Стійкий рідкий препарат етанерцепту

Реферат: Заявлений винахід стосується стійкого рідкого препарату етанерцепту (рекомбінантного злитого білка р75 sTNFR:Fc) та, зокрема, рідкого препарату, що містить один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі у кількості, достатній для зменшення виникнення побічних продуктів етанерцепту протягом його зберігання. UA 113172 C2 (12) UA 113172 C2 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід стосується рідкого препарату етанерцепту (рекомбінантний злитий (гібридний) білок p75 sTNFR:Fc) та, зокрема, рідкого препарату, що містить один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидинтаїх фармацевтично прийнятні солі у кількості, достатній для зменшення появи побічних продуктів етанерцепту протягом зберігання. Етанерцепт є біологічним модулятором запалення, що діє у якості конкурентного інгібітора TNF-α, зв'язуючись з рецептором TNF-α клітинної поверхні, щоб інгібувати імунні відповіді, опоередковані TNF-α.Етанерцепт є макромолекулою з молекулярною масою приблизно у 150 кДа та являє собою гомодимер двох злитих білків Fc, зв'язаних дисульфідним зв'язком, де кожен злитий білок Fc складається з розчинного рецептораTNF p75, спареного зFc - ділянкою імуноглобулину G людини, що відноситься допідкласу 1 (Goldenberg, Clinical Therapeutics, 21(1): 75-87, 1999; Moreland et al., Ann. Intern. Med., 130(6): 478-486, 1999). Цей злитий білок – прототип вперше синтезували на початку 1990-х років (синтез проводив Брюс A. Бейтлер у Південно-Західному медичному центрі Університету штату Техас) та з 2002 р. він є у продажу на ринку від компанії Amgen під торгівельною маркою Енбрел. Етанерцепт є інгібітором TNF-α, який застосовують для лікуванняревматоїдного артриту, псоріазу та анкілозуючого спондилоартриту. Також поводяться клінічні випробування цього препарату щодо лікування васкуліту, хвороби Альцгеймера та хвороби Крона. Подібно до білкових ліків, ліки на основі антитіл мають дуже короткий час напівжиття. Хімічна та фізична денатурація таких речовинможе бути легко спричинена впливом несприятливої температури, механічним подразненням, вібрацією, заморожуванням та відтаванням, дією УФ - променів, надмірним зміненням рН, дією органічних розчинників та мікробного забруднення. Хімічна денатурація охоплює наступні процеси, як-то дисоціацію димеру, окиснення, дезамінування, ізомеризацію та полімеризацію. Ці процеси зокрема залежать від амінокислотного складу антитіла та від умов, у яких знаходиться розчинник, що його містить (концентрація солей, pH температура). Фізична денатурація охоплює наступні процеси, як-то втрату третинної структури, ковалентну / нековалентну агрегацію та адгезію мономерів. На ці процеси впливають гідрофобні ділянки на поверхні білка, що змінюються під впливом навколишнього середовища, у якому знаходяться антитіла, як-то розчинників, а також під впливом термальної стійкості та комплексних структур білка, як-то розподілення заряду. Фізична або хімічна денатурація антитіла веде до втрати його фізіологічного функціонування. Оскільки денатурація є незворотним процесом, топісля денатурації антитіла можуть вже не відновити свої нативні властивості до першоначального стану, що веде до зменшення їх терапевтичної ефективності. Також було відзначено, що агрегація мономерів викликає імунні реакції. Отже, було проведено багатодосліджень препаратів, що містять фізіологічну ефективну кількість антитіл без утворення агрегатів (Ishikawa et al., Biol. Pharm. Bull., 33(8): 1413-1417, 2010; Levin et al., The Development of Therapeutic Monoclonal Antibody Products, editors. Boston (MA): BioProcess Technology Consultants, Inc, Chapter 9). Існує багато прийнятних способів запобігання денатурації білка у рідких препаратах. У деяких білкових препаратів, проблеми стійкості вирішуються шляхом ліофілізації. Наприклад, патентна заявка U.S. Patent No. 7,592,004 присвячена ліофілізованому препарату даклізумаб, стабілізованому застосуванням 5-25 мM буферного розчину гістидину (pH 5.5-6.5), 0.005-0.03 % неіонного полісорбату (поверхнево-активної речовини) та 100-300 мM невідновлюваного цукру, цукрози.