Збалансований інфузійний розчин

Реферат: Винахід належить до медицини та фармакології, а саме до сольових інфузійних розчинів, що мають детоксикуючу дію, і може бути використаним при лікуванні захворювань і станів, пов'язаних з інтоксикаціями організму різного ступеня тяжкості. Збалансований інфузійний розчин містить хлориди натрію, калію та магнію, розчинник і біологічно активну сполуку, відповідно до винаходу, як біологічно активний компонент містить натрію L-аргініну сукцинат. UA 111116 C2 (12) UA 111116 C2 UA 111116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини та фармакології, а саме до сольових інфузійних розчинів, що мають детоксикуючу дію, і може бути використаним при лікуванні захворювань і станів, пов'язаних з інтоксикаціями організму різного ступеня тяжкості. У медичній практиці широко застосовують сольові інфузійні розчини на основі солей бурштинової кислоти. Наприклад, існує зареєстрований полііонний розчин на основі сукцинату натрію - "Реогемін" (Реєстраційне посвідчення Республіки Білорусь РУ 12/12/2047 від 04.12.12), який застосовується як антигіпоксичний та дезінтоксикаційний засіб при гострих ендогенних і екзогенних інтоксикаціях різної етіології та для корекції водно-сольового балансу в організмі, що містить наступні компоненти: натрію сукцинат гексагідрат 7,5 г/л, натрію хлорид 4,0 г/л, калію дигідрофосфат 1,4 г/л, магнію хлориду гексагідрат 0,02 г/л, глюкоза 50 г/л, і має наступний іонний склад: натрій 161 ммоль/л, калій 10,2 ммоль/л, магній 1,1 ммоль/л, хлориди 70,5 ммоль/л, фосфати (в перерахунку на фосфор) 10,0 ммоль/л (Інструкція з медичного застосування, наказ Міністерства охорони здоров'я Республіки Білорусь № 1515 від 26.12.12) Необхідно підкреслити, що даний розчин не є збалансованим за основними життєвоважливими іонами та містить надлишок натрію (на 10 %), надлишок іонів калію (на 250 % від норми), і недостачу іонів хлору (на 30 %), що створює проблеми корекції водно-сольового обміну у пацієнтів. Крім того, відомо, що комбінація розчинів глюкози з низькомолекулярними дикарбоновими кислотами (в даному випадку з бурштиновою кислотою) створює ризик утворення небезпечних для здоров'я пацієнтів домішок (фурфуролів) при виробництві та зберіганні препарату (Encyclopedia of Pharmaceutical technology, Third Edition, 2006). Є відомим також препарат "Сукцинасол", який містить натрію хлориду - 6,2 г; калію хлориду 0,3 г; кальцію хлориду - 0,082 г; магнію хлориду - 0,1 г; бурштинової кислоти - 2,0 г; натрію гідрокарбонату - 3,0 г; води для ін'єкцій - до 1 л, і має наступний іонний склад: натрій 142 ммоль/л, калій 4,0 ммоль/л, магній 1,1 ммоль/л, хлориди 114 ммоль/л, що пропонується як засіб для лікування критичних станів, і також містить у своєму складі як активний компонент бурштинову кислоту. "Сукцинасол" покращує мікроциркуляцію крові, активує енергетичний обмін, відновлює гемодинамічні показники та функцію серцевого м'яза при різних патологічних станах (патент UZ 4106 B від 21.04.1994, РУз 10/140/3 від 11.05.10, Levin GS, Shevchenko LI, Gubaev SA. Comparative evaluation of the effects of crystalloid solutions containing sodium lactate and sodium succinate on the hemodynamic indicators in different types of hemorrhage, Gematol Transfuziol. 