Імуногенний пептид для імунотерапії

Реферат: Винахід належить до амінокислотної послідовності пептиду, що походить з пухлиноасоційованих антигенів, здатного зв'язуватися з HLA-комплексами будь-якого класу та викликати імунну реакцію, а також до використання такого пептиду в лікуванні захворювань. UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нові імуногенні епітопи для імунотерапії Цей винахід відноситься до нових амінокислотних послідовностей пептидів, що походять з пухлино-асоційованих антигенів, здатних зв'язуватися з MHC-комплексами будь-якого класу та викликати імунну реакцію. Рівень техніки Стимуляція імунної реакції залежить від наявності антигенів, які визнаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування пухлино-асоційованих антигенів дало можливість використовувати імунну систему хазяїна для впливу на зріст пухлин. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних важелів імунної системи для імунотерапії раку. Окремі елементи клітинної імунної реакції здатні специфічно розпізнавати та знищувати клітини пухлин. Виділення цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) з пухлино-інфільтруючих клітинних популяцій чи з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини грають важливу роль в природному імунному захисті проти раку (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94; High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumour efficacy.). + Зокрема, CD8-позитивні T-клітини (TCD8 ), які розпізнають молекули Класу I головного комплексу гістосумісності (MHC), що презентують пептиди зазвичай з 8-10 залишків, одержані з білків чи дефектних продуктів рибосом (DRIPS) (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), які розташовані у цитозолях, відіграють важливу роль в цій реакції. MHC-молекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Є два класи MHC-молекул: MHC-молекули класу I, котрі можна знайти на більшості клітин, що мають ядро; вони презентують пептиди, які є результатом протеолітичного розщеплення ендогенних протеїнів, DRIPS та більшіх за розміром пептидів. MHC-молекули класу II, переважно, знаходяться на професійних антиген-презентуючих клітинах (APC); вони презентують пептиди екзогенних протеїнів, що поглинаються АPC в ході ендоцитозу, та проходять подальшу обробку (Cresswell P. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259-93). Комплекси пептиду та MHC-молекули класу I розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними Tлімфоцитами, які презентують відповідні рецептори Т-клітин (TCR), а комплекси пептиду і MHCмолекули класу II розпізнаються CD4-позитивними Т-клітинами- хелперами, що презентують відповідні TCR. Добре відомим є той факт, що TCR, пептид і MHC є в надлишку в стехіометричному співвідношенні 1:1:1. CD4-позитивні T-клітини- хелпери відіграють важливу роль в регулюванні ефекторних функцій протипухлинних реакцій T-клітин, і з цієї причини ідентифікація епітопів CD4-позитивних T-клітин, які одержуються з пухлино-асоційованих антигенів (TAA) може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних реакцій (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NYESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 100(15):8862-7). CD4-позитивні T-клітини можуть призвести до локального зростання рівнів гамма-інтерферону (Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumour rejection by CD8+T cells; Cancer Res. 2003 J; 63(14):4095-4100). За відсутності запалення, експресія молекул MHC класу II, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, до професійних антиген-презентуючих клітин (APC), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. При дослідженні пацієнтів з пухлинами було несподівано виявлено, що клітини пухлини експресують MHCмолекули класу II (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). На моделях ссавців, наприклад, мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутністю цитотоксичних Т-лімфоцитарних (CTL) ефекторних клітин (тобто, CD8-позитивних Tлімфоцитів), CD4-позитивні T-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (IFNγ) (Qin, Z. and T. Blankenstein. 1 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2000. CD4+T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). Крім того, було показано, що CD4-позитивні T-клітини, які розпізнають пептиди з пухлино-асоційованих антигенів, представлених молекулами HLA класу II, можуть протидіяти розвитку пухлин за допомогою індукування реакцій антитіл (Ab) (Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. + Bright, 2003. CD4 T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen. Cancer Res. 63:1040-1045). На відміну від пухлиноасоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами HLA класу I, лише невелика кількість лігандів класу II TAA була описана на цей час (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Оскільки визначальна експресія молекул HLA класу II зазвичай обмежується клітинами імунної системи (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), the можливість виділення пептидів класу II безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Однак, автори Dengjel et al. за останній час досягли успіху в ідентифікації ряду епітопів MHC класу II безпосередньо з пухлин (EP 04 023 546.7, EP 05 019 254.1; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Для того, щоб пептид індукував (викликав) клітинну імунну реакцію, він повинен зв'язуватися з MHC-молекулою. Цей процес залежить від алелі MHC-молекули та специфічного поліморфізму амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, зв'язані з MHC класу I, як правило, мають довжину 8-10 амінокислотних залишків та зазвичай вміщують два консервативні залишки ("якір") в своїй послідовності, що взаємодіє з відповідною порожниною зв'язування MHC-молекули. Таким чином, кожна MHC-алель має "мотив зв'язку", що визначає, які пептиди можуть специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування (Rammensee H. G., Bachmann J. and Stevanovic, S; MHC Ligands and Peptide Motifs, Chapman & Hall 1998). В імунній реакції, залежній від MHC класу I, пептиди повинні не тільки мати здатність зв'язуватися з певними молекулами MHC класу I, експресованими пухлинними клітинами, вони також мають розпізнаватися T-клітинами, презентуючими специфічні T-клітинні рецептори (TCR). Антигени, котрі розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними T-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін., котрі мають підвищену експресію в клітинах відповідної пухлини. Крім того, пухлино-асоційовані антигени, наприклад, також можуть бути присутні тільки в клітинах пухлин, зокрема, як продукти генів, що мутували, чи з альтернативних відкритих рамок зчитування (ORF), або від сплайсингу білків. (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome, Science 2004 Apr 23; 304 (5670):587-90.). Іншим важливим класом пухлино-асоційованих антигенів є тканино-специфічні антигени, такі як CT ("cancer testis")-антигени, що експресуються в різних видах пухлин та в здоровій тканині сем'яників. Було ідентифіковано різні пухлино-асоційовані антигени. Крім того, проведена значна дослідницька робота по ідентифікації додаткових пухлино-асоційованих антигенів. Деякі групи пухлино-асоційованих антигенів, котрі також згадуються в літературі як пухлино-специфічні антигени, є тканино-специфічними. Деякі групи пухлино-асоційованих антигенів, котрі також згадуються в літературі як пухлино-специфічні антигени, є тканино-специфічними. Приклади включають, без обмежень, тирозиназу для меланоми, простато-специфічні антигени (PSA) та простатичні специфічні мембранні антигени (PSMA) для раку простати і хромосомні кросовери, такі як bcr/abl у лімфомах. Однак, ряд ідентифікованих пухлино-асоційованих антигенів зустрічається в багатьох видах пухлин, а деякі з них, такі як онкогенні білки та/або генисупресори пухлин (огляд генів-супресорів пухлин для раку нирки наведений, наприклад, в роботі Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170(6 Pt 1):2163-72), котрі фактично викликають трансформаційну дію, зустрічаються практично в усіх видах пухлин. Наприклад, звичайні білки клітин, що контролюють ріст та диференціацію клітин, такі як p53 (приклад гена-супресора пухлин), ras, c-met, myc, pRB, VHL та HER-2/neu, можуть накопичувати мутації, і це призводить до посилення експресії цих генних продуктів, таким чином роблячи їх онкогенними (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Ці білки-мутанти також можуть бути мішенню пухлино-специфічної імунної реакції при багатьох видах ракових захворювань. 2 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними T-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та з метою використання в лікуванні, мають бути дотримані деякі попередні умови. Антиген повинен експресуватися, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи бути присутнім в здорових клітинах в порівняно невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутнім в будь-якому виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто походять з білків, що беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину внаслідок їхньої функції, наприклад, в контролі клітинного циклу чи апоптозі. До того ж, наступні мішені цих білків, які є основною причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, відповідно, бути непрямим чином асоційованими з пухлинами. Такі непрямо пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol. Immunoether. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). Істотно важливою в обох випадках є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), що одержується з пухлино-асоційованого антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. По суті, будь-який пептид, здатний зв'язувати молекулу MHC, може функціонувати як Tклітинний епітоп. Передумовою для індукування Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo є наявність T-клітини з відповідним рецептором TCR та відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу. Отже, TAA є відправною точкою для розробки протипухлинної вакцини. Методи ідентифікації та характеризації TAA основані на використанні CTL, котрі можуть бути виділені у пацієнтів або здорових людей, або вони базуються на генерації різних профілів транскрипції або різних моделей експресії пептидів пухлин і нормальних тканин (Lemmel C., Weik S., Eberle U., Dengjel J., Kratt T., Becker H. D., Rammensee H. G., Stevanovic S. Nat. Biotechnol. 2004 Apr.; 22(4):450-4, T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62 (20):5818-5827, 2002.). Однак, ідентифікація генів, надмірно експресованих в тканинах пухлин чи клітинних лініях пухлин людини, або селективно експресованих в таких тканинах чи клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, транскрибованих з цих генів, в імунній терапії. Це можна пояснити тим, що тільки індивідуальна субпопуляція епітопів з цих антигенів є прийнятною для такого застосування, оскільки T-клітина з відповідним TCR повинна бути присутньою, а імунологічна толерантність до цього конкретного епітопа має бути відсутньою чи мінімальною. Отже, важливо обирати тільки ті пептиди з надмірно експресованих чи селективно експресованих білків, котрі презентуються в зв'язку із молекулами MHC, проти яких можна знайти функціональну T-клітину. Така функціональна T-клітина визначається як Т-клітина, що після стимуляції специфічним антигеном може клонально розмножуватись і здатна виконувати ефекторні функції ("ефекторна T-клітина"). T-клітини – хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції CTL в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію цих клітин типу TH1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних T-клітин- кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на своїх клітинних поверхнях. Таким чином, епітопи пухлино-асоційованих пептидів Т-хелперів, самостійно чи в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Оскільки обидва типи реакцій, залежні від CD8 та CD4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та характеристика пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються CD8-позитивними CTL (ліганд: молекула MHC класу I + пептидний епітоп) чи CD4- позитивними CTL (ліганд: молекула MHC класу II + пептидний епітоп). Отже, задача цього винаходу полягає в знаходженні нових амінокислотних послідовностей для пептидів, які здатні зв'язуватися з MHC-комплексами будьякого класу. Стислий опис малюнків Малюнок 1 показує результати тандему рідинної хроматографії та мас-спектрометрії з ESI, що ідентифікують пухлино-асоційований пептид (TUMAP) PCN-002 зі зразку карциноми товстої кишки CCA707 (Малюнок 1a), TOP-002 зі зразку гліобластоми GB1006 (Малюнок 1b), PTP-001 зі зразку гліобластоми GB1006 (Малюнок 1c), GAL-001 зі зразку гіпернефроми RCC190 (Малюнок 3 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1d), CHI-001 зі зразку гліобластоми GB1002 (Малюнок 1e), JAK-001 зі зразку гліобластоми GB1002 (Малюнок 1f), AKR-001 зі зразку немілкоклітинного раку легенів NSCLC-Пул 2 (Малюнок 1g) та FNI-001 зі зразку карциноми підшлункової залози PC330 (Малюнок 1h), представлені способом, що обмежується MHC класу I. Малюнок 2 показує результати тандему рідинної хроматографії та мас-спектрометрії з ESI, що ідентифікують пухлино-асоційований пептид (TUMAP) CEA-009 зі зразку карциноми шлунку GC-Пул 2 (Малюнок 2a), TGFBI-006 зі зразку карциноми шлунку GC-Пул 1 (Малюнок 2b), TGFBI007 зі зразку гліобластоми GB6002 (Малюнок 2c), TGFBI-008 зі зразку гліобластоми GB1004 (Малюнок 2d), TGFBI-009 зі зразку немілкоклітинного раку легенів NSCLC-Пул 1 (Малюнок 2e) та TGFBI-010 зі зразку гліобластоми GB6002 (Малюнок 2f), представлені способом, що обмежується MHC класу II. Малюнок 3 показує профілі експресії двох генів, які кодують пептиди, що асоціюються з гліобластомою, PTP-001 (Малюнок 3a) та CHI-001 (Малюнок 3b). Експресія генів відсутня чи дуже низька в нормальних тканинах і підвищена більш ніж в 250 разів в зразках гліобластоми (від GB1006T до GB1011T; NCH359T та NCH361T). Малюнок 4 відображає здатність обраних пептидів зв'язуватися з HLA-A*0201, визначену за допомогою аналізу EpI ELISA, відповідно до роботи Sylvester-Hvid, C, Kristensen, N, Blicher, T, Ferre, H, Lauemoller, SL, Wolf, XA, Lamberth, K, Nissen, MH, Pedersen, LO, and Buus, S; 2002, Establishment of a quantitative ELISA capable of determining peptide-MHC class I interaction, Tissue Antigens, 59, 251-258. Аналіз був зведений до пептидів, відомих як пептиди, що зв'язуються з MHC класу I. Афінність пептидів, що зв'язуються з HLA-DR, не може бути виміряна з використанням цього аналізу. Малюнок 5 відображає тетрамерний аналіз проліферації ODC-001 та NOX-001- специфічних CD8-позитивних лімфоцитів з периферичної крові з використанням мікросфер. 