Патентна заявка U.S. Patent Publication No. 2010-0158925 присвячена ліофілізованому препарату цетуксимаб, стабілізованому застосуванням буферного розчину гістидину та лактобіонової кислоти. Однак, процес ліофілізації породжує навантаження, викликані заморожуванням та висушуванням, як-то утворення кристалів льоду, змінення pH та високу концентрацію розчиненої речовини. Все це також може викликати денатурацію антитіл. Крім того, процес ліофілізації під час отримання вимагає наявності ліофілізатора великої ємності, а також високих витрат, що виникають при великих масштабах виробництва. Розчинений ліофілізований продукт у стерильному водному середовищі для відновлення перед застосуванням також є незручним. В якості альтернативного вирішення цих обмежень, у рідкі препарати для покращення стійкості антитіл додають стабілізатор. У якості стабілізаторів для білків, в тому числі для антитіл застосовують поверхнево-активні речовини, сироваткові альбуміни, полісахариди, амінокислоти, полімери, солі тощо (Wang, Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Wang et al., J. Pharm. Sci., 96(1): 1-26, 2007). Патентна заявка US Patent Publication No. 2011-0070231 присвячена стійкої рідкої композиції антитіл IgG, де стійкий фармацевтичний рідкий препарат містить 50мг/ мл або більше препарату 1 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 даклізумаб у 20-60 мМ розчині сукцинатного буферу (pH 5.5-6.5) з 0.02-0.04 % полісорбатом та 75-150 мМ хлоридом натрію. Патентна заявка US Patent Publication No. 2011-0020328 присвячена терапевтично ефективній кількості препарату анти-CD20 антитіл, де фармацевтично стійка композиція містить10-100 мМ ацетату натрію, 25-100 мМхлориду натрію, 0.5-5 % вільних аргінінових основ, 0.02-0.2 мМ EDTA та 0.01-0.2 %полісорбат 80 та має pH 5.0-7.0. Патентна заявка US Patent No. 7,785,592 присвячена стійкому препарату, уякому75 мг/ мл або більше препарату палівізумаб стабілізовано застосуваннямгістидинового буферного розчину та гліцину без іонних солей та поверхево-активної речовини та її стійкість підтримується при температурі 2 – 8 °C протягом принаймні15 місяців. Патентна заявка US Patent No. 6,991,790 присвячена стійкому водномуфармацевтичному препарату, що містить терапевтично ефективну кількість антитіл, розчин ацетатного буферу зі значенням pH приблизно 4.8-5.5, поверхево-активну речовину та поліол без ізотонічного агента, як-тохлорид натрію. Патентна заявка US Patent No. 7,648,702 присвячена рідкому препарату, де злитий білок рецептора фактора некрозу пухлин людини p75, зв'язаного з Fc - ділянкоюімуноглобулину людини G1 (IgG1) стабілізовано шляхом застосуванняприблизно10-200 мМ L- аргініну у якості агента запобігання агрегації. Ця патентна заявка стосується тільки способу з застосуванням етанерцепту у якості активного інгредієнта. З метою отримання стійких препаратів, відповідні стабілізатори треба застосовувати з урахуванням фізико-хімічних властивостей кожного активного інгредієнта. При застосуванні стабілізаторів у комбінації, конкуренція між ними та шкідливі наслідки можуть привести до небажаних ефектів. Крім того, концентрації антитіл повинні знаходитися у прийнятному для стабілізації діапазоні та вони є відносно великими у порівнянні з концентраціями антитіл білкових ліків. Отже, стабілізація антитіл у розчинах вимагає багато зусиль та обережності.(Shire et al., J. Pharm. Sci., 93(6): 1390-1402, 2004). Було проведено декілька досліджень стійкості рідких препаратів етанерцепту, але тільки у відомому винахідникам способі стабілізації етанерцепту у рідкомупрепараті було застосовано Lаргінін. Отже, існує нагальна необхідність у розробці нового рідкого препарату, здатного до стійкого підтримання активностіетанерцепту протягом тривалого часу, який буде більш ефективним у стабілізації етанерцепту, ніж відомий препарат, що містить L- аргінін. Винахідники приклали багато зусиль для розробки способу отримання рідкого препарату, здатного до стійкого підтримання активності етанерцепту.В результаті вони відкрили, що один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин та гістидин суттєво вплинули на стійкість етанерцепту у розчині, що тим самим довело заявлений винахід до завершення. Предметом заявленого винаходу є отримання водного препарату, що містить стабілізатори для зменшення утворення побічних продуктів етанерцепту під часйого зберігання у розчині та для підтримання його активності протягом тривалого часу. Рідкий препарат згідно з заявленим винаходом може ефективно запобігати утворенню побічних продуктів етанерцепту та стійко підтримувати його фармацевтичні ефективні властивості протягом довготривалого зберігання, що робить непотрібною процедуру відновлення перед введенням та дає можливість вводити пацієнтам стерильний препарат для забезпечення їх безпеки.