Комбінація інгібітора гістонових дезацетилаз з поєднаною активністю відносно гістонових дезацетилаз класу i і класу іі в з інгібітором протеасом бортезомібом для пригнічення росту пухлинних клітин

1. Комбінація інгібітора, де вказаним інгібітором протеасоми є бортезоміб, та інгібітора гістонової дезацетилази є сполукою 1а (JNJ 26481585) N H N N HO H N N N O , 1а його фармацевтично прийнятною кислотно- або основноадитивною сіллю та стереохімічно ізомерною формою. 2. Комбінація за п. 1 у формі фармацевтичної композиції, що містить бортезоміб і сполуку 1а разом з одним або декількома фармацевтичними носіями. Даний винахід відноситься до інгібіторів гістонових дезацетилаз (HDAC) з поєднаною активністю відносно гістонових дезацетилаз класу І і класу II. Він відноситься до комбінацій і композицій, що їх містять, а також до їх застосування у якості лікарського засобу, наприклад, у якості лікарського засобу для інгібування гематопоетичних пухлин, таких як лімфоми і лейкози. Сімейство ферментів HDAC було назване після ідентифікації їх першого субстрата, тобто ядерних білків-гістонів. Білки-гістони (Н2А, Н2В, НЗ і Н4) утворюють октамірний комплекс, довкола якого згортається спіраль ДНК, щоб створити структуру конденсованого хроматину. Ацетильований 4 3. Комбінація за п. 2 для одночасного, роздільного або послідовного застосування. 4. Комбінація за будь-яким з пп. 1-3 для застосування в медикаментозному лікуванні. 5. Застосування комбінації за п. 1 або 2 для виробництва лікарського засобу для інгібування росту пухлинних клітин. 6. Застосування інгібітора гістонової дезацетилази в комбінації з інгібітором протеасоми, для виробництва лікарського засобу для лікування гострого лімфобластомного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, гострого промієлоцитарного лейкозу, гострого мієлоїдного лейкозу, гострого моноцитарного лейкозу, лімфоми, хронічного В-клітинного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу у фазі бластомного кризу, лімфоми Беркітта і множинної мієломи, де вказаним інгібітором гістонової дезацетилази є сполука 1а N H N N HO H N N N O , 1а її фармацевтично прийнятні кислотно- або основноадитивні солі і стереохімічно ізомерні форми, і де вказаним інгібітором протеасоми є бортезоміб. 7. Застосування за п. 6, яке відрізняється тим, що вказаний лікарський засіб використовують для лікування резистентного до ліків гострого лімфобластомного лейкозу, резистентного до ліків гострого мієлогенного лейкозу, резистентного до ліків гострого промієлоцитарного лейкозу, резистентного до ліків гострого мієлоїдного лейкозу, резистентного до ліків гострого моноцитарного лейкозу, резистентної до ліків лімфоми, резистентного до ліків хронічного В-клітинного лейкозу, резистентного до ліків хронічного мієлоїдного лейкозу, резистентного до ліків хронічного мієлоїдного лейкозу у фазі бластомного кризу, резистентної до ліків лімфоми Беркітта і резистентної до ліків множинної мієломи. 8. Застосування за п. 6 або 7, яке відрізняється тим, що вказаний лікарський засіб використовують для лікування множинної мієломи, стійкої до бортезомібу. стан гістонів знаходиться в динамічній рівновазі, обумовленій гістоновими ацетилтрансферазами (HAT), які ацетилюють, і HDAC, які відповідають за дезацетилювання гістонових хвостів. Інгібування ферменту HDAC підсилює ацетилювання гістонових хвостів нуклеосоми, сприяючи створенню більш транскрипційно компетентної структури хроматину, яка, у свою чергу, призводить до зміненої експресії генів, залучених в клітинні процеси, такі як клітинна проліферація, апоптоз і диференціювання. За останні роки було ідентифіковано все зростаюче число додаткових, відмінних від гістонових, субстратів для HDAC. 5 При специфічних формах лейкозу і лімфоми, таких як гострий промієлоцитарний лейкоз (APL), неходжкінська лімфома і гострий мієлоїдний лейкоз (AML), виявляють постійне рекрутування HDAC з порушеною регуляцією в хроматині у поєднанні з онкогенними факторами транскрипції. У клітинах раку простати було виявлене підвищення HDAC1 на рівні білків по мірі прогресування захворювання, починаючи від злоякісних патологічних змін і високо диференційованої андроген-залежної аденокарциноми простати у напрямку до фенотипично дедиференційованому андрогеннечутливому раку простати. Крім того, у більшості експлантатів колоректального раку людини, який викликається втратою пухлинного супресора аденоматозного поліпозу товстого кишковика (АРС), виявляють підвищену експресію HDAC2. Відповідно до рівноваги активностей HDAC/HAT при раку було показано, що інгібітори HDАС індукують зупинку клітинного циклу, термінальне диференціювання і апоптоз у широкому спектрі ліній клітин пухлин людини in vitro,інгібують ангіогенез і проявляють in vivo протипухлинну активність на моделях ксенотрансплантатів людини у «голих мишей». Сімейство ферментів HDAC зазвичай підрозділяють на 3 класи: тобто класи І, II і III. В основному передбачали, що лише класи І і II опосередкують ефекти інгібіторів HDAC, що знаходяться в клінічній розробці. Було показано, що група HDAC класу І, яка складається з членів сімейства HDAC 1-3 і 8, є відповідальною за проліферацію пухлинних клітин. Серед великого числа факторів транскрипції, які для придушення специфічних промоторів використовують HDAC класу І, найбільш відомим прикладом є клас ядерних рецепторів гормонів, які у відсутність свого ліганда зв'язуються лише з HDAC3 і, таким чином, підтримують стан сайленсинга транскрипції. Комплекс дисоціює лігандзалежним способом, наприклад, за допомогою ретиноїдів, естрогену, андрогенів і так далі, приводячи до експресії гена і диференціювання. Іншим важливим прикладом є HDAC 1-залежний сайленwaf1,сір1 синг інгібітору циклін-залежної кінази p21 . waf1,сір1 Важлива роль індукції p21 в антипроліферативних ефектах інгібіторів HDAC була продемонстрована шляхом дослідження, що показує 6кратне підвищення стійкості до інгібітору HDAC трихостатину A (TSA) в клітинах, дефіцитних по waf1,сір1 p21 , у порівнянні з вихідними клітинами НСТ-116. Крім того, на відміну від дійсних генів waf1,сір1 пухлинної супресії, p21 всюди присутній у пухлинних клітинах і індукується інгібіторами HDAC. Субстратами HDAC класу І є не лише гістони. Наприклад, HDAC 1-3 дезацетилює пухлинний супресор р53, який в результаті стає убіквітинованим і деградуючим. Оскільки р53 є потенційним пухлинним супресором, що включає зупинку клітинного циклу і апоптоз, підтримка низьких рівнів цього білка важлива для життєздатності і неконтрольованої проліферації пухлинних клітин. HDAC класу II можуть бути розділені на 2 підкласи: клас llа, що містить HDAC 4, 5, 7, 9 і MITR, 97249 6 сплайсирований варіант гістонової дезацетилази HDAC 9. Клас llb містить HDAC6 і HDAC10, які мають домени HDAC, що повторюються. HDAC класу llа не мають дійсної активності гістонових дезацетилаз, але регулюють експресію генів, функціонуючи у якості єднальних факторів, оскільки вони асоціюють як з комплексами HDAC класу І, так і з комплексами фактор транскрипції/ДНК. Увагу привернув HDAC6, член класу llb, унаслідок його ідентифікації як дезацетилази Hsp90. Було показано, що інгібітори HDAC LAQ824 і LBH589 індукують дезацетилювання Hsp90, тоді як трапоксин і бутират натрію не індукують. Дезацетилювання Hsp90 приводить до деградації Нsр90асоційованих білків-«клієнтів», що сприяють виживанню і проліферації. Основні приклади включають Неr-2, Всr-Аb1, глюкокортикоїдний рецептор, мутантний FLT-3, cRaf і Akt. Окрім Hsp90, HDAC6 також опосередкує дезацетилювання тубуліну, яке приводить до дестабілізації мікротрубочок в умовах стресу. Біологічна роль