Застосування пробіотичних бактерій як домішок до раціону вагітних жінок

Реферат: Винахід належить до застосування композицій, що містять пробіотичні бактерії, для введення жінці принаймні у третьому триместрі вагітності для запобігання діабету вагітних, нормалізації концентрації глюкози в плазмі та/або підвищення чутливості до інсуліну. UA 103750 C2 (12) UA 103750 C2 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Область техніки Даний винахід стосується застосування пробіотичних бактерій у виробництві харчової домішки або спеціального дієтичного харчового продукту для вагітних жінок для нормалізації концентрації глюкози плазми, підвищення чутливості до інсуліну та зниження ризику розвитку діабету вагітних. Відомий рівень техніки Вагітність пов'язана з метаболічним регулюванням, включаючи збільшення ваги та зміни у метаболізмі глюкози та ліпідів. Таке регуляторне налаштування відбувається з метою підтримання росту плода та, завдяки цьому, успішного закінчення вагітності, але воно може мати довгострокові ефекти на здоров'я матері та дитини, такі як порушення метаболізму глюкози. На ранніх стадіях вагітність характеризується нормальною толерантністю до глюкози та інсуліну. На пізніх стадіях вагітності, навпаки, спостерігається зростання концентрації інсуліну в сироватці, яке супроводжується розвитком інсулінорезистентності. Такі метаболічні пристосування підтримують ріст плода шляхом переспрямовування метаболічного палива до плода замість матері. Однак, у деяких вагітних жінок цей процес адаптації є надмірним та призводить до порушення толерантності до глюкози. Ці особи мають підвищений ризик розвитку цукрового діабету вагітних і згодом цукрового діабету дорослих типу 2. Порушення метаболізму глюкози у вагітної жінки може бути пов'язане з макросомією та ризиком порушеної толерантності до глюкози у її дитини. Ці стани можуть розвиватися навіть коли толерантність до глюкози у матері перебуває в межах нормальних стандартних діапазонів значень, тобто, не класифікується як цукровий діабет вагітних. Ця патофізіологія - рівні глюкози вище оптимальних - є більш поширеною, ніж можна було б очікувати, і є головною причиною серцево-судинної смертності в цій групі. Тому існує потреба в створенні способів зниження ризику розвитку діабету вагітних та порушень толерантності до глюкози у вагітних жінок. Суть винаходу Автори винаходу провели дослідження з метою вивчення впливу щоденних харчових домішок для перорального введення, що містять пробіотичні бактерії, на концентрацію глюкози в плазмі та чутливість до інсуліну під час та після вагітності у поєднанні з дієтичними консультаціями чи без них. Вони далі дослідили ефективність конкретних штамів пробіотичних бактерій та комбінацій штамів. В ході цих досліджень було несподівано знайдено, що концентрація глюкози в плазмі була нижче, а чутливість до інсуліну поліпшувалася у групі, що отримувала пробіотичні домішки, особливо, протягом третього триместру вагітності. Далі, було встановлено, що після пологів статура у жінок з групи, що отримувала пробіотичні домішки, відрізнялася порівняло з жінками з інших груп, зокрема тим, що жирові тканини тіла, які визначалися за товщиною складок шкіри та обхватом талії, були менше в групі, яка отримувала пробіотичні домішки. Відповідно, в першому аспекті даний винахід передбачає застосування пробіотичних бактерій у виробництві композиції для введення жінці принаймні у третьому триместрі вагітності для запобігання діабету вагітних. В другому аспекті, даний винахід передбачає застосування пробіотичних бактерій у виробництві композиції для введення жінці принаймні у третьому триместрі вагітності для нормалізації концентрації глюкози в плазмі. В третьому аспекті, даний винахід передбачає застосування пробіотичних бактерій у виробництві композиції для введення жінці принаймні у третьому триместрі вагітності для поліпшення чутливості до інсуліну. В четвертому аспекті, даний винахід передбачає застосування пробіотичних бактерій у виробництві композиції для введення жінці принаймні у третьому триместрі вагітності та протягом принаймні трьох місяців після пологів для зниження ризику розвитку метаболічного синдрому. Винахід стосується способу профілактики діабету вагітних шляхом введення композиції, що містить терапевтичну кількість пробіотичних бактерій, жінці, яка потребує цього, принаймні у третьому триместрі вагітності. Винахід далі стосується способу зниження концентрації глюкози в плазмі та/або поліпшення чутливості до інсуліну у жінки, яка потребує цього, принаймні в третьому триместрі вагітності, шляхом введення вагітній жінці композиції, що містить терапевтичну кількість пробіотичних бактерій. Винахід також стосується способу зниження ризику розвитку метаболічного синдрому, який включає введення жінці, яка потребує цього, принаймні у третьому триместрі вагітності, 1 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композиції, що містить терапевтичну кількість пробіотичних бактерій, та продовження введення таких пробіотичних бактерій протягом принаймні трьох місяців після пологів. Після пологів, композиція може вводитись дитині від матері шляхом годування груддю або пробіотичні бактерії можуть бути введені безпосередньо дитині у вигляді спеціальної композиції або у харчовій композиції, такій як композиція