Застосування галогенокарбоксилатів диренію (ііі) як речовин з антипроліферативною активністю відносно клітин коренів кукурудзи та гібридоми 1д6, а також імунотропною активністю відносно взаємодії антиген-антиті

1. Застосування галогенокарбоксилатів диренію (ІІІ) загальної формули Re2(RCOO)nX6-nL2 , (1) де R означає СН3, С2Н5, і-С3Н7, NH2CH2CH2CH2 (GABA); X означає СІ або Br; L означає Н2О, ДМАА, ДМФА або відсутнє; n означає 2 або 4; за умови, коли L відсутнє, n означає 4, як речовин з антипроліферативною активністю відносно клітин коренів кукурудзи та гібридоми 1Д6. 2. Застосування галогенокарбоксилатів диренію (ІІІ) загальної формули (1) за п. 1 як речовин з імунотропною активністю відносно взаємодії антиген-антитіло. 3. Спосіб одержання галогенокарбоксилатів диренію (ІІІ) загальної формули (1) за п. 1 відновленням в кислому середовищі калій перенату в інертній атмосфері, який відрізняє ться тим, що амоній перенат переводять у літій перенат та проводять відновлення продукту кип'ятінням в кислому середовищі протягом 3-5 годин за допомогою станум (ІІ) хлориду. (19) (21) a200510232 (22) 31.10.2005 (24) 25.12.2007 (72) ШТЕМЕНКО ОЛЕКС АНДР ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ШТЕМЕНКО Н АТАЛІЯ ІВАНІВН А, U A, ГОРІЛА МАРИНА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, U A, СОРОЧАН ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВН А, U A, ГОЛІЧЕНКО ОЛЕКС АНДР АН АТОЛІЙОВИЧ, U A (73) УКРАЇНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ ХІМІКОТЕХНОЛОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ДНІПРОПЕТРОВСЬКИЙ НАЦІОН АЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA (56) UA 17183, A, 18.03.1997 Штеменко А.В., Котельникова А.С., Бовыкин Б.А., Голованева И.Ф. Синтез и свойства биядерных галогенокарбоксилатов рения(III) // Журн. неорган, химии.-1986Т.31, №2.-С.399-405 Кожура О.В. Синтез, будова та властивості біядерних комплексних сполук ренію (III) з амінокислотами: Автореф. дис. канд. хім. наук; Укр. держ. хім.-технол. ун-т. - Д., 2000. - 19 с. SU 819116, A1, 09.04.1981 Шалимов С.А., Кейсевич Л.В., Литвиненко А.А. и др. Платинотерапия: структурные основы и механизмы противоопухолевого действия нового поколения препаратов. В кн: Лечение неоперабельных опухолей органов брюшной полости. - К.: Преса Украины.-1998. - С. 256. Иванов В.Б., Чельцов П.А., Щелоков Р.Н. C2 2 UA 1 3 81311 Відоме використання сполук загальної формули (1), в яких R= СН3-, С2Н5-, С3Н7-, i-С3Н7-, (СН3)3С- у якості металокерамічних матеріалів на основі металічного ренію [Патент України 17183 А, пуб.18.03.1997, кл. С22С 27/00]. Відомий клас сполук платини з органічними лігандами загальної формули (X)2Pt(Y2), де X = СІ-, ОH-, Вr-; Υ = NH3 , NHCH3, N(CH3)2, що проявляють антипроліферативну активність відносно ракових клітин [Шалимов С.А., Кейсевич Л.В., Литвиненко А.А. и др. Платинотерапия: структурные основы и механизмы противоопухолевого действия нового поколения препаратов. В кн: Лечение неоперабельных опухолей органов брюшной полости. - «Преса Украины», Киев. - 1998. - С. 256.], у тому числі відносно клітин коренів кукурудзи [Иванов В.Б., Чельцов П.А., Щелоков Р.