Отже, очікується, що цей препарат буде застосовано там, де буде потрібно лікування этанерцептом. У одному аспекті, для досягнення вищеозначеної мети, заявленим винаходом передбаченорідкийпрепарат, що містить один або більше стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплюєметіонін, лізин, гістидинта їх фармацевтично прийнятні солі. Препарат заявленого винаходу може бути рідким препаратом етанерцепту, що містить етанерцепт та один або більше стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі. Препарат демонструє підвищену стійкість при зберіганні шляхомзменшеннякількості побічних продуктів етанерцепту, що виникають в результаті денатурації протягом зберігання. Метіонін, лізин, гістидин або їх фармацевтично прийнятні солі у якості стабілізаторів можуть бути присутніми у препараті укількості 0.1-250 мM. Етанерцепт у препараті може бути присутнім укількості1-100мг/мл. Додатково препарат може містити один або декілька матеріалів, вибраних згрупи, що охоплює буфер, ізотонічнийагент, наповнювач таконсервант. 2 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Буфер може бути вибрано з групи, що охоплює цитрат, фосфат, стеарат, тартрат, фумарат, глюконат, оксалат, лактат, ацетат, гістидин та Tris та може бути присутнім у кількості 0.1100 мM. Ізотонічний агент може бути вибрано з групи, що охоплює хлорид натрію, хлорид калію, борну кислоту, борат натрію, маніт, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, мальтозу, сахарозу, еритрит, арабіт, ксиліт, сорбіт та глюкозу таможе бути присутнім у кількості 11000 мM. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідким препаратом, що містить 1-100мг/ млетанерцепту, 0.1-250 мМ метіонінуабо його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферу та 1-1000 мМ хлориду натрію. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідким препаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферута1-1000 мМ хлориду натрію. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідким препаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферу та1-1000 мМхлориду натрію. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідким препаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферута1-1000 мМ хлориду натрію. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідкимп репаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферу та 1-1000 мМ хлориду натрію. Препарат етанерцепту згідно з заявленим винаходом може бути рідким препаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі0.1-100 мМ фосфатного буферута 11000 мМ хлориду натрію. Нижче наведено детальний опис заявленого винаходу. Заявлений винахід вперше показав, що метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі спричинюють зменшення утворення побічних продуктів етанерцепту у розчині та стійке підтримання його активності протягом довготривалого зберігання, отже заявленим винаходом передбачено їх застосування у якості стабілізаторів фармацевтично ефективної кількості етанерцепту. Для отримання стійких препаратів, відповідні стабілізатори повинні бути застосовані з урахуванням фізико-хімічних властивостей кожного активного інгредієнта. У відповідності з різницею типів, концентрації та комбінацій матеріалів, що входять до складу препарату, конкуренція між ними у препараті може привести до небажаних ефектів, тому є дуже важко отримати певний стійкий лікарський препарат. У світлі наведеного вище винахідники відкрили, що рідкий препарат, який містить один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі підвищують стійкість зберігання етанерцепту у порівнянні з препаратом, що не має стабілізаторів шляхом зменшення побічного продукту етанерцепту під час зберігання у розчині. Певним чином, у одному втіленні заявленого винаходу для дослідження оптимального стабілізатора для отримання стійкого рідкого препарату етанерцепту, до нього додавали різні амінокислоти, поверхнево-активні речовини та полімери з метою перевірки їх стабілізаційних дій. В результаті цих досліджень було знайдено, що лізин, гістидин, метіонін або їх комбінації суттєво впливають на стійкість етанерцепту шляхом запобігання його денатурації під час зберігання урозчиніз