для дитячого харчування. Не бажаючи бути зв'язаними теорією, автори винаходу вважають, що глибокий вплив мікробіоти кишечнику на фізіологію, імунологію та метаболізм людини був виявлений нещодавно. Пробіотичні бактерії можуть викликати перетравлювання харчових полісахаридів, що не перетравлюються ферментами людини, збільшуючи, таким чином, як запас інтралюмінальної всмоктуваної глюкози, так і кількість коротколанцюгових жирних кислот місцевої дії, які забезпечують взаємодію між бактеріями та організмом людини. Присутність пробіотичних бактерій у мікробіоті кишечнику посилює всмоктування глюкози, як було продемонстровано на прикладі стерильних мишей, що призводить до швидкого росту мікроворсинок, а також до підвищеного накопичення глюкози у жировій тканині через пригнічення генної транскрипції Fiaf (факторів індукованих голодуванням адипоцитів), що призводить до збільшення активності ліпопротеїнліпази. Таким чином, стерильні миші мають значно меншу вагу, ніж миші, вирощені у звичайних умовах, навіть при більшому споживанні енергії. Є підстави вважати, що поліпшена утилізація глюкози та підвищене накопичення у жировій тканині були важливими протягом періодів обмежень у харчуванні, яких часто зазнавали предки людини. Однак, в сучасних умовах достатнього харчування, принаймні у розвинутих країнах, неперетравлювані бактерії можуть, очевидно, бути додатковою причиною ожиріння, що є запорукою інтересу до задіяння пробіотиків для зміни складу мікробіоти і, таким чином, метаболізму глюкози. Західні суспільства зіштовхнулися із значним збільшенням кількості серцево-судинних захворювань. Досить часто передумовою розвитку серцево-судинних захворювань є так званий метаболічний синдром, ознаками якого є ожиріння, великий обхват талії, зміни у метаболізмі глюкози та у чутливості до інсуліну, аномальні рівні ліпідів у крові. Крім того, оскільки глікемія у матерів також асоційована з макросомією та ризиком порушеної толерантності до глюкози у дитини, яка може розвинутися, навіть коли толерантність до глюкози матері находиться в межах нормального діапазону значень, тобто, не класифікується як цукровий діабет вагітних, цей курс лікування може також мати корисний ефект для дитини. Стислий опис креслення Фігура 1 показує еволюцію концентрації глюкози в плазмі у трьох дослідних групах протягом часу від першого триместру вагітності до кінця і через 12 місяців після пологів. Детальний опис винаходу В даному описі наведені далі терміни мають такі значення: - "немовля" означає дитину у віці до 12 місяців. - "пробіотик" означає препарати мікробних клітин або компонентів мікробних клітин, які мають корисний ефект на стан здоров'я або самопочуття людини (Salminen S., Ouwehand A., Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10, 107-10). Усі посилання на проценти стосуються масових процентів, якщо не вказано інше. Пробіотичні бактерії вводять вагітній жінці протягом принаймні третього триместру вагітності. Переважно, однак, їх вводять також протягом другого триместру, і ще переважно, протягом усього терміну вагітності. Введення пробіотиків може продовжуватися після пологів протягом перших чотирьох-шести місяців життя немовляти. Після пологів, введення може здійснюватися від матері шляхом годування груддю або безпосередньо дитині. Пробіотичні бактерії можуть бути будь-якими молочнокислими бактеріями або біфідобактеріями з підтвердженими пробіотичними характеристиками, особливо такими, що мають відношення до властивостей адгезії та конкурентного виключення. Придатні пробіотичні молочнокислі бактерії включають Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, що можуть бути одержані, inter alia, від Valio Oy (Фінляндія) під торговою маркою LGG, та Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724. Придатні пробіотичні штами біфідобактерій включають Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, що продається, inter alia, компанією Christian Hansen (Данія), під торговою маркою Вb12, Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, що продається фірмою Morinaga Milk Industry Co. Ltd. (Японія), під торговою маркою ВВ536, штам Bifidobacterium breve, що продається фірмою Danisco під торговою маркою Вb-03, штам Bifidobacterium breve, що продається фірмою Morinaga під торговою маркою M-16V, та штам Bifidobacterium breve, що продається фірмою Institut Rosell (Lallemand) під торговою маркою R0070. 2 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, застосовують суміш пробіотичних молочнокислих бактерій та біфідобактерій. Особливо переважною сумішшю є рівні кількості Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 та Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446. 5 12 Прийнятна добова доза пробіотичних бактерій складає від 10 до 10 колонієутворювальних 7 11 одиниць (КУО, cfu), переважно, від 10 до 10 КУО. Пробіотичні бактерії можуть бути введені як вагітній жінці до пологів, так і матері після пологів як харчова домішка, наприклад, у формі таблеток, капсул, пастилок, жувальної гумки або рідини. Харчова домішка може додатково включати захисні гідроколоїди (такі як камеді, білки, модифіковані крохмалі), зв'язуючі, плівкоутворючі, інкапсулюючі агенти/матеріали, матеріали для утворення мембрани/оболонки, матричні сполуки, покриття, емульгатори, поверхнево-активні агенти, солюбілізувальні агенти (масла, жири, воски, лецитини і т.