Н. Подавление роста комплексами платины в зависимости от их строения// Доклады Академии наук СССР. - 1976. -Том 229, № 2. - с. 484 - 487.] (прототип). Однак, недоліком цих сполук є висока гепатота нефротоксичність, а також здатність проявлять ефект інгібування у високих нефізіологічних концентраціях та низька антипроліферативна активність при низьких концентраціях. Відомий спосіб одержання класу сполук ренію з амінокислотами загальної формули (1), в яких n = 2, a R = гліцин, валін, α-аланін, β-аланін, γаміномасляна кислота (GABA), який заснований на взаємодії солей Rе2СІ82- з амінокислотою та водою в нітрометані [Автореф. дис. канд. хім. наук: 02.00.01/ Кожура О.В.; Укр.. держ. хім..-технол. унт. -Д., 2000. - 19с.]. До недоліків цього способу відноситься багатостадійність такого синтезу та невеликий вихід цільового продукту реакції. Найбільш близьким щодо отриманого результату до заявляемого способу отримання галогенокарбоксилатів диренію(ІП) є спосіб одержання цис^тшрага?іогеноди-цацетатівдиренію(Ш) за допомогою автоклавного синтезу при відновленні калій перренату воднем у суміші оцтової та соляної кислот (у співвідношенні 2:1) в інертній атмосфері при температурі ЗОО°С та початковому тиску ЗО атм [Штеменко А.В., Котельникова А.С., Бовыкин Б.А., Голованева И.Ф. Синтез и свойства бяядерных галогенокарбоксшіатов рения(Ш) // Журн. неорган, химии.-1986.- Т.31., №2.- С.399-405] (прототип). До недоліків прототипу слід віднести складність способу отримання сполук, обумовлену необхідністю використання особливого обладнання (автоклаву), додаткові економічні витрати, пов'язані з пошкодженням обладнання в хімічно агресивному середовищі проведення синтезу, а також відсутність можливості контролювати перебіг реакції. В основу винаходу поставлена задача застосування відомих речовин загальної формули (1) як таких, що проявляють антипроліферативну активність відносно клітин коренів кукурудзи та гібридоми 1Д6, а також імунотропну активність відносно взаємодії антиген-антитіло та спосіб їх отримання.4 Поставлена задача досягається галогенокарбоксилатами диренію(ІІІ) загальної формули: Re2(RCOO)nX6-nL2 (1) де R = СН3, С2Н5, і-С3Н7, NH2CH2CH2CH2 (GABA); Х = Сl або Br; L = Н2 O, ДМАА, ДМФА, n=2 або 4; при n=4 L=0, що проявляють антипроліферативну активність відносно клітин коренів кукурудзи та гібридоми 1Д6, а також імунотропну активність відносно взаємодії антиген-антитіло. Також поставлена задача досягається тим, що в відомому способі отримання галогенокарбоксилатів диренію(Ш) загальної формули (1) відновненням воднем у кислому середовищі калій перренату в інертній атмосфері, відповідно винаходу амоній перренат переводять у літій перренат та проводять відновнення продукту кип'ятінням в кислому середовищі на протязі 3-5 годин за допомогою станум(І1) хлорида. Приводимо приклади конкретного виконання винаходу. Приклад 1. Синтез цисRе2(СН3СОO)2Сl4•2Н2О: до суміші 15 г NH4ReO4 та 2,4 г LiOH.H2O додають води і ставлять на роторний випарник. Після випару усієї води в колбі утвориться LiReO4•2H2O з ви ходом близько 100%, який потім змивають водою для одержання цисRе2(СН3СОO)2Сl4•2Н2О. У конічну колбу на 100мл у зазначеному порядку поміщають 1,35г LiReO4•2H2O, 5 мл води, 7,5 мл концентрованої оцтової кислоти, 4,5 г SnСІ2.2Н2O. При цьому утвориться розчин коричневого кольору. Колбу закривають пробкою та ставлять на магнітну мішалку і підтримують температуру розчину 30°С на протязі 1,5 годин. Після цього вносять до колби 60мл концентрованої соляної кислоти і нагрівають розчин до кипіння. Кип'я тять 3 години, слідкуючи за тим, щоб обсяг рідини не став менше 10-15 мл, потім відганяють з прямим холодильником половину розчину. Далі отриманий розчин кристалізують при температурі близько 5°С. Темно-синій осад, що утворився, відфільтровують і промивають 2мл спирту і 5мл гексана. Вихід 50 - 70%. 