'язується з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо воно реагує або асоціюються більш часто, швидше, з більшою тривалістю і/або з більшою афінністю з цим епітопом, ніж з альтернативними епітопами. Наприклад, антитілом, яке специфічно зв'язується з епітопом CD3, є антитіло, яке зв'язується з цим епітопом CD3 з більшою афінністю, авідністю, швидше і/або з більшою тривалістю, ніж воно зв'язується з іншими епітопами CD3 або епітопами, що не належать до CD3. Під інтерпретацією цього визначення також мається на увазі, що, наприклад, антитіло (або складова або епітоп), яке імуноспецифічно зв'язується з першою мішенню, може зв'язуватися або може не зв'язуватися специфічно або переважно з другою мішенню. По суті, "імуноспецифічне зв'язування" не має на увазі обов'язково (хоч воно може включати) "виняткове" зв'язування. Як правило, але необов'язково, посилання на зв'язування означає "імуноспецифічне" зв'язування. Використовуваний тут термін "імунологічно активний" у відношенні епітопу, що є або "що залишається імунологічно активним", стосується здатності антитіла (наприклад, антитіла проти CD3) до зв'язування з епітопом в різних умовах, наприклад, після зазнавання епітопом впливу відновлювальних і денатуруючих умов. Наприклад, якщо антитіло більше не здатне зв'язуватися з денатурованим епітопом, кажуть, що цей епітоп зробився імунологічно неактивним. Різні біологічні функції пов'язані з антитілами проти CD3 за даним винаходом, і такі антитіла можуть виявляти будь-яку або всі з наступних характерних властивостей, або можуть зазнавати нестачі одного, двох, трьох або більше таких характерних властивостей: здатність до специфічного зв'язування з CD3 людини, яка ендогенно представлена на поверхні нормальної Т-клітини людини; здатність до специфічного зв'язування з CD3 людини, яка ендогенно представлена на поверхні лейкозної Т-клітини людини; здатність до специфічного зв'язування з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванського макака), яка ендогенно представлена на поверхні нормальної Т-клітини ссавця, що не є людиною; здатність до специфічного зв'язування з CD3, що не є людським, який ендогенно представлений на поверхні нормальної надлюдської Т-клітини; здатність до специфічного зв'язування з CD3, що не є людським, який ендогенно представлений на поверхні надлюдської лейкозної Т-клітини; здатність нейтралізувати (тобто блокувати або перешкоджати зв'язуванню) утворення комплексу з CD3; здатність нейтралізувати утворення комплексу з TCR; здатність до модулювання (або антагоністично, або агоністично) передачі сигналу TCR-комплексом; здатність до зв'язування з Fc-рецептором; здатність до конкурентного інгібування переважного зв'язування відомого антитіла проти CD3 з CD3, включаючи здатність до переважного зв'язування з тим же епітопом CD3, з яким переважно зв'язується вихідне антитіло; здатність до зв'язування з частиною CD3, яка представлена на поверхні живої клітини in vitro або in vivo; здатність до зв'язування з частиною CD3, яка представлена на поверхні живої ракової клітини; здатність до доставки хіміотерапевтичного засобу в ракову Т-клітину; і/або здатність до доставки терапевтичного засобу, токсину або маркера, що виявляється, в Т-клітину. Як тут обговорювалося, поліпептиди (в тому числі антитіла) за даним винаходом можуть мати будь-яку одну або більше з цих характерних властивостей. 9 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовуваний тут термін "засіб (агент)» стосується біологічної, фармацевтичної або хімічної сполуки. Необмежувальні приклади включають просту або складну органічну або неорганічну молекулу, пептид, білок, олігонуклеотид, антитіло, похідне антитіла, фрагмент антитіла, похідне вітаміну, вуглевод, токсин або хіміотерапевтичну сполуку. Можна синтезувати різні сполуки, наприклад, невеликі молекули і олігомери (наприклад, олігопептиди і олігонуклеотиди), і синтетичні органічні сполуки, засновані на різних базових структурах. Крім того, різні природні джерела, такі як екстракти з рослин або тварин і т.п., можуть надати сполуки для відбору. Агенти, що використовуються в способах за даним винаходом, можуть бути відібрані випадково або відібрані раціонально або сконструйовані. Кажуть, що агент, як тут використовується, відібраний випадково, якщо агент вибраний без попереднього розгляду специфічних амінокислотних або інших хімічних складових, що беруть участь в асоціації молекули з її природним партнером(ами) по зв'язуванню або відомими антитілами, або без знання про них. Прикладом випадково відібраного агента є агент, який ідентифікований завдяки використанню хімічної бібліотеки або пептидної комбінаторної бібліотеки або її скринінгу. Кажуть, що агент, як тут використовується, відібраний раціонально або сконструйований, якщо агент вибраний на невипадковій основі, що враховує послідовність центра мішені і/або його конформацію в зв'язку з дією цього агента. Агент можна відібрати раціонально або сконструювати раціонально за допомогою використання пептидних послідовностей, які утворюють місця контактів в комплексі рецептор/ліганд і/або CD3/антитіло проти CD3. Наприклад, раціонально відібраним агентом у вигляді пептиду може бути пептид, амінокислотна послідовність якого ідентична епітопу, що з'являється в CD3, коли він виставлений на поверхні живої клітини в її природному оточенні. Такий агент буде зменшувати або блокувати асоціацію антитіла проти CD3 з CD3, або асоціацію CD3 з його природним лігандом, за бажанням, при зв'язуванні з антитілом проти CD3 або з його природним лігандом. Використовуваний тут термін "мічене", що стосується антитіла, як передбачається, охоплює пряме мічення антитіла за допомогою з'єднання (тобто фізичного зв'язку) речовини, що виявляється, такої як радіоактивний агент або флуорофор (наприклад, фікоеритрин (PE) або флуоресцеїн ізотіоціанат (також відомий як фторізотіоціанат або FITC) з антитілом, а також непряме мічення зонда або антитіла внаслідок реактивності з речовиною, що виявляється. Використовуваний тут термін "асоціація", що стосується антитіла, включає ковалентне або нековалентне приєднання або зв'язування агента (наприклад, хіміотерапевтичного засобу) до (c) антитіла(ом). Асоціацію антитіла з агентом (наприклад, хіміотерапевтичним засобом) можна здійснити за допомогою прямого зв'язування або непрямого зв'язування через приєднання до спільної платформи, так що антитіло визначає локалізацію агента в раковій клітині, з якою зв'язується антитіло, і причому антитіло і агент не зазнають значною мірою дисоціації при фізіологічних умовах, так що агент не направлений на ту ж ракову клітину, з якою зв'язується антитіло, або так що ефективність агента не зменшується. Термін "біологічний зразок" охоплює безліч типів зразків, які отримують від індивідуума і можуть використовуватися в дослідженні з метою діагностики або контролю. Визначення охоплює слину, кров і інші рідкі зразки біологічного походження, тверді зразки тканин, такі як біопсійний зразок, або культури тканин або клітини, що походять з них, і їх потомство, наприклад, клітини, отримані із зразка тканини, взятого у індивідуума з підозрою на наявність у нього раку, в переважних варіантах здійснення тканини яєчника, легені, передміхурової залози, підшлункової залози, ободової кишки і молочної залози. Визначення також включає зразки, якими маніпулювали після їх отримання будь-яким чином, наприклад, за допомогою обробки реагентами, солюбілізації або збагачення відносно певних компонентів, таких як білки або полінуклеотиди, або закладення в напівтверду або тверду матрицю з метою виготовлення зрізів. Термін "біологічний зразок" охоплює клінічний зразок, а також включає клітини в культурі, клітинні супернатанти, клітинні лізати, сироватку, плазму, біологічну рідину і зразки тканин. Термін "клітина-хазяїн" включає окрему клітину або культуру клітин, яка може бути або була реципієнтом вектора(ів) для включення полінуклеотидних вставок. Клітини-хазяїни включають потомство однієї клітини-хазяїна, і це потомство може необов'язково бути повністю ідентичним (по морфології або набору геномних ДНК) вихідній батьківській клітині внаслідок природної, випадкової або невипадкової мутації. Клітина-хазяїн включає клітини, трансфіковані in vivo полінуклеотидом(ами) за даним винаходом. Як тут використовується, "ефективна кількість" фармацевтичної композиції, в одному варіанті здійснення, є кількістю, достатньою для забезпечення благотворних або бажаних результатів, що включають, але без обмеження, клінічні результати, такі як зменшення розміру або швидкості росту пухлини, відстрочка або ослаблення запальної реакції, поліпшення якості життя тих, хто страждає захворюванням, зменшення дози інших лікарських засобів, необхідних 10 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для лікування такого захворювання, посилення ефекту іншого лікарського засобу, наприклад, за допомогою направленої доставки і/або інтерналізації, відстрочка прогресування захворювання і/або збільшення тривалості життя індивідуумів. Така ефективна кількість може вводитися при одному або більше введень. Застосовно до цілей цього винаходу, ефективною кількістю лікарського засобу, сполуки або фармацевтичної композиції є кількість, достатня для поліпшення клінічного стану, що спостерігається. У деяких варіантах здійснення ефективної кількості лікарського засобу, сплуки або фармацевтичної композиції можна досягнути або можна не досягнути разом з іншим лікарським засобом, сполукою або фармацевтичною композицією. Таким чином, "ефективна кількість" може розглядатися в рамках введення одного або більше додаткових засобів, і можна вважати, що один засіб призначений в ефективній кількості, якщо, разом з одним або більше інших засобів, можна досягнути або досягається бажаний результат. Хоч індивідуальні потреби варіюють, визначення оптимальних діапазонів ефективних кількостей кожної сполуки є частиною професійних знань даної галузі техніки. Типова доза, що вводиться пацієнту, звичайно складає від 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг ваги тіла пацієнта. Переважно, доза, що вводиться пацієнту, знаходиться між 0,0001 мг/кг і 20 мг/кг, 0,0001 мг/кг і 10 мг/кг, 0,0001 мг/кг і 5 мг/кг, 0,0001 і 2 мг/кг, 0,0001 і 1 мг/кг, 0,0001 мг/кг і 0,75 мг/кг, 0,0001 мг/кг і 0,5 мг/кг, 0,0001 мг/кг і 0.25 мг/кг, 0,0001 і 0,15 мг/кг, 0,0001 і 0,10 мг/кг, 0,001 і 0,5 мг/кг, 0,01 і 0,25 мг/кг або 0,01 і 0,10 мг/кг ваги тіла пацієнта. Дозу і частоту введення молекул за даним винаходом можна зменшити або змінити за допомогою збільшення поглинання і проникнення в тканині молекул за даним винаходом за допомогою модифікацій, таких як, наприклад, ліпідизація. Кажуть, що молекула нуклеїнової кислоти або агент, антитіло, композиція або клітина і т.д., як тут використовується, є "виділеною", якщо ця молекула нуклеїнової кислоти, агент, антитіло, композиція або клітина і т.