д.), адсорбенти, носії, наповнювачі, допоміжні сполуки, диспергувальні агенти, змочувальні агенти, технологічні домішки (розчинники), агенти плинності, агенти маскування смаку, обважнювачі, желетвірні агенти, гелеутворювачі, антиоксиданти та антимікробні засоби. Харчова домішка може також містити звичайні фармацевтичні домішки та ад'юванти, ексципієнти та розріджувачі, включаючи, без обмеження, воду, желатин будь-якого походження, рослинні смоли, лігнінсульфонат, тальк, цукри, крохмаль, гуміарабік, рослинні олії, поліалкіленгліколі, смакові агенти, консерванти, стабілізатори, емульгатори, буфери, лубриканти барвні речовини, змочувальні агенти, наповнювачі і тощо. В усіх випадках, такі додаткові компоненти слід вибирати з урахуванням їх придатності для потенційного реципієнта. Альтернативно, пробіотичні бактерії можуть бути введені вагітним жінкам у формі терапевтичної харчової композиції. Композиція може бути повноцінною поживною сполукою. Композиція з повним набором живильних речовин для введення вагітним жінкам відповідно до винаходу може включати джерело білка. Може бути використаний будь-який придатний дієтичний білок, наприклад, тваринні білки (такі як молочні білки, білки м'яса та яєчні білки), рослинні білки (такі як соєвий білок, пшеничний білок, рисовий білок та гороховий білок), суміші вільних амінокислот або їх комбінації. Особливо переважними є молочні білки, такі як казеин, молочна сироватка, та соєві білки. Композиція може також містити джерело вуглеводів та джерело жиру. Якщо рецептура включає джерело жиру на додаток до DHA, то джерело жиру переважно забезпечує від 5 % до 40 % енергії рецептури; наприклад, від 20 % до 30 % енергії. Придатний профіль жирів може бути одержаний шляхом застосування суміші олії каноли, кукурудзяної олії та соняшникової олії з високим вмістом олеїнової кислоти. До рецептури може бути додане джерело вуглеводів. Воно, переважно, забезпечує від 40 % до 80 % енергії рецептури. Може бути використаний будь-який придатний вуглевод, наприклад, сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, суха кукурудзяна патока, мальтодекстрини та їх суміші. Якщо бажано, може бути додана також харчова клітковина. Харчова клітковина проходить через тонкий кишечник, не гідролізуючись ферментами, і виконує функцію природного наповнювача та проносного засобу. Харчова клітковина може бути розчинною чи нерозчинною, і звичайно переважною є суміш цих двох типів. Придатні джерела харчової клітковини включають сою, горох, овес, пектин, гуарову смолу, гуміарабік, фруктоолігосахариди, галактоолігосахариди, сіаліл-лактозу та олігосахариди тваринного молока. Переважною сумішшю клітковини є суміш галактоолігосахаридів з коротколанцюговими фруктоолігосахаридами. Переважно, якщо клітковина є присутньою, то вміст клітковини складає від 2 до 40 г/л рецептури у готовому для споживання вигляді, ще переважніше, від 4 до 10 г/л. Рецептура може також містити мінеральні речовини та мікроелементи, такі як залишкові елементи та вітаміни згідно з рекомендаціями урядових установ, таких як USRDA. Наприклад, рецептура може включати на добову дозу один чи більше з таких мікроелементів у зазначених діапазонах значень: 300-500 мг кальцію, 50-100 мг магнію, 150-250 мг фосфору, 5-20 мг заліза, 1-7 мг цинку, 0,1-0,3 мг міді, 50-200 мкг йоду, 5-15 мкг селену, 1000-3000 мкг бета-каротину, 1080 мг вітаміну С, 1-2 мг вітаміну В1, 0,5-1,5 мг вітаміну В6, 0,5-2 мг вітаміну В2, 5-18 мг ніацину, 0,5-2,0 мкг вітаміну В12, 100-800 мкг фолієвої кислоти, 30-70 мкг біотину, 1-5 мкг вітаміну D, 3-10 ME вітаміну Е. Якщо бажано, до рецептури може бути включений один чи більше харчових емульгаторів, наприклад, складні ефіри діацетилвинної кислоти з моно- та дігліцеридами, лецитин та моно- і дигліцериди. Аналогічно, можуть бути включені придатні солі та стабілізатори. Рецептура, переважно, призначена для ентерального введення; наприклад, має форму порошку, який має бути відновлений молоком або водою. Пробіотичні бактерії можуть бути зручно введені немовлятам у вигляді композиції для дитячого харчування. Композиція для дитячого харчування, призначена для застосування згідно 3 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 з даним винаходом, може включати джерело білка у кількості не більш ніж 2,0 г/100 ккал, переважно, від 1,8 до 2,0 г/100 ккал. Вважається, що тип білка не є критичним для даного винаходу, за умови, що задовольняються мінімальні вимоги до вмісту основних амінокислот та забезпечується задовільний ріст, хоча, переважно, більше 50 % мас. джерела білка складає молочна сироватка. Таким чином, можуть бути використані джерела білка на основі молочної сироватки, казеїну та їх сумішей, а також джерела білка на основі сої. Що стосується білків молочної сироватки, джерело білка може бути одержане із сироватки кислого молока чи сироватки свіжого молока або їх суміші і може включати альфа-лактальбумін та беталактоглобулін в будь-яких бажаних співвідношеннях. Білки можуть бути інтактними чи гідролізованими або сумішшю інтактних та гідролізованих білків. Може бути бажаним використовувати частково гідролізовані білки (ступінь гідролізу від 2 до 20 %), наприклад, для немовлят, для яких існує ризик виникнення алергії на коров'яче молоко. Якщо