1991 Feb; 36 (2): 25-8., PMID: 2055408). Відомі розчини сукцинатів у комбінації з комплексом вітамінів і метаболічних компонентів. Так, відомий препарат "Цитофлавін" (Реєстраційний номер Російської Федерації РN 00313/1 від 21.10.2004), що містить бурштинову кислоту у вигляді натрію меглюміну сукцинату, в комбінації з інозином, нікотинамідом і рибофлавіном, що має цитопротекторну дію (патент ЕА001099). В клінічній практиці застосовуються полііонний інфузійний розчин "Реамберин" (Реєстраційний номер Російської Федерації Р № 99/363/2 08.10.1999), який містить у своєму складі бурштинову кислоту у вигляді натрію меглюмін сукцинату й збалансований набір макроелементів солей калію, магнію, натрію і вживається як детоксикуючий лікарський засіб (патент ЕА000879), й інфузійний розчин "Ремаксол" (Реєстраційний номер Російської Федерації ЛСР-009341/09 від 19.11.2009), що містить бурштинову кислоту у вигляді натрію меглюмін сукцинату в комбінації з інозином, нікотинамідом і метіоніном, що має гепатопротекторну дію (патент ЕА007865). Найближчим аналогом винаходу, що заявляється, за фармакологічною дією та складом є "Реамберин", вибраний як прототип, який являє собою збалансований інфузійний розчин, що містить хлориди натрію, калію та магнію, розчинник і біологічно активну сполуку - бурштинову кислоту у вигляді натрію меглюміну сукцинату (патент ЕА000879). Препарат збалансований за іонним складом і має детоксикуючі властивості за рахунок нормалізації водно-електролітного балансу, антигіпоксичного та антиоксидантного ефектів. Однак, незважаючи на наявність високого лікувального ефекту, відомий інфузійний розчин має ключовий фармакологічний недолік, обумовлений особливістю активного компонента меглюміну натрію сукцинату, катіон якого (метилглюкамоній) практично не метаболізується в організмі людини і при швидкій утилізації аніону - монозаміщеного натрію сукцинату, здатний накопичуватися в організмі та призводити до істотного залужування крові (алкалозу) і сечі, про що зазначено в інструкції для медичного застосування прототипу (Реєстраційний номер Російської Федерації Р № 99/363/2 08.10.1999). Даний стан тяжко коригується і є особливо небезпечним для хворих із зниженою буферною ємністю крові та нирковою недостатністю при критичних станах, таких як: політравма, сепсис, обмороження органів і тканин, печінкова 1 UA 111116 C2 5 10 15 20 25 недостатність, та інших станах, пов'язаних з активацією катаболічних процесів в організмі. У зв'язку з цим, високий вміст натрію меглюміну сукцинату в прототипі обмежує максимальний добовий об'єм введення цього препарату до 800 мл, що є недостатнім для інфузійної терапії ряду критичних станів (гостра крововтрата, сепсис, політравма, печінкова енцефалопатія), які вимагають введення великих об'ємів (до 10 літрів на добу). Крім того, залужування сечі, характерне при застосуванні прототипу й обумовлене виведенням органічної основи метилглюкамонію через нирки, може бути небезпечним для хворих на нефролітіаз. Це пов'язано з можливістю солюбілізації уратів й оксалатів кальцію під дією метилглюкамонію, що може ініціювати міграцію каменів в нирках і закупорку сечоводів. Всі перераховані вище недоліки відомого інфузійного розчину обмежують його клінічне використання у високих дозах і для певних груп пацієнтів, що значно звужує область його застосування. Задачею винаходу є створення нового збалансованого інфузійного розчину, що має підвищену детоксикуючу активність, низькою токсичністю та забезпечує широку область клінічного застосування. Поставлена задача вирішується тим, що збалансований інфузійний розчин, що містить хлориди натрію, калію та магнію, розчинник і біологічно активну сполуку, відповідно винаходу, як біологічно активний компонент містить натрію L-аргініну сукцинат формули: + + 2Na [NH=C(NH2)NH2(CH2)3CH(NH2)COOH] [ООС(CH2)2СОО] , при наступному співвідношенні компонентів, маc. %: хлорид натрію 0,540-0,600 хлорид магнію гексагідрат 0,015-0,030 хлорид калію 0,025-0,040 натрію L-аргініну сукцинат 1,400-1,700 вода для ін'єкцій решта. Інфузійний розчин, що заявляється, містить хлорид натрію, хлорид магнію гексагідрат і хлорид калію в певному кількісному співвідношенні, яке забезпечує фізіологічно прийнятний вміст неорганічних іонів натрію, калію, магнію і хлору (Mary Lee, Basic skills in interpreting laboratory data., 4th ed.). Як біологічно