6 1 × 10 збагачених CD8-позитивними PBMC (мононуклеарів периферичної крові) на лунку здорового HLA-A*0201-позитивного донора HD100 стимулювалися кожного тижня мікросферами в поєднанні з анти-CD28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/ODC-001 (верхня панель) чи анти-CD28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/NOX-001 (нижня панель). Після трьох стимуляцій in vitro, усі клітини були викрашені антитілами CD8 FITC плюс тетрамери A*0201/NOX-001 PE та A*0201/ODC-001 APC. Клітини обмежуються популяцією лімфоцитів або CD8-позитивних лімфоцитів (права панель); цифри представляють процент тетрамер-позитивних в межах CD8-позитивних лімфоцитів. Малюнок 6 показує імуногенність in vitro TGFBI-004, як визначено імуноферментним спотаналізом ELISPOT IFNγ (гамма-інтерферонів) після п'яти циклів стимуляції. Клітини були примовані та повторно рестимульовані TGFBI-004, а потім інкубовані з релевантним пептидом TGFBI-004 (Лунка 1, 2, 3 та 4) і не релевантним пептидом (Нег. контроль), відповідно. Аналіз після IFNγ ELISPOT був проведений на ELISPOT-рідері (CTL, Клівленд, США). PHA-іономіцин служив позитивним контролем. Цифри вказують на кількість позитивних плям. Малюнок 7 відображає імуногенність in vitro TGFBI-004, як визначено за допомогою аналізатора ICS після п'яти циклів стимуляції. Клітини були примовані аутологічними DC з введеним TGFBI-004 та повторно рестимульовані аутологічними PBMC плюс TGFBI-004. Для зчитування, клітини були інкубовані з релевантним пептидом TGFBI-004 (Лунка 1, 2, 3 та 4) і не релевантним пептидом (Нег. контроль), відповідно. Додатково до внутрішньоклітинного IFNγ-викрашування, клітини також були викрашені антитілами CD4-FITC та CD8-PerCP. Аналіз виконувався на чотирьохкольоровому цитометрі FACSCalibur (BD Biosciences, Німеччина). Малюнок 8 відображає аналіз ELISPOT виробництва IFNγ T-клітинними лініями після рестимуляції in vitro пептидом NOX-001 A. T-клітинна лінія 7+ від донора HBC-154 (сортована CD8+NOX-001 тетрамер+); B. T-клітинна лінія 7- від донора HBC-154 (сортована CD8+NOX-001 тетрамер). Сортовані CD8+NOX-001 тетрамер-позитивні (A.) та CD8+NOX-001 тетрамер-негативні (B.) клітини були проаналізовані за допомогою IFNγ ELISPOT після рестимуляції не релевантним пептидом (MLA-001) (верхні лунки) та релевантним пептидом (NOX-001) (нижні лунки) (10 мкг/мл). Цифри вказують на кількість позитивних плям. Малюнок 9 показує афінність пептидів, які включені в цей винахід, до HLA-A*0201. Константи дисоціації (KD) HLA-пептидів классу І P116 і пептиду вірусного маркера HBV-001 були виміряні за допомогою аналізу на основі ELISA (див. Приклади). Детальний опис винаходу 4 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 В першому аспекті винахід пропонує пептид, який вміщує послідовність, обрану з групи від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 29 або її варіант, що на 80 % гомологічний послідовності від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 29 або варіант, котрий індукуватиме перехресне реагування T-клітин з зазначеним пептидом. Термін "гомологічний" в цьому винаході відноситься до ступеню ідентичності між послідовностями двох амінокислотних послідовностей, тобто, пептидними або поліпептидними послідовностями. Вищеназвана "гомологія" визначається порівнянням двох послідовностей, доведених в оптимальних умовах до порівнюваних послідовностей. Послідовності, які порівнюються в цьому винаході, можуть мати доповнення чи делецію (наприклад, розрив і т.ін.) в оптимальному ряду двох послідовностей. Гомологія таких послідовностей може бути розрахована шляхом створення порівняльного ряду із використанням, наприклад, алгоритму ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Можуть також використовуватись наявні комп'ютерні програми для аналізу послідовностей, зокрема, Vector NTI, GENETYX або засоби аналізу в загальнодоступних базах даних, таких як, наприклад, http://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/. Досвідчений фахівець в цій галузі зможе оцінити, чи здатні T-клітини, індуковані варіантом конкретного пептиду, перехресно реагувати з самим пептидом – див. роботи (Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, and Engleman, EG; 2001, Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 98, 8809-8814); (Zaremba, S, Barzaga, E, Zhu, M, Soares, N, Tsang, KY, and Schlom, J; Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen, Cancer Res., 1997, 57, 4570-4577; Colombetti, S, Fagerberg, T, Baumgartner, P, Chapatte, L, Speiser, DE, Rufer, N, Michielin, O, and Levy, F;, Impact of orthologous melan-A peptide immunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell cross-reactivity, J Immunol., 2006, 176, 6560-6567;Appay, V, Speiser, DE, Rufer, N, Reynard, S, Barbey, C, Cerottini, JC, Leyvraz, S, Pinilla, C, and Romero, P; Decreased specific CD8+T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide, Eur.J Immunol., 2006, 36, 1805-1814). В Таблиці 1 показані пептиди, відповідний номер послідовності SEQ ID NO, а також інформація щодо вихідних білків. 30 Таблиця 1 Пептиди цього винаходу Ід. № послідовності SEQ ID NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Код пептиду Послідовність HLA-алелі Ген(и) C20-001 NOX-001 PCN-001 PCN-002 TOP-001 TOP-002 CEA-009 TGFBI-001 TGFBI-006 TGFBI-007 TGFBI-008 ALSNLEVTL ILAPVILYI KLMDLDVEQL SMSADVPLV KIFDEILVNA AAFVEELDKV VLLLVHNLPQHLFG ALFVRLLALA GDKLEVSLKNNVVS GKKLRVFVYRNSLCIENS LKNNVVSVNKEPVAEPD KNNVVSVNKEPVAEPD KNNVVSVNKEPVA LKNNVVSVNKEPVA NGVIHYIDELLIPDS GVIHYIDELLIPDSA LNRILGDPEALRDL TPPIDAHTRNLLRNH ALTTLMHQL SLDPSSPQV SLWAGVVVL A*02 A*02 A*02 A*02 A*02 A*02 Клас II A*02,A*02/B*13? Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II A*02 A*02 A*02 C20orf42 NOX1 PCNA PCNA TOP2A, TOP2B TOP2B CEACAM5 TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI TGFBI PTPRZ1 GAL3ST1 CHI3L2 12 TGFBI-009 13 14 15 16 17 TGFBI-010 TGFBI-004 PTP-001 GAL-001 CHI-001 5 UA 103751 C2 Продовження таблиці 1 18 19 20 21 22 23 24 10 15 20 25 30 35 EGFR-005 EGFR-006 CHI3L1-001 25 26 27 28 29 5 JAK-001 AKR-001 FN1-001 EGFR-002 CHI3L1-007 CHI3L1-008 DCA-001 KCN-001 GPM-001 KLTDIQIEL YLIHFPVSV IVDDITYNV GAVRFSNNPALCNVES AVRFSNNPALCNVES AVRFSNNPALCNVE NPTTYQMDVNPEGKYS FKKIKVLGSGAFG TTLIKEMKAEFIKEAQPG TLIKEMKAEFIKEAQPG TTLIKEMKAEFIKEA TLIKEMKAEFIKEA IKEMKAEFIKEAQPG TTLIKEMKAEFIKE VKSKVQYLKDRQLAG SRRTFIKSVPPFLRT KLGDFGLATVV SLFDQVVKV ALLSEVIQL A*02 A*02 A*02 Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II Клас II A*02 A*02 A*02 JAKMIP2 AKR1C1, AKR1C2 FN1 EGFR EGFR EGFR EGFR EGFR CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 CHI3L1 DCAMKL2 KCNJ10 GPM6B Відкрита рамка зчитування 42 20-ї хромосоми C20orf42 – це білок фокальної адгезії, який бере участь в приєднанні актинового цитоскелету до цитоплазматичної мембрани та в клітинних процесах, де посередником виступає інтегрин. Нестача C20orf42 в результаті мутацій з втратою функції викликає синдром Кіндлера, аутосомно-рецесивній генодерматоз, що характеризується утворенням пухирів на шкірі, прогресуючою атрофією шкіри, світлочутливістю та, в деяких випадках, канцерогенезом (Herz, C, Aumailley, M, Schulte, C, Schlotzer-Schrehardt, U, Bruckner-Tuderman, L, and Has, C; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J Biol Chem., 2006, 281, 36082-36090). Нещодавно з'явилася інформація про серйозне ураження шлунково-кишкового тракту з геморагічним колітом у пацієнта, в якого спостерігалася мутація з втратою функції (Sadler, E, Klausegger, A, Muss, W, Deinsberger, U, Pohla-Gubo, G, Laimer, M, Lanschuetzer, C, Bauer, JW, and Hintner, H; Novel KIND1 gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol., 2006, 142, 16191624). Що стосується раку, то в дослідженнях по вивченню генної експресії C20orf42 був описаний серед послідовностей, безпосередньо пов'язаних з раком. Було виявлено, що він надмірно експресується в 70 % колоректальних карцином та в 60 % карцином легенів, які були досліджені (n=10). Експресія в нормальних тканинах, виявлена за допомогою Норзерн-блотингу, зводилася до нейром'язових тканин (Weinstein, EJ, Bourner, M, Head, R, Zakeri, H, Bauer, C, and Mazzarella, R; URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216). Крім того, C20orf42 був ідентифікований як ген, що бере участь в TGF-βопосередкованій міграції клітин та інвазії (Kloeker, S, Major, MB, Calderwood, DA, Ginsberg, MH, Jones, DA, and Beckerle, MC; The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin-mediated adhesion, J. Biol. Chem., 2004, 279, 6824-6833). Гомолог-1 НАДФ(нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат)-оксидази (NOX1) NOX1 являє собою фермент, чутливий до фактору росту, який каталізує формування активних форм кисню - супероксида (O2-) та пероксида водню (H2O2). Його експресія була первісно виявлена в товстій кишці, простаті, матці та в проліферуючих клітинах судин гладких м'язів (Suh, Y. A. et al. 1999; Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature 401, 79-82). Експресія цього ферменту пов'язана з рядом біологічних реакцій, включаючи клітинну проліферацію, ангіогенез та активацію клітинних шляхів передачі сигналів (Harper, R. W., Xu, C., Soucek, K., Setiadi, H. & Eiserich, J. P. A reappraisal of the genomic organization of human Nox1 and its splice variants. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 435, 323-330). NOX1 в значній мірі експресується в товстій кишці, але його функція у фізіології або патології товстої кишки поки що недостатньо вивчена. В нормальних тканинах, екпресія NOX1 виявилась низкою у клубовій кишці, середньою в висхідній ободовій кишці та високою у 6 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низхідній ободовій кишці. Не було продемонстровано статистичної розбіжності в експресії NOX1 між зразками, одержаними з аденом та високо- чи низько-диференційованих аденокарцином товстої кишки. NOX1 був експресований в значній мірі в тканинах епітелію товстої кишки, як у складках, так і на поверхні порожнини. На завершення треба відзначити, що NOX1 є ферментом, який конститутивно експресується в епітелії товстої кишки і прямо не асоціюється з пухлиногенезом (Szanto, I. et al. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease. J Pathol. 2005, 207, 164-176). Дослідження в галузі імуногістохімії показали, що NOX1 конститутивно експресувався в поверхневих мукоїдних клітинах. Аденоми та високо-диференційовані аденокарциноми підвищують експресію NOX1. Ядерний фактор каппа-В (NF-kappaB) був переважно активований в клітинах аденоми та аденокарциноми, експресуючих NOX1 в надлишку, і це наводить на думку, що NOX1 може стимулювати NF-kappaB-залежні анти-апоптотичні шляхи в пухлинах товстої кишки (Fukuyama, M. et al. Overexpression of a novel superoxide-producing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Cancer Lett. 2005, 221, 97-104). Описано, що Wnt3a/бета-катеніновий шлях передачі сигналів індукує експресію NOX1 (Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells. J Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399). Нещодавно була висловлена думка, що активні форми кисню індукують ендотеліальний апоптоз, який згодом викликає експресію різних молекул адгезії для клітин пухлин. Це означає, що, вирішивши проблему із продукуванням ROS (активних форм кисню), можна реально запобігти рецидивам пухлин у віддалених ділянках (Ten, KM, van der Wal, JB, Sluiter, W, Hofland, LJ, Jeekel, J, Sonneveld, P, and van Eijck, CH; The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence, Br.J Cancer, 2006, 95, 1497-1503). Ядерний антиген проліферуючих клітин (PCNA) PCNA знаходиться в ядрі та є ко-фактором дельта-ДНК-полімерази. Кодований білок діє як гомотример та сприяє збільшенню процесивності синтезу лідируючого ланцюгу в ході ДНКреплікації. Отже, він експресується в усіх проліферуючих клітинах, зокрема, в клітинах пухлин, та використовується як маркер для визначення проліферації. ДНК-топоізомераза II TOP2A і TOP2B кодують ізоформи ДНК-топоізомерази, ферменту, що контролює та змінює топологію ДНК в ході транскрипції. Цей ядерний фермент бере участь у таких процесах, як конденсація хромосом, розділення хроматид та зняття торсіонного напруження, що має місце в ході транскрипції та реплікації ДНК. ДНК-топоізомераза каталізує тимчасове розділення та повторне з'єднання двох ланцюгів двоспіральної ДНК, що дозволяє ланцюгам проходити один крізь інший, таким чином, змінюючи топологію ДНК. Дві ізоформи цього ферменту є ймовірними продуктами події дуплікації генів. Ген, кодуючий альфа-форму, локалізується в хромосомі 17, а бета-ген локалізується в хромосомі 3. TOP2A є мішенню для декількох протиракових препаратів, і різноманітні мутації в цьому гені асоціюються з розвитком резистентності до ліків. Ген TOP2A знаходиться поблизу від онкогена HER-2, найбільш часто ампліфікованого онкогена у випадках раку молочної залози, на хромосомній ділянці 17q12-q21, та цей ген ампліфікується чи вищеплюється, з рівною частотою, майже в 90 % первинних пухлин молочної залози, ампліфікованих HER-2 (Jarvinen, TA and Liu, ET; Topoisomerase II alpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-more common than anticipated, Cytopathology, 2003, 14, 309313). Крім того, про ампліфікації TOP2A повідомлялося для інших видів раку. Без TOP2A, реплікація ДНК та клітинний поділ неможливі. Отже, він стає головною мішенню багатьох режимів протипухлинної терапії, навіть незважаючи на те, що точний механізм знищення клітин залишається неясним (Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim-DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243). Успіх цього підходу обмежується розвитком природної резистентності, та індуковане ліками ушкодження ДНК може збільшити злоякісність. Недавно одержані дані наводять на думку, що ампліфікація та делеція TOP2A може бути причиною як чутливості, так і резистентності до хіміотерапії з використанням інгібіторів TOP2A, залежно від специфічного генетичного дефекту в локусі TOP2A. Неясно, чи є подібніми функції TOP2B і TOP2A в ракових захворюваннях, та чи є значні розбіжності між двома ізоформами. TOP2B може, принаймні, доповнювати деякі функції TOP2A (Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054). Молекула клітинної адзезії 5, що відноситься до карциноембріонального антигену 7 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Карциноембріональний антиген (CEA=CEACAM5) є високо глікозильованим мембранним білком з масою 180 kDa, що складається з трьох C2 Ig-подібних повторюваних одиниць, до яких прилягає N-термінальна Ig V-подібна ділянка та C-термінальна ділянка, що включає ділянку зв'язування з глікофосфатидилінозитолом (Hegde, P, Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K, Dharap, S, Earle-Hughes, J, Gay, C, Nwokekeh, NU, Chen, T, Saeed, AI, Sharov, V, Lee, NH, Yeatman, TJ, and Quackenbush, J; Identification of tumour markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797). Як онкофетальний антиген, CEA експресується на протязі розвитку плода, але також, на низьких рівнях, – в епітелії шлунково-кишкового тракту дорослих людей. Однак, CEA надмірно експресується у великій кількості (в процентному відношенні) пухлин людини, включаючи 90 % клітин пухлин шлунково-кишкового тракту, товстої кишки та підшлункової залози, 70 % ракових клітин у випадках немілкоклітинного раку легенів та в 50 % клітин пухлин у випадках раку молочної залози (Thompson, JA, Grunert, F, and Zimmermann, W; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives, J Clin Lab Anal., 2005, 5, 344-366). Внаслідок його високої експресії клітинами пухлин та секреції у сироватку, CEA широко використовувався як маркер пухлин (Sikorska, H, Shuster, J, and Gold, P; Clinical applications of carcinoembryonic antigen, Cancer Detect. Prev., 1988, 12, 321-355) та є стандартним маркером сироватки для моніторингу колоректального раку (Locker, GY, Hamilton, S, Harris, J, Jessup, JM, Kemeny, N, Macdonald, JS, Somerfield, MR, Hayes, DF, and Bast, RC, Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal cancer, J Clin Oncol, 2006, 24, 5313-5327,). Незважаючи на надмірну експресію CEA в клітинах пухлин, у пацієнтів з раковими захворюваннями, зазвичай, не виявляється імунної реакції проти цього антигену (Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, and Bonfanti, G; Delayed cutaneous hypersensitivity reaction to carcinoembryonic antigen in cancer patients, Tumouri, 1982, 68, 473-475). Імунна система, як правило, стає толерантною до CEA, оскільки він нормально експресується на низьких рівнях в тілі людини. Однак, в ряді клінічних досліджень вакцин була продемонстрована імуногенність CEA (Sarobe, P, Huarte, E, Lasarte, JJ, and Borras-Cuesta, F; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Cancer Drug Targets., 2004, 4, 443-454), особливо в колоректальній карциномі (CRC) (Mosolits, S, Ullenhag, G, and Mellstedt, H; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results, Ann.Oncol., 2005, 16, 847-862), і CEA є пухлино-асоційованим антигеном (TAA) з найбільшою кількістю ділянок для створення вакцин, випробуваних в цьому типі пухлин (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84). Щодо CEA, було описано декілька епітопів цитотоксичних Т-клітин і Т-клітин– хелперів (Crosti, M, Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, and Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+T-cells of lung cancer patients, J Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L, Castelli, C, and Parmiani, G; A listing of human tumour antigens recognized by T-cells: March 2004 update, Cancer Immunol.Immunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867), що дають можливість проведення різних досліджень по розробці вакцин на пептидній основі стосовно CRC (Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, and Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2006, 55, 268-276; Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, and Engleman, EG; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumour immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98, 8809-8814; Liu, KJ, Wang, CC, Chen, LT, Cheng, AL, Lin, DT, Wu, YC, Yu, WL, Hung, YM, Yang, HY, Juang, SH, and Whang-Peng, J; Generation of carcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in HLA-A*0201 and HLAA*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K, Tsunoda, T, Tanaka, H, Umano, Y, Tanimura, H, Nukaya, I, Takesako, K, and Yamaue, H; Enhancement of cytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptidepulsed dendritic cells, Cancer Immunol.Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y, Itoh, T, Nukaya, I, Kawashima, I, Okugawa, K, Yano, Y, Yamamoto, Y, Naitoh, K, Shimizu, K, Imura, K, Fuji, N, Fujiwara, H, Ochiai, T, Itoi, H, Sonoyama, T, Hagiwara, A, Takesako, K, and Yamagishi, H; Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: 8 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Clinical outcomes of 18 patients withmetastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int.J Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, and Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005, 11, 5993-6001). Ці та інші клінічні дослідження на даний момент продемонстрували безпеку вакцин на основі CEA та доказали викликання імунної реакції проти цього антигену (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84). Трансформуючий фактор росту, бета-індукований (TGFBI) TGFBI був вперше ідентифікований як TGF-бета-індуцибельний ген в клітинній лінії аденокарциноми легенів людини. Він кодує білок позаклітинного матриксу, що секретується, котрий вважається впливаючим на адгезію клітин і на склад позаклітинного матриксу. Було показано, що TGFBI є серед найбільш підвищених за кількістю генів у випадках колоректального раку; крім того, він характеризується високими рівнями експресії в аденомах. Результаті кількісного ПЛР-аналізу продемонстрували сильне підвищення як в неочищених, так і в очищених ракових епітеліальних клітинах. Відповідно, в експериментах по гібридізації in situ було виявлено експресію TGFBI в багатьох типах клітин, і в стромальному, і в епітеліальному компартментах (Buckhaults, P, Rago, C, St, CB, Romans, KE, Saha, S, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Cancer Res., 2001, 61, 6996-7001). В мета-аналізі досліджень по вивченню генної експресії в колоректальній карциномі, TGFBI був визначений як лише один з дев'яти генів, що описуються з постійною підвищеною експресією (4 дослідження щодо TGFBI) (Shih, W, Chetty, R, and Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol. Rep., 2005, 13, 517-524). В тканинах пухлин підшлункової залози людини спостерігалося підвищення рівнів мРНК TGFBI в 32.4 рази, в порівнянні з нормальними контрольними тканинами. Гібридізація іn situ виявила експресію мРНК TGFBI, головним чином, в ракових клітинах в межах пухлинного утворення підшлункової залози (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, and Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1588, 1-6). TGFBI був ідентифікований як ген, що сприяє ангіогенезу в моделі in vitro. Крім того, в декількох пухлинах була визначена різко підвищена експресія TGFBI. Антисенсні олігонуклеотиди до TGFBI блокували генну експресію та утворення ендотеліальних трубок in vitro, і це наводить на думку, що TGFBI може грати вирішальну роль у взаємозв'язку між ендотеліальними клітинами та матриксом (Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, and Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171). Рецепторо-подібна протеїн тирозин-фосфатаза, Zeta1 (PTPRZ1) PTPRZ1 є членом сімейства рецепторо-подібних протеїн тирозин-фосфатаз та кодує однопрохідний мембранний білок типу I з двома цитоплазматичними тирозин-протеїнфосфатазними доменами, доменом альфа-карбонової ангідрази та фібронектиновим доменом типу III. Експресія цього гену індукується в клітинах раку шлунку (Wu, CW, Li, AF, Chi, CW, and Lin, WC; Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues, Cancer Lett., 2006, 242, 95-103), в ремієльованих олігодендроцитах ушкоджень внаслідок множинного склерозу (Harroch, S, Furtado, GC, Brueck, W, Rosenbluth, J, Lafaille, J, Chao, M, Buxbaum, JD, and Schlessinger, J; A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions, Nat. Genet., 2002, 32, 411-414), та в клітинах нирки ембріону людини в умовах гіпоксії (Wang, V, Davis, DA, Haque, M, Huang, LE, and Yarchoan, R; Differential gene up-regulation by hypoxia-inducible factor-1alpha and hypoxia-inducible factor-2 alpha in HEK293T-cells, Cancer Res., 2005, 65, 3299-3306). І білок, і транскрипт надмірно експресуються в клітинах гліобластоми, сприяючи їхній гаптотактичній міграції (Lu, KV, Jong, KA, Kim, GY, Singh, J, Dia, EQ, Yoshimoto, K, Wang, MY, Cloughesy, TF, Nelson, SF, and Mischel, PS; Differential induction of glioblastoma migration and growth by two forms of pleiotrophin, J Biol Chem., 2005, 280, 26953-26964). Крім того, PTRPZ1 часто ампліфікується на геномному рівні ДНК в гліобластомі (Mulholland, PJ, Fiegler, H, Mazzanti, C, Gorman, P, Sasieni, P, Adams, J, Jones, TA, Babbage, JW, Vatcheva, R, Ichimura, K, East, P, Poullikas, C, Collins, VP, Carter, NP, Tomlinson, IP, and Sheer, D; Genomic profiling identifies discrete deletions associated with translocations in glioblastoma multiforme, Cell Cycle, 2006, 5, 783-791). 9 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Янус-кіназа та Білок 2, що взаємодіє з мікротрубочками (JAKMIP2) JAKMIP2 був ідентифікований як одна з багатьох відомих чи передбачуваних мішеней PAX3FKHR в низхідному напрямку, котрі надмірно експресувалися в ARMS (рабдоміосаркома у дітей, альвеолярний підтип) (Lae, M, Ahn, E, Mercado, G, Chuai, S, Edgar, M, Pawel, B, Olshen, A, Barr, F, and Ladanyi, M; Global gene expression profiling of PAX-FKHR fusion-positive alveolar and PAXFKHR fusion-negative embryonal rhabdomyosarcomas, J Pathol., 2007, 212, 143-151). Фібронектин 1 (FN1) Фібронектин – це глікопротеїн з високою молекулярною вагою та вмістом приблизно 5 % вуглеводу, що зв'язується з рецепторними білками, пронизуючими мембрану клітини, які називаються інтегринами. На додаток до інтегринів, вони також зв'язують компоненти позаклітинного матриксу, такі як колаген, фібрін та гепарин. Є декілька ізоформ фібронектину, всі з яких являють собою продукт одного гену. FN відіграють вирішальну роль в підтриманні морфології нормальних клітин, клітинної адгезії, міграції, гемостазу, тромбозу, загоєнні ран, диференціації та проліферації (Hynes, RO; Fibronectins, Sci. Am., 1987, 254, 42-51). Полімерний фібронектин, sFN, формується in vitro шляхом обробки розчинного фібронектину пептидом 76-aa, III1-C (Анастеллін), котрий одержується з III повтору першого типу у фібронектині. Дослідження іn vivo пухлин у мишей показали, що системне застосування Анастелліну чи sFN сповільнювало ріст пухлин, ангіогенез та метастазування (Yi, M and Ruoslahti, E; A fibronectin fragment inhibits tumour growth, angiogenesis, and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98, 620-624). Ангінекс (Anginex) є синтетичним 33-амінокислотним пептидом, котрий був первісно змодельований для відтворення бета-складчастої структури анти-ангіогенних білків. Було показано, що ангінекс ініціює полімеризацію фібронектину та є неактивним у мишей, в яких немає фібронектину у плазмі (Akerman, ME, Pilch, J, Peters, D, and Ruoslahti, E; Angiostatic peptides use plasma fibronectin to home to angiogenic vasculature, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2005, 102, 2040-2045). В ході дослідження, науковці вивчали вплив FN на D-галактозамін(GalN)/ліпополісахарид- (LPS)-індуковану швидкоплинну печінкову недостатність у мишей. Результати показали, що FN захищає від GalN/LPS-індукованої печінкової недостатності з використанням механізму інгібування активації NF-kappaB, що знижує експресію TNF-альфа та підвищує експресію IL-10, а збільшення кількості Bcl-xL призводить до блокади апоптотичних сигналів, за допомогою чого апоптоз гепатоцитів під впливом GalN/LPS подавляється (Qiu, Z, Kwon, AH, Tsuji, K, Kamiyama, Y, Okumura, T, and Hirao, Y; Fibronectin prevents D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced lethal hepatic failure in mice, Shock, 2006, 25, 80-87). Інші результати вказували на те, що FN стимулює проліферацію клітин карциноми легенів у людей та знижує апоптоз in vitro, індукуючи експресію гену COX-2 та біосинтез PGE2 (Han, S, Sidell, N, Roser-Page, S, and Roman, J; Fibronectin stimulates human lung carcinoma cell growth by inducing cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, Int. J Cancer, 2004, 111, 322-331). Було показано, що фібронектин (FN) проходить альтернативний сплайсинг виключно в ході органогенезу та пухлиногенезу. Один з таких сплайс-варіантів, екстра-домен-B (ED-B) FN, зазвичай, відсутній в нормальних тканинах дорослих людей та, ймовірно, є маркером ангіогенезу пухлин (Khan, ZA, Caurtero, J, Barbin, YP, Chan, BM, Uniyal, S, and Chakrabarti, S; EDB fibronectin in non-small cell lung carcinoma, Exp.Lung Res., 2005, 31, 701-711). Автори Mhawech et al. показали, що пухлини голови та шиї з позитивним викрашуванням на EDB демонстрували тенденцію до значно нижчої загальної виживаності пацієнтів (Mhawech, P, Dulguerov, P, Assaly, M, Ares, C, and Allal, AS; EB-D fibronectin expression in squamous cell carcinoma of the head and neck, Oral Oncol., 2005, 41, 82-88). Експресія фібронектину регулює ангіогенез і васкулогенез та бере участь в реакціях мозкових тканин на ішемію та епілептичні припадки. Генна експресія фібронектину виявилася значно підвищеною (p < 0.05) в уражених SWS-фібробластах (хвороба Стерджа-Вебера) в порівнянні з фібробластами з нормальної шкіри SWS-пацієнтів (Comi, AM, Hunt, P, Vawter, MP, Pardo, CA, Becker, KG, and Pevsner, J; Increased fibronectin expression in sturge-weber syndrome fibroblasts and brain tissue, Pediatr. Res., 2003, 53, 762-769). Концентрація фібронектину була значно вищою у випадках раку яєчників, в порівнянні з доброякісними пухлинами яєчників та нормальними яєчниками. Концентрація фібронектину значно підвищена у пацієнтів з рецидивуючим раком яєчників, в порівнянні з пацієнтами, хворими на рак яєчників без рецидивів. Експресія ферментів екстрацелюлярного матриксу, одержаних з пухлин, та фібронектину є важливою у рості пухлин яєчників (Demeter, A, Szirmai, K, Olah, J, Papp, Z, and Jeney, A; Elevated expression of matrix metalloproteinase-9, and fibronectin concentration in recurrent epithelial ovarian cancer, Orv. Hetil., 2004, 145, 1617-1624). Той факт, що FN був одним з лише двох генів, які характеризувались значно зниженою експресією, з 1176 генів, проаналізованих в дослідженні, підтверджує гіпотезу ймовірної дії FN як важливого гену 10 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 супресора метастазування у випадках раку молочної залози (Urtreger, AJ, Werbajh, SE, Verrecchia, F, Mauviel, A, Puricelli, LI, Kornblihtt, AR, and Bal de Kier Joffe ED; Fibronectin is distinctly downregulated in murine mammary adenocarcinoma cells with high metastatic potential, Oncol. Rep., 2006, 16, 1403-1410). Авторами наукового звіту було виявлено, що три розчинні пептиди фібронектину (RGD, CS-1 та FN-C/H-V) індукують апоптоз в фібробластах легенів. Апоптоз відбувався шляхом порушення адгезії (аноїкозу). Використання невеликих фібронектинових пептидів для сприяння апоптозу фібробластів є гарантією їхнього подальшого вивчення як можливих варіантів проти-фіброзної терапії (Hadden, HL and Henke, CA; Induction of lung fibroblast apoptosis by soluble fibronectin peptides, Am.J Respir.Crit Care Med, 2000, 162, 1553-1560). Ще одне дослідження продемонструвало, що фібронектин (FN) стимулює проліферацію клітин немілкоклітинної карциноми легенів у людей (NSCLC). Показано, що FN підвищує рівень білку MMP-9, експресію мРНК та желатинолітичну активність в клітинах NSCLC (Han, S, Ritzenthaler, JD, Sitaraman, SV, and Roman, J; Fibronectin increases matrix metalloproteinase 9 expression through activation of cFos via extracellular-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in human lung carcinoma cells, J Biol Chem., 2006, 281, 29614-29624). В одному з досліджень вивчалося, чи можуть пухлино-супресивні ефекти сполук вітаміну D (VD) також бути опосередковані механізмами, які керують адгезивністю клітин. Введення малої інтерферуючої РНК проти FN призвело до зниженої експресії FN та зменшенню адгезивності клітин до матриксу колагену типу I. Результати цих досліджень підкреслили значимість FN в модулюванні адгезивності клітин раку щитовидної залози і, принаймні частково, в опосередкуванні функцій VD, пов'язаних з ростом неопластичних клітин (Liu, W, Asa, SL, and Ezzat, S; 1alpha, 25-Dihydroxyvitamin D3 targets PTEN-dependent fibronectin expression to restore thyroid cancer cell adhesiveness, Mol. Endocrinol., 2005, 19, 2349-2357). Генерація пухлино-асоційованих FN-ізоформ дозволяє розробляти специфічні ліганди (наприклад, антитіла), котрі можна використовувати для селективної доставки терапевтичних засобів в пухлинне оточення. FN використовується як мішень біомолекулярної інтервенції, як для розробки інгібіторних молекул, що блокують взаємодію FN з інтегринами та іншими рецепторами на поверхні клітин, так і для розробки цілеспрямованої візуалізації з використанням лігандів та для застосування стратегії лікування (Kaspar, M, Zardi, L, and Neri, D; Fibronectin as target for tumour therapy, Int. J Cancer, 2005, 118, 1331-1339). В одному з досліджень було продемонстровано, що експресія in vivo рекомбінантного CBD-HepIIполіпептиду FN, названого CH50, значною мірою інгібувала пухлинний ріст, інвазію та ангіогенез. Генна терапія з використанням CH50 не тільки підвищувала виживаність мишей з гепатокарциномою, але й стримувала ріст і здатність до інвазії пухлини в селезінку та її метастазування в печінку. В сукупності, ці результати підтверджують прийнятність CH50 в генній терапії раку печінки в майбутньому (Liu, Y, Huang, B, Yuan, Y, Gong, W, Xiao, H, Li, D, Yu, ZR, Wu, FH, Zhang, GM, and Feng, ZH; Inhibition of hepatocarcinoma and tumour metastasis to liver by gene therapy with recombinant CBD-HepII polypeptide of fibronectin, Int. J Cancer, 2007 121 (1) 184-92). Фібронектин (FN) має захищену функціональну ділянку (послідовність YTIYVIAL в межах III повтору 14-го типу), яка перешкоджає адгезії клітин до позаклітинного матриксу. 