HDAC6 була додатково підтверджена тим фактом, що специфічний низькомолекулярний інгібітор HDAC6, тубацин, викликає гіперацетилювання -тубуліна і знижує рухливість клітин, не впливаючи на проходження клітинного циклу. Тубацин, який інгібує лише домен дезацетилази -тубуліна гістонової дезацетилази HDAC6, викликає лише незначне підвищення ацетилювання HSP90. Відповідно, було виявлено, що HDAC6 важливий для естрадіол-стимульованої клітинної міграції клітин карциноми молочної залози MCF-7. На закінчення, HDAC6 відіграє важливу роль в контролі клітиною неправильно згорнутих білків і видаленні їх із цитоплазми. Унаслідок великої кількості білків-регуляторів клітинного циклу, регульованих за допомогою HDAC відносно рівня або їх експресії, або активності, антипроліферативний ефект інгібіторів HDAC не може бути пов'язаний з одиничним механізмом дії. Інгібування HDAC має певну перспективу в протираковій терапії, де спільний вплив на велику кількість шляхів, залучених в інгібування зростання, диференціювання і апоптоз, може мати переваги при лікуванні гетерогенної патології, такий як онкогенез і пухлинне зростання. Останніми роками стало зрозуміло, що HDAC відіграють важливу роль не лише в канцерогенезі, але й у великому числі незлоякісних процесів диференціювання. Це найочевидніше для класу llа 4, 5, 7 і 9. Наприклад, було висловлено припущення, що HDAC7 відіграє основну роль у дозріванні Тклітин в тимусі, тоді як HDAC4 залучений у регуляцію гіпертрофії хондроцитів і ендохондрального окостеніння. Найбільша увага, проте, була зосереджена довкола ролі HDAC класу llа в диференціюванні м'язової тканини. HDAC 4, 5, 7 і 9 супресують диференціювання міоцитів (м'язових клітин) в результаті наявності ко-репресорів транскрипції міоцит-специфічного енхансера 2 (MEF2). Найбільш частою токсичністю, що спостережується при використанні інгібіторів HDAC, є мієлосупресія від легкого до помірного ступеню. Крім того, в багатьох клінічних випробуваннях у якості 7 негативних ефектів спостерігаються нудота/блювота, стомлюваність і діарея. У патенті ЕР 1485365, опублікованому 18 вересня 2003, описується, серед інших, інгібітор HDAC R3 06465. У публікації WO 2006/010750 від 2 лютого 2006 описується отримання, склад і фармацевтичні властивості сполук наступної формули Маркуша їх N-оксидних форм, фармацевтично прийнятних аддитивних солей і стереохімічно ізомерних форм, 1 2 3 де n, m, R , R , R , X і Y мають значення, визначені у вказаному описі. Можливість лікування інгібітором HDAC, проте, виходить за межі використання окремого агента. Молекулярні шляхи, на які впливають інгібітори HDAC, роблять його перспективним кандидатом для комбінаторних досліджень. Існує потреба в інгібіторах з комбінованими діями відносно HDAC класу І і класу llb, які можуть забезпечити клінічні переваги, враховуючи ефективність та/або токсичність, або самостійно, або в поєднаннях з іншими терапевтичними агентами. Крім того, важливою, нещодавно розробленою стратегією при лікуванні раку є інгібування протеасоми. Протеасома є мультиферментним комплексом, що присутній у всіх клітинах, який бере участь у деградації білків, залучених у регуляцію клітинного циклу. Велика кількість важливих регуляторних білків, включаючи р53, цикліни і циклінwaf1,сір1 залежну кіназу p21 , з часом деградують в ході клітинного циклу за допомогою убіквітинпротеасомного шляху. Впорядкована деградація цих білків потрібна клітині для проходження клітинного циклу і для здійснення митоза. Більш того, убіквітин-протеасомний шлях необхідний для регуляції транскрипції. У патентах ЕР788360, ЕР1312609, ЕР1627880, US6066730 і US6083903 описуються складноефірні і кислотні сполуки боронової кислоти і пептиду, що використовуються як інгібітори протеасом. Одна із сполук, N-піразинкарбоніл-L-фенілаланін-Lлейцинборонова кислота (PS-341, у даний час відома як бортезоміб або Velcade (продукція фірми Millenium)), має протипухлинну активність на моделях ксенотрансплантатів пухлин людини і отримала дозвіл на лікування пацієнтів з рецидивуючою рефрактерною множинною мієломою, і в даний час проходить клінічні випробування в додаткових показаннях, що включають інший рак крові, а також солідні пухлини. Бортезоміб індукує смерть клітини, викликаючи накопичення неправильно скручених і інакше пошкоджених білків, таким 97249 8 чином, активуючи мітохондріальний шлях апоптозу, наприклад, через Вах-залежні або залежні від активних форм кисню механізми. Бортезоміб викликає секвестрацію кон'югованих з убіквітином білків у структурах, що називають агресомами. Агресоми представляються такими, що беруть участь у цитопротекторній відповіді, яка активується у відповідь на інгібування протеасоми, можливо, за допомогою перенесення убіквітильованих білків до лізосом для деградації. Бортезоміб-індуковане утворення агресоми може бути перерване використанням інгібітору HD AC SAHA (субероїланілідгідроксамової кислоти). SAHA також демонструє синергетичні ефекти відносно апоптозу in vitro і на моделі ортотопічного ксенотрансплантату раку підшлункової залози in vivo (Cancer Research 2006; 66: (7) 3773-3781). Інший інгібітор HDAC LAQ824 при введенні разом з бортезомібом також демонструє синергетичні рівні клітинної загибелі (Journal of Biological Chemistry 2005; 280: (29) 26729-26734). Синергетичний ефект SAHA і LAQ824 при введенні разом з бортезомібом був пов'язаний з їх активністю інгібування HDAC6. Існує додаткова необхідність у підвищенні ефективності інгібування інгібіторів протеасоми відносно пухлинного зростання, а також у зниженні доз таких агентів для зменшення вірогідності негативних токсичних побічних ефектів для пацієнта. На даний час немає прямих даних по взаємозв'язку між ступенем ацетилювання і відповіддю пухлини. Швидкі, прості і нескладні у виконанні відтворені способи розрахунку міри ацетилювання гістонових і відмінних від гістонових субстратів, обумовлені описаними нижче інгібіторами HDAC або комбінаціями, що містять вказані інгібітори HDAC, будуть вирішальними для перспективи їх використання. Завданням винаходу є надання інгібіторів HDAC і терапевтичних комбінацій інгібітору протеасоми і інгібіторів HDAC типа, описаного нижче, які можуть володіти стійкими і типовими ефектами ацетилювання, інгібування HDAC як класу І, так і класу llb, переважним ефектом інгібування зростання пухлинних клітин і зменшеними небажаними побічними ефектами. Тому, згідно винаходу, автори пропонують комбінацію інгібітору протеасоми і інгібітору HDAC формули (І) його фармацевтично прийнятної кислотно- або основно-аддитивної солі і стехіометрично ізомерних форм, де 4 R вибраний з водню або галогену. Сполуками, що цікавлять, є такі сполуки фор4 мули (І), в яких R є фтором. Сполуками, що більш цікавлять, є такі сполуки 4 формули (І), в яких R знаходиться в положенні 4 або 7 індолу. 