д. відділена значною мірою від примісних молекул нуклеїнових кислот, антитіл, агентів, композицій або клітин і т.д., які присутні в природі в її первинному джерелі. Термін "індивідуум" стосується хребетної тварини, переважно ссавця. Ссавці включають, але без обмеження, людей, сільськогосподарських тварин, тварин для спортивних заходів, улюблених домашніх тварин, приматів, мишей і щурів. У найбільш переважному варіанті здійснення термін "індивідуум" означає людину. Терміни "поліпептид", "олігопептид", "пептид" і "білок" використовуються тут взаємозамінно для посилання на полімери з амінокислот будь-якої довжини. Полімер може бути нерозгалуженим або розгалуженим, він може включати модифіковані амінокислоти, і він може перериватися не амінокислотами. Терміни також охоплюють полімер з амінокислот, який був модифікований в природі або внаслідок втручання, наприклад, утворення дисульфідних зв'язків, глікозилювання, ліпідизації, ацетилювання, фосфорилювання або будь-якої іншої маніпуляції або модифікації, такої як кон'югація з компонентом-міткою. У це визначення також включені, наприклад, поліпептиди, що містять один або більше аналогів амінокислоти (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти і т.д.), а також інші модифікації, відомі в даній галузі техніки. Зрозуміло, що, оскільки поліпептиди за даним винаходом засновані на антитілі, можуть зустрічатися поліпептиди у вигляді одиночних ланцюгів або у вигляді сполучених ланцюгів. Використовуваний тут термін "значною мірою чистий" стосується матеріалу з принаймні 50 % ступенем чистоти (тобто без домішок), більш переважно з принаймні 90 % ступенем чистоти, більш переважно з принаймні 95 % ступенем чистоти, більш переважно з принаймні 98 % ступенем чистоти, більш переважно з принаймні 99 % ступенем чистоти і найбільш переважно зі ступенем чистоти, що перевищує 99 %. Використовуваний тут термін "токсин" стосується будь-якої речовини, яка забезпечує негативну реакцію в клітині. Наприклад, токсин, направлений на ракову клітину, буде чинити негативний, іноді шкідливий вплив на ракову клітину. Приклади токсинів включають, але без обмеження, таксан, майтансиноїд, ауристатин (наприклад, монометилауристатин (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), ауристатин Е (AE) і т.д.) (наприклад, ті, які описані в патентах США №№ 5208020, 5416064, 6333410, 6340701, 6372738, 6436931, 6441163, 6596757, 7276497, 7585857 або 7851432), каліхеаміцин, антрациклін (наприклад, доксорубіцин), аналог CC-1065, доцетаксел, катепсин В або Е, рицин, гелонін, Pseudomonas екзотоксин, дифтерійний токсин і РНКазу; мічені радіоактивними ізотопами антитіла (наприклад, кон'юговані з тіуксетаном або 90 13 177 186 188 211 212 213 225 мічені токсичним радіоізотоп (наприклад, Y; I, Lu, Re, Re, At, Bi, Bi, Ac і т.д.)). Використовуваний тут термін "лікування" означає спосіб отримання благотворного або бажаного результату, в тому числі і переважно благотворного або бажаного клінічного результату. Такі благотворні або бажані клінічні результати включають, але без обмеження, одне або більше з наступного: зменшення запалення або аутоімунної реакції, зменшення 11 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проліферації (або знищення) ракових клітин або інших нездорових клітин, зменшення метастазування ракових клітин, що виявляється при злоякісних новоутвореннях, скорочення розміру пухлини, ослаблення симптомів, що є наслідком захворювання, поліпшення якості життя тих, хто страждає цим захворюванням, зменшення дози інших лікарських засобів, необхідних для лікування цього захворювання, відстрочку прогресування захворювання і/або збільшення тривалості життя індивідуумів. II. Способи створення антитіл і поліпептидів за даним винаходом Способи створення моноклональних антитіл відомі в даній галузі техніки. Одним способом, який може використовуватися, є спосіб Kohler, G. і інш. ((1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, " Nature 256: 495-497) або його модифікація. Типово моноклональні антитіла створюють у видах, що не є людьми, таких як миші. Звичайно мишу або щура використовують для імунізації, але можуть також використовуватися інші тварини. Антитіла виробляються при імунізації мишей імуногенною кількістю клітин, клітинних екстрактів або білкових препаратів, які містять CD3 людини. Імуногеном може бути, але без обмеження, ембріональні клітини, лінії клітин, що культивуються, ракові клітини, нуклеїнові кислоти або тканина. В одному варіанті здійснення моноклональні антитіла, які зв'язуються з CD3, отримують, використовуючи клітини-хазяїни, які надекспресують CD3, як імуноген. Такі клітини включають, як приклад, а не обмеження, Т-клітину людини. Для контролювання утворення антитіл невеликий біологічний зразок (наприклад, кров) може бути отриманий від тварини і перевірений відносно титру антитіл проти імуногену. Селезінка і/або декілька великих лімфатичних вузлів можуть бути витягнуті і піддані дисоціації до окремих клітин. Якщо бажано, клітини селезінки можуть бути піддані скринінгу (після видалення неспецифічно приєднаних клітин) за допомогою внесення клітинної суспензії в планшет або ямку, покритий(у) антигеном. В-клітини, що експресують зв'язаний з мембраною імуноглобулін, специфічний у відношенні антигену, будуть зв'язуватися з планшетом і не змиваються разом з іншою частиною суспензії. Отримувані в результаті В-клітини, або всі дисоційовані клітини селезінки, можна потім злити з мієломними клітинами (наприклад, X63-Ag8.653 і клітинами з Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA). Поліетиленгліколь (ПЕГ) може використовуватися для злиття клітин селезінки або лімфоцитів з мієломними клітинами для утворення гібридоми. Потім гібридому піддають культивуванню в селективному середовищі (наприклад, що містить гіпоксантин, аміноптерин, тимідин середовища, по-іншому відомого як "середовище HAT"). Гібридоми, що виходять, потім висівають методом серійного розведення і досліджують відносно продукції антитіл, які специфічно зв'язуються з імуногеном, використовуючи, наприклад, FACS (клітинний сортинг із збудженням флуоресценції) або відбір з використанням імуногістохімічного дослідження (IHC). Відібрані гібридоми, що секретують моноклональні антитіла, потім культивують або in vitro (наприклад, в матрацах для культур тканин або половолоконних реакторах), або in vivo (наприклад, у вигляді асцитичних рідин у мишей). Як інша альтернатива методу злиття клітин, можуть використовуватися В-клітини, іморталізовані за допомогою вірусу Епштейна-Барра (EBV), для продукції моноклональних антитіл по винаходу, що розглядається. Гібридоми нарощують і субклонують, якщо бажано, і супернатанти досліджують відносно антиімуногенної активності за допомогою звичайних процедур дослідження (наприклад, FACS, IHC, радіоімуноаналізу, імуноферментного аналізу, флуоресцентного імуноаналізу і т.д.). У разі іншої альтернативи, моноклональне антитіло проти CD3 або будь-які інші еквівалентні антитіла можна секвенувати і продукувати рекомбінантно за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі техніки (наприклад, гуманізації, використання трансгенних мишей для продукування повністю людських антитіл, технологій фагового дисплея і т.д.). В одному варіанті здійснення моноклональне антитіло проти CD3 секвенують, а потім полінуклеотидну послідовність клонують у вектор для експресії або нарощування. Послідовність, що кодує антитіло, яке представляє інтерес, може зберігатися у векторі в клітині-хазяїні, і клітини-хазяїни можна потім наростити і заморозити для подальшого використання. Полінуклеотидна послідовність моноклонального антитіла проти CD3 і будь-яких інших еквівалентних антитіл може використовуватися для генетичної маніпуляції з метою створення "гуманізованого" антитіла, збільшення афінності або поліпшення інших характеристик антитіла. Загальний принцип при гуманізації антитіла включає в себе збереження основної послідовності антигензв'язувальної частини антитіла, при заміні надлюдської частини антитіла, що залишилася, послідовностями антитіла людини. Існують чотири загальних стадії з метою гуманізації моноклонального антитіла. Цими стадіями є: (1) визначення нуклеотидної і 12 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 передбачуваної амінокислотної послідовності варіабельних доменів легкого і важкого ланцюгів вихідного антитіла; (2) конструювання гуманізованого антитіла, тобто рішення, яку каркасну ділянку антитіла використати під час процесу гуманізації; (3) методології/методи фактичної гуманізації; і (4) трансфекція і експресія гуманізованого антитіла. Дивіться, наприклад, патенти США №№ 4816567, 5807715, 5866692 і 6331415. Був описаний ряд молекул "гуманізованих" антитіл, що включають антигензв'язувальний сайт, що походить з надлюдського імуноглобуліну, в тому числі химерні антитіла, що містять ті, що походять від гризунів або модифікованих, V-ділянки, що походять від гризунів і зв'язані з ними ділянки, що визначають комплементарність (CDR), злиті з константними доменами людини (дивіться, наприклад, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies, " Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of А Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To А Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, " J. Immunol. 