високою температурою. Крім того, було знайдено, що препарат згідно з заявленим винаходом демонструє стабілізуючі ефекти етанерцепту, що були еквівалентними або вищими, ніж стабілізуючі ефекти відомого стійкого препарату етанерцепту, що містить L- аргінін(US Patent No. 7,648,702). Зокрема, було знайдено, що метіонін демонструє дуже гарний та покращений у порівнянні з Lаргініном ефект стабілізування етанерцепту. У зв'язку з цим, побічний продукт етанерцепту, отриманий під час зберігання перевірили шляхом застосування ексклюзіонної ВЕРХ-хроматографії (SE-HPLC). В результаті, у порівнянні з загальною кількістю домішок препарату етанерцепту, отриманого з застосуванням L- аргініну у якості стабілізаторау патентній заявці US Patent No. 7,648,702, препарат, отриманий з застосуванням лізину у якості стабілізатора показав подібну кількість домішок та препарат, 3 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриманий з застосування мг істидину або метіоніну у якості стабілізатора показав меншу кількість домішок(див. Таблицю 2). Подібні результати також були отримані за допомогою ВЕРХ-хроматографічного аналізу гідрофобної взаємодії (HI-HPLC). Ці результати свідчать про те, що гістидин, лізин та метіонін запобігають денатурації етанерцепту шляхом пригнічення утворенняйого побічних продуктів (див. Таблицю3). Отже, рідкий препарат згідно з заявленим винаходом може стійко підтримувати фармацевтичні ефективні властивості етанерцепту протягом тривалого часу шляхом ефективного зменшення утворення його побічних продуктів. Як тут застосовано, термін " етанерцепт "(рекомбінантний злитий білок p75 sTNFR:Fc) має відношення до білка, який є гомодимерною формою двох злитих білків Fc, зв'язаних дисульфідними зв'язками, де кожний такий злитий білок складається з розчинного рецептора p75 фактора некрозу пухлин (TNF) людинирозміром у 75 кДА, спареного з Fc - ділянкою IgG1 людини. Більш докладно, етанерцепт є гомодимерною формою двох злитих білків Fc, зв'язаних трьома дисульфідними зв'язками, де кожний такий злитий білок складається з зовнішньоклітинної частини зв'язування ліганду розчинного рецептора p75 TNF людини, спареної з Fc - ділянкою IgG1 людини. Fc – компонент етанерцепту містить домен CH2,домен CH3 та петельну ділянку, але не містить домен CH1 антитіла IgG1. Молекулярна маса етанерцепту може дорівнювати приблизно 150 кілодальтон (кДа). Ця сполука (етанерцепт) на даний час є у продажу під торгівельною маркою ENBREL® (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA.) та має CAS – номер (номер хімічної речовини або препарату відповідно доChemical Abstracts System) 185243-69-0. Етанерцепт можна отримати, але без обмеження, за допомогою технологій з застосуванням рекомбінантної ДНК. Етанерцепт заявленого винаходу є біологічним модулятором запалення, що діє у якості конкурентного інгібітора TNF-α шляхом зв'язування з рецептором TNF-α клітинної поверхні для пригнічення TNF-α - опосередкованих імунних відповідей та його застосовують для лікування ревматоїдного артриту, псоріазу та анкілозуючого спондилоартриту. Також ця сполука знаходиться на стадії клінічних випробувань щодо її застосування у лікуванні васкуліту, хвороби Альцгеймера та хвороби Крона. У рідкому препараті згідно з заявленим винаходом, етанерцепт знаходиться утерапевтично ефективній кількості. Переважним чином, етанерцепт знаходиться укількості 1-100 мг/мл. Як тут застосовано, термін" стабілізований рідкий препарат " або " стійкий рідкий препарат " має відношення до препарату, що зберігає фізичну та хімічну ідентичність та цілісність терапевтично активного інгредієнту, тобто етанерцепту, під час зберігання у розчині. Аналітичне вимірювання стійкості етанерцепту може бути здійснено шляхом проведення добре відомого у цій галузі аналізу стійкості білка. Вимірювання стійкості може бути проведено з попередньо визначеною температурою протягом попередньо визначеного періоду часу. Для швидкого аналізу, препаратможуть зберігати в умовах більш високої або " підвищеної " температури, наприклад, протягом 2 тижнів – 1 місяця або ще довше при 40 °C з вимірюванням залежної від температури стійкості препарату протягом цього періоду. Як тут застосовано, термін" стабілізатор "має відношення до певної хімічної сполуки, що взаємодіє з біологічною молекулою та/або з загальним фармацевтичним наповнювачем у препараті для покращення його