22мерний пептид FN, який вміщує цю ділянку (під назвою FNIII14), інгібує бета1- інтегринопосередковану адгезію без зв'язування з інтегринами. Дослідження показує, що FNIII14 має потенціал для запобігання метастазуванню клітин лімфоми (Kato, R, Ishikawa, T, Kamiya, S, Oguma, F, Ueki, M, Goto, S, Nakamura, H, Katayama, T, and Fukai, F; A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin, Clin Cancer Res., 2002, 8, 2455-2462). Рецептор епідермального фактору росту (EGFR) EGFR грає важливу роль в регулюванні проліферації, диференціації та виживаності нормальних клітин. З цієї причини, статус EGFR часто змінюється в багатьох типах пухлин у людей і, в цілому, корелює з несприятливим прогнозом. В неопластичних клітинах він сприяє їхньому росту та виживаності з використанням різних дивергентних шляхів (Maehama, T and Dixon, JE; The tumour suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, J Biol Chem., 1998, 273, 13375-13378). Аномалії в EGFR є однією з найбільш типових молекулярних аберацій в гліобластомі (Zawrocki, A and Biernat, W; Epidermal growth factor receptor in glioblastoma, Folia Neuropathol., 2005, 43, 123-132). Амліфікація EGFR та надмірна експресія мНРК часто зустрічаються у високо-злоякісних гліомах астроцитарного походження та завжди в значній мірі асоціюються з підвищеним рівнем білку EGFR (Wong, AJ, Bigner, SH, Bigner, DD, Kinzler, KW, Hamilton, SR, and Vogelstein, B; Increased expression of the epidermal growth factor receptor gene in malignant gliomas is invariably associated with gene amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1987, 84, 6899-6903;Chaffanet, M, 11 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Chauvin, C, Laine, M, Berger, F, Chedin, M, Rost, N, Nissou, MF, and Benabid, AL; EGF receptor amplification and expression in human brain tumours, 1992, Eur. J Cancer, 28, 11-17). Про надмірну експресію білку без генної ампліфікації доповідалося щодо мультиформних гліобластом (GBM) (до 27 % випадків захворювання), але також є інформація, що менш злоякісні астроцитоми та олігодендрогліоми демонстрували надмірну експресію EGFR без генної ампліфікації (Reifenberger, J, Reifenberger, G, Ichimura, K, Schmidt, EE, Wechsler, W, and Collins, VP; Epidermal growth factor receptor expression in oligodendroglial tumours, Am. J Pathol., 1996, 149, 29-35). Прогностічні дані щодо ампліфікації/надмірної експресії EGFR в пухлинах мозку є суперечливими. Ряд авторів не находять ніякого впливу ампліфікації/надмірної експресії EGFR на виживаність пацієнтів (Olson, JJ, Barnett, D, Yang, J, Assietti, R, Cotsonis, G, and James, CD; Gene amplification as a prognostic factor in primary brain tumours, Clin Cancer Res., 1998, 4, 215222; Newcomb, EW, Cohen, H, Lee, SR, Bhalla, SK, Bloom, J, Hayes, RL, and Miller, DC; Survival of patients with glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes, Brain Pathol., 1998, 8, 655-667; Waha, A, Baumann, A, Wolf, HK, Fimmers, R, Neumann, J, Kindermann, D, Astrahantseff, K, Blumcke, I, von, DA, and Schlegel, U; Lack of prognostic relevance of alterations in the epidermal growth factor receptor-transforming growth factoralpha pathway in human astrocytic gliomas, J Neurosurg., 1996, 85, 634-641), в той час як інші роблять висновок, що ці зміни є негативним прогностичним фактором (Etienne, MC, Formento, JL, Lebrun-Frenay, C, Gioanni, J, Chatel, M, Paquis, P, Bernard, C, Courdi, A, Bensadoun, RJ, Pignol, JP, Francoual, M, Grellier, P, Frenay, M, and Milano, G; Epidermal growth factor receptor and labelling index are independent prognostic factors in glial tumour outcome, Clin Cancer Res., 1998, 4, 2383-2390; Jaros, E, Perry, RH, Adam, L, Kelly, PJ, Crawford, PJ, Kalbag, RM, Mendelow, AD, Sengupta, RP, and Pearson, AD; Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumours, Br. J Cancer, 1992, 66, 373-385; Schlegel, J, Merdes, A, Stumm, G, Albert, FK, Forsting, M, Hynes, N, and Kiessling, M; Amplification of the epidermalgrowth-factor-receptor gene correlates with different growth behaviour in human glioblastoma, Int. J Cancer, 1994, 56, 72-77; Zhu, A, Shaeffer, J, Leslie, S, Kolm, P, and El-Mahdi, AM; Epidermal growth factor receptor: an independent predictor of survival in astrocytic tumours given definitive irradiation, Int. J Radiat. Oncol. Biol Phys., 1996, 34, 809-815). Існує небагато підходів до оцінки впливу молекули EGFR на ракову клітину. Найбільш детально вивчені підходи включають терапію специфічними антитілами з використанням неозброєних антитіл чи антитіл, поєднаних з токсинами, ліпосомами чи нуклідами, та використанням інгібіторів рецепторної тирозин-кінази. Є кілька типів моноклональних антитіл, спрямованих проти EGFRwt. Їхнє використання призводить до блокування доступу до рецептору для його лігандів (цетуксімаб) та/або швидкої інтерналізації рецептору (ABX-EGF) (Sridhar, SS, Seymour, L, and Shepherd, FA; Inhibitors of epidermal-growth-factor receptors: a review of clinical research with a focus on non-small-cell lung cancer, Lancet Oncol., 2003, 4, 397-406). Оскільки EGFRwt зустрічається також на поверхні нормальних клітин, побічні ефекти можуть обмежити його використання. EGFR надмірно експресується в плоскоклітинній карциномі голові і шиї (HNSCC), де рівні експресії корелюють зі зниженою виживаністю. Терапія, що блокує EGFR, показала обмежену ефективність в клінічних дослідженнях та, в основному, при поєданні зі стандартною терапією. EGFRvIII експресується в HNSCC, де він сприяє посиленому росту та резистентності до дії, спрямованої на EGFR дикого типу. Протипухлинна ефективність EGFR-спрямованих стратегій може бути посилена доданням EGFRvIII-специфічної блокади (Sok, JC, Coppelli, FM, Thomas, SM, Lango, MN, Xi, S, Hunt, JL, Freilino, ML, Graner, MW, Wikstrand, CJ, Bigner, DD, Gooding, WE, Furnari, FB, and Grandis, JR; Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting, Clin Cancer Res., 2006, 12, 5064-5073). Ще одна стратегія полягає в селективному індукуванні знищення клітин гліобластоми та інших ракових клітин, що надмірно експресують рецептор EGF. З використанням невірусного вектору доставки, котрий націлений на EGF-рецептор, синтетична анти-проліферативна дсРНК (поліінозин-цитозин [полі-IC]), сильний активатор апоптозу, була селективно націлена на ракові клітини. EGFR-спрямований полі-IC індукував швидкий апоптоз в клітинах-мішенях in vitro та in vivo. Доставка EGFR-спрямованого полі-IC до пухлини призводила до повної регресії виявлених раніше внутрішньочерепних пухлин у безтимусних Мишей з мутацією nude, без якоїсь явної токсичної дії на нормальну тканину мозку. Через рік після завершення лікування миші залишались здоровими, без ракового захворювання (Shir, A, Ogris, M, Wagner, E, and Levitzki, A; EGF receptor-targeted synthetic double-stranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer, and adenocarcinoma tumours in mice, PLoS. Med, 2006 Jan; 3(1):e6. Epub 2005 Dec 6). 12 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Застосування малих інтерферуючих РНК (міРНК) стало ефективним і високо специфічним засобом для модулювання генної експресії; широкий спектр онкогенів був успішно подавлений. Опосередковане міРНК зниження експресії EGFR було продемонстроване на двох розроблених клітинних лініях гліоми з різними рівнями експресії EGFR (U373 MG, LN18). Експресія мРНК EGFR та білку була знижена на 70-90 %. Однак, лікування міРНК не мало інгібіторного впливу на клітинну проліферацію, міграцію та статус активації зв'язаних з EGFR синальних каскадів. Згідно із цими результатами, аналіз генної експресії за допомогою мікрочипів виявив лише невеликі, хоча й специфічні зміни в моделях експресії. Отже, ці дані вказують, що специфічне зниження експресії EGFR може бути недостатнім для моно-терапевтичного підходу до лікування злоякісної гліоми (Vollmann, A, Vornlocher, HP, Stempfl, T, Brockhoff, G, Apfel, R, and Bogdahn, U; Effective silencing of EGFR with RNAi demonstrates non-EGFR dependent proliferation of glioma cells, Int. J Oncol., 2006, 28, 1531-1542). Було проведено кілька клінічних досліджень, що показали перспективні результати. Наприклад: h-R3 є гуманізованим моноклональним антитілом, що розпізнає зовнішній домен EGFR з високою афінністю, інгібуючи тирозин-кіназну активацію. Для оцінки безпеки, імуногенності та попередньої ефективності h-R3 у пацієнтів з вперше виявленою високозлоякісною гліомою, було проведене дослідження Фази I/II (Ramos, TC, Figueredo, J, Catala, M, Gonzalez, S, Selva, JC, Cruz, TM, Toledo, C, Silva, S, Pestano, Y, Ramos, M, Leonard, I, Torres, O, Marinello, P, Perez, R, and Lage, A; Treatment of high-grade glioma patients with the humanized antiepidermal growth factor receptor (EGFR) antibody h-R3: report from a phase I/II trial, Cancer Biol Ther., 2006, 5, 375-379). EKB-569 є потужним, селективним та незворотним інгібітором рецептору епідермального фактору росту (EGFR) з невеликою молекулярною вагою, що розробляється як протираковий препарат. У пацієнтів в Японії було проведено дослідження фази 1, з ескалацією дозування. На основі критеріїв RECIST, вони показали стабільне захворювання, однак, спостерігалася рентгенографічна регресія пухлини (Yoshimura, N, Kudoh, S, Kimura, T, Mitsuoka, S, Matsuura, K, Hirata, K, Matsui, K, Negoro, S, Nakagawa, K, and Fukuoka, M; EKB-569, a new irreversible epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, with clinical activity in patients with nonsmall cell lung cancer with acquired resistance to gefitinib, Lung Cancer, 2006, 51, 363-368). Гефітініб, специфічний інгібітор тирозин-кінази, асоційованої з рецептором епідермального фактору росту (EGFR), продемонстрував ефективність в підгрупі пацієнтів з немілкоклітинною карциномою легенів (NSCLC), у яких традиційна хіміотерапія не досягла успіху. Також доповідалося про його протипухлинний ефект при метастазуванні NSCLC в мозок. Крім того, мутації EGFR показали тісний зв'язок з чутливістю NSCLC до гефінітібу. Була визначена ефективність гефінітібу при мозкових метастазах від NSCLC, та оцінювалася залежність цієї ефективності від мутацій EGFR. Гефінітіб виявляється ефективним в лікуванні мозкових метастаз в підгрупі пацієнтів. Одержані дані підказують можливий зв'язок між ефективністю гефінітібу в лікуванні мозкових метастаз та мутаціями EGFR (Shimato, S, Mitsudomi, T, Kosaka, T, Yatabe, Y, Wakabayashi, T, Mizuno, M, Nakahara, N, Hatano, H, Natsume, A, Ishii, D, and Yoshida, J; 2006, EGFR mutations in patients with brain metastases from lung cancer: association with the efficacy of gefitinib, Neuro. Oncol., 8, 137-144). Хітіназа 3-подібна 2 (CHI3L2) CHI3L2 була спочатку ідентифікована з хондроцитів. Вона часто описувалася як антигенмішень в ревматоїдному артриті. Ніякого релевантного зв'язку СHI3L2 з раком не було ідентифіковано. Вважається, що хітіназа-3-подібні білки стимулюють проліферацію клітин з'єднувальних тканин людини, наприклад, фібробластів, шляхом активації екстрацелюлярної регуляторної кінази та подальшої активації PKB(протеїн-кіназа В) -залежного шляху передачі сигналів (Recklies AD, White C, Ling H; The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase-and protein kinase B-mediated signalling pathways; Biochem J. 2002; 365:119-126). Було виявлено, що у мишей хітіназа 3-подібні білки експресовані на високому рівні в моделях раку шлунку, викликаного Helicobacter (Takaishi S, Wang TC; Gene expression profiling in a mouse model of Helicobacter-induced gastric cancer; Cancer Sci. 2007 (3): 284-293) Даблкортин та CaM кініза-подібна 2 (DCAMKL2) Білок DCX, що асоціюється з мікротрубочками (MT), відіграє істотно важливу роль в розвитку кори головного мозку ссавців. Доповідалося про ідентифікацію протеїн-кінази, даблкортин- кінази-2 (DCAMKL2), з доменом (DC), високо-гомологічним до DCX. DCAMKL2 характеризується MT-зв'язувальною активністю, що асоціюється з його DC-доменом, та протеїнкіназною активністю, опосередкованою кіназним доменом, згідно із структурою, в якій два домени є функціонально незалежними. 13 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Надмірна експресія DCAMKL2 стабілізує цитоскелет MT проти холодової деполімеризації. Аутофосфорилювання DCAMKL2 набагато зменшує його афінність до MT. DCAMKL2 та мРНК DCX є специфічними до нервової системи та експресуються протягом періоду цереброкортикального розшарування. DCX має знижену експресію після пологів, в той час як DCAMKL2 продовжує існувати в надлишку в зрілому віці, і це наводить на думку, що DC-послідовність має раніше нерозпізнані функції в зрілій нервовій системі. В симпатичних нейронах, DCAMKL2 локалізується на тілі клітини і на термінальних сегментах аксонів та дендритів. DCAMKL2 може представляти залежний від фосфорилювання перемикач для реверсивного контролю MT-динаміки поблизу від нейрональних конусів росту. Моделі експресії, функціональної активності, регуляції та локалізації DCAMKL2 підтверджують те, що він функціонує паралельно або в тісній взаємодії з іншими членами сімейства генів DC (генів, кодуючих домен DC) під час подій, важливих для неврального розвитку та, в потенціалі, подій, характерних для зрілих нервових систем. DCAMKL2 складається з двох функціональних та незалежних доменів, MT- зв'язуючого та стабілізуючого домену (DC-послідовність) та кіназного домену з протеїн-фосфотрансферазною активністю. Було висловлено думку, що DC-послідовність грає вирішальну роль в трансдукуванні позаклітинних стимулів та їхніх внутрішньоклітинних сигналів в зміни в MT-динаміці. Зокрема, на основі здатності взаємодіяти з MT за способом, регульованим фосфорилюванням, та локалізуватися на термінальних сегментах аксонів та дендритів, тобто, ділянках, в яких MT є динамічно нестабільним, DCAMKL2 слід розглядати як потенціальний варіант посередника у швидких цитоскелетних перестановках, які відбуваються у відповідь на нейрональні сигнальні події (Edelman, AM, Kim, WY, Higgins, D, Goldstein, EG, Oberdoerster, M, and Sigurdson, W; Doublecortin kinase-2, a novel doublecortin-related protein kinase associated with terminal segments of axons and dendrites, J Biol Chem., 2005, 280, 8531-8543). ATФ-залежний калієвий канал 10, спрямовуючий калій всередину клітини (KCNJ10) Основна функція калієвих каналів внутрішнього спрямування (Kir) полягає у встановленні високої калієвої (K+) селективності мембрани гліальних клітин та різко негативного потенціалу покою (RMP), що є характерними фізіологічними властивостями глії. Класична ознака Kir в тому, що K+ тече всередину, коли RMP є негативним до потенціалу рівноваги для K+ (E(K)), але при більш позитивних потенціалах вихідні потоки уповільнюються. Ознакою глії CNS (центральної нервової системи) є її специфічна експресія підтипу KCNJ10, який є основним провідником K+ в мембранах гліальних клітин та грає ключову роль у встановленні гліального RMP. Отже, Kir і, зокрема, KCNJ10 є ключовими регуляторами гліальних функцій, що в свою чергу визначає нейрональну чутливість та передачу нервового збудження аксонами (Butt, AM and Kalsi, A; Inwardly rectifying potassium channels (Kir) in central nervous system glia: a special role for Kir4.1 in glial functions, J Cell Mol. Med, 2006, 10, 33-44). Знижені калієві та глутаматні буферні можливості астроцитів призводять до гіперзбудливості нейронів та аномальній синаптичній трансмісії. Канали KCNJ10, перш за все, відповідають за значну гіпер-поляризацію кортикальних астроцитів та можуть грати велику роль в буферизації калію. Значне інгібування виведення глутамату в астроцитах з відключеними KCNJ10 підкреслює роль мембранної гіпер-поляризації в цьому процесі (Kucheryavykh, YV, Kucheryavykh, LY, Nichols, CG, Maldonado, HM, Baksi, K, Reichenbach, A, Skatchkov, SN, and Eaton, MJ;, Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes, Glia 2006, 55 (3), 274-281). Локальна буферизація KCNJ10 позаклітинного K(+) в центральній нервовій системі може здійснюватись тільки завдяки нерівномірному розподілу KCNJ10 по поверхні гліальної клітини. Спостерігалося зміщення локалізації KCNJ10 в різних пухлинах мозку людини (низько- та високо-злоякісних астроцитомах та олігодендроцитомах), вказуючи на можливість порушення при цьому буферної здатності гліальних клітин, що в свою чергу може викликати приплив води (цитотоксичний набряк) (Warth, A, Mittelbronn, M, and Wolburg, H; Redistribution of the water channel protein aquaporin-4 and the K+channel protein Kir4.1 differs in low-and high-grade human brain tumours, Acta Neuropathol. (Berl), 2005, 109, 418-426). KCNJ10 також мав підвищену експресію в астроцитах в ушкодженому мозку. Була запропонована така гіпотеза: в астроцитах, в нормальних умовах, AQP4 поєднує водний транспорт з KCNJ10-опосередкованим помпуванням K+, але в патологічному стані AQP4 сприяє потоку рідини та набряку мозку, та KCNJ10 буферизує збільшений позаклітинний K+ (Saadoun, S, Papadopoulos, MC, and Krishna, S; Water transport becomes uncoupled from K+siphoning in brain contusion, bacterial meningitis, and brain tumours: immunohistochemical case review, J Clin Pathol., 2003, 56, 972-975). Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюжки, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема, 14 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом заміни їх боковим ланцюжком іншого природно існуючого амінокислотного залишку чи якимось іншим боковим ланцюжком) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою HLA, по суті, в такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися з прийнятною молекулою MHC, такою як HLA-A або -DR, та якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність утворювати активований CTL, що може розпізнавати та та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність, як визначено в аспектах винаходу. Як можна дізнатися з бази даних, окремі позиції HLA-A- зв'язуючих пептидів є, зазвичай, доменними залишками, що формують ключову послідовність, яка відповідає за зв'язок у порожнини зв'язування HLA. Ті амінокислотні залишки, що не суттєвими для взаємодії з T-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має значного впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНC. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид винаходу може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи варіант, що надається. Крім того, відомо, стосовно МНС-презентуючих пептидів (класу II) відомо, що ці пептиди складаються з "ключової послідовності", яка має певний HLA-специфічний амінокислотний фрагмент та, додатково, N- та/або C-термінальні подовження, які не втручаються у функцію ключової послідовності (тобто, вважаються не релевантними до взаємодії пептиду та усіх клонів або субпопуляції клонів T-клітин, які розпізнають природну копію). N- та/або C-термінальні подовження можуть мати довжину, наприклад, від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Ці пептиди можуть використовуватись безпосередньо для завантаження MHC-молекул класу II, або послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описом. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватися довші пептиди. Пептиди винаходу можуть мати будь-який розмір, але, як правило, вони можуть бути меншими, ніж 100 000, за молекулярною вагою, переважно, меншими, ніж 50 000, ще більш переважно меншими, ніж 10 000 та, зазвичай, приблизно дорівнюючими 5 000. Стосовно кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше 1000 залишків, переважно менше, ніж 500 залишків, та ще більш переважно менше 100 залишків. Відповідно, цей винахід також надає пептиди та їхні варіанти, в яких пептид чи варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно, від 8 до 30, та найбільш переважно - від 8 до 16, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 чи 16 амінокислот. Відповідно, природно існуючі або штучні варіанти, що індукують перехресне реагування Tклітин з пептидом винаходу, часто є варіантами з різною довжиною. Приклади для таких природно існуючих варіантів довжини надані в Таблиці 1 для послідовностей SEQ ID NOs 11 та 12, 21 та 24, відповідно. Якщо пептид, більший ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування з MHC-молекулою класу ІІ, бажано, щоб залишки, розташовані по краях основної ділянки зв'язування HLA, не мали значного впливу на здатність пептиду специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування MHC-молекули класу ІІ чи презентувати пептид в CTL. Однак, як вже зазначалося вище, перевага надається використанню більш крупних пептидів, особливо, коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більш крупні пептиди можуть розділятися на частини відповідними антиген-презентуючими клітинами. Також можливо, щоб епітопи MHC класу I, хоча вони мають, зазвичай, довжину 8-10 амінокислот, утворювались шляхом процесингу пептидів з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Подібно епітопам MHC класу II, бажано, щоб залишки, розташовані по краях ділянки зв'язування, не мали значного впливу на здатність пептиду специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування MHC-молекули класу I чи презентувати пептид в CTL, і не маскували ділянки для протеолітичного розпаду, необхідні для експозиції фактичного епітопу в ході процесингу. Відповідно, цей винахід також пропонує пептиди та варіанти епітопів MHC класу I, які мають загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 до 16, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 амінокислот. Звичайно, пептид чи варіант, відповідно до цього винаходу, матимуть здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (MHC) класу I чи II. Зв'язування пептиду чи варіанту з MHC-комплексом мое бути перевірене за допомогою методів, добре відомих в цій галузі, наприклад, описаних у прикладі 4 цього винаходу чи в довідковій літературі для різних алелів MHC класу II (наприклад, в роботах Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus 15 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association;.J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993; 163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776). В переважному втіленні винаходу пептид складається чи по суті складається з амінокислотної послідовності відповідно до послідовності від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 29. Вираз "по суті, складається" означає, що пептид, згідно із цим винаходом, на додаток до будь-якої послідовності за номерами від SEQ ID No. 1 дo SEQ ID No. 29, чи її варіанту, вміщує додаткові N- та/або C-термінальні ділянки амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як епітоп для епітопу МНС-молекул. Однак, ці ділянки можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду, відповідно до цього винаходу, в клітини. В одному з втілень цього винаходу, пептид цього винаходу є гібридним білком, який вміщує, наприклад, 80 N-термінальних амінокислот HLA-DRантиген-асоційованого інваріантного ланцюгу (p33, надалі "Ii"), одержаного з NCBI, інвентарний номер в генному банку (GenBank) X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 1984, 3 (4), 869-872). Крім того, пептид чи варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності та/або зв'язку із молекулами MHC, щоб викликати сильнішу імунну реакцію. Методи для такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків. В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-CO-NH-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть вироблятися за методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі Meziere et al J. Immunol. 1997, 159, 3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Такий підхід включає формування псевдо-пептидів, які вміщують зміни із залученням основи, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Meziere et al (1997) показують, що для реакцій клітин MHC і T-клітин- хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретроінверсивні пептиди, які вміщують зв'язки NH-CO замість пептидних зв'язків CO-NH, набагато більш стійкі до протеолізу. Непептидний зв'язок – це, наприклад, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, CH(OH)CH2- та -CH2SO-. Патент США 4,897,445 пропонує метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-CH2-NH) в поліпептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних процедур, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності NaCNBH3. Пептиди, що включають послідовності винаходу, як описано вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- та/або карбоксильних кінцях, зокрема, для посилення стабільності, біологічної доступності та/або афінності пептидів. Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи t-бутилоксикарбонільні групи можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-фторенілметокси-карбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також, наприклад, гідрофобна група, tбутилоксикарбонільна чи амідо-група. Крім того, всі пептиди винаходу можуть бути синтезовані для зміни їхньої стеричної конфігурації. Наприклад, може використовуватися D-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний L-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів винаходу може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків не природного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності та/або функції зв'язування пептидів винаходу. 16 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Подібним чином, пептид чи варіант винаходу може модифікуватися хімічно, шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, без обмежень, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального алкілювання, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензол-сульфоновою кислотою (TNBS), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення цистеїну надмурашиною кислотою в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання йодооцтовою кислотою чи йодоацетамідом та карбамоїлування цианатом при лужному pH, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними вище. В цьому відношенні, досвідчений спеціаліст повинен звернутися до Глави 15 роботи Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), де викладена детальна методика відносно хімічної модифікації білків. Стисло кажучи, модифікація, наприклад, аргінілових залишків в білках часто базується на реакції віцинальних дикарбонілових сполук, таких як фенілгліоксаль, 2,3-бутанедіон та 1,2циклогексанедіон, для утворення адукту. Ще один приклад – це реакція метилгліоксалю з аргініновими залишками. Цистеїн може модифікуватися без супутньої модифікації інших нуклеофільних ділянок, таких як лізин і гістидин. В результаті, доступна велика кількість реактивів для модифікації цистеїну. Веб-сайти Pierce Chemical Company, Sigma-Aldrich та інших надають інформацію про окремі реактиви. Типовим також є селективне відновлення дисульфідних зв'язків в білках. Дисульфідні зв'язки можуть формуватися та окиснюватися при тепловій обробці біофармацевтичних препаратів. К-реагент Вудварда може використовуватися для модифікації окремих залишків глутамінової кислоти. N-(3-(діметиламіно)пропіл)-N’-етилкарбодиімід може бути застосований для утворення внутрішньомолекулярних крос-лінків між лізиновим залишком та залишком глутамінової кислоти. Діетилпірокарбонат, наприклад, є реактивом для модифікації гістидилових залишків в білках. Гістидин також може бути модифікований із використанням 4гідрокси-2-ноненалу. Реакція лізинових залишків та інших α-аміно-груп є, наприклад, прийнятною у зв'язуванні пептидів з поверхнями або перехресному зшиванні білків/пептидів. Лізин – це місце приєднання полі(етилен)гліколю та основна ділянка модифікації при глікуванні білків. Метіонінові залишки в білках можуть бути модифіковані, наприклад, за допомогою йодоацетаміду, бромоетиленаміну, хлораміну T. Тетранітрометан та N-ацетилімідазол можуть використовуватися для модифікації тирозильних залишків. Перехресне зшивання шляхом формування дитирозину може здійснюватися за допомогою пероксиду водню/іонів міді. В недавніх дослідженнях щодо модифікації триптофану використовувався Nбромосуккінімід, 2-гідрокси-5-нітробензил-бромід чи 3-бромо-3-метил-2-(2-нітрофенілмеркапто)3H-індол (BPNS-скатол). Успішна модифікація PEG (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням полу-періоду циркуляції при перехресному зшиванні білків з глютаральдегідом, поліетиленгліколь-діакрилатом та формальдегідом, використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування з ціанатом калію. Пептид чи варіант, в якому пептид модифікується чи включає непептидні зв'язки, є переважним втіленням винаходу. В цілому, пептиди та варіанти (принаймні, ті, що вміщують пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані, наприклад, із використанням Fmocполіамідного способу синтезу пептидів твердої фази, як розкривається в роботі Lu et al J. Org. Chem. 1981, 46, 3433 та посиланнях на літературні джерела, наведених в ній. Тимчасовий захист N-аміно-групи забезпечується 9-фторенілметилоксикарбонільною (Fmoc) групою. Повторне розщеплювання цієї високо-лабільної основної захисної групи виконується із використанням 20 % піперидину в N, N-діметилформаміді. Функціональність бокових ланцюгів може захищатися у виді їхніх простих бутилових ефірів (у випадку серинового треоніну і тирозину), складних бутилових ефірів (у випадку глутамінової кислоти та аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільних похідних (у випадку лізину та гістидину), тритилового похідного (у випадку цистеїну) та 4-метокси-2,3,6-тріметилбензолсульфонільного похідного (у випадку аргініну). Коли глютамін чи аспарагін є C-термінальними залишками, використовується 4,4'діметоксибензогідрильна група для захисту функціональних амідних груп бокових ланцюгів. В якості твердофазної підкладки використовують полідиметил-акриламідний полімер, що 17 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з трьох мономерів, диметилакриламіду (основний мономер), бісакрилоїлетилендіаміну (крос-лінкер) та метилового ефіру акрилоїлсаркозину (функціональна речовина). Використовувана речовина пептидно-полімерного зв'язку, що розщеплюється, - це кислотно-лабільна похідна 4-гідроксиметил-феноксиоцтової кислоти. Усі амінокислотні похідні додаються у виді їхніх сформованих симетричних ангідридних похідних, за винятком аспарагіну та глютаміну, що додаються за допомогою реверсованої процедури зв'язку, де посередником виступає N, N-діциклогексил-карбодиімід/1гідроксибензотриазол. Контроль усіх реакцій зв'язування та зняття захисту ведеться із використанням нінгідринового, тринітробензолсульфоново-кислотного чи ізотинового тестів. Після завершення синтезу пептиди звільняються від полімерної підкладки з одночасним видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 % трифтороцтовою кислотою, яка вміщує 50 % суміші поглиначів. Поглиначі, які зазвичай використовуються, – це етандітіол, фенол, анізол та вода; точний вибір залежить від амінокислот-складників пептиду, який синтезується. Крім того, можлива комбінація методик твердої фази і рідкої фази для синтезу пептидів (див. наприклад, Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-ton quantities for drugs of the future Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb; 5(1):29-43 та наведені в цій роботі посилання). Трифтороцтова кислота видаляється шляхом випарювання у вакуумі, з подальшим розтиранням в порошок з діетиловим ефіром, з одержанням первинного пептиду. Будь-які присутні поглиначі видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дає первинний пептид, вільний від поглиначів. Реактиви для пептидного синтезу, взагалі, можна одержати, наприклад, в компанії Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. Очищення може виконуватися за допомогою будь-якого одного чи кількох методів, таких як рекристалізація, гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, ацетонітріл/ вода. Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (CSPE), зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після гідролізу кислот та мас-спектрометричного аналізу аналізу із бомбардуванням прискореними атомами (FAB), а також мас-спектрометричного аналізу MALDI та ESI-Q-TOF. Ще один аспект винаходу пропонує нуклеїнову кислоту (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи варіант винаходу. Полінуклеотид, наприклад, може бути ДНК, кДНК, ПНК, СНК, РНК, мРНК та міРНК чи їхньою комбінацією, одно- та/або двонитковою, природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіатним скелетом; він може вміщувати або не вміщувати інтрони, за умови, що полінуклеотид кодує пептид. Звичайно, тільки ті пептиди, що вміщують природно існуючи амінокислотні залишки, з'єднані природними пептидними зв'язками, кодуються полінуклеотидом. Інший аспект винаходу пропонує вектор експресії, здатний експресувати поліпептид, відповідно до винаходу. Були розроблені різноманітні методи для оперативного зв'язку полінуклеотидів, зокрема, ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних когезійних сайтів термінації. Наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки можуть додаватися до ДНК-сегменту для введення у векторну ДНК. Вектор та ДНК-сегмент потім з'єднуються шляхом водневого зв'язку між комплементарними гомополімерними кінцями для формування рекомбінантних молекул ДНК. Синтетичні лінкери, які вміщують один чи кілька рестрикційних сайтів, забезпечують альтернативний метод з'єднання ДНК-сегменту з векторами. Синтетичні лінкери, що вміщують ряд рестрикційних сайтів ендонуклеази, можна придбати в багатьох компаніях, включаючи International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, США. Бажаним способом модифікації ДНК, що кодує поліпептид винаходу, є використання ланцюгової полімеразної реакції, як розкривається в роботі Saiki et al (1988) Science 239, 487491. Цей метод може застосовуватись для введення ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення належних рестрикційних сайтів, чи для модифікації ДНК іншими прийнятними шляхами, які відомі в цій галузі. Якщо використовуються вірусні вектори, переважними є вектори, основані на вірусі віспи чи аденовірусі. ДНК (або, у випадку ретровірусних векторів, РНК) може потім експресуватися в належному організмі хазяїна для утворення поліпептиду, що становить пептид чи варіант винаходу. Таким 18 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чином, ДНК, що кодує пептид або варіант винаходу, може використовуватися за відомими методами, відповідним чином модифікованими згідно із доктринами, вміщеними тут, для створення вектору експресії, що згодом використовується для трансформації відповідної клітини хазяїна з метою експресії та формування поліпептиду винаходу. Такі методики включають ті, що розкриті в патентах США, а саме: патент № 4,440,859, виданий 3 квітня 1984 р. авторам Rutter et al, № 4,530,901, виданий 23 липня 1985 автору Weissman, № 4,582,800, виданий 15 квітня 1986 р. автору Crowl, № 4,677,063, виданий 30 червня 1987 р. авторам Mark et al, № 4,678,751, виданий 7 липня 1987 р. автору Goeddel, № 4,704,362, виданий 3 листопада 1987 р. авторам Itakura et al, № 4,710,463, виданий 1 грудня 1987 р. автору Murray, № 4,757,006, виданий 12 липня 1988 р. авторам Toole, Jr. et al, № 4,766,075, виданий 23 серпня 1988 р. авторам Goeddel et al та № 4,810,648, виданий 7 березня 1989 р. автору Stalker, всі з яких включені в цей документ шляхом посилань. ДНК (або, у випадку ретровірусних векторів, РНК), що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може з'єднуватись з різними іншими ДНК-послідовностями для введення в належний організм хазяїна. Супутня ДНК буде залежати від характеру хазяїна, способу введення ДНК до хазяїна та від того факту, чи бажане епісомне утримання або інтеграція. В цілому, ДНК вводиться у вектор експресії, такий як плазміда, в належній орієнтації та з відповідною рамкою зчитування для експресії. При необхідності, ДНК може зв'язуватися з належними нуклеотидними послідовностями транскрипційного і трансляційного регуляторного контролю, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи взагалі є доступними у векторі експресії. Вектор потім вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. В цілому, не всі організми-хазяїни будуть трансформуватися вектором. Таким чином, виникає необхідність обрати трансформовані клітини хазяїна. Одна з методик вибору включає введення у вектор експресії ДНК-послідовності з будь-якими необхідними контрольними елементами, що кодує специфічну рису у трансформованій клітині, наприклад, резистентність до антибіотиків. Як альтернативний варіант, ген для такої специфічної риси може бути на іншому векторі, котрий використовується для ко-трансформації бажаної клітини хазяїна. Клітини хазяїна, трансформовані рекомбінантною ДНК винаходу, потім культивуються протягом достатнього часу в належних умовах, які відомі досвідченим фахівцям, з урахуванням розкритих в цьому документі доктрин, щоб дозволити експресію поліпептиду, котрий згодом може бути виділений. Існує багато систем експресії, включаючи бактерії (наприклад, E. coli та Bacillus subtilis), дріжджі (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), нитковидні грибки (наприклад, Aspergillus), клітини рослин, тварин і комах. Переважною системою можуть бути клітини ссавців, такі як клітини колоректальних ракових пухлин чи гліобластоми, котрі можна одержати в ATCC Cell Biology Collection. Типовою векторною плазмідою клітин ссавців є pSVL, що є в наявності в компанії Pharmacia, Piscataway, Нью-Джерсі, США Прикладом індукованого вектору експресії у ссавців є pMSG, який також можна придбати в Pharmacia. Прийнятними плазмідними векторами дріжджів є pRS403406 та pRS413-416, що, як правило, доступні для придбання в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Каліфорнія 92037, США. Плазміди pRS403, pRS404, pRS405 та pRS406 - це дріжджові інтегровані плазміди (YIp), що включають специфічні маркери дріжджів HIS3, TRP1, LEU2 та URA3. Плазмідами pRS413-416 є дріжджові центромерні плазміди (Ycps). Існують також інші вектори та системи експресії, для використання з клітинами різних хазяїв. Цей винахід також відноситься до клітини хазяїна, що трансформується полінуклеотидним вектором даного винаходу. Клітина хазяїна може бути прокаріотом чи еукаріотом. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами хазяїна, в деяких обставинах це типові штами E. coli, такі як, наприклад, штами DH5 E. coli, які можна придбати в Bethesda Research Laboratories Inc., Бетесда, Меріленд, США, та RR1, доступні для придбання в American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, Меріленд, США (№ ATCC 31343). Переважні еукаріотичні клітини хазяїна включають клітини дріжджів, комах та ссавців, переважно клітини хребетних, такі як клітини мишей, пацюків, мавп чи фібробластичні клітинні лінії та клітинні лінії товстої кишки людини. Дріжджові клітини хазяїна включають YPH499, YPH500 та YPH501, що, як правило, є доступними для придбання в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Каліфорнія 92037, США. Переважні клітини хазяїна у ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), що можна придбати в ATCC під номером CCL61, клітини ембріона NIH швейцарської миші NIH/3T3, доступні для придбання в ATCC під номером CRL 1658, клітини COS-1, виділені з нирок мавпи, що є в наявності для продажу в ATCC під номером CRL 1650 та 19 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клітини 293, які представляють клітини нирок ембріону людини. Переважними клітинами комах є клітини Sf9, в які можуть вводитись вектори експресії бакуловірусу. Трансформація клітин хазяїна ДНК-конструкцією цього винаходу виконується за допомогою добре відомих методів, що, як правило, залежать від типу використовуваного вектору. Трансформація прокаріотичних клітин хазяїна описана, наприклад, в роботах Cohen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2110 та Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Трансформація дріжджових клітин описана в роботі Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Метод Бегса – Beggs, Nature 1978, 275,104-109 – також є прийнятним. Стосовно клітин хребетних, реактиви, які використовуються для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію та DEAE-декстран чи ліпосомні композиції, можна придбати в компаніях Stratagene Cloning Systems або Life Technologies Inc., Gaithersburg, Меріленд 20877, США. Електропорація також прийнятна для трансформації та/або трансфекції клітин і є добре відомим методом трансформації дріжджових клітин, бактеріальних клітин, клітин комах та хребетних. Успішно трансформовані клітини, тобто, клітини, які вміщують ДНК-конструкцію цього винаходу, можна ідентифікувати за допомогою добре відомих методик, таких як PCR (ланцюгова полімеразна реакція). Альтернативно, присутність білку в надосадовій рідині може визначатися із використанням антитіл. Далі роз'яснюється, що певні клітини хазяїна, згідно із винаходом, можуть застосовуватись у підготовці пептидів винаходу, наприклад, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини комах. Однак, в ряді терапевтичних методів можуть бути застосовними інші клітини хазяїна. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть з успіхом використовуватись для експресування пептидів винаходу, за умови, що вони можуть надходити у відповідні MHC-молекули. Отже, цей винахід пропонує клітину хазяїна, яка вміщує нуклеїнову кислоту або вектор експресії, згідно із винаходом. В переважному втіленні, клітиною хазяїна є антиген-презентуюча клітина, зокрема, дендритна клітина або антиген-презентуюча клітина. APC, в які завантажений рекомбінантний гібридний білок, що вміщує кислотну фосфатазу простати (PAP), зараз вивчаються з метою лікування раку простати (Sipuleucel–T) (Small EJ, Schellhammer PF, Higano CS, Redfern CH, Nemunaitis JJ, Valone FH, Verjee SS, Jones LA, Hershberg RM.; Placebo-controlled phase 3 trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer; J Clin Oncol. 2006; 24(19):3089-3094; Rini BI, Weinberg V, Fong L, Conry S, Hershberg RM, Small EJ; Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (Provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy; Cancer. 2006; 107(1):67-74) Ще один аспект винаходу пропонує метод створення пептиду чи його варіанту. Метод полягає в культивуванні клітини хазяїна та виділенні пептиду з клітини хазяїна або з середовища для культивування. Ще в одному втіленні, пептид, нуклеїнова кислота чи вектор експресії винаходу використовуються в медицині. Наприклад, пептид чи варіант можуть бути підготовлені для внутрішньовенного (i.v.) введення, підшкірного (s.c.) введення, інтрадермального (i.d.) введення, внутрішньочеревного (i.p.) введення, внутрішньом'язового (i.m.) введення. Переважними способами введення s.c., i.d., i.p., i.m. та i.v. Переважними способами введення ДНК є i.d., i.m., s.c., i.p. та i.v. Можуть вводитись дози, наприклад, від приблизно 50 мкг до 1.5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг пептиду чи ДНК, та вони будуть залежати від відповідного пептиду чи DNA. Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Важливим аспектом цього винаходу є метод in vitro для виробництва активованих CTL. Метод включає контакт CTL in vitro з антиген-завантаженими MHC-молекулами класу I або II людини, експресованими на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації CTL антиген-специфічним способом, коли антиген являє собою пептид згідно із винаходом. Переважно, з антиген-презентуючою клітиною використовується достатня кількість антигену. 20 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Коли як антиген використовується епітоп MHC класу II, CTL є CD4-позитивними клітинамихелперами, переважно TH1-типу. MHC-молекули класу II можуть експресуватися на поверхні будь-якої прийнятної клітини, та переважно, щоб клітина природно не експресувала MHCмолекули класу II (в цьому випадку виконується трансфекція клітини для експресії такої молекули) або, якщо вона природно експресує MHC-молекули класу II, вона є дефектною в шляхах процесінгу чи презентації ангигену. Таким чином, для клітини, що експресує MHCмолекулу класу II, можливо примування, по суті, повністю, обраним пептидним антигеном до активації CTL. Антиген-презентуюча клітина (чи клітина-стимулятор), як правило, має на своїй поверхні MHC-молекулу класу II та переважно не здатна, сама по собі, завантажувати зазначену MHCмолекулу класу II обраним антигеном. MHC-молекула класу II може легко завантажуватись обраним антигеном in vitro. Переважно, клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР, чи має його знижений рівень або зменшену функцію. Відповідні клітини, в яких немає пептидного транспортера ТАР, включають T2, RMA-S та клітини дрозофіли. TAP is the Transporter Associated with antigen Processing. TAР - це Транспортер, асоційований з Процесінгом Антигенів. Клітинна лінія Т2, яка не здатна завантажувати пептиди людини, є доступною для придбання в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Мері ленд 20852, США, номер за каталогом CRL 1992; лінія клітин дрозофіли, лінія Schneider 2, доступна для придбання в ATCC, номер за каталогом CRL 19863; клітинна лінія миші RMA-S описана авторами Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745. Переважно, щоб клітина хазяїна перед трансфекцією не експресувала MHC-молекули класу I. Також бажано, щоб клітина-стимулятор експресувала молекулу, важливу для ко-стимуляції Тклітини, наприклад, будь-яку з B7.1, B7.2, ICAM-1 та LFA 3. Нуклеїново-кислотні послідовності різних MHC-молекул класу II, а також ко-стимуляторних молекул, доступні в базах даних GenBank та EMBL. Подібним чином, у випадку, коли як антиген використовується епітоп MHC класу I, CTL є CD8-позитивні клітини-хелпери. MHC-молекули класу I можуть експресуватися на поверхні будь-якої прийнятної клітини, та переважно, щоб клітина природно не експресувала MHCмолекули класу I (в цьому випадку виконується трансфекція клітини для експресії такої молекули) або, якщо вона природно експресує MHC-молекули класу I, вона є дефектною в шляхах процесінгу чи презентації антигену. Таким чином, для клітини, що експресує MHCмолекулу класу I, можливо примування, по суті, повністю, обраним пептидним антигеном до активації CTL. Якщо антиген-презентуюча клітина трансфекується для експресування такого епітопу, переважно, щоб клітина вміщувала вектор експресії, здатний експресувати пептид, що включає послідовності від SEQ ID NO 1 до SEQ ID NO 29 чи варіант амінокислотної послідовності. Для генерації CTL in vitro може використовуватись ряд інших методів. Наприклад, методи, описані в роботах Peoples et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 432-436 та Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148, 638-643, використовують аутологічні лімфоцити з популяцій пухлинних клітин в генерації CTL. Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 описує використання аутологічних лімфоцитів периферичної крові (ЛПК) для отримання CTL. Робота Jochmus et al (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 стосується створення аутологічних CTL шляхом імпульсного введення пептиду чи поліпептиду до дендритних клітин або інфікування рекомбінантним вірусом. Автори роботи Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 та Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 використовують B-клітини у формуванні аутологічних CTL. Крім того, макрофаги, завантажені пептидом чи поліпептидом імпульсним методом або інфіковані рекомбінантним вірусом, можуть використовуватись для отримання аутологічних CTL. Автори S. Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171 (10):4974-8) описують примування Т-клітин in vitro, з використанням штучних антиген-презентуючих клітин, котрі є також прийнятним методом для генерації T-клітин проти обраного пептиду. Алогенні клітини також можуть використовуватись у підготовці CTL, та зразок такого способу детально описаний в патенті WO 97/26328, включеному шляхом посилання. Наприклад, на додаток до клітин дрозофіли та клітин T2, можуть застосовуватись інші клітини для представлення антигенів, такі як клітини CHO, клітини комах, інфіковані бакуловірусом, клітини бактерій, дріжджів та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою. Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Porta et al, Virology, 1994, 202, 449 21 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 955, в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів. Активовані CTL, коли вони спрямовуються проти пептидів винаходу, є корисними в терапії. Отже, ще один аспект винаходу пропонує активовані CTL, що одержуються за допомогою згаданих вище методів винаходу. Активовані CTL, продуковані за допомогою наведеного вище методу, будуть селективно розпізнавати клітину, що аберантно експресує поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність від SEQ ID NO 1 до 29. Переважно, CTL розпізнає клітину шляхом взаємодії через її TCR з комплексом HLA/пептид (наприклад, зв'язування). CTL є корисними у методі знищення клітин-мішеней у пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу. Пацієнту вводиться ефективна кількість активованих CTL, і CTL, що вводяться пацієнту, можуть бути одержані у пацієнта та активовані, як описано вище (тобто, вони є аутологічними CTL). Альтернативно, CTL одержуються не від пацієнта, а від іншої людини. Безумовно, переважно, якщо донор є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" мається на увазі, що людина взагалі має добре здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, що може бути легко перевірено та виявлено. Клітини-мішені in vivo для CD4-позитивних CTL, відповідно до цього винаходу, можуть бути клітинами пухлини (котрі іноді експресують MHC класу II) та/або стромальними клітинами, що оточують пухлину (пухлинні клітини) (котрі іноді також експресують MHC класу II; (Dengjel, J, Nastke, MD, Gouttefangeas, C, Gitsioudis, G, Schoor, O, Altenberend, F, Muller, M, Kramer, B, Missiou, A, Sauter, M, Hennenlotter, J, Wernet, D, Stenzl, A, Rammensee, HG, Klingel, K, and Stevanovic, S; Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas, Clin Cancer Res., 2006, 12, 4163-4170)). CTL винаходу можуть використовуватися як активні інгредієнти в терапевтичній композиції. Отже, винахід також пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені аберантно експресують поліпептид, шо вміщує амінокислотну послідовність винаходу. Метод включає введення пацієнту ефективної кількості CTL, як описано вище. Під терміном "аберантно експресовані" ми маємо на увазі, що поліпептид надмірно експресований, в порівнянні з нормальними рівнями експресії, або що ген є мовчазним у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Термін "надмірно експресований" трактується авторами винаходу таким чином: поліпептид присутній на рівні, що принаймні в 1.2 рази перевищує рівень, який спостерігається в нормальній тканині; та переважно, принаймні, в 2 рази та ще більш переважно, принаймні, в 5 або 10 разів більше рівня, присутнього в нормальній тканині. CTL можуть одержуватися за методами, відомими в цій галузі, наприклад, такими, як описано вище. Протоколи для так званого адоптивного переносу CTL добре відомі в цій галузі, та їх можна знайти, наприклад в роботах (Rosenberg, SA, Lotze, MT, Muul, LM, Chang, AE, Avis, FP, Leitman, S, Linehan, WM, Robertson, CN, Lee, RE, Rubin, JT, et al., A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone, N. Engl. J. Med., 1987, 316, 889-897; Rosenberg, SA, Packard, BS, Aebersold, PM, Solomon, D, Topalian, SL, Toy, ST, Simon, P, Lotze, MT, Yang, JC, Seipp, CA, et al.; Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report, N.Engl.J Med, 1988, 319, 1676-1680; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Robbins, PF, Yang, JC, Hwu, P, Schwartzentruber, DJ, Topalian, SL, Sherry, R, Restifo, NP, Hubicki, AM, Robinson, MR, Raffeld, M, Duray, P, Seipp, CA, Rogers-Freezer, L, Morton, KE, Mavroukakis, SA, White, DE, and Rosenberg, SA; Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes, Science, 2002, 298, 850-854; Yee, C, Thompson, JA, Byrd, D, Riddell, SR, Roche, P, Celis, E, and Greenberg, PD; Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A, 2002, 99, 1616816173; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Yang, JC, Sherry, RM, Topalian, SL, Restifo, NP, Royal, RE, Kammula, U, White, DE, Mavroukakis, SA, Rogers, LJ, Gracia, GJ, Jones, SA, Mangiameli, DP, Pelletier, MM, Gea-Banacloche, J, Robinson, MR, Berman, DM, Filie, AC, Abati, A, and Rosenberg, SA; Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma, J. Clin. Oncol., 2005, 23, 2346-2357); їх огляд наведений в (Gattinoni, L, Powell, DJ, Jr., Rosenberg, SA, and Restifo, NP; Adoptive immunotherapy for cancer: building on success, Nat. Rev. Immunol., 2006, 6, 383-393) та (Morgan, 22 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 RA, Dudley, ME, Wunderlich, JR, Hughes, MS, Yang, JC, Sherry, RM, Royal, RE, Topalian, SL, Kammula, US, Restifo, NP, Zheng, Z, Nahvi, A, de Vries, CR, Rogers-Freezer, LJ, Mavroukakis, SA, and Rosenberg, SA; Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science, 2006, 314 (5796): 126-129). Будь-яка молекула винаходу, тобто, пептид, нуклеїнова кислота, вектор експресії, клітина, активований CTL, T-клітинний рецептор чи нуклеїнова кислота, що кодує його, є прийнятними для лікування порушень, які характеризуються клітинами, що уникають імунної реакції. Отже, будь-яка молекула цього винаходу може використовуватись як медикамент чи у виготовленні медикаменту. Молекула може бути використана сама по собі чи комбінована з іншими молекулами винаходу чи відомими молекулами. Переважним медикаментом є вакцина. Вона може вводитись пацієнту безпосередньо, в уражений орган чи системно, або застосовуватись ex vivo до клітин, виділених у пацієнта чи клітинної лінії людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись in vitro для обирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються у пацієнта і потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини in vitro, вона може бути корисною для клітин, що трансфекуються, щоб спільно експресувати імунно-стимулюючі цитокіни, наприклад, такі як інтерлейкін -2. Пептид може бути, по суті, чистим, або поеднаним з імуно-стимулюючим ад'ювантом (див.нижче) чи використовуватись в комбінації з імунно-стимулюючими цитокінами, або вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може поєднуватись з належним носієм, таким як гемоцианін лімфи равлика (KLH) або маннан (див. WO 95/18145 та Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид також може бути міченим, і бути гібридним білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовність яких надається в цьому винаході, стимулюють CD4 або CD8 CTL. Однак, стимуляція більш ефективна у присутності підтримки, яка надається T-клітинами, позитивними до протилежного CD. rovided by T-cells positive for the opposite CD. Отже, для епітопів MHC Класу II, які стимулюють CD4 CTL, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, що стимулюють CD8-позитивні T-клітини. З іншої сторони, для епітопів MHC Класу I, які стимулюють CD8 CTL, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, котрі стимулюють CD4-позитивні T-клітини. CD4- та CD8стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході. В одному з аспектів винаходу, вакцина вміщує принаймні один пептид, переважно від двох до 50, більш переважно від двох до 25, навіть більш переважно від двох до 15 та найбільш переважно два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять або тринадцять пептидів винаходу чи додаткових пептидів. Пептиди можуть бути одержані з одного чи кількох специфічних TAA та можуть зв'язуватись з молекулами MHC класу I та/або класу II. Переважно, коли пептиди винаходу використовуються у вакцині чи у медикаменті винаходу, вони представлені як сіль, наприклад, але без обмежень, яе ацетат чи хлорид. Приклад 7 описує дослідження вакцини IMA-910, котра вміщує деякі з пептидів цього винаходу, та препарат вакцини з використанням пептидів в формі солі, а також розмір часток. Полінуклеотид може бути, по суті, чистим, або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Нуклеїнова кислота може бути ДНК, кДНК, ПНК, СНК, РНК чи їхніми комбінаціями. Методи розробки та введення такої нуклеїнової кислоти добре відомі в цій галузі. Огляд наведений в роботі, наприклад, S. Pascolo: Vaccination with messenger RNA Methods Mol Med 2006, 127; 23-40; R. Stan, JD Wolchok and AD Cohen DNA vaccines against cancer Hematol Oncol Clin North Am 2006, 3; 613-636 or A Mahdavi and BJ Monk Recent advances in human papillomavirus vaccines Curr Oncol Rep 2006, 6, 465-472. Полінуклеотидні вакцини прості в приготуванні, але спосіб дії цих векторів в індукуванні імунної реакції не є повністю зрозумілим. Прийнятні вектори та системи доставки включають вірусні ДНК та/або РНК, такі, як системи, що базуються на аденовірусі, вірусі коров'ячої віспи, ретровірусах, вірусі герпесу, аденоасоційованому вірусі чи гібридах, які включають елементи більш, ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі як засоби доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної пушки". Пептид, або пептид, кодований нуклеїновою кислотою, може бути гібридним білком, наприклад, з епітопом, що стимулює T-клітини для відповідного протилежного CDR, як зазначено вище. Медикамент винаходу може включати один чи кілька ад'ювантів. Ад'юванти – це речовини, котрі неспецифічно збільшують чи посилюють імунну реакцію (наприклад, імунні реакції, де посередниками виступають CTL і Т-клітини- хелпери (TH) на антиген, отже, вони вважаються доцільними для медикаменту цього винаходу. Прийнятні ад'юванти включають, без обмежень 23 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1018 ISS, солі алюмінію, Amplivax, AS15, БЦЖ, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Іміквімод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориловий ліпід A, Монтанід IMS 1312, Монтанід ISA 206, Монтанід ISA 50V, Монтанід ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторну систему PepTel®, мікрочастинки PLG, резіквімод, SRL172, Віросоми та інші вірусоподібні частинки, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон QS21 Aquila, який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, такі як Ribi's Detox, Quil, або Superfos. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або GM-CSF… Кілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, MF59), специфічних для дендритних клітин, та їхнє приготування, були описані раніше (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, TNF-α), прискорюючи перетворення дендритних клітин в ефективні антиген-презентуючі клітини для T-лімфоцитів (наприклад, GM-CSF, IL-1 та IL-4) (Патент США №5,849,589, окремо включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючи як імуно-ад'юванти (наприклад, IL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418). Також доповідалося про те, що імуно-стимулюючі CpG-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у вакцинному складі. Теоретично, не будучи зв'язаними, CpG олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою Toll-подібних рецепторів (TLR), переважно TLR9. Активація TLR9, ініційована CpG, посилює антигенспецифічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'югати в профілактичних і терапевтичних вакцинах. Більш важливо те, що така активація посилює визрівання та диференціацію дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію TH1-клітин та генерацію цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL), навіть за відсутності допомоги CD4 T-клітин. Активація TH1, індукована стимуляцією TLR9, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як солі алюмінію чи неповний ад'ювант Фрейнда (IFA), котрі зазвичай сприяють активації TH2. CpG-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли формулюються або вводяться разом з іншими ад'ювантами чи в таких формуляціях, як мікрочастинки, нано-частинки, ліпідні емульсії або подібні формуляції, особливо необхідні для індукування сильної реакції, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну реакцію та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки, в порівнянні з реакціями антитіл на вакцину в повній дозі без CpG в деяких експериментах (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, JUNE 2006, 471-484). В Патенті США 6,406,705 B1 описується комбіноване використання CpG-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не вміщують нуклеїнових кислот, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної реакції. Наявним у продажу CpG TLR9-антагоністом є dSLIM (імуномодулятор з подвійно-нитчастим контуром) фірми Mologen (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу. Також можуть використовуватись інші TLR- зв'язувальні молекули, наприклад, TLR 7, TLR 8 та/або TLR 9, зв'язані з РНК. Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані CpGs (наприклад, CpR, Idera), Poly(I:C) (наприклад, AmpliGen), бактеріальні ДНК або РНК, відмінні від CpG, а також невеликі імуноактивні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітініб (sunitinib), бевакізумаб, целебрекс (celebrex), NCX-4016, сілденафіл (sildenafil), тадалафіл (tadalafil), варденафіл (vardenafil), сорафеніб (sorafinib), XL-999, CP-547632, пазопаніб (pazopanib), ZD2171, AZD2171, анти-CTLA4 та SC58175, котрі можуть діяти терапевтично та/або як ад'ювант. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятих в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим спеціалістом без неналежного експериментування. Переважними ад'ювантами є dSLIM, BCG, OK432, ALDARA, PeviTer та JuvImmune. Переважні медикаменти цього винаходу активно діють проти раку. Рак може бути неметастатичним або метастатичним, зокрема, рак ротової порожнини та рак глотки, рак шлунково-кишкового тракту, рак товстої кишки, прямої кишки та анусу, рак дихальних шляхів, рак молочної залози, рак шийки матки, вагіни та вульви, рак матки та яєчника, рак статевих шляхів у чоловіків, рак сечовивідних шляхів, рак кістки та м'яких тканин, саркома Капоші, 24 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 меланома шкіри, меланома ока, рак ока немеланомного характеру, рак мозку та центральної нервової системи, рак щитовидної залози та інших ендокринних залоз, лімфома Ходжкіна, нехождкінська лімфома та мієлома. Найбільш переважним неопластичним порушенням, котре лікується за методом цього винаходу, є колоректальний рак, рак легенів, рак грудей, рак підшлункової залози, рак простати, рак шлунку, рак нирки, стромальні пухлини ШКТ або гліобластома Оскільки пептиди винаходу були виділені з гліобластоми, колоректальних пухлин, пухлин підшлункової залози, легенів, нирки чи шлунку, медикамент винаходу буде, зокрема, прийнятним, якщо раковим захворюванням, що лікується, є гліобластома, колоректальний рак, рак підшлункової залози, легенів, нирки чи шлунку. На додаток до використання з метою лікування раку, пептиди цього винаходу також є прийнятними як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди були генеровані з гліобластоми, і було визначено, що ці пептиди не присутні в нормальних тканинах, дані пептиди можуть використовуватися для діагностування наявності раку. Присутність пептидів цього винаходу на біоптатах тканин може допомогти патологоанатому в діагностуванні раку. Визначення окремих пептидів цього винаходу за допомогою антитіл, масспектрометрії чи інших методів, відомих у цій галузі, може підказати патологоанатому, що тканина є злоякісною чи запаленою або взагалі ураженою хворобою. Наявність груп пептидів цього винаходу може дозволити проведення класифікації чи суб-класифікації хворих тканин. Визначення пептидів цього винаходу на зразку хворої тканини може підказати рішення про необхідність терапії із включенням імунної системи, зокрема, якщо відомо або передбачається, що T-лімфоцити беруть участь в механізм дії. Втрата MHC-експресії є добре описаним механізмом уникнення імунного контролю інфікованими або злоякісними клітинами. Тобто, присутність пептидів цього винаходу показує, що цей механізм не використовується проаналізованими клітинами. Пептиди цього винаходу могли б використовуватися для аналізу реакцій лімфоцитів проти пептидів цього винаходу, таких як T-клітинні реакції або реакції антитіл проти пептидів цього винаходу, чи пептидів цього винаходу в комплексі з молекулами MHC. Такі лімфоцитарні реакції можуть використовуватися як прогностичні маркери для прийняття рішення щодо подальших етапів лікування. Ці реакції також можна застосовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, спрямованих на індукування реакцій лімфоцитів різними засобами, наприклад, вакцинацією білком, нуклеїновими кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивним переносом лімфоцитів. В генній терапії, реакції лімфоцитів проти пептидів цього винаходу можуть розглядатись в ході оцінки побічних ефектів. Моніторинг реакцій лімфоцитів також може стати корисним засобом для подальшого обстеження при трансплантаційній терапії, наприклад, для виявлення реакцій "трансплантат проти хазяїна" та "хазяїн проти трансплантата". Пептиди цього винаходу можуть використовуватися для створення та розробки специфічних антитіл проти комплексів MHC/пептид. Вони можуть використовуватись для терапії, із націленням токсинів чи радіоактивних речовин на тканину, уражену хворобою. Ще одним способом використання цих антитіл може бути спрямування радіонуклідів на тканину, уражену хворобою, в цілях томографії, наприклад, PET (позитронно-емісійної томографії). Це може допомогти у визначенні початку розвитку метастаз або визначити розмір і точну локалізацію хворих тканин. Крім того, пептиди можуть використовуватись для підтвердження діагнозу раку, поставленого патологоанатомом на основі біопсії. Цей винахід, ще в одному своєму аспекті, відноситься до комплекту, який вміщує (a) контейнер, який вміщує фармацевтичну композицію, як описано вище, в розчині або в ліофілізованій формі; (b) додатково, другий контейнер, який вміщує розріджувач або відновлюючий розчин для ліофілізованої формуляції; та (c) додатково, інструкції по (i) використанню розчину або (ii) відновленню та/або використанню ліофілізованої формуляції. Комплект може, крім того, включати один чи кілька (iii) буферів, (iv) розріджувачів, (v) фільтрів, (vi) голок або (v) шприців. Контейнер, переважно, є пляшкою, пробіркою, шприцом чи тестовою пробіркою; він може бути контейнером багаторазового використання. Фармацевтична композиція є переважно ліофілізованою. Комплекти цього винаходу, переважно, включають ліофілізовану формуляцію цього винаходу в належному контейнері та інструкції по її відновленню та/або використанню. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, пробірки (наприклад, пробірки з двох частин), шприці (такі як двокамерні шприці) і тестові пробірки. Контейнер може бути виготовлений з різних матеріалів, таких як скло чи пластмаса. Переважно, комплект та/або контейнер вміщує інструкції на контейнер або такі, що відносяться до нього, із вказівками щодо відновлення та/або 25 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використання. Наприклад, на ярлику може вказуватися, що ліофілізована формуляція повинна бути відновлена до концентрацій пептидів, як зазначено вище. Ярлик, крім того, може зазначати, що формуляція є прийнятною або призначена для підшкірного введення. Контейнер, вміщуючий формуляцію, може бути пробіркою багаторазового використання, котра дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до 6 введень) відновленої формуляції. Комплект, крім того, може включати другий контейнер з прийнятним розріджувачем (наприклад, розчином бікарбонату натрію). Після змішування розріджувача та ліофілізованої формуляції, остаточна концентрація пептиду у відновленій формуляції становить, переважно, принаймні 0.15 мг/мл/пептид (=75 мкг) та переважно не більше 3 мг/мг/пептид (=1500 мкг). Комплект, крім того, може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та із врахуванням використання, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприці та вкладиші з інструкціями по використанню. Комплекти цього винаходу можуть включати один контейнер, який вміщує формуляцію фармацевтичних композицій, відповідно до цього винаходу, з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції інших сполук) чи включати окремий контейнер для кожного компоненту. Переважно, комплекти винаходу включають формуляцію винаходу, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, GM-CSF), хіміотерапевтична речовина, природний продукт, гормон чи антагоніст, анти-ангіогенезний агент чи інгібітор, апоптоз-індукуючий агент або хелатор, чи їхню фармацевтичну композицію. Компоненти комплекту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері, до введення пацієнту. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині. Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть перетворюватися на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, котрі переважно вміщені в іншому окремому контейнері. Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою пробірку, тестову пробірку, колбу, пляшку, шприць або будь-який інший засіб для зберігання твердого тіла чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект буде включати другу пробірку чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також вміщувати інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприців, крапельниц, піпетку та ін.), який робить можливим введення речовин винаходу, що становлять компоненти цього комплекту. Фармацевтична формуляція цього винаходу є прийнятною для введення пептидів будь-яким зручним методом, наприклад, пероральним (ентеральним), назальним, очним, підшкірним, інтрадермальним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення здійснюється s.c., та найбільш переважно, i.d.-методом. Введення може виконуватись інфузійним насосом. З метою цього винаходу, усі довідкові матеріали, згадані тут, включені шляхом посилань в усій повноті. Приклад 1. Синтез і структура Пептиди були синтезовані за допомогою стандартного і добре відомого твердофазного синтезу з використанням Fmoc-хімії. Після очищення препаративною HPLC (високоефективною рідинною хроматографією), була виконана іонообмінна процедура для включення фізіологічно сумісних протилежно заряджених іонів (у вигляді ацетатів чи хлоридів). Нарешті, після ліофілізації були одержані тверді речовини, які мали колір від білого до жовтуватого. Усі TUMAP вводяться як ацетати, крім IMA-CCN-001, що надавався як хлорид, по технічним причинам, в ході процедури виготовлення. 2. Ідентифікація пухлино-асоційованих пептидів (TUMAP), присутніх на поверхні клітин Зразки тканин Тканини пухлин і здорові тканини пацієнтів були надані кількома клінічними установами (див. Таблицю нижче). До хірургічного видалення тканин, була одержана письмова інформована згода від усіх пацієнтів. Тканини були заморожені шоковим способом в рідкому азоті відразу після хірургічної операції та зберігались до виділення TUMAP при -80 °C. Виділення HLA-пептидів із зразків тканин Пули пептидів HLA з заморожених шоковим способом зразків тканин були одержані імунним осадженням з твердих тканин, відповідно до незначно зміненого протоколу (Falk, K., Rotzschke, O., Stevanovic, S., Jung, G. and Rammensee, H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351, 290-296 (1991); Seeger, F.H. et al. The HLA 26 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 49, 571-576 (1999)) із використанням HLA-A*02-специфічного антитіла BB7.2 або HLA-A, -B, -C-специфічного антитіла W6/32, CNBr-активованої сефарози, кислотної обробки та ультрафільтрації. Визначення TUMAP за допомогою рідинної хроматографії та мас-спектрометрії з іонізацією електророзпиленням (ESI-LCMS) Одержані пули пептидів HLA розділялися відповідно до їхньої гідрофобності із використанням зворотно-фазної хроматографії (CapLC, Waters); елюйовані пептиди були проаналізовані на гібридному квадрупольному тандемному мас-спектрометрі з ортогональним прискоренням часу прольоту (Q-TOF Ultima, Waters) з джерелом ESI. Пептиди були завантажені на пред-колонку C18 для концентрації та демінералізації. Після завантаження, пред-колонка була розміщена лінійно для сепарації кварцовою мікрокапілярною колонкою (75 мкм i.d. x 250 мм), заповненою 5 мкм C18 зворотно-фазного матеріалу (Dionex). Розчинником A був 4 мМ ацетат амонію/вода, а розчинником B-2 мM ацетат амонію в 80 % ацетонітріл/вода. Обидва розчинники були скориговані до pH 3.0 мурашиною кислотою. Був виконаний бінарний градієнт з 15 % до 60 % розчину B протягом 90 хвилин, із застосуванням швидкості потоку в 5 мкл на хвилину, зменшеною приблизно до 200 нл на хвилину спліт-системою. Був використаний скляний капіляр з золотим покриттям (PicoTip, New Objective) для введення в мікро-ESIджерело. Час інтеграції для аналізатора TOF становив 1.9 с, з затримкою між сканами в 0.1 с. Згодом пептидні послідовності були виявлені мас-спектрометричним аналізом (ESI-LCMS/MS) індукованого зіткненнями розпаду (CID). Ідентифікована послідовність TUMAP була підтверджена порівнянням генерованої природної моделі фрагментації TUMAP з моделлю фрагментації синтетичного контрольного пептиду з ідентичною послідовністю. Малюнок 1 і Малюнок 2 показують зразки спектрів, одержаних з тканин пухлини, для TUMAP, асоційованих з MHC класу I (Малюнок 1a-1h) і TUMAP, асоційованих з MHC класу II (Малюнок 2a-2f). 3. Профілі експресії генів, що кодують пептиди винаходу Пептиди, ідентифіковані як такі, що презентуються на поверхні клітин пухлин молекулами MHC, ймовірно, здатні індукувати T-клітини з високою специфічністю розпізнавання для тканини, з якої вони походять. Щоб звести до мінімуму ризик ауто імунності, викликаної вакцинацією такими пептидами, актори винаходу зосередились на тих пептидах, що одержані з білків, котрі надмірно експресуються на клітинах пухлин, в порівнянні з більшістю нормальних тканин. Ідеальний пептид буде одержаний з білку, котрий є індивідуальним для пухлини, та не присутній на будь-якій іншій тканині. Щоб ідентифікувати пептиди, котрі одержуються з генів з ідеальною експресією, ідентифіковані пептиди були закріплені за білками та генами, відповідно, з яких вони одержувались, та були побудовані профілі експресії генів. Джерела та підготовка РНК Зразки тканин, видалені хірургічним шляхом, були надані кількома різними клінічними установами (див. Таблицю 2), після одержання письмової інформованої згоди від кожного пацієнта. Зразки тканини пухлин були миттєво заморожені в рідкому азоті відразу після хірургічної операції та пізніше гомогенізовані з використанням ступки та пестика під рідким азотом. Усі РНК були підготовлені з цих зразків з використанням TRIzol (Invitrogen, Карлсруе, Німеччина), з наступним очищенням за допомогою RNeasy (QIAGEN, Хільден, Німеччина); обидва методи виконувались за протоколом виробника. РНК зі здорових тканин людей, в повному обсязі, були одержані комерційним шляхом (Ambion, Хантінгтон, Великобританія; Clontech, Гейдельберг, Німеччина; Stratagene, Амстердам, Нідерланди; BioChain, Хейард, Каліфорнія, США). РНК від кількох людей (від 2 до 123 людей) були змішані таким чином, щоб РНК від кожної особи була однаково зважена. Лейкоцити були виділені зі зразків крові 4 здорових добровольців. Якість та кількість усіх зразків РНК були оцінені на Біоаналізаторі Agilent 2100 (Agilent, Вальдбронн, Germany), з використанням комплекту RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent). Експерименти з використанням мікро-чіпів Аналіз генної експресії усіх зразків РНК пухлин та нормальних тканин був виконаний з використанням олігонуклеотидних мікро-чіпів Affymetrix Human Genome (HG) U133A або HGU133 Plus 2.0 (Affymetrix, Санта Клара, Каліфорнія, США). Усі етапи виконувалися відповідно до посібника Affymetrix. (http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx). Стисло кажучи, двониткова кДНК була синтезована з 5-8 мкг усієї РНК, з використанням SuperScript RTII 27 UA 103751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (Invitrogen) та оліго-dT-T7-праймеру (MWG Biotech, Еберсберг, Німеччина), як описано в посібнику. In vitro-транскрипція булавиконана з використанням приладу маркування РНКтранскриптів BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Фармінгейл, штат Нью-Йорк, США) для чіпів U133A, або приладу GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) для чіпів U133 Plus 2.0, після чого були здійснені кРНК-фрагментація, гібридизація та викрашування стрептавідін-фікоерітріновим та біотінільованим анти-стрептавідіновим антитілом (Molecular Probes, Лейден, Нідерланди). Зображення були скановані приладом Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) або Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0). Дані аналізувалися з використанням програми GCOS (Affymetrix), з використанням стандартних установок для усіх параметрів. Для стандартизації були застосовані 100 службових генів, наданих Affymetrix (http://www.affymetrix.com/support/technical/mask_files.affx). Відносні значення експресії були розраховані по відношенням реєстрації сигналу, наданим комп'ютерною програмою, та нормальний зразок був довільно встановлений на 1.0. Профілі експресії усіх пептидів цього винаходу демонструють високу експресію відповідного гену в тканині пухлини, в той час як в нормальних тканинах вони не експресуються чи експресуються незначно. Малюнок 3 показує такі профілі для генів гліобластомно-специфічних пептидів PTP-001 (ген: PTPRZ1, Малюнок 3a), та CHI-001 (ген: CH3L2, Малюнок 3b). 4. Повторне визначення TUMAPs за допомогою ESI-рідинної хроматографії та массспектрометрії (ESI-LCMS) в додаткових зразках пухлин. Був проведений систематичний пошук TUMAP, ідентифікованих за методом ПРИКЛАДУ 1, на зразках колоректальних пухлин за допомогою мас-спектрометрії. Одержані пули пептидів HLA розділялися відповідно до їхньої гідрофобності із використанням зворотно-фазної хроматографії (CapLC, Waters); елюйовані пептиди були проаналізовані на гібридному квадрупольному тандемному мас-спектрометрі з ортогональним прискоренням часу прольоту (Q-TOF Ultima, Waters) з джерелом ESI. Пептидні пули були завантажені на пред-колонку C18 для концентрації та демінералізації. Після завантаження, пред-колонка була розміщена лінійно для сепарації кварцовою мікрокапілярною колонкою (75 мкм i.d. x 250 мм), заповненою 5 мкм C18 зворотно-фазного матеріалу (Dionex). Розчинником A був 4 мМ ацетат амонію/вода, а розчинником B-2 мM ацетат амонію в 80 % ацетонітріл/вода. Обидва розчинники були скориговані до pH 3.0 мурашиною кислотою. Був виконаний бінарний градієнт з 15 % до 60 % розчину B протягом 90 хвилин, із застосуванням швидкості потоку в 5 мкл на хвилину, зменшеною приблизно до 200 нл на хвилину спліт-системою. Був використаний скляний капіляр з золотим покриттям (PicoTip, New Objective) для введення в мікро-ESIджерело. Час інтеграції для аналізатора TOF становив 1.9 с, з затримкою між сканами в 0.1 с. Для детекції визначених пептидів був виконаний високочутливий скринінг в цьому типі експериментів ESI-LCMS, на основі відомої молекулярної ваги та часу утримання пептидів в хроматографічній системі. Отже, перелік, що включає відношення маси до заряду (m/z) раніше ідентифікованих пептидів (одно- та/або дво-зарядних), був застосований для вибору прекурсорів. Згодом послідовність була виявлена мас-спектрометричним аналізом (ESILCMS/MS) індукованого зіткненнями розпаду (CID). Послідовність TUMAP була підтверджена порівнянням генерованої природної моделі фрагментації TUMAP з моделлю фрагментації синтетичного контрольного пептиду з ідентичною послідовністю. Оцінка продуктивності очищення пептиду HLA та відтворюваності аналітичної системи, включаючи стабільність часу утримання, проводилася з використанням інтенсивності та часу утримання надлишкового ендогенного HLA-A*02-пептиду (YLLPAIVHI з DDX5), як внутрішнього стандарту. Отже, критерій включення зразків CRC для визначення раніше ідентифікованих TUMAP в цих експериментах був встановлений на мінімальну інтенсивність в 650 одиниць на скан внутрішнього двозарядного стандартного сигналу (YLLPAIVHI) в експерименті LCMS/MS, для гарантії успішного виділення пептиду HLA та належної роботи аналітичної системи В Таблиці 2 показані результати аналізу зразків пухлин товстої кишки та прямої кишки на різних стадіях, а також метастаз, що походять з будь-якої ділянки первинних пухлин. Усі TUMAP HLA-A*02 були виявлені на більшості зразків. При повторному визначенні частота TUMAP HLADR, в цілому, нижче. Цього можна очікувати, оскільки для пептидів HLA класу II може існувати кілька варіантів довжини для кожної ключової послідовності. ODC-001, TUMAP, ідентифікований раніше (M Diehl, PhD thesis 1998, University of Tuebingen) та відомий як присутній у великій кількості пухлин товстої кишки, служив позитивним контролем. 28