9 97249 10 Бажаними сполуками формули (І) є сполука № 1а, сполука № 30 і сполука № 39 відповідно до нумерації, вказаної в публікації WO 2006/010750. Іншими бажаними сполуками формули (І) є 4 сполуки, в яких R є воднем. Найбажанішою сполукою є сполука № 1а Термін «інгібітори HDАС з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb» або «інгібування HDАС класу І і класу llb» використовують для ідентифікації сполук, які знижують ферментативну активність як члена сімейства HDAC класу І (HDAC 1-3 або 8), так і члена сімейства HDAC класу llb (HDAC 6 або 10) в концентрації, яка нижче, ніж концентрація інгібітору, необхідна для інгібування інших класів ферментів HDAC, таких як, наприклад, клас llа, або в концентрації, яка нижче, ніж концентрація інгібітору, необхідна для інгібування іншого, не пов'язаного з цим, біологічного ефекту. Як використовується в даному документі, під термінами «протеасома» і «убіквітин-протеасомна система (UPS)» розуміють будь-яку структуру і функцію всіх компонентів в UPS, які включають, без обмеження перерахованим: a) убіквітин (Ub) і убіквітин-подібні білки (U1p); наприклад, SUMO, NEDD8, ISG15 і подібні, b) мономери убіквітина, К48-зв'язані поліубіквітинові ланцюги, К6З-зв'язані поліубіквітинові ланцюги і подібні, c) убіквітин-активуючі ферменти E1; наприUb SUMO NEDD8 ISG15 клад, E1 , E1 , E1 , E1 і подібні, d) субодиниці убіквітин-активуючих ферментів E1; наприклад, АРРВР1, UBA3, SAE1, SAE2 і подібні, e) убіквітин-кон'югуючі ферменти Е2; наприклад, UBC9, UBC12, UBC8 і подібні, f) убіквітин-лігази Е3; наприклад, RING-finger Е3, одиночні RING-finger Е3, RING-finger Е3 сімейства куллінів, RВХ1-/RВХ2-залежні Е3, НЕСТдоменові Е3, U-box Е3 і подібні, g) комплекс Е3 убіквітин-лігази SCF (SKPlSKP2 куллін1-F-bох), наприклад, SCF , B-TRCP FBW7 SCF , SCF і подібні; h) білки сімейства куллінів, наприклад, CUL1, CUL2, CUL3, CUL4, CUL5 і подібні, і) білки сімейства F-box, наприклад, SKP2, білки B-TRCP, білки FBW і подібні, j) інші субстрат-специфічні адаптори, наприклад, білки ВТВ, білки SOCS-box, DDB1/2, VHL і подібні, k) протеасому, її компоненти і тому подібне, l) металоізопептидазу RPN11, субодиницю кришки протеасоми, яка видаляє убіквітин з мішеней UPS перед їх деструкцією, і подібні, або її фармацевтично прийнятна адитивна сіль. Лінії, проведені в біциклічні кільцеві системи від замісників, вказують на те, що зв'язки можуть бути приєднані до будь-якого з відповідних кільцевих атомів біциклічної кільцевої системи. Як використовується у вищезазначених визначеннях і далі в даному документі, галоген відноситься до фтору, хлору, брому і йоду. Як використовується в даному документі, під термінами «гістонова дезацетилаза» і «HDАС» розуміють будь-яке сімейство ферментів, які видаляють ацетильні групи з -аміногруп лізинових залишків на N-конці гістону. Якщо контекстом не вказане інше, під терміном «гістон» розуміють будь-який білок-гістон, включаючи Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 і Н5, від будь-якого виду. Білки або генні продукти HDAC людини включають, без обмеження перерахованим, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 і HDAC-11. Гістонова дезацетилаза також може бути отримана з простіших або грибів. Термін «інгібітор гістонової дезацетилази» або «інгібітор дезацетилази гістону» використовують для ідентифікації сполуки, яка здатна взаємодіяти з гістоновою дезацетилазою і інгібувати її активність, конкретніше, її ферментативну активність. Під інгібуванням ферментативної активності гістонової дезацетилази розуміють зниження здатності гістонової дезацетилази видаляти ацетильну групу з гістону або іншого білкового субстрата. Бажано, таке інгібування є специфічним, тобто інгібітор гістонової дезацетилази знижує здатність гістонової дезацетилази видаляти ацетильну групу з гістону або іншого білкового субстрату в концентрації, яка нижче, ніж концентрація інгібітору, необхідна для отримання іншого, не пов'язаного з цим, біологічного ефекту. 11 m) металоізопептидазу CSN5, субодиницю СОР9-сигналосомного комплексу, яка відповідає за видалення NEDD8 з білків сімейства куллінів, і подібні, n) стадію активації за допомогою убіквітинактивуючого ферменту E1, на якій Ub/U1p спочатку стає аденільованим на своєму С-кінцевому гліциновому залишку, а потім стає зарядженим у вигляді складного тіолового ефіру, знову-таки на своєму С-кінці, о) перенесення Ub/U1p з убіквітинактивуючого ферменту E1 на убіквітинкон'югуючий фермент, р) розпізнавання убіквітин-кон'югата, q) перенесення і зв'язування субстратубіквітинового комплексу з протеасомою, r) видалення убіквітина, або s) деградацію субстрата. Термін «інгібітор протеасоми» і «інгібітор убіквітин-протеасомної системи» використовують для ідентифікації сполуки, яка здатна взаємодіяти з яким-небудь нормальним, зміненим, гіперактивним або надекспресуючим компонентом в UPS і інгібувати її активність, конкретніше, її ферментативну активність. Під інгібуванням ферментативної активності UPS розуміють зниження здатності компонента UPS здійснювати свою активність. Бажано, таке інгібування є специфічним, тобто інгібітор протеасоми знижує активність компонента UPS в концентрації, яка нижче, ніж концентрація інгібітору, необхідна для отримання іншого, не пов'язаного з цим, біологічного ефекту. Інгібітори активності компонента UPS включають, без обмеження перерахованим: a) інгібітори аденілювання Ub або U1p, що блокують доступ Ub/UPS до сайту аденілювання або такі, що блокують доступ АТФ; наприклад, іматиніб (Gleevec; Novartis) і подібні, b) дезінтегратори взаємодії Е3 або Е3комплекса з Е2, c) відокремлювачі взаємодії між субстратом і доменом Е3 або Е3-комплекса, що взаємодіє з субстратом, такі як блокуючі взаємодію між р53 (субстрат) і MDM2 (RING-finger Е3), наприклад, білки сімейства натлінів (що зв'язуються з MDM2), RITA (що зв'язуються з N-кінцем р53) і подібні, d) відокремлювачі лігазного комплексу Е3, e) фактори, штучно рекрутуючі субстрати для убіквітин-лігаз, наприклад, білки сімейства протак і подібні, f) інгібітори протеасоми і її компонентів, наприклад, бортезоміб, карфілзоміб, NPI-0052, Bsc2128 і подібні, g) інгібітори видалення убіквітина/U1p, такі як інгібітори металоізопептидаз RPN11 і CSN5, або h) модифікатори поліубіквітинового ланцюга, наприклад, убістатини і подібні. Під фармацевтично прийнятними кислотно-аддитивними солями, згаданими в даному документі вище, розуміють вміст терапевтично активних нетоксичних кислотно-аддитивних сольових форм, які здатні утворювати сполуки формули (І). Сполуки формули (І), які мають основні властивості, можуть бути перетворені в їх фармацевтично прийнятні кислотноадитивні солі шляхом обробки вказаної основної 97249 12 форми прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти включають, наприклад, неорганічні кислоти, такі як галогенводневі кислоти, наприклад, хлористоводнева або бромистоводнева кислота; сірчана; азотна; фосфорна і подібні кислоти; або органічні кислоти, такі як, наприклад, оцтова, трифтороцтова, пропанова, гідроксиоцтова, молочна, піровиноградна, щавлева, малонова, янтарна (тобто бутандикислота), малеїнова, фумарова, яблучна, винна, лимонна, метансульфонова, етансульфонова, бензолсульфонова, п-толуолсульфонова, цикламова, саліцилова, п-аміносаліцилова, памова і подібні кислоти. Сполуки формули (І), які мають кислотні властивості, можуть бути перетворені в їх фармацевтично прийнятні основно-адитивні солі шляхом обробки вказаної кислотної форми відповідною органічною або неорганічною основою. Відповідні основні сольові форми включають, наприклад, солі амонію, солі лужних і лужноземельних металів, наприклад, солі літію, натрію, калію, магнію, кальцію і подібні, солі з органічними основами, наприклад, бензатин, N-метил-D-глюкамін, солі гідрабаміна, і солі з амінокислотами, такими як, наприклад, аргінін, лізин і подібні. Терміни кислотно- або основно-адитивна сіль також включають гідрати і адитивні форми з розфактором, які здатні утворювати сполуки формули (І). Прикладами таких форм є, наприклад, гідрати, алкоголяти і тому подібне. Термін стереохімічно ізомерні форми сполук формули (І), що використовується в даному документі вище, визначає всі можливі сполуки, що складаються з тих же атомів, зв'язаних тією ж послідовністю зв'язків, але маючих різні тривимірні структури, не є взаємозамінними, якими можуть володіти сполуки формули (І). Якщо не згадується або не