2LiReO4 + 2СН3СООН + 4SnСl2 + 22НСl ® ® цис-Rе2(СН3СОО)2СІ4 • 2Н2О + 4Н2SnСl6 + 2LiCl + 6Н2O Приклад 2. Синтез цисRе2(СН3СОО)2СІ4•2ДМАА: проводять аналогічно прикладу 2 з додаванням диметилацетаміду (ДМАА) до кінцевого розчину. Приклад 3. Синтез цисRе2(СН3СОО)2СІ4•2ДМФА: проводять аналогічно прикладу 2 з додаванням диметилформаміду (ДМФА) до кінцевого розчину. Приклад 4. Синтез цисRе2(СН3СОО)2Вr4•2Н2O: проводиться аналогічно прикладу 2 з використанням бромідної кислоти замість хлоридної. Приклад 5. Синтез цисRе2(С2Н5СОО)2Вr4•2ДМАА: 5 81311 проводиться аналогічно прикладу 2 з використанням бромідної кислоти замість хлоридної та додаванням диметилацетаміду (ДМАА) до кінцевого розчину. Приклад 6. Синтез Rе2(і-С3Н7СОО)4СІ2; розчин 1 г (NBu4)2Re2Cl8 в 40 мл ізомасляній кислоті і кип'ятять із зворотнім холодильником на протязі 1 часу до розчинення вихідної речовини і утворення синього розчину. Далі для зміщення рівноваги в бік Rе2(і-С3Н7СОО)4СІ2 відганяють 10 мл розчину і додають 10 мл ізомасляної кислоти. Таким чином видаляють надлишкову хлоридної кислоти, яка утворюється при проходженні реакції. Колір розчина при цьому змінюється з синього на темночервоний і при охолодженні утворюється жовтогарячий осад Rе2(і-С3Н7СОО)4СІ2. Осад відфільтровують та промивають ацетоном, діетиловим ефіром та сушать до постійної маси. Вихід 80%. (NBu4)2Re2Cl8 + 4 і-С 3Н7СООН ® ® Rе2(і-С3Н7СОО)4СІ2 + 2 NBu 4Cl + 4 НСl Приклад 7. Синтез цис[Rе2(САВА)2СІ 4(Н2O) 2]СІ2 . Наважку 0,165 г (0,2 ммоль) [GABAH]2Re2Cl8 розчиняють в 20 мл нітрометану, попередньо осушеного перегонкою над Р2O5, потім додають 0,02 мл (1 ммоль) води, ізолюють отриманий розчин від доступу повітря і залишають на місяць для кристалізації. Кристали, що утворилися, відфільтровують, промивають сухим нітрометаном і сушать 5 годин у вакуумі при температурі 45-50°С. [GABAH]2Re2Cl8 + 2Н2O ® цис[Rе2(GАВА) 2СІ4(Н 2O)2 ]СІ2 + 2НСl Дослідження на антипроліферативну активність були проведені на коренях проростків кукурудзи за способом, описаним Івановим В.Б. [Иванов В.Б., Чельцов П.А., Щелоков Р.Н. Подавление роста комплексами платины в зависимости от их строения // Доклады Академии наук СССР. - 1976. - т.229, № 2. - С.484-487]. Дании метод запропонований для початкового скринінгу речовин, які можуть бути запропоновані для відбору потенційних антиракових препаратів, оскільки показана висока ступінь кореляції між антипроліферативною активністю на коренях кукурудзи та антиканцерогенною активністю різноманітних речовин. Насіння пророщували на фільтрувальному папері, зволоженому дистильованою водою, при кімнатній температурі. Триденні проростки поміщали у фарфорові стакани з дистильованою водою та розчинами сполук ренію, які вивчаються. Довжину коренів вимірювали один раз на добу протягом трьох діб. Розчини комплексів, які вивчаються готували у концентраціях 10-5; 10-6; 10-7; 10-8; 10-9; 10-10 моль/л. Ступінь інгібування росту кореніву різний час після початку обробки обчислювали за формулою: I= [(Dlk - D li ) / Dlk ]x 100 де D lk - приріст контрольних коренів, D li ЛІ; приріст коренів, які росли у розчинах сполук. Тобто, сполуки, які мають виражену протипухлинну активність, виявляють ознаки виборчого інгібування мітозів при обробці ними 6 коренів [Иванов В.