активний компонент збалансований інфузійний розчин, що заявляється, містить нову хімічну сполуку натрію L-аргініну сукцинат формули: + + 2Na [NH=C(NH2)NH2 (CH2)3CH(NH2)COOH] [ООС(CH2)2СОО] (1) Фізико-хімічні властивості натрію L-аргініну сукцинату наведені в таблиці 1: Таблиця 1 Параметр Зовнішній вигляд Розчинність рН водних розчинів Температура плавлення, °C ІК-спектр Спектри ЯMP 1Н (D2O) 13C (D2O) 15N (D2O) Брутто-формула Елементний аналіз Молекулярна маса Значення Аморфна гігроскопічна речовина білого кольору Добре розчиняється у воді, диметилформаміді, диметилсульфоксиді, мало розчинне в спиртах, не розчинне в ацетоні, ефірі, бензолі, хлороформі 7,0-7,2 214-215 з розкладанням 3400 (NH2), 1630 (NH3+), 1570 (COO-), 1400 (СОО-) 1,55-1,61 (CH2); 1,77-1,80 (CH2); 2,29 (CH2); 3,11-3,14 (CH2); 3,64-3,67 (CH) 23,86 (CH2); 27,54 (CH2); 34,14 (CH2); 40,07 (CH2); 54,28 (CH); 156,78 (C=NH); 174,42 (COOH); 182,35 (COOH) 83,45 (NH2); 70,17 (NH); 39,35 (NH2) C10H19N4NaO6 Розраховано, % С 38,22; Н 6,09; N 17,83; O 30,55, Na 7,32 Знайдено, %: С 38,65; Н 6,18; N 17,30; O 30,52; Na 7,35 Розраховано 314,27 Знайдено: 306,81 (масспектроскопія) 30 35 40 Добра розчинність у воді й фізіологічно прийнятне значення рН водних розчинів (7,0-7,2) натрію L-аргініну сукцинату, робить його придатним для отримання парентеральних лікарських препаратів. Відомо, що солі бурштинової кислоти в композиції з умовно-незамінною амінокислотою Lаргініном використовуються як компоненти лікарських препаратів, що мають стабілізуючі та буферні властивості. Наприклад, існує композиція інгібітору шляху тканинного фактора і Lаргініну сукцинату (патент EP 1602667), для консервації розчинів антитіл (заявка US 20100239567, патент JP2009-108040, заявка US 20120121581), і як миючого лікувальнокосметичного засобу (заявка JP2001-081025). Описано складні композиції, до складу яких входять L-аргінін і бурштинова кислота для 2 UA 111116 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування і профілактики печінкових енцефалопатій у вигляді шипучих таблеток, що застосовуються як біологічні добавки до їжі (заявка RU 2011109884/15). У науково-технічній літературі описано кардіопротекторну дію моно- та діаргініносукцинат різних комбінацій бурштинової кислоти з L-аргініном. Так, встановлено ефект L-аргініну моносукцинату як потенційного кардіопротекторного препарату (Б.В. Дубовик, А.А. Жданов, Д.І. Романовський, Порівняльна кардіопротекторна ефективність аргініну гідрохлориду і аргініну сукцинату при ішемічному реперфузійному пошкодженні міокарда у щурів //Медичний журнал Білоруського державного медичного університету. - 2005. - № 4. - С. 51-53). На основі діаргініносукцинату зареєстрований препарат "Кардінозин" (ТУ BY 100185198.1122009, реєстраційний номер 027761 від 09.12.2009), що містить активну речовину у вигляді 5 % водного розчину, який застосовується як засіб для лікування гострого інфаркту міокарда. У ряді винаходів запропоновані комбіновані лікарські препарати для лікування серцевосудинних захворювань на основі комбінації аргініну сукцинату з аргініну аспарагінатом у вигляді розчину для орального парентерального застосування (патенти UA №№ 36998, 37388, 39095, 90368). У доступній науково-технічній літературі не описані інфузійні розчини, що містять як активний компонент натрію L-аргініну сукцинат формули (1). У нашому винаході вперше показано, що нова хімічна сполука формули (1) може бути використана як біологічно активний компонент детоксикуючого інфузійного розчину. Зокрема, авторами встановлено, що введення натрію L-аргініну сукцинату до складу інфузійного розчину, що заявляється, підвищує його детоксикуючі властивості та знижує токсичність порівняно з прототипом. В результаті проведених експериментів з вибору збалансованого складу інфузійного розчину, який