вказується інше, хімічна назва сполуки охоплює суміш усіх можливих стереохімічно ізомерних форм, які може мати вказана сполука. Вказана суміш може містити всі діастереомери і енантіомери основної молекулярної структури вказаної сполуки. Усі стереохімічно ізомерні форми сполук формули (І), як у чистому вигляді, так і в суміші один з одним, включені в обсяг даного винаходу. Деякі сполуки формули (І) можуть також існувати в їх таутомерних формах. Хоча такі форми явно не вказані в наведеній вище формулі, вони мають бути включені в обсяг даного винаходу. Термін «сполуки формули (І)», що використовується тут і далі у всьому описі, включає також фармацевтично прийнятні кислотно- або основноадитивні солі і всі стереоізомерні форми. Особливо бажаним інгібітором протеасоми, що використовується відповідно до винаходу, є бортезоміб. Бортезоміб комерційно доступний від фірми Millennium під торгівельним найменуванням Velcade і може бути отриманий, наприклад, як описано в патентах ЕР788360, ЕР1312609, ЕР1627880, US6066730 і US6083903 або способами, аналогічними цим. Даний винахід також відноситься до комбінацій за винаходом для вживання в консервативній терапії, наприклад, для інгібування зростання пухлинних клітин. 13 Даний винахід також відноситься до вживання комбінацій за винаходом для отримання фармацевтичної композиції для інгібування зростання пухлинних клітин. Даний винахід також відноситься до способу інгібування зростання пухлинних клітин в індивідуума, який включає введення індивідуумові ефективної кількості комбінації за винаходом. Даний винахід додатково відноситься до способу інгібування аномального зростання клітин, включаючи трансформовані клітини, шляхом введення ефективної кількості комбінації за винаходом. Аномальне зростання клітин відноситься до клітинного зростання, незалежного від нормальних механізмів регуляції (наприклад, втрата контактного інгібування). Цей спосіб включає інгібування зростання пухлини як безпосередньо, викликаючи зупинку зростання, термінальне диференціювання та/або апоптоз ракових клітин, так і побічно, шляхом інгібування міграції, інвазії і життєздатності пухлинних клітин або неоваскуляризації пухлин. Даний винахід також відноситься до способу інгібування зростання пухлини шляхом введення ефективної кількості комбінації за даним винаходом індивідуумові, наприклад, ссавцеві (а конкретніше, людині), що потребує такого лікування. Зокрема, даний винахід відноситься до способу інгібування зростання пухлин шляхом введення ефективної кількості комбінації за даним винаходом. Даний винахід особливо можна застосовувати для лікування раку підшлункової залози, гематопоетичних пухлин лімфоїдного ряду, наприклад, гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, гострого промієлоцитарного лейкозу, гострого мієлоїдного лейкозу, гострого моноцитарного лейкозу, лімфоми, хронічного Вклітинного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу у фазі бластного кризу, лімфоми Беркітта, множинної мієломи, недрібноклітинного раку легенів, дрібноклітинного раку легенів, неходжкінської лімфоми, меланоми, раку простати, раку молочної залози і колоректального раку. Приклади інших пухлин, які можуть бути інгібовані, включають, без обмеження перерахованим, фолікулярний рак щитовидної залози, мієлодиспластичний синдром (MDS), пухлини мезенхімального походження (наприклад, фібросаркоми і рабдоміосаркоми), тератокарциноми, нейробластоми, гліоми, доброякісну пухлину шкіри (наприклад, кератоакантоми), ниркову карциному, карциному яєчників, карциному сечового міхура і епідермальну карциному. Даний винахід також відноситься до способу лікування гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, гострого промієлоцитарного лейкозу, гострого мієлоїдного лейкозу, гострого моноцитарного лейкозу, лімфоми, хронічного B-клітинного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу у фазі бластного кризу, лімфоми Беркітта і множинної мієломи шляхом введення ефективної кількості інгібітору гістонової дезацетилази формули (І) індивідуумові, наприклад, ссавцеві (а конкретніше, людині), що потребує такого лікування. 97249 14 Даний винахід також відноситься до способу лікування резистентних до ліків пухлин, таких як, без обмеження перерахованим, гематопоетичні пухлини лімфоїдного ряду, наприклад, резистентний до ліків гострий лімфобластний лейкоз, резистентний до ліків гострий мієлогенний лейкоз, резистентний до ліків гострий промієлоцитарний лейкоз, резистентний до ліків гострий мієлоїдний лейкоз, резистентний до ліків гострий моноцитарний лейкоз, резистентна до ліків лімфома, резистентний до ліків хронічний B-клітинний лейкоз, резистентний до ліків хронічний мієлоїдний лейкоз, резистентний до ліків хронічний мієлоїдний лейкоз у фазі бластного кризу, резистентна до ліків лімфома Беркітта і резистентна до ліків множинна мієлома, шляхом введення ефективної кількості інгібітору гістонової дезацетилази формули (І), або індивідуально, або у поєднанні з інгібітором протеасоми, індивідуумові, наприклад, ссавцеві (а конкретніше, людині), що потребує такого лікування. Даний винахід особливо можна застосовувати для лікування резистентної до ліків множинної мієломи, конкретніше, для лікування множинної мієломи, резистентної до інгібіторів протеасом, ще конкретніше, для лікування множинної мієломи, стійкої до бортезомібу. Термін «резистентна до ліків множинна мієлома» включає, без обмеження перерахованим, множинну мієлому, стійку до одного або декількох лікарських засобів, вибраних з групи, що складається з талідоміда, дексаметазону, ревліміда, доксорубіцина, вінкристина, циклофосфаміда, памідроната, мелфалана, дефібротида, преднізону, даринапарсина, беліностата, вориностата, PD 0332991, LBH589, LAQ824, MGCD0103, НuLuc63, AZD 6244, пазопаніба, Р276-00, плітидепсина, бендамустина, танеспіміцина, ензастаурина, перифозина, АВТ-737 або RAD001. Термін «резистентна до ліків множинна мієлома» також включає рецидивуючу або рефрактерну множинну мієлому. Під терміном «резистентний до ліків» розуміють стан, при якому спостерігається вихідна або надбана стійкість. Під «вихідною резистентністю» розуміють характерний профіль експресії в ракових клітинах основних генів відповідних шляхів, що включають, без обмеження перерахованим, апоптоз, розвиток клітин і відновлення ДНК, який приводить до здатності більш швидкого зростання канцерогенних клітин у порівнянні з їх нормальними аналогами. Під «надбаною резистентністю» розуміють багатофакторну ознаку, що виникає при утворенні і прогресуванні пухлини, яке може впливати на чутливість ракових клітин до лікарського засобу. Надбана резистентність може бути обумовлена декількома механізмами, такими як, без обмеження перерахованим, зміни в комплексах лікарський засіб - мішень, понижена акумуляція лікарського засобу, зміна внутрішньоклітинного розподілу лікарського засобу, понижена взаємодія лікарського засобу з мішенню, підвищена реакція детоксифікації, порушення регуляції клітинного циклу, підвищене відновлення пошкодженої ДНК і понижена реакція апоптозу. Деякі з вказаних механізмів можуть виникати одночасно і можуть взаємодіяти один з одним. Їх активація і інактивація 15 може бути викликана генетичними або епігенетичними явищами або наявністю онковірусних білків. Надбана резистентність може виникати до окремих лікарських засобів, але також може спостерігатися більш широко відносно різних лікарських засобів, що мають різні хімічні структури і різні механізми дії. Цю форму резистентності називають множинною лікарською резистентністю. Комбінацію за винаходом можна використовувати для інших