стійкості. Звичайно стабілізатор захищає білки від навантажень, викликаних перехідною зоною між розчином та повітрям та від навантажень, викликаних розділом " розчин / поверхня ", що ведуть до агрегування білка. У заявленому винаході, стабілізатор є компонентом, що зменшує утворення побічних продуктів етанерцепту у розчині під час його зберігання для підтримання його активності протягом тривалого часу. Один або декілька стабілізаторів є переважно вибраними з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі. Стосовно амінокислот слід зазначити, що обсяг заявленого винаходу охоплює як L-,так і Dізомерні форми цих сполук, а також не тільки самі амінокислоти, як-то метіонін, лізин та гістидин, але й їх аналоги, сольвати, гідрати, стереоізомери та фармацевтично прийнятні солі за умови того, що всі вони демонструють істотно однакову дію. Як тут застосовано, термін" фармацевтичноприйнятні солі "має відношення до сполук, отриманих у вигляді солейамінокислот, як-тометіоніну, лізину тагістидину у межах збереження їх функцій стабілізаторів у заявленому винаході. Певним чином, вони можуть утворювати сіль шляхом додавання кислоти, наприклад, утворювати сіль з неорганічною кислотою (як-то, наприклад, соляна кислота, бромистоводневакислота, фосфорна кислота, азотна кислота, сірчана кислота), органічною карбоновоюкислотою (як-то, наприклад, оцтова кислота, 4 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галогензаміщена оцтова кислота, як-тотрифтороцтовакислота, пропіонова кислота, малеїнова кислота, бурштиновакислота, яблучна кислота, лимонна кислота, винна кислота, саліциловакислота), цукровоюкислотою(як-то, наприклад, глюкуронова кислота, галактуронова кислота, глюконова кислота, аскорбінова кислота), кислотним полісахаридом (як-то, наприклад, гіалуронова кислота, хондроїтину сульфат та аргінінова кислота), органічною сульфокислотою, в тому числі цукровим ефіром сульфокислоти, як-то хондроїтину сульфат (наприклад, метансульфонова кислота, ρ-толуолсульфонова кислота). Як тут застосовано, термін'аналоги'має відношення до сполук, що демонструють ті ж саме функції, як і амінокислоти, як-тометіонін, лізин тагістидин, що застосовують у якості стабілізаторів у заявленому винаході. Заявлений винахід також охоплює, але без обмеження, аналоги зазначених амінокислот, як-тометіоніну, лізину тагістидину.У заявленому винаході, приклади аналогів можуть охоплювати, але без обмеження, аналоги метіоніну, як-то селенометіонін, гідроксиметилбутанову кислоту, етіонін та трифторметіонін. Як тут застосовано, термін "побічні продукти" має відношення до небажаних продуктів, що зменшують зміст терапевтично активного інгредієнту, як-то етанерцепту, у препараті. Типові побічні продукти охоплюють " продукти з малою молекулярною масою ", що виникають внаслідок денатурації етанерцепту шляхом дезамінування або гідролізу та" продукти з великою молекулярною масою ", як-тоолігомери, агрегати або їх суміші. Як тут застосовано, термін " продукти з великою молекулярною масою "охоплює фрагменти етанерцепту, що завдяки денатурації згодом утворюють агрегати (наприклад, фрагменти, що виникають внаслідок пептидної деградації шляхом дезамінування або гідролізу) або їх суміші. Звичайно, продукти з великою молекулярною масою являють собою комплекси з більшими молекулярними масами, ніж молекулярна маса терапевтичного мономеру етанерцепту та можуть мати молекулярну масу, більшу, ніжприблизно150кДа. Як тут застосовано, термін" продукти з малою молекулярною масою "охоплює, наприклад, терапевтичні поліпептиди, отримані шляхом дезамінування або гідролізу, тобто фрагменти етанерцепту. Звичайно, продукти з малою молекулярною масою являють собою комплекси з меншими молекулярними масами, ніж молекулярна маса терапевтичного мономеру етанерцепту таможуть мати молекулярну масу, меншу, ніжприблизно150кДа. Рідкий препарат заявленого винаходу має один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидинта їх фармацевтично прийнятні солі. Точніше кажучи, рідкий препарат має один стабілізатор, як-то метіонін, лізин абогістидинабо має два стабілізатора, як-тометіонінталізин, метіонінтагістидинаболізин та гістидин або три стабілізатори, як-тометіонін, лізин тагістидин. Також до вищезазначеного препарату, що містить комбінації амінокислот можуть бути додатково додані фармацевтично прийнятнісолі, відповідно, метіоніну, лізину та