заявляється, виявлено, що розчини, отримані в діапазоні вмісту натрію L-аргініну сукцинату від 14 до 17 г/л мають теоретичну (розрахункову) осмолярність від 350 до 360 ммоль/л і практичну (фізіологічну) осмоляльність 315-324 ммоль/кг, відповідно. Відомо, що фактична осмоляльність плазми крові становить 286±5 ммоль/кг. Однак осмоляльність в діапазоні 315-324 ммоль/кг для інфузійного розчину, що заявляється, є оптимальною, оскільки отримані дані з фармакокінетики показали, що in vivo натрію L-аргініну сукцинат швидко проникає в клітини і метаболізує до осмотично неактивних вуглекислого газу і води, що знижує його осмоляльність до фізіологічних значень. Зазначені характеристики дозволяють збалансувати склад інфузійного розчину, що заявляється, і вводити його без істотних обмежень в об'ємах, що розширює область клінічного застосування за рахунок виключення ряду протипоказань, пов'язаних із залужуванням крові та сечі. В інфузійному розчині, що заявляється, співвідношення компонентів, яке забезпечує збалансованість складу, підібрано дослідним шляхом. Так, введення до складу інфузійного розчину, що заявляється, катіонів калію і магнію пропонується шляхом додавання калію хлориду в концентраціях 0,025-0,040 г/л і магнію хлориду гексагідрату в концентраціях 0,015-0,030 г/л, що забезпечують фізіологічно прийнятний вміст іонів калію 3,4-5, 3 ммоль/л і магнію 0,7-1,5 ммоль/л, відповідно. Введення до складу інфузійного розчину, що заявляється, іонів натрію пропонується шляхом додавання натрію хлориду. Наприклад, додавання натрію хлориду в концентрації 8,6 г/л дозволяє отримати фізіологічно прийнятний вміст катіонів натрію - 147 ммоль/л. При цьому, вміст аніонів хлору, що утворюється при дисоціації натрію хлориду, калію хлориду і магнію хлориду гексагідрату складе близько 153 ммоль/л, що істотно перевищить фізіологічну норму (Mary Lee, Basic skills in interpreting laboratory data., 4th ed.). У нашому винаході пропонується привести вміст хлоридів до фізіологічної норми (97-110 ммоль/л) шляхом заміщення у складі інфузійного розчину, що заявляється, частини натрію хлориду (NaCl) новою біологічно активною речовиною. При цьому її вміст у препараті в концентраціях від 14 до 17 г/л забезпечує фізіологічний вміст хлоридів без порушення вмісту катіонів натрію. Винахід здійснюють наступним чином. Приклад. На першому етапі отримують новий біологічно активний компонент - натрію Lаргініну сукцинат формули (1). Для отримання натрію L-аргініну сукцинату беруть 52,80 кг бурштинової кислоти (CAS Number 110-15-6); 77,89 кг L-аргініну (Eur. Ph.); 17,88 кг натрію гідроксиду (Eur. Ph.) та розчиняють в 500 л води. При цьому утворюється водний 28 % розчин нової речовини натрію Lаргініну сукцинату згідно з хімічною реакцією: 3 UA 111116 C2 HOOC(CH2)2COOH+NAOH+NH=C(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)COOH Na+[NH=C(NH2)NH2(CH2)3CH(NH2)COOH]+[OOC(CH2)2COO]2-+H2O 5 10 15 20 25 30 35 40 Отриманий розчин піддають розпилювальному сушінню і виділяють натрію L-аргініну сукцинат в кількості 134,9 кг (вихід 96 %) у вигляді білого аморфного порошку, фізико-хімічні властивості якого відповідають даним, наведеним у таблиці 1. Далі порошок натрію L-аргініну сукцинату упаковують в герметичну первинну упаковку з високими бар'єрними властивостями відносно пар води і кисню, а потім - у вторинну упаковку. На другому етапі отримують інфузійний розчин, що заявляється. Для цього беруть порошок натрію L-аргініну сукцинату у кількості 14,052 кг і розчиняють його в 500 л води для ін'єкцій, до розчину додають 6,0 кг натрію хлориду (Eur. Ph.), 0,244 кг магнію хлориду і 0,3 кг калію хлориду (Eur. Ph.) і доводять об'єм розчину до 1000 л водою для ін'єкцій (Eur. Ph.). Потім отриманий розчин фільтрують, розливають в скляну або пластикову упаковку, герметично