терапевтичних цілей, наприклад: a) підвищення чутливості пухлин до радіотерапії шляхом введення сполуки за винаходом перед, у час або після опромінення пухлини з метою лікування раку; b) лікування артропатій і захворювань остеопатій, таких як ревматоїдний артрит, остеоартрит, ювенільний артрит, подагра, поліартрит, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт і системний червоний вовчак; c) інгібування проліферації гладком'язових клітин, включаючи проліферативні розлади судин, атеросклероз і рестеноз; d) лікування запальних захворювань і захворювань шкіри, таких як виразковий коліт, хвороба Крону, алергічний риніт, захворювання «трансплантат проти господаря», кон'юнктивіт, астма, ARDS, хвороба Бехчета, відторгнення трансплантата, кропив'янка, алергічний дерматит, гніздна алопеція, склеродерма, висип, екзема, дерматоміозит, акне, діабет, системний червоний вовчак, хвороба Кавасакі, розсіяний склероз, емфізема, кістозний фіброз і хронічний бронхіт; e) лікування ендометріозу, фіброзу матки, дисфункціональної маткової кровотечі і гіперплазії ендометрія; f) лікування надлишкової васкуляризації ока, включаючи васкулопатію, що зачіпає судини сітківки і судинне сплетення; g) лікування порушення серцевої діяльності; h) інгібування імуносупресуючих захворювань, таке як лікування ВІЛ-інфекції; і) лікування ниркової недостатності; j) супресія ендокринних розладів; k) інгібування порушення глюконеогенезу; l) лікування нейропатології, наприклад, хвороби Паркінсона або нейропатології, яка приводить до когнітивного розладу, наприклад, хвороби Альцгеймера або нейрональних захворювань, пов'язаних з поліглутаміном; m) лікування психіатричних розладів, наприклад, шизофренії, біполярного розладу, депресії, стану тривоги і психозу; n) інгібування нейром'язової патології, наприклад, бічного аміотрофічного склерозу; о) лікування спінальної м'язової атрофії; р) лікування інших патологічних станів, що підлягають лікуванню шляхом потенціювання експресії гена; q) посилення генної терапії; г) інгібування адипогенеза; s) лікування паразитарного захворювання, такого як малярія. Отже, даний винахід відноситься до описаних вище комбінацій для вживання у якості лікарського засобу, а також до застосування інгібітору HDAC 97249 16 формули (І) з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb, або самостійно, або у поєднанні з інгібітором протеасоми, для отримання лікарського засобу для лікування одного або декількох з вищезазначених захворювань. Таким чином, даний винахід відноситься до вживання інгібітору HDAC формули (І) з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb, або самостійно, або в комбінації, для отримання лікарського засобу для лікування гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, гострого промієлоцитарного лейкозу, гострого мієлоїдного лейкозу, гострого моноцитарного лейкозу, лімфоми, хронічного B-клітинного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу, хронічного мієлоїдного лейкозу у фазі бластного кризу, лімфоми Беркітта і множинної мієломи. Даний винахід також відноситься до застосування інгібітору HDAC формули (І) з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb, або самостійно, або в комбінації, для отримання лікарського засобу для лікування резистентних до ліків пухлин, таких як, без обмеження перерахованим, гематопоетичні пухлини лімфоїдного ряду, наприклад, резистентний до ліків гострий лімфобластний лейкоз, резистентний до ліків гострий мієлогенний лейкоз, резистентний до ліків гострий промієлоцитарний лейкоз, резистентний до ліків гострий мієлоїдний лейкоз, резистентний до ліків гострий моноцитарний лейкоз, резистентна до ліків лімфома, резистентний до ліків хронічний Bклітинний лейкоз, резистентний до ліків хронічний мієлоїдний лейкоз, резистентний до ліків хронічний мієлоїдний лейкоз у фазі бластного кризу, резистентна до ліків лімфома Беркітта і резистентна до ліків множинна мієлома. Даний винахід додатково відноситься до застосування інгібітору HDAC формули (І) з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb, або самостійно, або в комбінації, для отримання лікарського засобу для лікування резистентної до ліків множинної мієломи, конкретніше, множинної мієломи, стійкої до інгібіторів протеасоми, ще конкретніше, множинної мієломи, стійкої до бортезомібу. Інгібітор протеасоми і інгібітор HDAC формули (І) можна вводити одночасно (наприклад, в роздільних або єдиних композиціях) або послідовно у будь-якому порядку. В останньому випадку дві сполуки мають бути введені в період і в кількості і способом, які достатні для досягнення сприятливого або синергетичного ефекту. Повинно бути зрозуміло, що бажаний спосіб і порядок введення і відповідні дозування і схеми лікування для кожного компонента комбінації залежатимуть від конкретного інгібітору протеасоми і інгібітору HDАС, що вводиться, способу введення комбінації, конкретної оброблюємої пухлини і конкретного господаря, що потребує лікування. Оптимальний спосіб і порядок введення і дозування і схема лікування можуть бути без зусиль визначені фахівцем у даній галузі, використовуючи прийняті способи і в світлі інформації, представленої в даному документі. Даний винахід додатково відноситься до продукту, що містить у якості першого активного інг 17 редієнта інгібітор HDAC формули (І) і у якості другого активного інгредієнта інгібітор протеасоми, у вигляді комбінованого препарату для одночасного, роздільного або послідовного застосування при лікуванні онкологічних хворих. Фахівець у даної галузі може без зусиль визначити ефективну кількість, ґрунтуючись на результатах випробувань, представлених у даному документі нижче. Як правило, передбачається, що терапевтично ефективна кількість сполуки формули (І) і інгібітору протеасоми складатиме від 0,005 мг/кг до 100 мг/кг маси тіла і, зокрема, від 0,005 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла. Може підходити введення необхідної дози у вигляді двох, трьох, чотирьох або більше субдоз з відповідними інтервалами протягом дня. Вказані субдози можуть бути складені у вигляді стандартних лікарських форм, наприклад, таких, що містять від 0,5 до 500 мг і, зокрема, від 10 мг до 500 мг активного інгредієнта на стандартну лікарську форму. Зважаючи на їх фармакологічні властивості, що використовуються, компоненти комбінацій за винаходом, тобто інгібітор протеасоми і інгібітор HDАС, можуть бути складені в різні фармацевтичні форми залежно від цілей введення. Компоненти можуть бути складені окремо в окремих фармацевтичних композиціях або в єдиній фармацевтичній композиції, що містить обидва компоненти. Інгібітори HDAC можуть бути отримані і складені у фармацевтичні композиції способами, відомими в даній галузі, і, зокрема, відповідно до способів, описаних в опублікованому патентному описі, згаданому в даному документі і наведеному у якості посилання. Даний винахід, отже, також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить інгібітор протеасоми і інгібітор HDAC формули (І) разом з одним або декількома фармацевтичними носіями. Для отримання фармацевтичних композицій для застосування за винаходом ефективна кількість певної сполуки, у формі основно- або кислотноадитивної солі, у якості активного інгредієнта об'єднують у ретельно перемішаній суміші з фармацевтично прийнятним носієм, який можна вибрати з великого числа форм залежно від форми препарату, наміченої для введення. Ці фармацевтичні композиції бажані в стандартній лікарській формі, відповідній, бажано, для перорального, ректального, черезшкірного введення або введення шляхом парентеральної ін'єкції. Наприклад, при отриманні