138: 4534-4538, і Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, " Cancer Res. 47: 3577-3583). В інших посилальних документах описуються CDR, що походять від гризунів, пересаджені в людську підтримуючу каркасну ділянку (FR) до злиття з відповідним константним доменом антитіла людини (дивіться, наприклад, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy, " Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, " Science 239: 1534-1536; і Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In А Human Antibody With Those From А Mouse, " Nature 321: 522-525). В іншому посилальному документі описуються ті, що походять від гризунів CDR, що підтримуються рекомбінантно венованими каркасними ділянками, що походять від гризунів. Дивіться, наприклад, публікацію Європейського патенту № 519596. Ці "гуманізовані" молекули розроблені для мінімізації небажаної імунологічної реакції по відношенню до молекул антилюдських антитіл гризунів, яка обмежує тривалість і ефективність терапевтичних застосувань цих складових у реципієнтів, що є людьми. Інші способи гуманізації антитіл, які також можуть використовуватися, описані в Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of А Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, " Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 і в патентах США №№ 6180377, 6054297, 5997867 і 5866692. Даним винаходом також охоплюються одноланцюгові Fv-фрагменти ("scFv") антитіл за даним винаходом, такі як мишачий анти-CD3. Одноланцюгові Fv-фрагменти створюють за допомогою зв'язування варіабельних ділянок легкого і/або важкого ланцюга, використовуючи короткий пептид-лінкер. Bird і інш. ((1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins, " Science 242: 423-426) приводять приклад пептидів-лінкерів, які утворюють перемичку розміром приблизно 3,5 нм між карбоксильним кінцем однієї варіабельної ділянки і аміно-кінцем іншої варіабельної ділянки. Були розроблені і використовувалися лінкери з іншими послідовностями (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins, " Science 242: 423-426). Лінкери можуть бути в свою чергу модифіковані заради додаткових функцій, таких як приєднання лікарських засобів або приєднання до твердих підкладок. Одноланцюгові варіанти можна продукувати або рекомбінантно, або синтетично. Для синтетичного отримання scFv може використовуватися автоматичний синтезатор. Для рекомбінантної продукції scFv прийнятна плазміда, що містить полінуклеотид, який кодує scFv, може бути введена у прийнятну клітину-хазяїна, або еукаріотичну, таку як дріжджі, клітини рослин, комах або ссавців, або прокаріотичну, таку як Е. coli. Полінуклеотиди, що кодують scFv, що представляє інтерес, можна створити за допомогою звичайних маніпуляцій, таких як лігування полінуклеотидів. Результуючий scFv можна виділити, використовуючи стандартні методи очищення білків, відомі в даній галузі техніки. Даний винахід включає модифікації по відношенню до антитіл проти CD3 і їх зв'язувальних фрагментів. Модифікування поліпептидів є звичайною практичною діяльністю в даній галузі техніки, і його докладний опис тут не потрібний. Приклади модифікованих поліпептидів включають поліпептиди з консервативними замінами амінокислотних залишків, однієї або більше делецій або додатків амінокислот, які не приводять значною мірою до шкідливих змін функціональної активності, або використанням хімічних аналогів. Амінокислотні залишки, які можуть бути консервативно замінені один іншим, включають, але без обмеження: гліцин/аланін; валін/ізолейцин/лейцин; аспарагін/глютамін; аспарагінову кислоту/глютамінову кислоту; серин/треонін; лізин/аргінін і фенілаланін/тирозин. Ці поліпептиди також включають глікозильовані і неглікозильовані поліпептиди, а також поліпептиди з іншими посттрансляційними модифікаціями, такими як, наприклад, глікозилювання з використанням різних цукрів, ацетилювання і фосфорилювання. Переважно, якби амінокислотні заміни були 13 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 консервативними, тобто замінена амінокислота мала б хімічні властивості, схожі з такими вихідної амінокислоти. Такі консервативні заміни відомі в даній галузі техніки, і вище представлені приклади. Амінокислотні модифікації можуть тягнутися від зміни або модифікації однієї або більше амінокислот до повної реконструкції ділянки, такої як варіабельна ділянка. Зміни варіабельної ділянки можуть привести до зміни афінності і/або специфічності. Інші способи модифікування включають використання методів з'єднання, відомих в даній галузі техніки, що включають, але без обмеження, ферментативний спосіб, окислювальне заміщення і хелатування. Модифікації можуть використовуватися, наприклад, для приєднання міток у випадку імуноаналізу, наприклад, приєднання радіоактивних складових у випадку радіоімуноаналізу. Модифіковані поліпептиди створюють, використовуючи процедури, широко відомі в даній галузі техніки, і можуть бути піддані скринінгу, використовуючи стандартні дослідження, відомі в даній галузі техніки. Та обставина, що зміна одного амінокислотного залишку в CDR може привести до втрати функціонального зв'язування (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity, " Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6): 1979-1983), забезпечує спосіб методичної ідентифікації альтернативних функціональних послідовностей CDR. В одному переважному способі отримання таких варіантів CDR, полінуклеотид, що кодує CDR, мутують (наприклад, за допомогою неспецифічного мутагенезу або методу сайт-специфічного мутагенезу (наприклад, ампліфікації з використанням полімеразної ланцюгової реакції, використовуючи праймери, які кодують мутований локус)) для отримання CDR, що містить заміщений амінокислотний залишок. За допомогою порівняння ідентифікатора відповідного залишку у вихідній (функціональній) послідовності CDR з ідентифікатором варіанту послідовності CDR із заміною (не функціональній), можна визначити бальну оцінку цієї заміни BLOSUM62.iij. Система BLOSUM забезпечує матрицю амінокислотних замін, створену внаслідок аналізу бази даних, що стосуються послідовностей, заради надійних поєднань (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8): 1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks, " Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes, " Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective, " J. Mol. Biol. 219, 555-565). У цей час найбільш розвиненою базою даних BLOSUM є база даних BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). У таблиці 1 представлені бальні оцінки замін BLOSUM62.iij (чим вище бальна оцінка, тим більш консервативною є заміна, і, відповідно, більш ймовірно, що заміна не буде впливати на функцію). Якщо антигензв'язувальний фрагмент, що включає результуючий CDR, не зв'язується з CD3, то вважають, що бальна оцінка заміни BLOSUM62.iij є недостатньо консервативною, і вибирають і здійснюють нову можливу заміну, що має більш високу бальну оцінку. Таким чином, наприклад, якщо вихідним залишком був глютамат (Е), а нефункціональним заміняючим залишком був гістидин (Н), то бальна оцінка заміни BLOSUM62.iij буде дорівнювати 0, і переважними є більш консервативні заміни (наприклад, на аспартат, аспарагін, глютамін або лізин). 14 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 Таким чином, в даному винаході передбачається використання неспецифічного мутагенезу для ідентифікації поліпшених CDR. Альтернативно, для збільшення (або зменшення) афінності CDR може використовуватися технологія фагового дисплея. У разі цієї технології, званої дозріванням афінності, використовується мутагенез або "прогулянка по CDR", а при повторному відборі використовується антиген-мішень або його антигенний фрагмент для ідентифікації антитіл, що містять CDR, які зв'язуються з більшою (або меншою) афінністю з антигеном, ніж вихідне або батьківське антитіло (дивіться, наприклад, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149: 3903). Мутування цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів приводить до отримання напіввипадкового набору мутацій амінокислот. Можна створити бібліотеки, що складаються з сукупності варіантів клонів, кожний з яких відрізняється зміною однієї амінокислоти в одному CDR, і утримуючі варіанти, що відображають кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку CDR. Мутанти із збільшеною (або зменшеною) афінністю до антигену можна відібрати за допомогою приведення підданих імобілізації мутантів в контакт з міченим антигеном. Будьякий спосіб скринінгу, відомий в даній галузі техніки, може використовуватися для ідентифікації мутантних антитіл із збільшеною або зменшеною афінністю до антигену (наприклад, ELISA) (дивіться Wu et al. 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95: 6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155: 1994). Можна використати прогулянку по CDR, у разі якої випадковий характер надається легкому ланцюгу (дивитеся Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263: 551). Способи здійснення такого дозрівання афінності описані, наприклад, в Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of А Human Antibody, " MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas, " Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes, " J. Mol. Biol. 401(1): 84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of А Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5): 462-474; Gustchina, Е. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of А Monoclonal Fab Derived From А Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields А Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth, " Virology 393(1): 112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of А Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals А High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions, " J. Mol. Biol. 388(3): 541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development, " Methods Mol. Biol. 525: 353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification, " Mol. Immunol. 46(1): 135-144; і Barderas, R. et al. (2008) "Affinity 15 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 maturation of antibodies assisted by in silico modeling, " Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26): 90299034. В переважному варіанті здійснення багатоямкові планшети можна покрити вибраним антитілом проти CD3 (наприклад, 100 нг/ямку в карбонатному буфері при кімнатній температурі протягом 2 год.) і згодом інкубувати з розчинним CD3, що додається в розведенні 1/10, і інкубувати при кімнатній температурі протягом 16 год., або розвести до концентрації 50 нг/мл в PBS-T-BSA (0,05 мл додають в кожну ямку і інкубують протягом принаймні 2 год. при кімнатній температурі). Потім планшет промивають, і розведення рекомбінантних антитіл, починаючи з 0,5 мкг/мл в PBS-T-BSA, потім додають і інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі. Зв'язування рекомбінантних антитіл із захопленим антигеном потім вимірюють, використовуючи, наприклад, кон'югат антилюдський IgG-HRP і субстрат TMB. Після зупинки розвитку забарвлення, використовуючи розбавлену сірчану кислоту, планшет зчитують при 450 нм, і ідентифікують антитіла з більшою афінністю (дивіться, наприклад, патент США № 7351803). Даний винахід включає поліпептиди, що включають амінокислотну послідовність антитіл за даним винаходом. Поліпептиди за даним винаходом можна створити за допомогою процедур, відомих в даній галузі техніки. Поліпептиди можна отримати за допомогою протеолітичного або іншого розщеплення антитіл, за допомогою способів з використанням рекомбінантних молекул (тобто окремі або злиті поліпептиди), як описано вище, або за допомогою хімічного синтезу. За допомогою хімічного синтезу без великих зусиль створюють поліпептиди антитіл, особливо більш короткі поліпептиди аж до приблизно 50 амінокислот. Способи хімічного синтезу відомі в даній галузі техніки і є на ринку. Наприклад, поліпептид проти CD3 можна було отримати за допомогою автоматичного синтезатора поліпептидів, використовуючи твердофазний метод. Даний винахід також включає злиті білки, що включають один або більше фрагментів або райони з поліпептидів і антитіла за даним винаходом. В одному варіанті здійснення забезпечується злитий поліпептид, що включає принаймні 10 амінокислот, що слідують одна за одною, варіабельної ділянки легкого ланцюга і принаймні 10 амінокислот варіабельної ділянки важкого ланцюга. В іншому варіанті здійснення злитий поліпептид містить гетерологічну константну ділянку імуноглобуліну. В іншому варіанті здійснення злитий поліпептид містить варіабельну ділянку легкого ланцюга і варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що продукується депонованою з відкритим використанням гібридомою. Застосовно до цілей цього винаходу злитий білок, що є антитілом містить одного або більше поліпептидних доменів, які специфічно зв'язуються з CD3, і іншу амінокислотну послідовність, до якої він не приєднаний в природній молекулі, наприклад, гетерологічну послідовність або гомологічну послідовність з іншого району. Анти-CD3 поліпептиди і інші агоністи, антагоністи і модулятори CD3 можна створити за допомогою способів, відомих в даній галузі техніки, наприклад, синтетично або рекомбінантно. Один спосіб отримання таких молекул включає хімічний синтез поліпептиду з подальшою обробкою в умовах окислення, що підходять для отримання природної конформації, тобто відповідних сполук за допомогою дисульфідних зв'язків. Це можна здійснити, використовуючи методології, добре відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям (дивіться, наприклад, Kelley, R.F. et al. (1990) In: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M. et al. (1984) SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; дивіться також патенти США №№ 4105603, 3972859, 3842067 і 3862925). Поліпептиди за даним винаходом можна без великих зусиль приготувати, використовуючи твердофазний синтез пептидів (Merrifield, В. (1986) "Solid Phase Synthesis, " Science 232(4748): 341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, А. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, " Mini Rev. Med. Chem. 6(1): 3-10). Проте, в іншому варіанті повністю людські антитіла можна отримати за допомогою використання мишей, що є в продажу, які були створені для експресії білків - специфічних імуноглобулінів людини. Трансгенних тварин, яких створюють для виклику більш бажаної (наприклад, утворення повністю людських антитіл) або більш сильної імунної відповіді, можна також використати для вироблення гуманізованих або людських антитіл. Прикладами такої TM TM технології є XENOMOUSE (Abgenix, Inc., Fremont, CA) і HUMAB-MOUSE(R) і TC MOUSE (обидві від Medarex, Inc., Princeton, NJ). У варіанті антитіла можна створити рекомбінатно і експресувати, використовуючи будь-який спосіб, відомий в даній галузі техніки. Антитіла можна створити рекомбінантно за допомогою спочатку виділення вироблених антитіл з тварин-хазяїнів, отримання послідовності гену і використання послідовності гену для експресії антитіла рекомбінантно в клітинах-хазяїнах 16 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, клітинах CHO). Іншим способом, який може використовуватися, є експресія послідовності антитіла в рослинах (наприклад, тютюні) або трансгенному молоці. Прийнятні способи експресії антитіл рекомбінантно в рослинах або молоці були описані (дивитеся, наприклад, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, " Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice, " Int. Rev. Immunol 13: 65-93; і Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As А Method For The Production Of Recombinant Antibodies, " J. Immunol Methods 231: 147-157). Прийнятні способи отримання похідних антитіл, наприклад, гуманізованих, одноланцюгових і т.д., відомі в даній галузі техніки. В іншому варіанті антитіла можна створити рекомбінантно за допомогою технології фагового дисплея (дивіться, наприклад, патенти США №№ 5565332, 5580717, 5733743, 6265150, і Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology, " Annu. Rev. Immunol. 12: 433455). Антитіла або білок, що представляють інтерес, можна піддати секвенуванню за допомогою розщеплення білків по Едману, яке добре відоме кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям. Інформацію про пептиди, отриману від мас-спектрометрії або розщеплення білків по Едману, можна використати для конструювання зондів або праймерів, які використовуються для клонування білка, що представляє інтерес. Альтернативний спосіб клонування білка, що представляє інтерес, здійснюють з допомогою "пенінгу", використовуючи очищений CD3 або його частини для клітин, що експресують антитіло або білок, що представляють інтерес. Процедуру "пенінгу" можна провести за допомогою отримання бібліотеки кДНК на основі тканин або клітин, які експресують CD3, надекспресії кДНК у другому типі клітин і скринінгу трансфікованих клітин другого типу клітин відносно специфічного зв'язування з CD3. Докладні описи способів, що використовуються при клонуванні генів ссавців, що кодують білки клітинної поверхні, з допомогою "пенінгу", можна знайти в даній галузі техніки (дивіться, наприклад, Aruffo, А. et al. (1987) "Molecular Cloning Of А CD28 cDNA By А High-Efficiency COS Cell Expression System, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 8573-8577 і Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, " Endocrinol. 140: 5841-5854). кДНК, що кодують антитіла проти CD3 і інші пептидні агоністи, антагоністи і модулятори CD3 можна отримати за допомогою зворотного транскрибування мРНК з конкретного типу клітин у відповідності зі стандартними способами в даній галузі техніки. Зокрема, мРНК можна виділити, використовуючи різні літичні ферменти або хімічні розчини відповідно до процедур, викладених, наприклад, в MOLECULAR CLONING: А LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), або екстрагувати, використовуючи зв'язувальні нуклеїнові кислоти смоли, що є в продажу, слідуючи супровідним інструкціям, що надаються виробниками (наприклад, Qiagen, Invitrogen, Promega). Синтезовані кДНК можна потім вбудувати в експресійний вектор для продукції антитіла або білка, що представляє інтерес, в клітинах другого типу. Передбачається, що експресійний вектор повинен бути таким, що реплікується в клітинах-хазяїнах або у вигляді епісоми, або у вигляді інтегральної частини хромосомної ДНК. Відповідні експресійні вектори включають, але без обмеження, плазміди, вірусні вектори, в тому числі аденовіруси, аденоасоційовані віруси, ретровіруси, і косміди. Вектори, що містять полінуклеотиди, що представляють інтерес, можна ввести в клітинухазяїна за допомогою будь-якого з ряду відповідних способів, включаючи електропорацію, трансфекцію з використанням хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію, DEAEдекстрану або інших речовин; бомбардування мікрочастинками; ліпофекцію і інфікування (наприклад, якщо вектором є інфекційний агент, такий як вірус коров'ячої віспи). Вибір введення векторів або полінуклеотидів буде часто залежати від особливостей клітини-хазяїна. Будь-які клітини-хазяїни, здатні до надекспресії гетерологічних ДНК, можна використати з метою виділення генів, що кодують антитіло, поліпептид або білок, що представляють інтерес. Необмежувальні приклади прийнятних клітин ссавців-хазяїнів включають, але без обмеження, клітини COS, HeLa і CHO. Переважно, коли клітини-хазяїни експресують кДНК на рівні, який вище приблизно в 5 разів, більш переважно вище в 10 разів, навіть більш переважно вище в 20 разів такого відповідного ендогенного антитіла або білка, що представляє інтерес, у разі його наявності, в клітинах-хазяїнах. Скринінг клітин-хазяїнів відносно специфічного зв'язування з CD3 здійснюють з допомогою імуноаналізу або FACS. Клітину, що надекспресує антитіло або білок, що представляє інтерес, можна ідентифікувати. III. Способи скринінгу поліпептидів і моноклональних антитіл Декілька способів можуть використовуватися для скринінгу поліпептидів і моноклональних антитіл, які зв'язуються з CD3. Зрозуміло, що "зв'язування" стосується біологічно або імунологічно відповідного специфічного зв'язування і не стосується неспецифічного зв'язування, 17 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яке може мати місце, наприклад, при використанні імуноглобуліну в дуже високій концентрації проти неспецифічної мішені. В одному варіанті здійснення моноклональні антитіла піддають скринінгу на предмет зв'язування з CD3, використовуючи стандартні методи скринінгу. Таким чином можна отримати моноклональне антитіло проти CD3. Переважними гібридомами за даним винаходом є ті, які продукують антитіла mAb1 і mAb2, або їх химерні або гуманізовані похідні. Однак можна ідентифікувати додаткові моноклональні антитіла, які зв'язуються з CD3. З цією метою моноклональні антитіла піддають скринінгу на предмет їх диференціальної здатності до зв'язування з CD3 людини, а також CD3 примата. Будь-яку з декількох різних систем детектування можна використати для виявлення зв'язування антитіл зі зрізом тканини. Типово імуногістохімічне дослідження включає зв'язування першого антитіла з тканиною, а потім другого антитіла, направленого проти виду, від якого перше антитіло було отримане, і кон'югованого з маркером, що виявляється (наприклад, пероксидазою хрону (HRP) або діамінобензидином (DAB)). Одним альтернативним способом, який може використовуватися, є поліклональні антитіла, що є дзеркальним відображенням антигенної структури або polyMICATM (поліклональні Mirror Image Complementary Antibodies; The Binding Site Limited, Birmingham, UK; Mangham, D.C. et al. (1999) "А Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies TM (MICA)," Histopathology 35(2): 129-33). Спосіб PolyMICA може використовуватися для перевірки зв'язування перших антитіл (наприклад, антитіл проти CD3) з нормальною і раковою TM тканиною. У продажу є декілька видів наборів для детектування polyMICA : продукт № TM HK004.D є набором для детектування polyMICA , в якому використовується хромоген DAB; TM продукт № HK004.A є набором для детектування polyMICA , в якому використовується хромоген AEC. Альтернативно, перше антитіло можна безпосередньо помітити маркером, що виявляється. IV. Способи отримання характеристик антитіл проти CD3 Будь-який з декількох способів може використовуватися для отримання характеристик антитіл проти CD3. Одним способом є ідентифікація епітопу, з яким воно зв'язується. Картування епітопів є на ринку від різних постачальників, наприклад, Pepscan Systems (Lelystad, Нідерланди). Картування епітопів може використовуватися для визначення послідовності, з якою зв'язується антитіло проти CD3. Епітоп може бути лінійним епітопом, тобто що міститься в одному фрагменті амінокислот, або конформаційним епітопом, утворених внаслідок просторової взаємодії амінокислот, які можуть необов'язково міститися в одному фрагменті. Пептиди різних довжин (наприклад, переважно довжиною принаймні 4-6 амінокислот) можна виділити або синтезувати (наприклад, рекомбінантно) і використати для аналізів зв'язування з антитілом проти CD3. Епітоп, з яким зв'язується антитіло проти CD3, можна визначити при методичному скринінгу, використовуючи пептиди, що перекриваються, що походять з екстраклітинної послідовності і визначаючи зв'язування антитілом проти CD3. Проте, іншим способом, який може використовуватися для отримання характеристик антитіла проти CD3, є