закривають і стерилізують, використовуючи стандартний режим (витримують при температурі 121 °C не менше 15 хвилин). Виготовлений згідно з прикладом інфузійний розчин має наступний склад: Компонент: маc. %: хлорид натрію 0,6000 хлорид магнію гексагідрат 0,0244 хлорид калію 0,0300 натрію L-аргініну сукцинат 1,4000 вода для ін'єкцій до 1 літра, Іонний склад: ммоль/л: натрій 147 калій 4,0 магній 1,2 хлорид 109. Вивчення безпеки та біологічної активності збалансованого інфузійного розчину, що заявляється, отриманого в прикладі приготування, проведено в порівнянні з прототипом препаратом "Реамберин", розчин для інфузій 1,5 %, в серії експериментальних досліджень на тваринах (досліди 1-6). Дослід 1. Дослідження гострої токсичності інфузійного розчину, що заявляється. Експерименти виконані на білих безпородних щурах обох статей. Для визначення показників гострої токсичності досліджуваний розчин вводили внутрішньовенно відповідно до планованого способу застосування в клінічній практиці щурам обох статей у дозах, що збільшувались, по Літчфілду-Уілкоксону та в максимально можливих для гострого введення об'ємах. Контрольним тваринам вводили 0,9 % розчин натрію хлориду в об'ємі 20 мл/кг (ICH M 3 (R2) Guidance of NonClinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals, Current Step 4, version dated 11 June 2009). При вивченні гострої токсичності інфузійного розчину, який заявляється, виявлено, що при введенні препарату в максимально можливій дозі 8175 мг/кг у перерахунку на активну речовину летальність в групі тварин не спостерігалася. У той час як токсичність розчину прототипу склала LD50=5600 мг/кг маси тіла тварини в перерахунку на активну речовину. Таким чином, в умовах гострого досліду, інфузійний розчин, що заявляється, є менш токсичним, ніж прототип, не має мутагенної, тератогенної, ембріотоксичної, алергенної та імунотоксичної дій. Дослід 2. Вивчення впливу на летальність інфузійного розчину, що заявляється, на моделі гострого ендотоксикозу, індукованого ліпополісахаридом Salmonella enterica. Дослідження проводили на 200 стандартних щурах Вістар віку 17-18 тижнів і масою 180-210 г. Усі тварини отримували стандартне харчування і воду. Летальний ендотоксикоз моделювали введенням бактеріального ендотоксину ліпополісахариду Salmonella enterica серотип enteritidis (SIGMA-ALDRICH.). Ендотоксин вводили внутрішньовенно (в хвостову вену) одноразово в 0,2 мл води для ін'єкцій. Експериментально підібрані дози ендотоксину, що викликають пірогенну реакцію та 50 і 100 % летальність тварин від токсичного шоку, які склали 5 мкг/кг і 25 мкг/кг ендотоксину відповідно. Пірогенну реакцію фіксували шляхом заміру ректальної температури (Filkins JP, Di Luzio NR, Endotoxin induced 4 UA 111116 C2 5 10 15 20 25 hypothermia and tolerance in the rat. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968 Dec, 129 (3): 724-6; Utili R, Abernathy CO, Zimmerman HJ. Endotoxin effects on the liver. Life Sci. 1977 Feb 15, 20 (4): 553-68; Banet M., Fever and survival in the rat. The effect of enhancing fever, Pflugers Arch. 1979 Jul, 381 (1): 35-8.). Для дослідження було сформовано вісім груп експериментальних тварин по 25 щурів в кожній: 2 контрольні групи - без лікування, 2 піддослідні групи тварин, яким вводили 0,9 % розчин натрію хлориду в дозі 20 мл/кг, 2 піддослідні групи тварин, яким вводили прототип в дозі 20 мл/кг, 2 піддослідні групи тварин, яким вводили новий інфузійний розчин в дозі 20 мл/кг. Досліджувані препарати вводили внутрішньовенно одноразово через 2 години після введення ліпополісахариду. Оцінку ефективності препаратів оцінювали за показником смертності в групах протягом семи днів після введення ліпополісахариду (табл. 3). У тварин контрольних груп протягом перших семи діб після введення ліпополісахариду в дозах 5 і 25 мг/кг