композицій у лікарській формі для перорального введення можна використовувати, у разі рідких препаратів для перорального введення, таких як суспензії, сиропи, еліксири і розчини, будь-яке загальноприйняте фармацевтичне середовище, таке як, наприклад, вода, гліколі, масла, спирти і тому подібне; або, в разі порошків, пілюль, капсул і пігулок, тверді носії, такі як крохмалі, цукри, каолін, змащуючі речовини, зв'язуючі речовини, дезинтегруючі агенти і тому подібне. Завдяки простоті їх введення, найпереважнішою стандартною лікарською формою для перорального введення є пігулки і капсули, у разі яких, очевидно, використовують тверді фармацевтичні носії. У разі парентеральних композицій носій, як правило, міститиме стерильну 97249 18 воду, щонайменше в значній мірі, хоча можуть бути включені інші інгредієнти, сприяючі, наприклад, розчинності. Можуть бути отримані, наприклад, ін'єкційні розчини, в яких носій містить фізіологічний розчин, розчин глюкози або суміш фізіологічного розчину і розчину глюкози. Також можуть бути отримані ін'єкційні суспензії, у разі яких можна використовувати відповідні рідкі носії, суспендуючі агенти, і тому подібне. У композиціях, прийнятних для черезшкірного введення, носій, необов'язково, містить підсилювач пенетрації та/або прийнятний зволожувач, необов'язково, у поєднанні з відповідними добавками будь-якої природи в незначних кількостях, причому добавки не роблять істотного негативного впливу на шкіру. Вказані добавки можуть полегшувати введення через шкіру та/або можуть сприяти здобуттю бажаних композицій. Ці композиції можна вводити різними способами, наприклад, у вигляді трансдермального пластиру, у вигляді диска, у вигляді мазі. Особливо бажано для простоти введення і одноманітності дозування складати вищезазначені фармацевтичні композиції в стандартну лікарську форму. Стандартна лікарська форма, як використовується в описі і формулі винаходу даного документа, відноситься до фізично дискретних одиниць, прийнятних у якості одиничних доз, причому кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активного інгредієнта, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту, в асоціації з необхідним фармацевтичним носієм. Прикладами таких стандартних лікарських форм є пігулки (включаючи пігулки з рискою або покритими пігулками), капсули, пілюлі, пакетики з порошком, облатки, розчини, що ін'єктуються, або суспензії, чайні ложки, столові ложки і тому подібне, і їх роздільні кратні кількості. Це може бути прийнятним для введення необхідної дози кожного компонента комбінації у вигляді двох, трьох, чотирьох або більше субдоз з відповідними інтервалами впродовж курсу лікування. Субдози можуть бути складені у вигляді стандартних лікарських форм, наприклад, таких, що в кожному випадку містять незалежно від 0,01 до 500 мг, наприклад, від 0,1 до 200 мг і, зокрема, від 1 до 100 мг кожного активного інгредієнта на стандартну лікарську форму. Під терміном «індукція ацетилювання гістонів або інших білків» розуміють індукцію ацетильованого стану субстратів HDAC, таких як, без обмеження перерахованим, гістони, наприклад гістон 3, гістон 4 і подібні; тубулін, наприклад, альфатубулін і подібні; білки теплового шоку, наприклад, Hsp 90 і подібні. Під терміном «індукція білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням» розуміють вторинні ефекти, такі як, без обмеження перерахованим, індукція Hsp 70, індукція р21 і тому подібне. Винахід також відноситься до способу характеризації інгібітору HDАС формули (І), або самостійно, або в комбінації з інгібітором протеасоми, що включає визначення в зразку величини індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індук 19 ції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням. Конкретніше, винахід відноситься до способу характеризації інгібітору HDAC формули (І), або самостійно, або в комбінації з інгібітором протеасоми, що включає визначення в зразку величини a) індукції ацетилювання гістону 3, індукції ацетилювання гістону 4 або індукції р21 і b) індукції ацетилювання альфа-тубуліну, індукції ацетилювання Hsp 90 або індукції Hsp 70. У найконкретнішому варіанті винахід відноситься до вищезгаданого способу, в якому концентрація, необхідна для отримання індукції згідно з пунктом а), знаходиться в тому ж діапазоні, що і концентрація для отримання індукції згідно з пунктом b). Визначення в зразку величини індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, може включати ідентифікацію пацієнтів, які відповідають на лікування і, таким чином, може мати сприятливий ефект відносно лікування раку людини. Визначення в зразку величини індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, може включати моніторинг ефективності лікування пацієнтів і, таким чином, може мати позитивний ефект відносно лікування раку людини. Визначення в зразку величини індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, може включати прогнозування терапевтичних відповідей на лікування і, таким чином, може мати сприятливий ефект відносно лікування раку людини. Отже, даний винахід також відноситься до застосування інгібітору HDAC формули (І) з поєднаною активністю відносно HDAC класу І і класу llb, або самостійно, або в комбінації з інгібітором протеасоми, де індукція гіперацетилювання гістонів або інших білків, або індукція білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, має позитивний ефект відносно лікування раку людини. Зразок може бути отриманий з клітин, які були оброблені вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією. Зразок також може бути отриманий з тканини, враженої розладом, і від індивідуумів, підданих дії інгібітору HDAC формули (І) або комбінації інгібітору протеасоми і інгібітору HDAC формули (І). Клітини можуть бути культивованими клітинами, які приводили в контакт з вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією. Вказаний інгібітор або вказана комбінація можуть бути додані в середовище для зростання клітин. Клітини також можуть бути отримані з тканини та/або від індивідуума, підданих дії вказаного інгібітору або вказаної комбінації. Переважно, спосіб характеризації включає лише стадії, які здійснюють in vitro. Тому, згідно з даним варіантом здійснення, стадія отримання 97249 20 тканинного матеріалу з тіла людини або тварини не охоплюється даним винаходом. Для визначення індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, клітини, як правило, обробляють до стану, прийнятного для способу, що використовується. Обробка може включати гомогенізацію, екстракцію, фіксацію, відмивання і пермеабілізацію. Спосіб обробки, в основному, залежить від способу, що використовується для визначення індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням. Зразок може бути отриманий з матеріалу біопсії пацієнта. Матеріал біопсії може бути додатково оброблений для отримання зразка, який знаходиться в стані, прийнятному для способу, що використовується для визначення індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням. Величину ацетилювання білків або кількість індукованого білка можна визначити, використовуючи антитіло. Як використовується в даному документі, під терміном «антитіло» розуміють імуноглобулін або його похідне, таке, що має ту ж саму специфічність зв'язування. Антитіло, що використовується за винаходом, може бути моноклональним антитілом або антитілом, отриманим з або таке, що міститься в поліклональній антисироватці. Під терміном «антитіло» додатково розуміють похідні, такі як фрагменти Fab, F(ab')2, Fv або scFv. Антитіло або його похідне може бути природним або може бути отримано (напів) синтетично. Можна