використання аналізів конкуренції з іншими антитілами, які, як відомо, зв'язуються з тим же антигеном, тобто CD3, для визначення того, чи зв'язуються антитіла проти CD3 з тим же епітопом, що і інші антитіла. Приклади антитіл, що є в продажу проти CD3 можуть бути в розпорядженні і можуть бути ідентифіковані, використовуючи аналізи зв'язування, викладені тут. Аналізи конкуренції добре відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, і такі процедури і пояснювальні дані деталізовані далі в розділі "Приклади". Антитіла проти CD3 можна, крім того, охарактеризувати відповідно до тканин, типу раку або типу пухлини, з яким вони зв'язуються. V. Переважні композиції за даним винаходом Даним винаходом охоплюються композиції, в тому числі фармацевтичні композиції, що включають антитіла проти CD3, поліпептиди, що походять з антитіл проти CD3, полінуклеотиди, що включають послідовність, що кодує антитіла проти CD3, і інші агенти, що описуються тут. У даному винаході, крім того, передбачаються кон'югати будь-якого пептидного агоніста, антагоніста або модулятора CD3 і додаткових хімічних структур, які реалізовують передбачувану функцію або функції конкретного пептидного агоніста, антагоніста або модулятор CD3. Ці кон'югати включають пептидний агоніст, антагоніст або модулятор CD3, ковалентно зв'язаний з макромолекулою, такою як будь-яка нерозчинна, матриця, що є твердою підкладкою, що використовується в способах діагностування, скринінгу або очищення, що обговорюються тут. Прийнятні матеріали матриці включають будь-яку речовину, яка є хімічно інертною, характеризується високим ступенем пористості і має велике число функціональних груп, здатних до утворення ковалентних зв'язків з пептидними лігандами. Приклади матеріалів матриць і способів приготування кон'югатів матриця-ліганд наведені в Dean et al. (Eds) 18 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 AFFINITY CHROMATOGRAPHY: А PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1985); Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", in Work et al. (eds) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 7, Part II, North-Holland (1979); Porath et al., "Biospecific Affinity Chromatography", in Neurath, Н. et al. (eds), THE PROTEINS, 3rd ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975); і Schott, H. AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Macel Dekker, Inc. NY (1984). Тут також забезпечуються кон'югати пептидного агоніста, антагоніста або модулятора CD3 і будь-якої репортерної складової, що використовується в діагностичних процедурах, що описуються тут. Агенти, поліпептиди і білки за даним винаходом, що являються пептидними агоністами, антагоністами або модуляторами CD3, в тому числі антитіла проти CD3, крім того, ідентифікують і характеризують згідно з будь-яким (одним або більше) з наступних критеріїв: (1) здатність до специфічного зв'язування з CD3 людини, яка ендогенно представлена на поверхні нормальної Т-клітини людини; (2) здатність до специфічного зв'язування з CD3 людини, яка ендогенно представлена на поверхні лейкозної Т-клітини людини; (3) здатність до специфічного зв'язування з CD3, що не є людським (наприклад, CD3 яванського макака), який ендогенно представлений на поверхні нормальної надлюдської Тклітини; (4) здатність до специфічного зв'язування з CD3, що не є людським, який ендогенно представлений на поверхні надлюдської лейкозної Т-клітини; (5) здатність нейтралізувати (тобто блокувати або перешкоджати зв'язуванню) утворення комплексу з CD3; здатність нейтралізувати утворення комплексу з TCR; (6) здатність до модулювання (або антагоністично, або агоністично) передачі сигналу TCRкомплексом; (7) здатність до зв'язування з Fc-рецептором; (8) здатність до конкурентного інгібування переважного зв'язування відомого антитіла проти CD3 з CD3, включаючи здатність до переважного зв'язування з тим же епітопом CD3, з яким переважно зв'язується вихідне антитіло; (9) здатність до зв'язування з частиною CD3, яка представлена на поверхні живої клітини in vitro або in vivo; здатністю до зв'язування з частиною CD3, яка представлена на поверхні живої ракової клітини; (10) здатність до доставки хіміотерапевтичного засобу в ракову Т-клітину; і/або (11) здатність до доставки терапевтичного засобу, токсину або маркера, що виявляється, в Т-клітину. Переважне антитіло за даним винаходом буде демонструвати диференціальне IHC фарбування пухлинної тканини по відношенню до нормальної, неракової тканини і буде, крім того, здатне до перевірки в моделях на приматі (і особливо яванському макаці) ефективності антитіла. Переважні антитіла за даним винаходом будуть, крім того, виявляти бажані рівні афінності і антигенної специфічності. Переважні антитіла за даним винаходом будуть, крім того, виявляти бажані рівні імуномодулюючої активності і інтерналізацї в клітини. У деяких варіантах здійснення антитілом за даним винаходом є антитіло, яке продукує гібридома mAb1 або гібридома mAb2, які відповідно експресують мишаче антитіло mAb1 і мишаче антитіло mAb2, або її потомство. Даним винаходом також охоплюються різні препарати антитіл, що продукуються цими гібридомами, і еквівалентні антитіла або поліпептидні фрагменти (наприклад, Fab, Fab', F(ab')2Fv, Fc і т.д.), химерні антитіла, одиночний ланцюг (ScFv), їх мутанти, злиті білки, що включають частину антитіла, гуманізовані антитіла і будь-яка інша модифікована конФігурація будь-якого з цих або еквівалентних антитіл, яка включає сайт розпізнавання антигену (CD3) необхідної специфічності. Даним винаходом також забезпечуються антитіла людини, що демонструють одну або більше з біологічних характеристик члена анти-CD3 сімейства. Еквівалентні антитіла анти-CD3 сімейства (в тому числі гуманізовані антитіла і антитіла людини), поліпептидні фрагменти і поліпептиди, що включають будь-який з цих фрагментів, ідентифікують і характеризують відповідно до будьякого (одного або більше) з описаних вище критеріїв. Відповідно, даним винаходом забезпечується будь-яке з наступного (або композиції, в тому числі фармацевтичні композиції, що включають будь-яке з наступного): (a) антитіло, продуковане клітиною-хазяїном або її потомством; (b) гуманізованаформа такого антитіла; (c) антитіло, що включає одну або більше варіабельних ділянок легкого ланцюга і/або важкого ланцюга такого антитіла; (d) химерне антитіло, що включає варіабельні ділянки, гомологічні варіабельним ділянкам важкого ланцюга і легкому ланцюгу такого антитіла або що походять від них, і константні ділянки, гомологічні константним ділянкам важкого ланцюга і легкому ланцюгу антитіла людини або що походять від них; (е) антитіло, що включає один або більше CDR 19 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (принаймні один, два, три, чотири, п'ять або шість) легкого ланцюга і/або важкого ланцюга такого антитіла; (f) антитіло, що включає важкий і/або легкий ланцюг такого антитіла; (g) антитіло людини, яке еквівалентне такому антитілу. Гуманізована форма антитіла може містити або може не містити CDR, ідентичні таким вихідного антитіла, або антитіла, продукованого клітиною-хазяїном, визначеного вище. Визначення CDR-ділянок повністю є частиною професійних знань даної галузі техніки. Інші варіанти здійснення включають антитіла, які містять принаймні два, три, чотири, п'ять або шість CDR, які значною мірою гомологічні принаймні двом, трьом, чотирьом, п'яти або шести CDR антитіла, що продукується депонованою гібридомою, визначеною тут, або походять з такого антитіла. Зрозуміло, що в контексті цього винаходу специфічність зв'язування і/або загальна активність, як правило, зберігається, хоч ступінь активності може відрізнятися в порівнянні з антитілом, що продукується депонованою гібридомою (може бути вище або нижче). Даним винаходом також забезпечуються способи створення будь-якого з цих антитіл. Способи створення антитіл відомі в даній галузі техніки і описані тут. Даним винаходом також забезпечуються поліпептиди, що включають амінокислотну послідовність антитіл за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення поліпептиди включають одну або більше варіабельних ділянок легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення поліпептиди включають один або більше CDR легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення поліпептиди включають три CDR легких ланцюги і/або важких ланцюги антитіла. У деяких варіантах здійснення поліпептид включає амінокислотну послідовність антитіла, яка містить будь-яке з наступного: принаймні 5 амінокислот послідовності вихідного антитіла, що слідують одна за одною, принаймні 8 амінокислот, що слідують одна за одною, принаймні приблизно 10 амінокислот, що слідують одна за одною, принаймні приблизно 15 амінокислот, що слідують одна за одною, принаймні приблизно 20 амінокислот, що слідують одна за одною, принаймні приблизно 25 амінокислот, що слідують одна за одною, принаймні приблизно 30 амінокислот, що слідують одна за одною, причому принаймні 3 з амінокислот походять з варіабельної ділянки антитіла. В одному варіанті здійснення варіабельна ділянка походять з легкого ланцюга вихідного антитіла. В іншому варіанті здійснення варіабельна ділянка походить з важкого ланцюга антитіла. В іншому варіанті здійснення 5 (або більше) амінокислот, що слідують одна за одною, походять з ділянки (CDR) антитіла, що визначає комплементарність. У деяких варіантах здійснення цього винаходу клітини за даним винаходом, які експресують CD3, частина CD3, антитіла проти CD3 і інші CD3-зв'язувальні поліпептиди за даним винаходом, вводять безпосередньо індивідууму для модулювання in vivo біологічної активності CD3. Переважними антитілами проти CD3 за даним винаходом є mAb1 і mAb2, і їх гуманізовані або химерні похідні і антигензв'язувальні фрагменти, які реагують з молекулою CD3 людини і яванського макака. Нижче представлені амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга мишачих антитіл mAb1 і mAb2 і полінуклеотидних послідовностей, що кодуюють їх. Послідовності CDR, що наводяться як приклад антитіл (mAb1 і mAb2), накреслюються напівжирно і підкреслені. А. Послідовності варіабельних ділянок мишачого моноклонального антитіла mAb1 Амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb1 (SEQ ID NO: 1): . Полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb1 (SEQ ID NO: 2): . 