Б., Чельцов П.А., Щелоков Р.Н. Подавление роста комплексами платины в зависимости от их строения // Доклады Академии наук СССР. - 1976. - т.229, № 2. -С.484-487]. Сполуки даного винаходу інгібують in vi vo проліферацію клітин, що доказано виміренням розміру коренів кукурудзи, співвідносно із загальновідомими умовами, описаними у літературі (табл.1). Ступінь інгібування росту бічних коренів (І, %) сполук цис-[Rе2(СН3СОО)2СІ4(ДМФА)2 ] 70,34 ±6,75 цис-[Rе2(СН3СН2СОО)2Вr4(ДМАА)2] 94,56 ±9,14 Концент 10-6 1 90,46 48 ±6,18 ±4 40,45 45 ±4,86 ±3 45 0 ±4 29,16 38 ±2,58 ±3 31,24 33 ±3,36 ±3 84 97,88 ±7 ±9,66 цис-[Rе2(СН3СОО)2Вr4(Н2O) 2 93,66 ±8,79 94,96 ±9,55 0 0 Формули сполук Цис-[Рt(NН3)2СІ2] Tpaнс-[Pt(NH3)2Cl2] цис-[Rе2(GАВА) 2СІ4(Н2O) 2]СІ 2 цис-[Rе2(СН3СОО)2СІ4(ДМАА)2 ] Re2(i-С3Н7СОО)4СІ2 10-5 98,34 ±5,55 29,15 ±2,42 0 0 У вказаних вище експериментах тетраізобутиратодиреній(III) хлорид, диаква-цистетрабромодиm -ацетатодирений (III), гідрофосфатотетраm -ацетатодирений (III) проявляють особливо значну активність. Дослідження сполук ренію на імунотропну активність були проведені на взаємодії антигенантитіло [Черниш В.А. Практическое руководство по иммунохимическим методам исследования. М., Высшая школа. - 1985. - 379 с.]. При постановці експериментів були використані стандартна сироватка крові людини з заздалегідь відомим вмістом імуноглобулінів G (8.82мг/мл), А (1.52мг/мл), М (1.1мг/мл). До них були моноспецифічні поліклональні антитіла проти імуноглобулінів крові людини, що були добуті від вівці. Препарати є виробництвом НДІ епідеміології та мікробіології м. Нижнього Новгороду. Під час кількісного імуноелектрофорезу в якості антигену був взятий препарат альбуміну сироватки крові фірми "Реанон" (Венгрія), електрофоретичне чисти,, ліофільне висушений. А також поліспецифічні антитіла до сироватки крові людини. Препарати є виробництвом НДІ епідеміології та мікробіології м. Нижнього Новгороду. До зразків додавали сполуки даного винаходу у концентраціях: 10-5; 10-6; 10-7; 10-8; 10-9; 10-10;10-11; 10-12 моль/л . Сполуки даного винаходу пригнічують in vitro взаємодію антиген-антитіло, що доведено 99 ±9 41 ±4 7 81311 вимірюваннями розміру імнунопреципітатів (табл.2,3), співвідносно із загальновідомою сполукою (цис-платин), описаною у літературі (табл.4). Таблиця 2 ВПЛИВ цис-[Rе2(GАВА) 2СІ4(Н2 O)2]СІ 2 на імунохімічні взаємодії Розмір кіл імунопреципітатів (мм 2), n=12 Концентрація IgG IgA IgM сполуки ренію, моль/л контроль 114 65 36 10-5 моль/л 92 39 35 10-6 моль/л 93 50 34 10-7 моль/л 92 49 35 10-8 моль/л 80 46 30 10-9 моль/л 75 38 25 10-10 моль/л 100 50 35 10-11 моль/л 99 51 35 10-12 моль/л 101 49 35 8 Вплив Тимогену на імунохімічні взаємодії Розмір кіл імунопреципітатів (мм 2). n=12 Концентрац ія сполуки ренію, моль/л контроль 10-6 10-8 10-10 10-12 IgG. IgA. IgM 100±4 124±6 67±4 45±2 44±1 100±4 116±6 76±8 45±2 54±3 100±4 52±2 34±1 42±1 34±2 При цьому Тимоген пригнічує утворення комплексу антиген-антитіло в експериментах з імуноглобуліном М (Ig М). Вплив розчинів сполук ренію на проліферацію клітин оцінювали шляхом їх додавання у кільтуральне середовище клітин мишачої гібридами 1Д6. Мишача гібрид ома 1Д6 була отримана шляхом злиття клітин мієломи миші лінії SP-2 та спліноцитів миші в Інституті біохімії ім. О.