використовувати вестерн-блоттинг, який, як правило, відомий у даній галузі. Для отримання зразків клітинний матеріал або тканина можуть бути гомогенізовані і оброблені денатуруючими та/або поновлюючими агентами. Зразок можна нанести на поліакриламідний гель для розділення білків з подальшим перенесенням на мембрану або безпосередньо помістити на тверду фазу. Антитіло потім приводять в контакт із зразком. Після однієї або декількох стадій відмивання антитіло, що зв'язалося, визначають, використовуючи методики, які відомі в даній галузі. Після фіксації і пермеабілізації тканинного матеріалу, наприклад, зрізів твердих пухлин, можна використовувати імуногістохімічне дослідження, антитіло потім інкубують із зразком і після однієї або декількох стадій відмивання визначають антитіло, що зв'язалося. За допомогою ELISA можна визначити величину індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням. Може бути розглянута велика кількість варіантів ELISA. У одному з варіантів антитіло іммобілізують на твердій фазі, такій як планшет для мікротитрування, з подальшою блокадою сайтів неспецифічного зв'язування і інкубацією із зразком. У іншому варіанті зразок спочатку приводять в контакт з твердою фазою для іммобілізації ацетильованих та/або індукованих білків, що містяться в зразку. Після 21 блокування і, необов'язково, відмивання антитіло приводять в контакт з іммобілізованим зразком. Величину індукції ацетилювання гістонів або інших білків, або індукції білків, функціонально регульованих вказаним ацетилюванням, можна визначити проточною цитометрією. Клітини, наприклад, клітини культури клітин або клітини крові, або клітини кісткового мозку фіксують і підвищують їх проникність, дозволяючи антитілу досягти ацетильованих та/або індукованих білків. Після необов'язкового відмивання і стадій блокування антитіло приводять в контакт з клітинами. Для визначення клітин, що мають антитіло, пов'язане з ацетильованими та/або індукованими білками, потім здійснюють проточну цитометрію відповідно до методик, відомих у даній галузі. Для визначення, чи має інгібітор HDAC або комбінація інгібітору протеасоми і інгібітору HDАС формули (І) свою активність, можна визначити величину ацетилювання білка або індукції білка в контрольному зразку, де контрольний зразок отримують з клітин, які не обробляли вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією. Визначення величини ацетилювання білка і кількості індукованого білка в зразку і контрольному зразку можна здійснити паралельно. У разі клітин з культури клітин, отримують дві композиції клітин, одну з яких обробляють вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією, тоді як іншу залишають необробленою. Потім обидві композиції додатково обробляють і визначають відносні величини ацетилювання білків і кількість індукованого білка. Альтернативно, для визначення, чи має інгібітор HDAC або комбінація інгібітору протеасоми і інгібітору HDАС формули (І) свою активність, можна визначити інгібування клітинної проліферації. У разі пацієнтів, зразок отримують від пацієнта, якого піддавали дії інгібітором HDAC формули (І) або комбінацією інгібітору протеасоми і інгібітору HDАС формули (І). Контрольний зразок отримують від іншого пацієнта, що страждає на той же самий розлад, якого не піддавали дії вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією, або від здорового індивідуума. Тканина, з якої отримують контрольний зразок, відповідає тканині, з якої отримують зразок. Наприклад, якщо зразок отримують з тканини пухлини від пацієнта, що страждає на рак молочної залози, то контрольний зразок також отримують з тканини пухлини від пацієнта, що страждає на рак молочної залози, або з тканини молочної залози здорового індивідуума. Також можна передбачити те, що зразок і контрольний зразок отримують від одного і того ж індивідуума. У цьому випадку тканина, з якої отримують контрольний зразок, отримана від індивідуума до або після лікування індивідуума вказаним інгібітором HDAC або вказаною комбінацією. Бажано, тканину отримують до лікування, щоб виключити можливі наслідки лікування інгібітором після припинення лікування. Експериментальна частина А. Фармакологічний приклад Відносно активності сполук формули (І) в плані дії на клітини, яку визначали на клітинах пухлини А2780, використовуючи колориметричний аналіз 97249 22 для визначення токсичності для клітин або життєздатності клітин (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983), посилаються на експериментальну частину публікації WO 2006/010750. Антипроліферативні ефекти інгібіторів HDAC були пов'язані з інгібуванням HDAC класу І, який складається з членів сімейства HDAC 1-3 і 8. Активність JNJ 26481585 відносно HDAC 1, імунопреципітованого з клітин А2780, і його потенційні можливості в порівнянні з R306465, SAHA, LBH589 і LAQ-824 можна знайти в прикладі А.1. Активність JNJ 26481585 відносно HDAC 8, рекомбінантного ферменту людини, і його потенційні можливості в порівнянні з R306465, SAHA, LBH-589 і LAQ-824 можна знайти в прикладі А.2. Додатково вивчали, чи модулює R306465 стан ацетилювання субстратів HDAC 1 гістону 3 (Н3) і гістону 4 (Н4). Також вивчали індукцію інгібітору waf1,cip1 циклінзалежних кіназ p21 у клітинах карциwaf1,cip1 номи яєчника А2780. p21 репресується в результаті ацетилювання гістонів і грає важливу роль в індукції зупинки клітинного циклу у відповідь на інгібітори HDAC (див. приклад А.3.). Для оцінки інгібування HDAC 6 і відносній активності сполук відносно HDAC 1 у порівнянні з HDAC 6 спостерігали ацетилювання її субстрату тубуліну і індукцію Hsp 70, яка є наслідком ацетилювання Hsp 90 (див. приклад А.4.). Приклад А: специфічність класу І і ефекти ацетилювання сполук формули (І) Приклад А.1.: інгібування ферменту HDАС 1, імунопреципітованого з клітин А2780 Для досліджень активності HDАС 1 здійснювали імунопреципітацію HDАС 1 з клітинних лізатів А2780 і інкубували з вказаним інгібітором HDAC, узятим в кількостях, відповідних кривій зміни кон3 центрації, і з [ Н]міченим для ацетилу фрагментом пептиду Н4 (50,000 імп/хв) [біотин-(63 аміногексановий) Gly-Ala-(ацетил[ H]Lys-Arg-HisArg-Lys-Val-NH2] (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Активність HDAC оцінювали, вимірюючи вивільнення вільних ацетилових груп. Результати виражають у вигляді середніх величин ІС50 ± SD для трьох незалежних експериментів. JNJ 26481585 R306465 SAHA LAQ-824 LBH-589 ІС50 інгібування HDAC 1 в нМ 0,16±0,02 3,31±0,78 73±26 0,29±0,05 0,23±0,06 Приклад А.2: інгібування рекомбінантного ферменту людини HDAC 8 Для інгібування рекомбінантного HDAC 8 людини використовували набір для колориметричного/флуорометричного дослідження активності HDAC 8/доставки лікарського засобу (Biomol; Cat. nr. АК-508). Результати виражали у вигляді середніх величин ІС50 (нМ) ± SD для трьох незалежних експериментів. Аналізи здійснювали в двох повторах і, використовуючи програму Graphpad Prism (Graphpad Software), розраховували стандартне відхилення ІС50. 