потрібні гідролізовані білки, то процес гідролізу може бути проведений так, як це буде бажано та як відомо спеціалістам. Наприклад, гідролізат білка молочної сироватки може бути одержаний шляхом ферментативного гідролізу фракції молочної сироватки в одну чи більше стадій. Було знайдено, що, якщо фракція молочної сироватки, використовувана як вихідний матеріал, по суті не містить лактози, то білок зазнає значно меншого блокування лізину в процесі гідролізу. Це дозволяє зменшити ступінь блокування лізину з приблизно 15 % мас. загального лізину до менш ніж приблизно 10 % мас. лізину; наприклад, приблизно 7 % мас. лізину, що значно поліпшує харчову цінність джерела білка. Композиція для дитячого харчування може включати джерело вуглеводів. Може бути використане будь-яке джерело вуглеводів, звичайно присутнє в композиціях для дитячого харчування, таке як лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крохмаль та їх суміші, хоча переважним джерелом вуглеводів є лактоза. Переважно, джерела вуглеводів складають від 35 до 65 % від загальної енергії рецептури. Композиція для дитячого харчування може включати джерело ліпідів. Джерело ліпідів може бути будь-яким ліпідом чи жиром, придатним для застосування в композиціях для дитячого харчування. Кращі джерела жирів включають пальмолеїн, соняшникову олію з високим вмістом олеїнової кислоти та сафлорову олію з високим вмістом олеїнової кислоти. Можуть бути додані також основні жирні кислоти лінолієва та α-лінолеїнова кислоти, а також маленькі кількості масел, які містять високі кількості попередньо утворених арахідонової кислоти та докозагексаєнової кислоти, таких як риб'ячі жири або мікробні жири. Загалом, вміст жиру, переважно, є таким, щоб він забезпечував від 30 до 55 % загальної енергії рецептури. Джерело жиру, переважно, має співвідношення n-6 до n-3 жирних кислот від приблизно 5:1 до приблизно 15:1; наприклад, від приблизно 8:1 до приблизно 10:1. Композиція для дитячого харчування може також містити усі вітаміни та мінеральні речовини, які вважаються незамінними у щоденному харчовому раціоні, в значних для харчування кількостях. Були визначені мінімальні рівні потреби для певних вітамінів та мінеральних речовин. Приклади мінеральних речовин, вітамінів та інших живильних речовин, необов'язково присутніх в композиціях для дитячого харчування, включають вітамін А, вітамін В1, вітамін В2, вітамін В6, вітамін В12, вітамін Е, вітамін K, вітамін С, вітамін D, фолієву кислоту, інозит, ніацин, біотин, пантотенову кислоту, холін, кальцій, фосфор, йод, залізо, магній, мідь, цинк, марганець, хлор, калій, натрій, селен, хром, молібден, таурин та L-карнітин. Мінеральні речовини звичайно додають у формі солей. Присутність та кількість конкретних мінеральних речовин та інших вітамінів буде змінюватися в залежності від потенційної групи немовлят. У випадку потреби, композиція для дитячого харчування може включати емульгатори та стабілізатори, такі як соєвий лецитин, складні ефіри лимонної кислоти з моно- та дігліцеридами і тощо. Композиція для дитячого харчування може необов'язково містити інші речовини, що можуть виявляти корисний ефект, такі як клітковини, лактоферин, нуклеотиди, нуклеозиди і тощо. Як композиція для дитячого харчування, так і рецептура харчового продукту, описані вище, можуть бути виготовлені у будь-який придатний спосіб. Наприклад, вони можуть бути виготовлені шляхом змішування разом білка, джерела вуглеводів та джерела жиру у відповідних пропорціях. Якщо використовуються емульгатори, то вони можуть бути включені на цій стадії. Вітаміни та мінеральні речовини можуть бути додані на цій стадії, але звичайно їх додають пізніше, щоб уникнути термічної деградації. Будь-які ліпофільні вітаміни, емульгатори тощо можуть бути розчинені в джерелі жиру перед перемішуванням. Потім для утворення рідкої суміші може бути додана вода, переважно, піддана зворотному осмосу. Температура води звичайно становить від приблизно 50 °C до приблизно 80 °C для полегшення диспергування 4 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 інгредієнтів. Можуть бути використані комерційно доступні розріджувачі для утворення рідкої суміші. Рідку суміш потім гомогенізують, наприклад, у дві стадії. Рідка суміш може потім бути піддана термообробці для зменшення бактеріального навантаження, наприклад, шляхом швидкого нагрівання рідкої суміші до температури в інтервалі значень від приблизно 80 °C до приблизно 150 °C протягом від приблизно 5 секунд до приблизно 5 хвилин. Це може бути здійснене шляхом інжекції пари, в автоклаві або за допомогою теплообмінника, наприклад, пластинчастого теплообмінника. Потім рідка суміш може бути охолоджена до температури від приблизно 60 °C до приблизно 85 °C, наприклад, шляхом миттєвого охолодження. Рідка суміш може потім бути знов гомогенізовано, наприклад, у дві стадії, при від приблизно 10 МПа до приблизно 30 МПа на першій стадії та від приблизно 2 МПа до приблизно 10 МПа на другій стадії. Гомогенізована суміш може потім бути далі охолоджена для додавання будь-яких термочутливих компонентів, таких як вітаміни та мінеральні речовини. На цій стадії зручно регулюють величину рН та вміст сухих речовин гомогенізованої суміші. Гомогенізовану суміш переносять до придатного сушильного апарату, такого як розпилювальна сушарка або