розвивався токсичний шок - гіпертермія, зниження рухової активності, зниження м'язового тонусу, відмова від їжі, діарея і загибель. Введення ендотоксину в дозі 5 мг/кг приводило до 60 % летальності. Проведення стандартної терапії сформованого токсичного шоку 0,9 % розчином натрію хлориду, знизило смертність тварин у 1,5 разу (з 60 % до 40 %). Застосування прототипу знизило летальність порівняно з контрольною групою тварин, в 1,88 рази (з 60 % до 32 %), а порівняно з групою, що отримувала натрію хлорид, в 1,25 разу. При використанні розчину, що заявляється, спостерігалося зниження смертності протягом семи діб експерименту в порівнянні з контролем в 2,5 разу, в порівнянні з терапією натрію хлоридом - в 1,67 разу, а в порівнянні з прототипом - в 1,33 разу (з 32 % до 24 %). Збільшення введеної лабораторним тваринам разової дози ендотоксину до 25 мкг/кг призвело до погіршення перебігу токсичного шоку і 100 % летальності протягом семи діб спостереження. Таблиця 2 Вплив інфузійних розчинів на летальність тварин з ендотоксикозом, викликаним ліпополісахаридом Летальність Зміна Експериментальні Початкова в групах на Доза ендотоксину температури групи температура третю добу, в першу добу щурів (%) Ліпополісахарид Salmonella enteric 5 мкг/кг Ліпополісахарид Salmonella enteric 25 мкг/кг 30 35 Без лікування 0,9 % розчин натрію хлориду 20 мл/кг (контрольна група) Прототип 20 мл/кг Розчин, що заявляється, 20 мл/кг Без лікування 0,9 % розчин натрію хлориду 20 мл/кг (контрольна група) Прототип 20 мл/кг Розчин, що заявляється, 20 мл/кг Загальна Летальність в Летальність летальність групах на в групах на протягом четверту п'яту добу, семи добу, щурів (%) діб, щурів (%) щурів (%) 2(8) 12(48) 15(60) 36,9±0,3 +1,9±0,2 1(4) 37,6±0,9 +1,5±0,3 1(4) 1(4) 8(32) 10(40) 36,8±0,8 +1,6±0,6 1(4) 7(28) 8(32) 37,1±0,5 +1,1±0,5 1(4) 5(20) 6(24) 37,4±0,6 +2,1±0,3 2(8) 11(44) 13(52) 25(100) 36,4±0,8 +2,4±0,4 2(8) 7(28) 9(36) 18(72) 36,6±0,6 +2,1±0,5 2(8) 7(28) 8(32) 17(68) 37,4±0,8 +1,9±0,5 2(8) 5(20) 8(32) 15(60) Проведення стандартної терапії 0,9 % розчином натрію хлориду в дозі 20 мл/кг, знизило смертність тварин у групі в 1,39 разу (з 100 % до 72 %). Застосування прототипу знизило смертність порівняно з контрольною групою вже в 1,47 разу, а в порівнянні з групою, що одержувала натрію хлорид, в 1,06 разу. Використання розчину, що заявляється, показує більш значне зниження смертності протягом семи діб експерименту в порівнянні з контролем - в 1,67 разу, в порівнянні з терапією натрію хлоридом - в 1,2 разу, а в порівнянні з прототипом - в 1,13 разу (з 68 % до 60 %). Таким чином, тестування інфузійного розчину, що заявляється, на моделі токсичного шоку показало його високу детоксикуючу активність при різних дозах ендотоксину Salmonella enterica. Дослід 3. Вивчення ефективності інфузійного розчину, що заявляється, на моделі гострого токсичного гепатиту Дослідження розчину, що заявляється, проводили в порівнянні з прототипом на щурах 5 UA 111116 C2 5 10 15 20 25 самцях породи "Вістар" з масою тіла 180-200 г. Експеримент проведений на 90 тваринах, з яких сформували 6 груп: інтактні тварини (n=15); контрольна група (n=15) - тваринам вводили 0,9 % розчин натрію хлориду в дозі 20 мл/кг; піддослідні групи №1 (n=15) і № 2 (n=15) - тварини, яким вводили прототип в дозах 10 мл/кг і 20 мл/кг відповідно; піддослідні групи № 3 (n=15) і № 4 (n=15) - тварини, яким вводили інфузійний розчин, що заявляється, в дозах 10 мл/кг і 20 мл/кг, відповідно. Для формування гострого токсичного гепатиту тваринам контрольної та піддослідних груп одноразово внутрішньоочеревинно вводили фенілгідразину сульфат в дозі 50 мг/кг, а потім через 24 години внутрішньошлунково вводили 50 % масляний розчин тетрахлорметану в дозі 3 мл/кг маси тіла. Через 2 години на піддослідних групах