В.Паладіна НАН України (м. Київ) [Skok M.V., Voitenko L.P., Voitenko S.V., L ykhmus E.Y., Kalashnik E.N., Litvin T.I., Tsartos S.J., Skok Tаблиця 3 V.I. Stud y of a subunit composition ofnicotinic acetylcholine receptor in the neurons of autonomic ВПЛИВ Rе2(ізо-С 3Н7СОO)4СІ2 на імунохімічні ganglia of the rat with subunit-specific anti- a (181взаємодії 192) peptide antibodies // Neuroscience. - 1999- v.93, 2 Розмір кіл імунопреципітатів (мм ), n=12 №499-P. 143 7-1446]. Концентрація Для оцінки кількості живих клітин після їхньої IgG IgA IgM сполуки ренію, обробки сполуками металів використовували МТТмоль/л тест [Mossman T. Rapid colorimetric assay for контроль 120 70 90 cellular growth and survival: application to 10-6 моль/л 80 62 50 proliferation and cytotoxicity assay // J.Immunol.Methods. - 1983. - №65. -P.55-63]. 3-[4,5 10-8 моль/л 100 38 35 диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолію бромід 10-10 моль/л 92 51 53 -12 вносили до культурального середовища у 10 моль/л 83 52 65 планшети з культурою клітин до досягнення кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. Після У вказаних вище експериментах чотиригодинної інкубації у СО2-інкубаторі дихлоротетра- m -ізобутиратодиреній(ІІІ) та диаквасередовище видаляли, планшети тричі промивали цис-тетрабромодиц-ацетатодирений (Ш) PBS і розчиняли формазан, що утворився, у 100% проявляють особливо значну активність. диметилсульфоксиді протягом 5 хв. за інтенсивного перемішування. Надалі проводили Таблиця 4 фотометричне вимірювання планшетів на рідері ("Dynatech", модель MR580). Кількість живих Вплив цис-платину на імунохімічні взаємодії клітин після обробки розчинами сполук металів представлено у таблиці 6. 2 Розмір кіл імунопреципітатів (мм ), n=12 Концентрація сполуки Таблиця 6 IgG. IgA. IgM ренію, моль/л контроль 71±3 68±3 Кількість живих клітин мишачої гібридоми 55±3 1Д6 (А, 30±2 %) після інкубації у розчинах сполук ренію 10-6 52±2 52±2 та платини 10-8 51±3 50±2 33±1 -10 10 55±2 61±2 42±1 Концентрація сполук, 10-12 61±1 63±2 52±2 Формули сполук моль/л Нами було проведено порівняльне дослідження із препаратом Тимоген, (табл.5). Таблиця 5 Цис-[Рt(NН3)2СІ2] цис 10-4 10-6 94,0 44,34 ±9,54 ±4,56 44,19 5,62 10-8 10-10 5,67 1,17 ±0,18 ±0,12 2,47 4,0 9 [Rе2(GАВА) 2СІ4(Н 2O) 2]СІ2 Re2(i-С3Н7СОО)4СІ2 81311 ±4,18 ±0,24 ±0,16 ±0,54 24,19 5,07 ±0,32 ±0,24 1,34 0,90 ±0,26 ±0,04 Аналіз даних, приведених в таблиці показує, що антипроліферативний ефект цис-платину проявляється тільки при високій концентрації, в той час як для сполуки ренію антипроліферативний ефект зберігається у всьому діапазоні концентрацій. Отже, речовини, що пропонуються, як це видно з наведених прикладів, проявляють антипроліферативну активність відносно коренів кукурудзи та клітин гібридами 1Д6 у діапазоні низьких концентрацій, де активність сполук прототипу майже відсутня. Одержані сполуки можуть бути використані в медицині та фармацевтичній промисловості для одержання нових препаратів, які проявляють імунотропну та антипроліферативну активність. 10