ліофілізатор, та перетворюють на порошок. Порошок повинен мати вміст вологи менш ніж приблизно 5 % мас. Вибрані пробіотичні бактерії можуть культивуватися відповідно до будь-якого придатного способу та підготовлюватися для додавання в харчову композицію або композицію для дитячого харчування, наприклад, шляхом ліофілізації або розпилювального сушіння. Альтернативно, бактеріальні препарати можуть бути придбані у спеціалізованих постачальників, таких як Christian Hansen та Valio, вже підготовленими у придатній формі для додавання до харчових продуктів, таких як харчові композиції та композиції для дитячого 3 12 харчування. Пробіотичні бактерії можуть бути додані до рецептури у кількості від 10 до 10 7 12 КУО/г порошку, ще переважно, від 10 до 10 КУО/г порошку. Винахід далі буде проілюстрований з посиланням на наступні приклади: Приклад 1 Нижче наведений приклад стабільної при зберіганні харчової домішки, призначеної для застосування згідно з даним винаходом: 30 Енергія (ккал) Жири (г) Білки (г) Вуглеводи (г) Харчова клітковина (г) Мінеральні речовини Натрій (мг) Калій (мг) Хлор (мг) Кальцій (мг) Фосфор (мг) Магній (мг) Селен (мкг) Вітаміни Бета-каротин (мкг) Вітамін D (мкг) Вітамін Е (ME) Вітамін С (мг) Вітамін В1 (мг) Вітамін В2 (мг) Ніацин (мг) Вітамін В6 (мг) Фолієва кислота (мкг) Вітамін В12 (мкг) Біотин (мкг) Мікроелементи Залізо (мг) Йод (мкг) На 100 ккал 100 0,92 3,54 19,4 3,62 На 100 г готового напою 65 0,60 2,30 12,60 2,35 На порцію (190 мл) 130 1,20 4,60 25,2 4,70 51 238 123 308 162 58,0 7,7 33 155 80 200 105 38 5,0 66 310 160 400 210 76 10,0 1600 3,8 4,6 38 1,2 1,3 12 1,1 310 1,2 54 1050 2,50 3,0 25 0,75 0,85 8 0,7 200 0,75 35 2100 5,0 6,0 50 1,5 1,7 16 1,4 400 1,5 70 12 150 7,5 100 15 200 5 UA 103750 C2 Мідь (мг) Цинк (мг) Пробіотичні бактерії L. rhamnosus ATCC 53103 В. lactis Bb12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0,20 3,8 0,13 2,5 0,26 5,0 10 10 10 10 Приклад 2 Цей приклад наводить порівняння впливу введення пробіотичних бактерій вагітним жінкам на концентрацію глюкози в плазмі та чутливість до інсуліну з впливом ефекту введення плацебо порівнюваній групі вагітних жінок. 256 вагітних жінок погодилися взяти участь у рандомізованих перспективних комбінованих дослідженнях з дієтичними консультаціями та вивченням введення пробіотиків (NCTOO 167700, http://www.clinicaltrials.gov). Суб'єктів залучали на першому триместрі вагітності при їх першому відвідуванні жіночих консультацій у місті Турку та прилеглих районах південно-західної Фінляндії. Включені до досліджень суб'єкти не мали метаболічних захворювань. Жінки підписували заяву про інформовану згоду, і протокол досліджень був затверджений комітетом з етики Управління лікарнями південно-західної Фінляндії. Схема досліджень та їх проведення Дослідні відвідування відбувалися у кожному триместрі вагітності та через 1, 6 та 12 місяців після пологів. Спочатку суб'єктів випадково розподіляли на три дослідні групи - дві з 85 участниками та одна з 86 участниками. Група 1 (n=85) отримувала капсули з пробіотиками та дієтичні консультації (раціон/пробіотики), Група 2 (n=86) отримувала плацебо та дієтичні консультації (раціон/плацебо) і Група 3 (n=86) отримувала плацебо без дієтичних консультацій (контроль/плацебо). Рандомізація на отримання пробіотиків (Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC 53103. Valio Ltd., 10 Helsinki, Finland, та Bifidobacterium lactis Вb12, Chr. Hansen, Hoersholm, Denmark, 10 КУО/добу кожного) або плацебо (безводна мікрокристалічна целюлоза та декстроза, Chr. Hansen, Hoersholm, Denmark) в групах з дієтичними консультаціями проводилася у подвійно сліпий спосіб, у той час як контрольна група отримувала плацебо у простий сліпий спосіб. Введення пробіотиків починалося при першому дослідному відвідуванні та тривало до закінчення вигодовування тільки груддю. Активність пробіотиків підтверджували за допомогою регулярних аналізів мікробного вмісту і дотримання режиму приймання капсул оцінювали за допомогою інтерв'ю. Дотримання режиму приймання дослідних капсул оцінювали за допомогою інтерв'ю. Загалом 97,8 % повідомили, що приймали капсули щодня. На момент початку приймання капсул 6,3 % жінок повідомили про пов'язані з кишечником симптоми, включаючи метеоризм, рідкі випорожнення або запор, але схожа більш регулярна функція кишечнику була пов'язана з прийманням капсул в усіх трьох групах. Після цього поширеність вказаних симптомів зменшувалася до 1,3 % та 0,4 % при наступних дослідних відвідуваннях. Дієтичні консультації для Груп 1 та 2 проводилися дієтологом при кожному дослідному відвідуванні з наміром модифікувати прийом їжі так, щоб він відповідав сучасним рекомендаціям, причому особлива увага приділялася якості харчового жиру. Для досягнення рекомендованого раціону учасників забезпечували легко доступними харчовими продуктами з придатним складом жирів (наприклад, пастами на основі ріпакової олії та салатними соусами) для споживання удома. Прийом їжі оцінювали кожного триместру за допомогою 3-денних щоденників харчування. Енергія та прийом живильних речовин обчислювали за допомогою комп'ютерної програми Micro-Nutrica® (версія 2.5, Research Centre of the Social Insurance Institution, Turku, Finland). На початку досліджень за допомогою інтерв'ю збирали допоміжну інформацію, що