20 UA 115122 C2 Амінокислотна послідовність варіабельної моноклонального антитіла mAb1 (SEQ ID NO: 3): 5 ділянки важкого ланцюга мишачого . Полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb1 (SEQ ID NO: 4): . В. Послідовності варіабельних ділянок мишачого моноклонального антитіла mAb2 Амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb2 (SEQ ID NO: 5): 10 15 . Полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb2 (SEQ ID NO: 6): Амінокислотна послідовність варіабельної моноклонального антитіла mAb2 (SEQ ID NO: 7): ділянки важкого ланцюга . мишачого . Полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла mAb2 (SEQ ID NO: 8): 21 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 . Положення 40 важкого ланцюга є положенням якірного залишку зв'язувального пептиду з високою афінністю класу II MHC. Положення 44, 48, 54, 94, 99 і 108 важких ланцюгів є положеннями якірних залишків зв'язувального пептиду із середньої афінністю класу II MHC. Положення 69 легкого ланцюга є положенням якірного залишку зв'язувального пептиду з високою афінністю класу II MHC. Положення 59 легкого ланцюга є положенням якірного залишку зв'язувального пептиду із середньою афінністю класу II MHC. Ці залишки можна замінити, використовуючи стандартні методи молекулярної біології, на який-небудь залишок для ослаблення або виключення сайту розпізнавання MHC класу II. С. Антитіла проти CD3 зі сконструйованим Fc При звичайному функціонуванні імунної системи взаємодія комплексів антитіло-антиген з клітинами імунної системи приводить до широкого ряду реакцій, що розповсюджуються від ефекторних функцій, таких як антитілозалежна цитотоксичність, дегрануляція тучних клітин і фагоцитоз, до імуномодулюючих сигналів, таких як проліферація регулюючих лімфоцитів і секреція антитіл. Будь-яка з цих взаємодій ініціюється завдяки зв'язуванню Fc-домену антитіл або імунних комплексів зі спеціалізованими рецепторами клітинної поверхні гемопоетичних клітин. Різноманітність клітинних реакцій, що запускаються антитілами і імунними комплексами, є наслідком структурної гетерогенності трьох Fc-рецепторів: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) і FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) і FcγRIII (CD16) є активуючими (тобто що посилюють імунну систему) рецепторами; FcγRIIB (CD32B) є інгібуючим (тобто що заспокоює імунну систему) рецептором. Амінокислотна послідовність Fc-ділянки IgG1 представлена нижче (як SEQ ID NO: 9, з нумерацією у відповідності з Kabat і інш. (SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991), який включений в даний опис в словесній формі за допомогою посилання, нижче званого "Kabat EU"). Залишки 230-341 є CH2-ділянкою Fc. Залишки 342-447 є CH3-ділянкою Fc. . Оскільки CD3-специфічні антитіла, що не зв'язуються з Fc-рецептором (FcR) є в мінімальній мірі такими, що виснажують, було висунене припущення, що вони можуть змінювати сигнали від TCR так, що могла б індукуватися імунологічну толерантність (St. "Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, " Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657). Таким чином, така терапія має потенційне застосування при лікуванні аутоімунного захворювання і відторгнення внаслідок реакції "хазяїн проти трансплантата". CD3-специфічні антитіла, що не зв'язуються з FcR, як також було постульовано, індукують толерантність у вигляді ремісії цукрового діабету типу 1 (St. "Clair E.W. (2009) Novel Targeted Therapies for Autoimmunity, " Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657; Masharani, U.B. et al. (2010) "Teplizumab Therapy For Type 1 Diabetes, " Expert Opin. Biol. Ther. 10(3): 459-465). 22 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, даний винахід включає специфічно антитіла, що зв'язуються з CD3, які включають варіант Fc-ділянки, що мають Fc-ділянки, які модифіковані (наприклад, містять заміни, делеції, вставки в одній або більше частинах), щоб бути нездатними або менш здатними до зв'язування з Fc-рецептором (в порівнянні з антитілом, що містить ті ж CDR, але Fc-область дикого типу). В одному варіанті здійснення такі антитіла будуть нездатні до зв'язування з будь-яким Fcрецептором. Альтернативно, Fc-область антитіла буде модифікована так, щоб дати їй можливість зв'язуватися з такими Fc-рецепторами, як FcγRIIB, які є інгібіторними, але не з такими Fc-рецепторами, як FcγRIIA, FcγRIIIA або FcγRIIIB, які стимулюють активацію імунної системи. Переважно, здатності до зв'язування молекул за даним винаходом визначають за допомогою in vitro функціональних аналізів для визначення однієї або більше FcγRопосередковуваних функцій клітин-ефекторів. Афінності і здатності до зв'язування молекул, наприклад антитіл, за даним винаходом до (с) FcγR можна визначити, використовуючи in vitro аналізи (біохімічні або імунологічні аналізи), відомі в даній галузі техніки для визначення взаємодій антитіло-антиген або Fc-FcγR, тобто специфічного зв'язування антигену з антитілом або специфічного зв'язування Fc-ділянки з FcγR, відповідно, що включають, але без обмеження, аналіз ELISA, аналіз з використанням поверхневого плазмонного резонансу, аналіз методом імунопреципітації. В найбільш переважних варіантах здійснення молекули за даним винаходом мають здатності до зв'язування в in vivo моделях (таких як ті, які описані і розкриті тут), схожими з такими в in vitro аналізах. Однак даний винахід не виключає молекули за даним винаходом, які не демонструють бажаний фенотип в in vitro аналізах, але демонструють бажаний фенотип in vivo. У деяких варіантах здійснення молекули за даним винаходом, що включають варіант Fcділянки, включають принаймні одну модифікацію амінокислоти (наприклад, маючи 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше модифікацій амінокислот) в CH3-домені Fc-ділянки, який визначають як домен, розташований від амінокислоти 342 до амінокислоти 447. У інших варіантах здійснення молекули за даним винаходом, що включають варіант Fc-ділянки, включають принаймні одну модифікацію амінокислоти (наприклад, маючи 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше за модифікації амінокислот) в CH2-домені Fc-ділянки, який визначають як домен, розташований від амінокислоти 231 до амінокислоти 341. У деяких варіантах здійснення молекули за даним винаходом включають принаймні дві модифікації амінокислот (наприклад, маючи 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше за модифікації амінокислот), причому принаймні одна така модифікація знаходиться в CH3-області, і принаймні одна така модифікація знаходиться в CH2-області. Даним винаходом, крім того, охоплюється модифікація амінокислоти в шарнірній ділянки. В окремому варіанті здійснення даним винаходом охоплюється модифікація амінокислоти в CH1домені Fc-ділянки, який визначають як домен, розташований від амінокислоти 216 до амінокислоти 230. У особливо переважних варіантах здійснення даним винаходом охоплюються молекули, що включають варіант Fc-ділянки, причому вказаний варіант надає їм зменшену ADCC активність і/або зменшене зв'язування з FcγRIIA (CD32A) або володіє ними, як визначено, використовуючи способи, відомі кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцеві і наведені тут як приклад. Аналізи ADCC, що використовуються у відповідності зі способами за даним винаходом, можуть бути NK-залежними або макрофагозалежними. У особливо переважних варіантах здійснення даним винаходом охоплюються молекули, що включають варіант Fc-ділянки, причому вказаний варіант надає їм зменшену ADCC активність і/або зменшене зв'язування з FcγRIIIA (CD16A) або володіє ними, як визначено, використовуючи способи, відомі кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцеві і наведені тут як приклад. Аналізи ADCC, що використовуються у відповідності зі способами за даним винаходом, можуть бути NK-залежними або макрофагозалежними. Варіанти Fc за даним винаходом можуть бути в комбінації з іншими модифікаціями Fc, такі як ті, які описані в патентах США №№ 7632497, 7521542, 7425619, 7416727, 7371826, 7355008, 7335742, 7332581, 7183387, 7122637 і 6737056; в публікаціях РСТ-заявок з № WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269 і WO 04/063351; і в Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering therapeutic antibodies for improved function, " Biochem. Soc. Trans. 30(4): 487-490; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcgammaRIII and antibody-dependent cellular toxicity, " J. Biol. Chem. 26; 277(30): 26733-26740, і Shields, R.L. et al. (2001) "High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R, 23 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 " J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604). Даним винаходом охоплюється комбінація варіанту Fc за даним винаходом з іншими модифікаціями Fc для надання модифікованому антитілу адитивних, синергетичних або нових властивостей. У інших варіантах здійснення даним винаходом охоплюється використання будь-якого варіанту Fc, відомого в даній галузі техніки, такого як того, який описаний в Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, " Immunol. Lett. 82: 5765; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, " Biochem. Soc. Trans. 30: 487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement, " J. Immunol. 166: 2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R, " J. Biol. Chem. 276: 6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, А Chimeric Antibody With А Human IgG Fc, " J. Immunol. 164: 4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of А Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, " Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, " Eur. J. Immunol. 29: 2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, " Immunol. Lett. 54: 10104; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, " J. Immunol. 157: 4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With А Gamma 4 Variant Of Campath-1H, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, " Immunol. Lett. 44: 11117; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors, " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "А "Non-Activating Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo, " Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII, " Mol. Immunol. 29: 53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, " J. Immunol. 147: 26572662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, " Nature 332: 563-564; в патентах США №№ 5624821, 5885573, 6194551, 7276586 і 7317091; і публікаціях РСТ-заявок з № WO 00/42072 і WO 99/58572. У деяких варіантах здійснення антитіло даного винаходу включає варіант Fc-ділянки (в тому числі Fc, що походить з будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA і IgY) або класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2) або підкласу імуноглобулінів людини), причому вказаний варіант Fc-ділянки включає принаймні одну модифікацію амінокислоти в порівнянні з Fc-ділянкою дикого типу, який (варіант Fc-ділянки) демонструє зменшене або анульоване зв'язування з одним або більше лігандів-ефекторів, як визначено за допомогою стандартних досліджень, відомих в даній галузі техніки і описаних тут, відносно порівнюваної молекули, що включає Fc-область дикого типу. У деяких варіантах здійснення варіант Fc-домену антитіла за даним винаходом включає модифікацію амінокислоти (тобто вставку, заміну, делецію) в одному або більше з положень залишків 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 270, 297, 298, 299. У конкретному варіанті здійснення однієї або більше модифікації амінокислот, які зменшують або анулюють зв'язування з одним або більше лігандів-ефекторів, є заміна фенілаланіном або проліном в положенні 233; заміна аланіном в положенні 234; заміна аланіном або глютаміновою кислотою в положенні 235; заміна аланіном в положенні 236, заміна аланіном в положенні 237, заміна аргініном в положенні 238; заміна аланіном або глютаміновою кислотою в положенні 265; заміна аланіном або аспарагіном в положенні 270; заміна аланіном або глютаміном в положенні 297; заміна фенілаланіном, аспарагіном або проліном в положенні 298; заміна будь-якою амінокислотою, що відрізняється від серину або треоніну, в положенні 299 або комбінація з двох або більше вищеперелічених замін. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc-домен, що містить заміну аланіном в положенні 265 і в положенні 297; заміну аланіном в положенні 265 і глютаміном в положенні 297; заміну глютаміновою кислотою в положенні 265 і аланіном в положенні 297; або заміну глютаміновою кислотою в положенні 265 і глютаміном в положенні 297. У переважних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc-домен, що містить модифікацію (наприклад, заміну, вставку, делецію) в положенні 234 і в положенні 235 Fc-ділянки. У конкретному прикладі відповідно до цього варіанту здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc-домен, що містить заміну 24 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аланіном в положенні 234 і заміну глютаміновою кислотою в положенні 235. Проте, в більш переважному варіанті здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc, що містить заміну аланіном в положенні 234 і заміну аланіном в положенні 235. В інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає варіант Fc-ділянки, який демонструє зменшене або анульоване зв'язування з одним або більше лігандамиефекторами, як визначено за допомогою стандартних досліджень, відомих в даній галузі техніки і описаних тут, відносно порівнянної контрольної молекули. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом має Fc-область, що демонструє зменшене або анульоване зв'язування з одним або більше лігандами-ефекторами, яка включає фенілаланін або пролін в положенні 233; аланін в положенні 234; аланін або глютамінову кислоту в положенні 235; аланін в положенні 236, аланін в положенні 237, аргінін в положенні 238; аланін або глютамінову кислоту в положенні 265; аланін або аспарагін в положенні 270; аланін або глютамін в положенні 297; фенілаланін, аспарагін або пролін в положенні 298; будь-яку амінокислоту, що відрізняється від серину або треоніну, в положенні 299 або комбінацію з двох або більше вищеперелічених замін. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc-домен, що містить аланін в положенні 265 і в положенні 297; аланін в положенні 265 і глютамін в положенні 297; глютамінову кислоту в положенні 265 і аланін в положенні 297; або глютамінову кислоту в положенні 265 і глютамін в положенні 297. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc-домен, що містить аланін в положенні 234 і глютамінову кислоту в положенні 235. У переважних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом включає Fc, що містить аланін в положенні 234 і аланін в положенні 235. Антитіла за даним винаходом, які включають Fc-домен, що містить аланін в положеннях, що відповідають 234 і 235 згідно з системою нумерації по Kabat, відомі як "ala-ala" антитіла. У деяких варіантах здійснення використання "ala-ala" Fc-доменів і/або інших комбінацій з комбінацій амінокислот, що описуються тут (в тому числі комбінацій, що включають "ala-ala" Fcдомени), може анулювати зв'язування Fc-домену з всіма FcγR. Зв'язування Fc-домену з одним або більше за FcγR можна визначити за допомогою будь-якого способу, описаного тут і/або відомого в даній галузі техніки. У деяких варіантах здійснення одна або більше модифікацій амінокислот, які анулюють зв'язування з всіма FcγR або зменшують або анулюють зв'язування з одним або більше лігандами-ефекторами, включають комбінації модифікацій, перераховані тут, або комбінації модифікацій, перераховані тут, з будь-яким з тих, які можуть забезпечити зв'язування нульового порядку з будь-яким FcR (наприклад, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIIA), як визначено за допомогою способів, описаних тут або відомих кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцеві. Як це буде без великих зусиль зрозуміло кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцеві, такі антитіла за даним винаходом можуть знайти конкретне застосування при лікуванні аутоімунного захворювання, у разі якого антитіла проти CD3 і антигензв'язувальні фрагменти служать для модулювання функції імунної системи без пов'язаної реакції на першу дозу, характерної для антитіл проти імуноцитів. У деяких варіантах здійснення антитіла проти CD3 і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом, або їх антигензв'язувальні фрагменти, характеризуються зменшеним (наприклад, але без обмеження, менше 50 %, менше 40 %, менше 30 %, менше 20 %, менше 10 %, менше 5 % або менше 1 % в порівнянні зі зв'язуванням білком, що включає контрольний Fc-домен) або, більш переважно, зв'язуванням, що не виявляється, з одним або більше з будьяких FcγR (наприклад, FcγRI, FcγRII або FcγRIII) завдяки своєму Fc-домену, як визначено за допомогою звичайних в даній галузі техніки аналізів. Додатково або альтернативно, антитіла проти CD3 і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом, або їх антигензв'язувальні фрагменти, можуть характеризуватися зменшеним (наприклад, але без обмеження, менше 50 %, менше 40 %, менше 30 %, менше 20 %, менше 10 %, менше 5 % або менше 1 % в порівнянні зі зв'язуванням контрольним білком, що включає контрольний Fc-домен) або, більш переважно, зв'язуванням, що не виявляється, з будь-якими рецепторами комплементу, такими як C1q, як визначено в аналізах, що звичайно використовуються. В окремих варіантах здійснення антитіло є неглікозильованим. В інших варіантах здійснення в антитілі відсутній Fcдомен (наприклад, воно являє собою Fab-фрагмент, F(ab')2 або одноланцюгове антитіло). Таким чином, антитіла за даним винаходом є, зокрема, корисними, оскільки вони характеризуються зменшеною in vivo токсичністю, причиною якої є продукція лімфокінів або викид цитокінів, або її відсутністю. Способи визначення продукції лімфокінів і викиду цитокінів відомі і є звичайними в даній галузі техніки і включені в даний опис. Наприклад, викид цитокінів можна визначити за допомогою вимірювання секреції цитокінів, що включають, але без обмеження, інтерлейкін-2 (IL-2), інтерлейкін-4 (IL-4), інтерлейкін-6 (IL-16), PDGF, TGF-α, TGF-β, 25 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TNF-α, TNF-β, GCSF, GM-CSF, MCSF, IFN-α, IFN-β, TFN-γ, IGF-I, IGF-II. Наприклад, дивіться Isaacs et al., 2001, Rheumatology, 40: 724-738; Soubrane et al., 1993, Blood, 81(1): 15-19; всі з яких включені сюди за допомогою посилання в їх повному об'ємі. TM D. CD3-специфічні діатіла DART Як обговорювалося вище, даним винаходом, крім того, охоплюються біспецифічне, триспецифічне і поліспецифічне антитіла. Особливо переважний приклад таких антитіл включає TM" молекули діатіл "DART , які включають принаймні два поліпептидних ланцюги, які утворюють принаймні два епітопзв'язувальних сайти, принаймні один з яких специфічно зв'язується з CD3. TM" Молекули діатіл "DART , що наводяться як приклад, представлені в US20100174053, US20090060910, US20070004909, EP2158221, EP1868650, WO2010080538, WO2008157379 і WO2006113665. TM У переважних варіантах здійснення перший поліпептидний ланцюг діатіла DART включає: (i) домен (А), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (VL1), специфічну у відношенні епітопу (1); (ii) домен (В), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (VH2), специфічну у відношенні епітопу (2); і (iii) домен (С); TM другий поліпептидний ланцюг діатіла DART включає: (i) домен (D), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (VL2), специфічну у відношенні епітопу (2); (ii) домен (Е), що включає зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (VH1), специфічну у відношенні епітопу (1); і (iii) домен (F). TM Домени (А) і (В) діатіла DART не асоціюються один з одним з утворенням TM епітопзв'язувального сайту. Так само домени (D) і (Е) діатіла DART не асоціюються один з TM одним з утворенням епітопзв'язувального сайту. Точніше, домени (А) і (Е) діатіла DART асоціюються з утворенням зв'язувального сайту, який зв'язує епітоп (1); вказані домени (В) і (D) TM діатіла DART асоціюються з утворенням зв'язувального сайту, який зв'язує вказаний епітоп (2). Домени (С) і (F) ковалентно зв'язані разом. TM Кожний поліпептидний ланцюг молекули діатіла DART включає VL-домен і VH-домен, які ковалентно зв'язані, так що самозбірка доменів утруднена. Взаємодія двох з поліпептидних ланцюгів буде приводити до двох спарювань VL-VH, утворюючи два епітопзв'язувальних сайти, тобто двовалентну молекулу. Ні VH-домен, ні VL-домен не обмежується яким-небудь положенням в поліпептидному ланцюгу, тобто не обмежується аміно (N) кінцем або карбоксильним (С) кінцем, також домени не обмежуються їх положеннями відносно один одного, тобто VL-домен може бути N-кінцевим по відношенню до VH-домену і навпаки. Єдиним обмеженням є те, щоб в розпорядженні був комплементарний поліпептидний ланцюг для TM утворення функціональних діатіл DART . Якщо VL- і VH-домени походять з одного і того ж антитіла, два комплементарних поліпептидних ланцюги можуть бути ідентичними. Наприклад, якщо зв'язувальні домени походять з антитіла, специфічного у відношенні епітопу А (тобто зв'язувальний домен утворений, виходячи з взаємодії VL A-VHA), кожний поліпептид буде включати VHA і VLA. Гомодимеризація двох поліпептидних ланцюгів антитіла буде приводити до утворення двох зв'язувальних сайтів VLA-VHA, приводячи до двовалентного моноспецифічного антитіла. Якщо VL- і VH-домени походять з антитіл, специфічних у відношенні різних антигенів, TM для утворення функціонального біспецифічного діатіла DART потрібна взаємодія двох різних поліпептидних ланцюгів, тобто утворення гетеродимеру. Наприклад, у випадку біспецифічного TM діатіла DART , один поліпептидний ланцюг буде включати VLA і VLB; гомодимеризація вказаного ланцюга буде приводити до утворення двох зв'язувальних сайтів VL A-VHВ, або не зв'язувальних, або непередбачувано зв'язувальних. На відміну від цього, якщо два відмінних поліпептидних ланцюги можуть взаємодіяти, наприклад, в рекомбінантній експресійній системі, одній, що включає VLA і VHB, а інша, що включає VLB і VHA, будуть утворюватися два відмінних TM зв'язувальних сайти: VLA-VHA і VLB-VHB. У разі всіх пар поліпептидних ланцюгів діатіл DART існує імовірність неправильного поєднання або неправильного зв'язування двох ланцюгів, тобто взаємодія доменів VL-VL або VH-VH; однак легко здійснити очищення функціональних антитіл на основі імуноспецифічності правильно димеризованих зв'язувальних сайтів, використовуючи будь-який афінний спосіб, відомий в даній галузі техніки або наведений тут як приклад, наприклад, афінну хроматографію. TM Один або більше з поліпептидних ланцюгів діатіла DART може необов'язково включати Fc-домен або його частину (наприклад, СH2-домен або CH3-домен). Fc-домен або його частина може походити з будь-якого ізотипу або алотипу імуноглобулінів, в тому числі, але без 26 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмеження, IgA, IgD, IgG, IgE і IgM. У переважних варіантах здійснення Fc-домен (або його частина) походять з IgG. У конкретних варіантах здійснення ізотипом IgG є IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 або його алотип. В одному варіанті здійснення молекула діатіла включає Fc-домен, що включає CH2-домен і CH3-домен, які незалежно вибирають з будь-якого ізотипу імуноглобулінів (тобто Fc-домен, що включає CH2-домен, що походить з IgG, і CH3-домен, що походить з IgE, або CH2-домен, що походить з IgG1, і CH3-домен, що відбувається з IgG2, і т.