23 JNJ26481585 R306465 SAHA LAQ-824 LBH-589 97249 ІС50 інгібування HDAC 8 в нМ 34±41 23±17 370±314 37±23 283±29 Приклад A.3: Ацетилювання клітинних субwaf1,cip1 стратів HDAC 1 і індукція p21 Клітини карциноми яєчника людини А2780 інкубували протягом 24 год із сполуками в концентраціях 0, 1, 3, 10, 30,100, 300, 1000 і 3000 нМ. Отримували сумарні клітинні лізати і аналізували за допомогою SDS-PAGE. Визначали рівні ацетильованих гістонів Н3 і Н4, загальний рівень waf1,cip1 білків Н3 і рівні білка p21 , використовуючи кролячі поліклональні і мишачі моноклональні антитіла з подальшим визначенням посиленої хемілюмінесценції (ECL). Рівні ацетильованих Н3 і Н4 визначали за допомогою антитіл від Upstate Biotechnology (Cat. nr. 06-299 і 06-866), сумарний рівень білків Н3 визначали за допомогою антитіл від Abcam (Cat. nr. waf1,cip1 аb1791), і рівень білка p21 визначали за допомогою антитіл від Transduction Laboratories (Cat. nr. C24420). Антитіла у відповідних розведеннях інкубували протягом або 1-2 год при кімнатній температурі, або протягом ночі при 4°С. Щоб проконтролювати еквівалентне завантаження, блоти вирізали і повторно зондували мишачими моноклональними IgM проти актину (Ab-1, Oncogene Research Products). Для контролю ефективності екстракції ядерних білків блоти вирізали і повторно зондували антитілами проти ламіна В1 (Zymed; Cat. nr. 33.2000). Комплекси білок-антитіло потім візуалізували шляхом хемілюмінесценції (Pierce Chemical Co) або флуоресценції (Odyssey) згідно з інструкціями виробника. Експерименти здійснювали в трьох повторах. JNJ 26481585 R306465 SAHA LAQ-824 LBH-589 Концентрація (нМ), при якій спостерігається індукція ацетилювання гістону Н3 і Н4 і індукція waf1,cip1 p21 10 100 3000 10 10 Приклад А.4. Ацетилювання тубуліну і індукція Hsp 70 Клітини карциноми яєчника людини А2780 інкубували із сполуками в концентраціях 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 і 3000 нМ протягом 24 год. Отримували сумарні клітинні лізати і аналізували за допомогою SDS-PAGE. Рівні загального і ацетильованого тубуліну визначали, використовуючи антитіла від Sigma: клони DM1A (Cat. nr. T9026) і 6-111В (Cat. nr. T6793). Білок Hsp 70 визначали за допомогою антитіла від Stressgen (Cat. nr. SPA-810) з подальшим визначенням за допомогою ECL. Антитіла у відповідних розведеннях 24 інкубували протягом або 1-2 год при кімнатній температурі, або протягом ночі при 4°С. Щоб проконтролювати еквівалентне завантаження, блоти вирізали і повторно зондували мишачими моноклональними IgM проти актина (Ab-1, Oncogene Research Products). Для контролю ефективності екстракції ядерних білків блоти вирізали і повторно зондували антитілами проти ламіна В1 (Zymed; Cat. nr. 33.2000). Комплекси білок-антитіло потім візуалізували шляхом хемілюмінесценції (Pierce Chemical Co) або флуоресценції (Odyssey) згідно з інструкціями виробника. Експерименти здійснювали в трьох повторах. JNJ 26481585 R306465 SAHA LAQ-824 LBH-589 Концентрація (нМ), при якій спостерігається початок індукції ацетилювання тубуліну і індукції Hsp 70 30 1000 100 30 30 Приклад В: Інгібування проліферації клітин пухлини кровотворної системи людини Здійснення оцінки антипроліферативної активності JNJ 26481585 у панелі ліній клітин пухлини кровотворної системи людини передавали фірмі Oncodesign (Dijon, France). Клітини пухлини вирощували у вигляді клітинної суспензії у відповідному прийнятному культуральному середовищі при 37°С в інкубаторі 5% СО2 з системою зволоження. Вільні від мікоплазми клітини пухлини засівали в 96-лункові плоскодонні планшети для мікротитрування і інкубували при 37°С протягом 24 год в культуральному середовищі, що містить 10% FCS. Пухлинні клітини потім експонували з носієм (контроль) або JNJ 26481585 у підвищених концентраціях (5 різних концентрацій*), бортезомібом (5 різних концентрацій*) або комбінацією обох лікарських засобів в різних співвідношеннях. Клітини потім інкубували протягом додаткових 72 год. Цитотоксичну активність сполуки(сполук) показували за допомогою стандартного аналізу MTS, вимірюючи оптичну щільність при 490 нм. Взаємодії сполук (синергізм, адитивність або антагонізм) розраховували шляхом множинного аналізу ефектів лікарських засобів і здійснювали за допомогою рівняння медіани згідно з методикою, описаною Chou & Talalay [CHOU et al. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55; CHOU et al. (1991) у Encyclopaedia of human Biology. Academic Press. 2: 371-379; CHOU et al. (1991) у Synergism and antagonism in chemotherapy. Academic Press: 61102; CHOU et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86: 1517-1524]. *: на підставі попереднього визначення антипроліферативної активності кожного лікарського засобу, що використовується як самостійний агент, вибирали концентрації, що не перевищують 50% інгібування в кожній з вибраних ліній клітин. Приклад В.1.: Інгібування проліферації клітин пухлини кровотворної системи людини за допомогою JNJ 26481585. 25 97249 26 Таблиця F.1 Результати виражають у вигляді середньої величини ІС40 (тобто концентрації, вираженій в нМ, потрібною для досягнення 40% інгібувань клітинної проліферації) ± SD, визначеною з 3 незалежних достовірних експериментів Лінія клітин CCRF-CEM Jurkat clone E6-1 KG-1 MOLT-4 SUP-B15 HL-60 ОCI-AML2 THP-1 EHEB BV-173 K-562 KCL-22 LAMA-84 U-937 Daudi Namalwa Raji Ramos ARH-77 RPMI8226 Тип Гострий лімфобластний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий мієлогенний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий промієлоцитарний лейкоз Гострий мієлоїдний лейкоз Гострий моноцитарний лейкоз Хронічний B-клітинний лейкоз Хронічний В-клітинний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз у фазі бластного кризу Лімфома Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Мієлома Мієлома Величина 11,93 9,22 13,39 42,96 1,13 24,28 19,56 50,65 165,81 4,54 15,91 7,71 30,40 23,67 9,08 4,65 26,34 4,66 40,42 6,41 SD 7,75 7,75 10,48 56,25 10,72 13,93 22,84 128,15 4,28 8,29 5,14 19,93 10,14 1,27 4,32 16,11 2,82 24,32 5,44 Приклад В.2.: Інгібування проліферації клітин пухлини кровотворної системи людини за допомогою бортезоміба. Таблиця F.2 Результати виражають у вигляді середньої величини IC40 (тобто концентрації, вираженій в нМ, потрібною для досягнення 40% інгібувань клітинної проліферації) ± SD, визначеною з 3 незалежних достовірних експериментів Лінія клітин CCRF-CEM Jurkat clone E6-1 KG-1 MOLT-4 SUP-B15 HL-60 OCI-AML2 THP-1 EHEB BV-173 K-562 KCL-22 LAMA-84 U-937 Daudi Namalwa Rajі Ramos ARH-77 RPMI8226 Тип Гострий лімфобластний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий мієлогенний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий лімфобластний лейкоз Гострий промієлоцитарний лейкоз Гострий мієлоїдний лейкоз Гострий моноцитарний лейкоз Хронічний B-клітинний лейкоз Хронічний B-клітинний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз Хронічний мієлоїдний лейкоз у фазі бластного кризу Лімфома Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Лімфома Беркітта Мієлома Мієлома Величина 4,40 5,63 3,36 12,14 2,40 13,38 11,64 5,83 6,02 2,77 12,83 1,74 2,61 5,68 2,68 4,48 5,20 1,83 7,21 4,23 SD 0,84 2,68 0,83 12,91 1,99 11,61 0,94 0,34 0,20 4,11 1,56 0,46 1,07 0,54 1,00 0,69 0,10 2,22 0,99 27 97249 28 Приклад В.3: Інгібування проліферації клітин пухлини кровотворної системи людини за допомогою JNJ 26481585 в комбінації з бортезомібом. Таблиця F.3 Результати виражають у вигляді середнього індексу комбінації (СІ ± SD) усереднених величин СІ в кожному окремому дослідженні (3 незалежних достовірних експеримента) і розраховують з кожного окремого співвідношення комбінації. СІ менше 0,9 вказує на «синергізм» (сірий колір), а СІ в інтервалі між 0,91 і 1,09 вказує на «адитивність» (білий) Величина CCRF-CEM Jurkat KG-1 MOLT-4 SUP-B15 HL-60 OCI-AML2 THP-1 EHEB 0,76 K-562 KCL-22 LAMA-84 U-937 Daudi Namalwa Raji Ramos ARH-77 RPMI8226 SD 0,75 0,80 0,96 0,85 0,81 0,81 0,71 0,94 0,62 0,05 0,75 0,96 1,05 0,67 0,87 0,58 0,80 0,89 0,90 0,76 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне 0,10 0,15 0,26 0,17 0,03 0,24 0,12 0,25 0,11 0,25 0,26 0,27 0,06 0,18 0,08 0,08 0,36 0,34 0,06 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601