стосується освіти та кількості пологів у минулому. Вагу до вагітності та зріст учасники повідомляли самі, і ці параметри використовували для обчислення індексу маси тіла (ВМІ) до вагітності як співвідношення ваги (кг) до росту (м). Загальне збільшення ваги під час вагітності обчислювали відніманням ваги до вагітності, самостійно повідомленої, від ваги, зареєстрованої при допологовому відвідуванні або у лікарні через один тиждень до пологів. Інформацію про вагу та ріст немовлят при народженні та про перебіг вагітності одержували з лікарняних записів. Зранку в день кожного відвідування брали з антекубітальної вени зразки крові після 10 годин голодування протягом ночі. Товщину складки шкіри на біцепсі вимірювали при першому відвідуванні та при відвідуваннях через 1, 6 та 12 місяців після пологів і обхват талії вимірювали при відвідуваннях через 6 та 12 місяців після пологів. 6 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аналітичні методи Концентрацію глюкози в плазмі вимірюють з застосуванням ферментативного методу на основі гексокінази за допомогою автоматичного аналізатора Modular P800 (Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Germany). Глікозильований гемоглобін А1С крові вимірюють методом іонообмінної високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) з застосуванням програми BioRad Variant TM II Haemoglobin A1C (Bio-Rad Laboratories, Marnes-la-Coquette, France). Концентрацію інсуліну в сироватці вимірюють методом імуноелектрохіміколюмінометричного аналізу (ECLIA) за допомогою автоматичного аналізатора Modular El70 (Roche Diagnostics GmbH). Для оцінки чутливості до інсуліну обчислюють кількісний контрольний індекс чутливості до інсуліну (QUICKI), як описано Katz et al. 14. Модельну оцінку гомеостазу (НОМА) проводять з застосуванням формули Matthews et al. 15. Провокативні скринінг-тести на глюкозу проводили в гінекологічних клініках відповідно до стандартних процедур для жінок, які відповідали критеріям ризикованих вагітностей (ВМІ до вагітності більше 25, вік старше 40 років, цукровий діабет вагітних під час попередньої вагітності, попереднє народження дитини вагою більше 4500 г, виявлення глюкози у сечі або підозра гігантизму плоду при даній вагітності) в період 28-30 тижня вагітності. Концентрації глюкози в плазмі вище 4,8 ммоль/л під час вагітності та 5,6 ммоль/л у невагітному стані, співвідношення глікозильованого гемоглобіну до загального гемоглобіну вище 6,5 % та концентрація інсуліну в сироватці вище 26 mU/л вважаються підвищеними (Turku University Central Laboratories). Поліпшену чутливість до інсуліну оцінювали за підвищеними значеннями QUICKI та зниженими значеннями НОМА. Результати провокативних тестів на глюкозу вважали патологічними, якщо підвищене значення глюкози натщесердце (>4,8 ммоль/л) спостерігалося разом із принаймні одним аномальним післяобіднім показником (післяобідня глюкоза крові >10,0 ммоль/л через одну годину або >8,7 ммоль/л через дві години). Статистичні аналізи Первинним об'єктом дослідження був метаболізм глюкози у матері, який характеризувався концентрацією глюкози в плазмі, глікозильованим гемоглобіном А1С крові, інсуліном в сироватці та індексами НОМА і QUICKI. Виміри проводили протягом першого триместру (початок) та третього триместру вагітності і через 1, 6 та 12 місяців після пологів. Відсутні значення (не більш ніж одне під час вагітності та одне протягом періоду після пологів) обчислювали, використовуючи групове середнє або геометричне середнє, оскільки методи лінійної екстраполяції або інтерполяції були незастосовними через значні неусувні нелінійні флуктуації усередині вибірки. Порівняння метаболізму глюкози у третьому триместрі вагітності або через 12 місяців після пологів між трьома дослідними групами робилося за допомогою коваріаційного аналізу (ANCOVA), і період після пологів (1, 6 та 12 місяців) аналізували з застосуванням ANCOVA для повторних вимірювань. Неперервний коваріат був включений до обох аналізів як початкове значення. Інсулін в сироватці та НОМА мали позитивну асиметрію та підлягали логарифмічному перетворенню до аналізу. Результати наведені у вигляді значень по відношенню до початкової величини або геометричних середніх з точністю в межах (СШ) 95 %. Парні групові порівняння проводили з корекцією за Бонферроні (Bonferroni). Співвідношення у суб'єктів з підвищеними концентраціями глюкози (>4,8 ммоль/л під час вагітності, >5,6 ммоль/л після пологів) порівнювали між дослідними групами з застосуванням критерію хі-квадрат. Результати групових порівнянь наведені як коефіцієнт ризиків (OR) з 95 % СІ. Додатково, аналізували харчові речовини з великим вмістом енергії за оцінювальними даними, узятими зі щоденників харчування, для пояснення змін метаболізму глюкози. Дослідні групи порівнювали у третьому триместрі, на протязі періоду після пологів та через 12 місяців після пологів, з застосуванням таких саме методів, як описані для первинних результатів. Зміни початкових показників аналізували з застосуванням критерію хі-квадрат, ANOVA, критерію Крускала-Уолліса (5` Apgar) або ANCOVA для повторних вимірювань (вага та ВМІ). Рандомізація та аналізи даних з застосуванням програми SPSS (версія 14.