д.). Fc-домен можна спроектувати в поліпептидному ланцюгу, що включає молекулу діатіла за даним винаходом, в будь-якому положенні відносно інших доменів або частин вказаного поліпептидного ланцюга (наприклад, Fc-домен, або його частина, може бути С-кінцевим по відношенню до обох VL- і VH-доменів поліпептидного ланцюга; може бути N-кінцевим по відношенню до обох VL- і VH-доменів; або може бути N-кінцевим по відношенню до одного домену і С-кінцевим по відношенню до іншого (тобто знаходитися між двома доменами поліпептидного ланцюга)). TM Fc-домени в поліпептидних ланцюгах молекул діатіл DART переважно зазнають TM димеризації, що приводить до утворення молекули DART , яка демонструє властивості, подібні до таких імуноглобулінів, наприклад, взаємодії Fc-Fcγ. Fc-вмісні діатіла можуть бути димерами, наприклад, що складаються з двох поліпептидних ланцюгів, кожен з яких включає VH-домен, VL-домен і Fc-домен. Димеризація вказаних поліпептидних ланцюгів приводить до утворення TM двовалентного діатіла DART , що включає Fc-домен, хоч і зі структурою, що відрізняється від TM такої не модифікованого двовалентного антитіла. Такі молекули діатіл DART будуть виявляти змінені фенотипи в порівнянні з імуноглобуліном дикого типу, наприклад, змінений напівперіод існування в сироватці, здатності до зв'язування і т.д. В інших варіантах здійснення молекули TM діатіл DART , що включають Fc-домени, можуть бути тетрамерами. Такі тетрамери включають два "більш важкі" поліпептидні ланцюги, тобто поліпептидний ланцюг, що включає VL, VH і Fcдомен, і два "більш легкі" поліпептидні ланцюги, тобто поліпептидний ланцюг, що включає VL і VH. Більш легкі і більш важкі ланцюги взаємодіють з утворенням мономеру, і вказані мономери взаємодіють завдяки їх неспареним Fc-доменам з утворенням Ig-подібної молекули. Таке IgTM подібне діатіло DART є чотиривалентним і може бути моноспецифічним, біспецифічним або тетраспецифічним. VI. Терапевтичні способи застосування антитіл проти CD3 за даним винаходом Антитіла проти CD3 за даним винаходом і їх антигензв'язувальні фрагменти, зокрема, застосовні для лікування злоякісних новоутворень, пов'язаних з експресією CD3, і для лікування аутоімунного захворювання і інших запальних порушень. Ці застосування можуть приводити до утворення комплексу між CD3 і антитілом, яке специфічно зв'язується з CD3. Приклади таких антитіл включають, але без обмеження, моноклональні антитіла проти CD3 mAb1 і mAb2 або, більш переважно, їх гуманізовані похідні. Утворення такого комплексу може відбуватися in vitro або in vivo. Без обмеження цією теорією, антитіло проти CD3 може зв'язуватися з CD3 завдяки екстраклітинному домену CD3 і може потім зазнавати інтерналізації в живу нормальну або ракову клітину. А. Лікування раку Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з CD3, присутнім на поверхні Т-клітин. Антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом можуть використовуватися у разі біспецифічної (або триспецифічної, або поліспецифічної) молекули, такої як молекула DART або BiTE, для перенаправлення Т-клітин на пухлинну клітину. Т-клітина може потім знищувати пухлинну клітину. Біспецифічні (або триспецифічні, або поліспецифічні) молекули за даним винаходом здатні до зв'язування як з CD3 людини, так і з CD3 ссавця, що не є людиною (наприклад, яванського макака), а також з другим (або додатковим) і відмінним антигеном(ами) і епітопом(ами). Другим антигеном або епітопом переважно є пухлиноспецифічний антиген, представлений на пухлинній клітині. Такі пухлинні клітини можуть бути із злоякісних новоутворень, наприклад, раку молочної залози, раку передміхурової залози, раку шлунка, раку легені, раку шлунка, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку підшлункової залози, раку печінки, раку яєчника, раку ротової порожнини, раку глотки, раку стравоходу, раку гортані, раку кістки, раку шкіри, меланоми, раку матки, раку яєчок, раку сечового міхура, раку нирки, раку головного мозку, гліобластоми, раку щитовидної залози, лімфоми, мієломи і лейкозу. Такими додатковими антигенами або епітопами переважно є пухлиноспецифічні антигени або епітопи на клітинній поверхні (такі як: 17-1A, A33, основний антиген I ендодермального походження на еритроцитах дорослої людини, альфа-фетопротеїн, антиген оболонки РНК-вірусу пухлини, онкоембріональний антиген, специфічний для пухлини сечового міхура, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, специфічний для лімфоми Беркіта антиген-38.13, CA125, CD18, CD19, специфічний для В-клітинної лімфоми людини антиген 27 UA 115122 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CO17-1A, CTA-1, CTLA-4, рецептор епідермального фактора росту, Ep-CAM, EphA2, антиген I на еритроцитах новонародженого, антиген фібросаркоми, гангліозид GD2, гангліозид GD3, гангліозид GM2, гангліозид GM3, GICA 19-9, gp IIIb/IIIa, gp72, HER1, HER-2/neu, HER3, HER4, специфічний для меланоми антиген з великою молекулярною масою, антиген HLA-DR, специфічний для лейкозу людини Т-клітинний антигенGp37, специфічний для карциноми легені людини антиген L20, специфічний для карциноми легені людини антиген L6, антиген у вигляді глобулярної частинки молочного жиру людини, IgE, специфічний для карциноми KS 1/4 pan антиген, LEA, специфічний для аденокарциноми антиген F3, специфічний для злоякісних лімфоцитів людини АРО-1, специфічний для меланоми антиген gp75, зв'язаний з меланомою антиген p97, неоглікопротеїн, nuC242, специфічний для поліморфного епітелію антиген муцинового типу, специфічний для передміхурової залози антиген, специфічний для передміхурової залози мембранний антиген, специфічний для передміхурової залози кислий фосфат, антиген SK-1, TAG-72, T-антиген, пухлиноспецифічний антиген CA125, пухлиноспецифічний антиген MUC1, пухлиноспецифічний трансплантаційний антиген клітинній поверхні, фактор росту судинного ендотелію, рецептор фактора росту судинного ендотелію і ανβ3). Альтернативно, такі додаткові антигени або епітопи можуть бути зв'язані з патогеном (таким як: вірус гепатиту типу А, вірус гепатиту типу В, вірус гепатиту типу С, вірус грипу, вірус вітряної віспи, аденовірус, вірус простого герпесу типу I (HSV-I), вірус простого герпесу типу II (HSV-II), збудник чуми рогатої худоби, риновірус, ЕСНО-вірус, ротавірус, респіраторно-синцитіальний вірус, папіломавірус, паповавірус, цитомегаловірус, ехіновірус, арбовірус, хантавірус, коксакі-вірус, вірус епідемічного паротиту, вірус кору, вірус краснухи, поліовірус, збудник натуральної віспи, вірус Епштейн-Барра, вірус імунодефіциту людини типу I (HIV-I), вірус імунодефіциту людини типу II (HIV-II), збудник вірусного менінгіту, збудник вірусного енцефаліту, збудник денге, збудник натуральної віспи; мікобактерії, рикетсії, мвкоплазма, нейсерії, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi, Bacillus anthracis, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, збудник правця, збудник коклюшу, збудник холери, збудник чуми, збудник дифтерії, хламідії і легіонели; лейшманія, збудник кокцидіозу, трипаносома або збудник малярії; хламідії і рикетсії). Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти за даним винаходом зв'язуються з CD3, присутнім на поверхні Т-клітин. Використовуючи звичайні способи, такі антитіла можна помітити флуоресцеїном, як описано вище. При інкубації таких мічених молекул в присутності TM біспецифічної молекули (такої як, наприклад, діатіло UDART , що містить епітопзв'язувальний домен, який зв'язується з Т-клітинним рецептором, і епітопзв'язувальний домен, який TM" зв'язується з флуоресцеїном ("TCR-UDART )), вони можуть зв'язуватися з міткою флуоресцеїном - і таким чином самі локалізуватися на поверхні клітин, які експресують CD3, і приводити до перенаправленого знищення таких клітин. У альтернативному варіанті здійснення CD19 може використовуватися як "другий" епітоп, TM так що біспецифічне антитіло, або більш переважно, діатіло DART , що розпізнає CD3 і CD19, використовується для знищення В-клітинної лімфоми завдяки входженню в контакт і зі специфічним для В-клітин антигеном (CD19), і з комплексом Т-клітинний рецептор/CD3 на Тклітинах-ефекторах. Як обговорювалося в Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, " Blood TM 2011 blood-2010-09-306449, CD3/CD19-специфічне діатіло DART використовувалося для знищення В-клітинної лімфоми завдяки входженню в контакт і зі специфічним для В-клітин антигеном (CD19), і з комплексом Т-клітинний рецептор/CD3 на Т-клітинах-ефекторах. Внаслідок порівняння бік об бік з одноланцюговим біспецифічном антитілом, що містить послідовності Fv антитіла проти CD19 і CD3, виявлено, що DART є більш ефективним в наведенні на лізис В-клітин. Збільшена активність при використанні CD19xCD3-біспецифічного DART відмічалася відносно всіх CD19-експресуючих В-клітин-мішеней при оцінці, використовуючи і заздалегідь піддані стимуляції PBMC людини, що покояться або очищені популяції Т-клітин-ефекторів. Внаслідок визначення характеристик CD19xTCR-біспецифічного DART виявлена ефективність, еквівалентна такій CD19xCD3 DART, що вказує на гнучкість структури DART в підтримці асоціацій Т-клітина/В-клітина у разі застосувань для перенаправленого, опосередковуваного Т-клітинами знищення. Важливо зазначити, що збільшений рівень знищення, опосередковуваного молекулами DART, не супроводжувався яким-небудь збільшенням активації неспецифічних Т-клітин або лізису негативних по CD19 клітин. Дослідження клітинних асоціацій вказують на те, що структура DART добре підходить для збереження міжклітинних контактів, безсумнівно, що роблять внесок у високий рівень знищення клітин-мішеней. Нарешті, здатність CD19xTCR-біспецифічного DART до інгібування В-клітинної лімфоми у мишей NOD/SCID при спільному введенні з PBMC людини, крім того, 28