починали проведення інфузійної терапії досліджуваними розчинами. Терапію проводили протягом 2 днів послідовно. Після закінчення терапії оцінювали маркери інтоксикації: активність ферментів аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази, лактатдегідрогенази, лужної фосфатази, рівень білірубіну і показники гемостазу: протромбіновий час, активований частковий тромбопластиновий час, тромбіновий час (Heimberg M, Watkins ML, Tooker R. Carbon tetrachloride hepatotoxicity: the direct action of CCl4 on the liver Pharmacol. Exp. Ther. 1964 Jul145: 92-101; Plaa GL, Larson RE, CCl4 induced liver damage. Current concept, regarding mechanism of action. Arch Environ. Health., 1964 Oct. (9), 536-43; Bruckner JV, Mac Kenzie WF, Muralidhara S, Luthra R, Kyle GM, Acosta D. Oral toxicity of carbon tetrachloride: acute, subacute, and subchronic studies in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 1986 Jan. 6 (1): 16-34). У контрольній групі відзначали ознаки розвитку токсичного гепатиту: синдром цитолізу, порушення детоксикаційної функції печінки зі збільшенням активності ферментів ЛФ, аспартатамінотрансферази, рівня білірубіну, "провалом" активності аланінамінотрансферази і тенденцією до збільшення активності лактатдегідрогенази (р=0,222 порівняно з групою інтактних тварин) (табл. 3). Таблиця 3 Вплив інфузійної терапії на біохімічні показники крові щурів на моделі гострого токсичного гепатиту Показники, що вивчалися, М±m Експериментальні лужна групи, аланінамінотрансфераза, аспартатамінотрансфераза, лактатдегідрогеназа, білірубін, фосфатаза, n=15 МО/л МО/л МО/л мкмоль/л Од/л Інтактні 24,5±1,1 115,8±3,3 333,1±27,4 3060±265 10,3±0,1 тварини Контрольна група 6,8±2,4 340,2±38,6 761,0±120,6 51,9±6,8 4281±602 Без лікування р1=0,009 р1=0,009 р1=0,009 р1=0,008 Піддослідна група № 30,1±2,2 294,8±63,3 610,8±100,4 58,4±17,1 1 3285±790 р2=0,009 р1=0,047 р1=0,028 р1=0,008 Прототип, 10 мл/кг Піддослідна група № 3 18,4±4,7 188,7±48,2 699,3±54,2 56,0±13,1 Розчин, що 3177±446 р2=0,047 р2=0,047 р1=0,009 р1=0,007 заявляється, 10 мл/кг Піддослідна група № 22,3±2,8 331,8±81,9 599,4±49,7 64,8±7,0 2 3781±1019 р2=0,016 р1=0,009 р1=0,009 Прототип, 20 мл/кг Піддослідна група № 4 35,2±6,6 34,8±6,8 439,8±39,6 Розчин, що 556,5±122,6 2846±359 р1=0,008 р2=0,016 р1=0,009 заявляється, 20 р5=0,032 мл/кг 30 Інфузійна терапія прототипом сприяла обмеженню синдрому цитолізу за впливом на активність аланінамінотрансферази й аспартатамінотрансферази, але не вплинула на активність маркера холестазу лужної фосфатази і рівень білірубіну. Дія розчину, що заявляється, на відміну від прототипу, характеризувалася достовірним зниженням рівня білірубіну (р=0,032) та активності лужної фосфатази (р>0,05 у порівнянні з групою інтактних тварин). Однак виявлені зміни були різноспрямованими (табл. 4). 6 UA 111116 C2 Таблиця 4 Вплив інфузійної терапії на біохімічні показники гемостазу щурів на моделі гострого токсичного гепатиту Експериментальні групи, n=15 Інтактні тварини Контрольна група Без лікування Піддослідна група № 1 Прототип, 10 мл/кг Піддослідна група № 3 Розчин, що заявляється, 10 мл/кг Піддослідна група № 2 Прототип, 20 мл/кг Піддослідна група № 4 Розчин, що заявляється, 20 мл/кг 5 10 15 20 25 30 35 40 Показники, що вивчалися, М±m активований частковий тромбіновий протромбіновий час, тромбопластиновий час, час, сек сек сек 24,08±0,70 15,42±0,79 60,32±5,02 40,60±19,86 99,08±12,81 26,22±3,45 p1=0,009 p1=0,026 60,48±24,36 26,10±3,63 67,82±4,66 p1=0,027 34,82±4,95 78,48±5,09 31,12±2,63 p1=0,009 p1=0,009 30,08±6,49 28,76±4,51 96,00±14,78 p1=0,009 16,34±1,0 61,76±3,73 p2=0,009 28,6±4,97 p2=0,044 p3=0,009 p3=0,047 p5=0,009 Позитивні зміни при терапії прототипом і, більшою мірою, розчином, що заявляється, виражалися в зниженні патологічно підвищеного активованого