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) виконувалися статистиком (ТР), незалежним від клінічних досліджень. Результати Спостереження за 81 % залучених жінок (208/256) продовжувалося до 12 місяців після пологів. Причини припинення спостереження були типовими для звичайної групи вагітних жінок. З 208 жінок, спостереження яких було завершене, 23 були знов вагітними наприкінці періоду спостереження. Для виконання послідовних аналітичних рядів біохімічних змінних на кожному етапі оцінки результатів приймали до уваги від 3 до 7 значень; остаточна чисельність суб'єктів спостереження становила 66 суб'єктів в Групі 1, 70 в Групі 2 і 65 в Групі 3. Жінки, які брали участь у дослідженнях, належали до європеоїдної раси, більшість мали вищу освіту (79 % у Групі 1, 69 % у Групі 2 та 79 % у Групі 3) та очікували народження своєї 7 UA 103750 C2 5 першої дитини (65 % у Групі 1, 51 % у Групі 2 та 57 % у Групі 3). Немовлята були народжені вчасно та їх середні значення росту та ваги відповідали нормальному діапазону значень для групи населення. Відповідно до середніх значень індексу ваги тіла (ВМІ) до вагітності жінки мали нормальну вагу. Групи не відрізнялися за умовами наведення показників збільшення ваги при вагітності, відкоригованої початкової величини ваги або ВМІ після пологів. Середня тривалість годування виключно груддю і, таким чином, тривалість застосування пробіотиків/плацебо між дослідними групами не відрізнялися. Характеристики жінок та їх немовлят наведені у Таблиці 1 нижче: Таблиця 1 Характеристики жінок та їх немовлят Контроль/ плацебо (n = 85) Жінки Вік (років) 30,2 Вага (кг) 1-й триместр вагітності (початкове 68,9 значення) 3-й триместр 78,4 Збільшення ваги під час вагітності 14,8 2 ВМІ (кг/м ) До вагітності 23,7 1-й триместр вагітності (початкове 24,7 значення) 3 Після пологів 1 місяць 25,7 6 місяців 25,2 12 місяців 24,8 Тривалість (місяців) годування виключно груддю 3,4 годування груддю в цілому 8,3 5 Немовлята Народження на тижні вагітності 40,1 Вага при народженні (г) 3600 Ріст при народженні (см) 51 Окружність голови (см) 35,1 Кількість балів за шкалою Апгар на 5 9 хвилині 1 Раціон/ плацебо (n = 86) Раціон/ пробіотики (n = 85) (5,0) 30,1 (5,2) 29,7 (4,1) 0,813 (11,8) 71,0 (13,1) 64,9 (9,7) 0,003 (12,2) (5,1) 79,5 14,8 (11,0) (5,1) 74,8 15,0 (10,1) (4,3) 0,790 0,946 (3,5) 24,3 (4,4) 22,9 (3,2) 0,037 (3,6) 25,4 (4,7) 23,7 (3,2) 0,017 (3,6) (3,9) (3,9) 25,9 25,6 25,1 (4,2) (5,0) (5,3) 24,6 23,8 23,4 (3,1) (3,4) (3,3) 0,975 (1,6) (4,5) 3,6 9,1 (1,9) (5,8) 3,3 7,6 (1,8) (4,3) 0,587 0,287 (1,3) (515) (2) (1,4) 39,9 3602 51 35,1 (1,8) (439) (2) (1,3) 39,9 3489 51 34,8 (1,3) (431) (2) (1,3) 0,672 0,209 0,197 0,257 (4-10) 9 (3-10) 9 (6-10) 0,280 Значення Р 2 4 6 10 15 20 25 результати наведені як середнє (SD) або медіана (інтервал значень) 2 ANOVA або ANCOVA, з включенням початкового значення як коваріату, якщо це потрібно (вага та ВМІ) 3 вагітні матері були виключені з аналізу 4 ANOVA для повторних вимірювань (1, 6 та 12 місяців) 5 n = 76-78 в групі контроль/плацебо, n = 76-79 в групі раціон/плацебо і n = 75-81 в групі раціон/пробіотики 6 критерій Крускала-Уолліса Вплив втручання на метаболізм глюкози В усіх дослідних групах концентрація глюкози в плазмі зменшувалася з першого триместру до третього триместру та зростала протягом 12-місячного періоду після пологів (Фігура 1). Різниця між дослідними групами була істотною під час вагітності, коли відкориговані за початковим значенням середні значення становили 4,56, 4,60 та 4,45 ммоль/л у Групі 3, Групі 2 та Групі 1, відповідно (р = 0,025), майже досить істотною через 12 місяців після пологів (відкориговані середні значення 5,06, 5,22 та 4,93 ммоль/л; р = 0,060) та істотною протягом 12 місяців після пологів (відкориговані середні 5,02, 5,01 та 4,87 ммоль/л; р = 0,025). Група 1 відрізнялася від Групи 2 у третьому триместрі вагітності (р = 0,026), через 12 місяців після 8 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 пологів (р = 0,054) та протягом усього періоду після пологів (р = 0,066), а також від Групи 3 на протязі періоду після пологів (р = 0,048). Хоча середні значення концентрації глюкози в плазмі знаходилися в межах нормальних діапазонів значень в усіх дослідних групах, ризик підвищеної концентрації глюкози у Групі 1 був зниженим на протязі періоду досліджень (Фігура 1, вставка). Протягом третього триместру втручання у Групі 1 спричиняло для зниження ризику високої концентрації глюкози в плазмі (>4,8 ммоль/л) (OR 0,31, 95 %СІ 0,12-0,78; р = 0,013) у порівнянні з Групою 3. Однак, втручання у Групі 2 не виявляло такої здатності у порівнянні з Групою 3 (OR 1,26, 95 %СІ 0,59-2,69; р = 0,553). Хоча дані не є статистично достовірними, ризик високої концентрації глюкози в плазмі (>5,6 ммоль/л) зберігався в Групі 1 у післяпологовий період в меншому ступені (OR=0,46, 95 %СІ 0,14-1,50; р = 0,197), але не в Групі 2 (OR 1,55, 95 %СІ 0,61-3,95; р = 0,360), у порівнянні з Групою 3. Для 45 % суб'єктів проводили провокаційну глюкозну пробу під час вагітності. Хоча поширеність патологічних результатів тесту була найнижчою у Групі 1 (37 % суб'єктів) порівняно з Групою 2 (58 %) та Групою 3 (57 %), достовірного зменшення відносного ризику не відбувалося. Глікозильований гемоглобін А1С залишався в межах нормального діапазону значень протягом усього дослідження у всіх, крім одного суб'єкта Групи 2 через 12 місяців після пологів. Хоча середній глікозильований гемоглобін А1С був порівняним в дослідних групах у третьому триместрі вагітності та через 12 місяців після пологів, спостерігалася тенденція до зниженого глікозильованого гемоглобіну А1С у Групі 1 порівняно з Групою 2 на протязі періоду після пологів (Таблиця 2). Вплив втручання на статуру матері після пологів Як було відзначено вище, не спостерігалося різниці у збільшенні ваги між групами під час вагітності. Однак, статура тіла після пологів, що визначалася за товщиною складки шкіри біцепсів, яка є мірою жиру тіла, відрізнялася у групах, як видно з Таблиці 2 нижче, причому найнижчі значення були зареєстровані для Групи 1, і різниця була статистично достовірною (р = 0,03), коли результати вимірів при першому відвідуванні використовувалися як коваріат. Таблиця 2 Товщина складки шкіри біцепсів (см) Група 1 Група 2 Група 3 Стандартний відхил наведений у дужках 1 місяць 0,83 (0,33) 0,97 (0,52) 1,03 (0,54) 6 місяців 0,89 (0,44) 1,05 (0,6) 1,13 (0,62) 12 місяців 0,81 (0,4) 0,89 (0,5) 1,08 (0,65) 30 Далі, обхват талії, який є іншою мірою жиру тіла, а також одним з факторів метаболічного синдрому, також був меншим у Групі 1, причому різниця між групами була статистично достовірною в часі (р = 0,005). Результати вимірів наведені у Таблиці 3 нижче. Таблиця 3 Обхват талії (см) Група 1 Група 2 Група 3 6 місяців 76,31 (7,90) 81,28 (10,89) 80,54 (9,17) 12 місяців 74,90 (6,85) 80,08 (11,23) 78,75 (10,15) Стандартний відхил у дужках. 35 40 Вплив втручання на індекси інсуліну в сироватці та чутливості до інсуліну Концентрація інсуліну, а також інсулінорезистентність, оцінені за індексом НОМА підвищувались, а чутливість до інсуліну, оцінена за індексом QUICKI, знижувалася протягом третього триместру вагітності в усіх групах. Для порівняння, після пологів концентрація інсуліну та індекс НОМА знижувалися і індекс QUICKI зростав. Було знайдено, що середня концентрація інсуліну в сироватці, інсулінорезистентність та чутливість до інсуліну відрізняються в групах на протязі періоду досліджень (Таблиця 3). Цю різницю в третьому триместрі вагітності та протягом періоду після пологів пояснили ефектом зниження інсуліну в сироватці завдяки втручанню у групі 1, яке було особливо вираженим у порівнянні з Групою 3 при поєднанні з 9 UA 103750 C2 5 10 15 20 25 30 відвідуваннями після пологів. Індекс НОМА був найнижчим і індекс QUICKI найвищим, що дозволяє припустити збільшення чутливості до інсуліну у Групі 1. Втручання у Групі 1 виявилося особливо корисним у порівнянні з Групою 2 на протязі третього триместру вагітності та з Групою 3 протягом періоду після пологів. Ці дослідження дали перші свідчення наявності активного діалогу між організмом людини та мікробіотою кишечнику при метаболізмі глюкози; комбіновані дієтичні консультації та введення пробіотиків можуть регулювати концентрацію глюкози в плазмі та забезпечити глікемічний контроль у здорових молодих жінок. Хоча попередні дослідження дали свідчення поліпшення метаболізму глюкози під час вагітності дієтичними засобами, особливо, у жінок з діагнозом діабету вагітних, ці дослідження уперше показали довготривалий корисний ефект пробіотиків у поєднанні з дієтичними консультаціями на метаболізм глюкози та інсуліну. Пробіотики, очевидно, спричиняли більш глибокий ефект зниження глюкози, ніж одні лише дієтичні консультації, що дає змогу припустити особливу важливість пробіотиків. Починаючи з описаних вище досліджень, сироватку немовлят, відповідної контрольної групи, групи 1 та групи 2, аналізували на концентрацію "розщепленого проінсуліну 32-33". Виміри проводилися відповідно до стандартного методу, описаного, зокрема, у The Lancet 2003; vol. 361: 1089-97 (опублікований 29 березня 2003 p.). Зразки брали, коли немовлята були у віці 6 місяців, зразки крові брали венопункцією до полудня, сироватку негайно відокремлювали та зберігали спочатку при -20 °C, а потім при -80 °C, до проведення аналізу на розщеплений проінсулін 32-33 методом періодичного фторометричного аналізу (The Lancet 2003). Розщеплений проінсулін 32-33 є частково отриманий з проінсуліну, вища концентрація якого свідчить про вищу інсулінорезистентність. Більша інсулінорезистентність сама по собі пов'язана з трьома добре відомими факторами ризику метаболічних розладів (ожиріння, діабет, гіпертензія). Результати наведені у Таблиці 4. Поширеність високорозщепленого проінсуліну 3233 у Групі 2 (втручання-плацебо) складає 46 % від контрольної групи. У Групі 1 (група втручання-пробіотики) поширеність високорозщепленого проінсуліну 32-33 складає 37 % від контрольної групи. Результати свідчать, що дієтичне втручання з застосуванням пробіотиків пов'язане з нижчою поширеністю високорозщепленого проінсуліну 32-33 у немовлят. Тому вважається, що втручання може бути корисним для дітей і може знижувати ризик метаболічного синдрому, такого як надлишкова вага, діабет та гіпертензія у майбутньому житті. Таблиця 4 Високий проінсулін (>85 % проінсуліну або розщепленого проінсуліну 32-33) у дослідних 1 групах. Нескориговане та скориговане групове порівняння з застосуванням логістичного регресійного аналізу Дослідна група Група 1 Група 2 Тривалість годування груддю (>6 місяців) Глюкоза у матерів >медіани Нескориговане значення OR 95 % СІ Р 0,066 0,46 0,19-1,10 0,079 0,37 0,15-0,94 0,037 0,22 0,09-0,50