часткового тромбопластинового часу (внутрішній шлях коагуляції) і тромбінового часу. При цьому при терапії розчином, що заявляється, було виявлено достовірну нормалізуючу дію відносно активованого часткового тромбопластинового часу і тромбінового часу (р=0,009 і 0,05) в порівнянні з такими при терапії прототипом в еквівалентній за об'ємом дозі. Аналізуючи отримані дані, можна зробити висновок, що інфузійний розчин, який заявляється, має достовірно більш виражену гепатопротекторну дію в умовах моделі гострого токсичного гепатиту, ніж прототип. Дослід 4. Вивчення ефективності інфузійного розчину, що заявляється, на моделі отруєння карбонатом амонію. Експерименти виконувалися на 150 безпородних білих щурах-самцях масою 170-180 г у віці 13-14 тижнів. Усього було сформовано 5 експериментальних груп: інтактні тварини (n=30); контрольна група - тварини з інтоксикацією без лікування (n=30); піддослідна група 1 - тварини з інтоксикацією і введенням інфузійного розчину, що заявляється (n=30); піддослідна група 2 тварини з інтоксикацією і введенням фізіологічного розчину (n=30); піддослідна група 3 тварини з інтоксикацією і введенням прототипу (n=30). Інтоксикація карбонатом амонію створювалася введенням його водного 10 % розчину внутрішньошлунково через атравматичний зонд в дозі 250 мг/кг (ЛД 50). Клінічна картина при введенні токсиканта супроводжувалася початковим руховим збудженням, вокалізацією з наступним вираженим загальним токсичним ефектом - істотне зниження активності, м'язового тонусу, реакції на больове подразнення при атаксії та розвитку сопорозного стану. У деяких тварин спостерігалося бокове положення та судоми. Дані кислотно-лужної рівноваги крові тварин (табл. 5) показали характерну картину розвитку метаболічного алкалозу під дією аміаку, що вивільняється з карбонату амонію (Karr NW, Hendriks EL. The toxicity of intravenous ammonium compounds. Am. J. Med. Sci. 1949 Sep. 218 (3): 302-7; Ting YC. The toxicity of ammonia. Science. 1950 Jul 21, 112 (2899): 91-2; Warren KS, The differential toxicity of ammonium salts. J. Clin. Invest. 1958 Apr. 37 (4): 497-501; Handford SW, An experimental study of ammonium intoxication. Gastroenterology. 1959 Jun; 36 (6): 770-9). Порівнювані розчини починали вводити внутрішньовенно через 1 годину після розвитку виражених симптомів інтоксикації в хвостову вену в дозі 20 мл/кг протягом 3-х днів. Про ефективність лікування судили по клінічній картині, летальності, показникам кисневого бюджету і кислотно-лужної рівноваги: HCO3 - бікарбонат плазми крові; pCO2 - парціальний тиск вуглекислого газу; pO2 - парціальний тиск кисню; BB - надлишок основ крові; BE - дефіцит буферних основ плазми; BE ecf - надлишок основ позаклітинної рідини. Крім того, оцінювали функцію нирок за масою нирок, добовим діурезом, вмістом білка і хлоридів в сечі, густині та рН сечі. Через 4 години після введення досліджуваних розчинів по 10 тварин з кожної групи піддавали декапітації, брали змішану кров і вимірювали параметри кисневого бюджету і кислотно-лужної рівноваги (табл. 5) 7 UA 111116 C2 Таблиця 5 Показники стану кисневого бюджету і кислотно-лужної рівноваги у щурів через 4 години після початку лікування (M±m) Показники рН рСО2, мм Hg рО2, мм Hg ВЕ, ммоль/л ВЕ ecf, ммоль/л ВВ, ммоль/л НСО3, ммоль/л Інтактні, n=10 7,27±0,02 40,3±0,5 45,7±0,8 -1,0±0,3 -1,5±0,5 45,8±3,0 18,4±1,0 Експериментальні групи Піддослідна група Піддослідна група Піддослідна група Контроль, n=10 1 2 3 n=10 n=10 n=10 8,26±0,03* 7,35±0,01 7,63±0,05* 8,47±0,03* 52,6±0,9* 41,3±2,6 49,7±0,8* 47,4±2,8 23,2±0,5* 38,1±0,5* 25,4±1,5* 35,4±0,6* 1,5±0,1* -2,3±0,2 1,0±0,1* 0,8±0,1* 3,5±0.3 -0,5±0,1 2,5±0,4* 0,5±0,2 64,7±2,5* 49,5±2,4 60,2±2,1* 58,3±2,9* 27,3±1,5* 23,7±1,3 29,4±1,3* 29,2±1,7* * - достовірні відмінності від інтактних тварин при р