гістидину або метіонін, лізин та гістидин можуть бути, відповідно, модифікованими формами фармацевтично прийнятних солей. Переважно, у якості стабілізатора рідкий препарат містить метіонін, лізин, гістидин; метіонінталізин; метіонінтагістидин або лізин та гістидин та, більш переважніше, він містить метіонін. Метіонін є незамінною амінокислотою та має хімічну формулу C5H11NO2S та молекулярну масу 149.21. Метіонін є неполярною амінокислотою тамістить тіоефірну групу (-S-CH3) у бічному ланцюзі. Значення pK1 метіоніну дорівнює 2.28, значення pK2 дорівнює 9.21 та ізоелектрична точка (PI) дорівнює 5.74. Метіонін запобігаєокисленню антитіл у рідких препаратах та надає антитілам стійкості шляхом конкурування з метіоніновими залишками у антитілах у реакції з вільними гідроксильними радикалами (Lam et al., J. Pharm. Sci., 86(11): 1250-1255, 1997; Wang, Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999). Лізин є незамінною амінокислотою та має хімічну формулу C 6H14N2O2 та молекулярну масу 146.19. Лізин є основною амінокислотою та значення pK 1 лізину дорівнює 2.18, значення pK2 дорівнює 8.95, значення pK3 дорівнює 10.53 та PI дорівнює 9.74. Гістидин є незамінною амінокислотою з імідазольною функціональною групою, що має позитивно заряджений бічний ланцюг, хімічну формулу C6H9N3O2 та молекулярну масу 155.15. Гістидин є основною амінокислотою та значення pK1 гістидину дорівнює 1.82, значення pK2 дорівнює 9.17, значення pK3 дорівнює 6.0 та PI дорівнює7.59. На відміну від цього, L- аргінін, що знаходиться у складі відомого наявного у продажу препарату етанерцепту є незамінною амінокислотою, що має хімічну формулу C 6H14N4O2 та молекулярну масу 174.2.Гістидин є основною амінокислотою та значення pK1 аргініну дорівнює 2.17, значення pK2 дорівнює 9.04, значення pK3 дорівнює 12.48 та PI дорівнює 10.76. Інакше кажучи, застосовані у якості стабілізатора у заявленому винаході метіонін, лізин та гістидин повністю відрізняються конструкцією, хімічною формулою, фізико-хімічними властивостями та ступенем схильності до іонізації від аргініну, застосованого у якості стабілізатора для 5 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 етанерцепту. Заявлений винахід вперше продемонстрував, що амінокислоти, як-то метіонін, лізин та гістидин є прийнятними стабілізаторами для етанерцепту. Зміст стабілізатора в рідкій композиції заявленого винаходу дорівнює 0.1-250 мM, переважно 1-100 мM табільш переважно 5-50 мM. Рідкий препарат заявленого винаходу також може містити будь-який матеріал, що звичайно знаходиться у складі композицій білкових лікарських засобів або препаратів антитіл для збільшення стійкості етанерцепту у відповідності з одним або декількома стабілізаторами, вибраними з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі за виключенням сполук, що погіршують призначення заявленого винаходу. Наприклад, до рідкого препарату заявленого винаходу може бути додано L- аргінін, відомийу якості стабілізатора етанерцепту. Крім того, на додачу до стабілізатора, рідкий препарат за заявленим винаходом може також містити буфер. Термін "буфер",як тут застосовано, має відношення докомпонента, що підвищує ізотонічність та хімічну стійкість препарату та функції підтримання фізіологічно прийнятного значення pH. Буфер запобігає швидкому зміненню pH рідкого препаратуз підтриманням pH розчину для стабілізаціїетанерцепту. Бажані приклади буферів охоплюють, але без обмеження, цитрат, фосфат, сукцинат, тартрат, фумарат, глюконат, оксалат, лактат, ацетат, гістидин та Tris. У окремому втіленні, буфер є фосфатним буфером. Буфер може бути застосовано або окремо або у комбінаціях двох або більше буферів. У різних втіленнях заявленого винаходу препарат повинен мати значення pH, що дорівнює приблизно 5-7.5 або приблизно 5.8-6.8.У окремому втіленні, препарат має pH приблизно 6.0-6.6. Частиною заявленого винаходу також призначені бути й діапазони проміжних значень вищевказаних рівнів pH, наприклад, pH у діапазоні приблизно5.2-6.4 (наприклад, pH 6.2). Також до заявленого винаходу призначено включення, наприклад, діапазонів значень з застосуванням комбінації будь-яких вищевказаних значень у якості верхньої та/або низької межі. При необхідності, значення pHможе бути відрегульовано з застосуванням відомих у цей галузі технічних прийомів. Наприклад, pHможе бути доведено до будь-якого бажаного діапазону шляхом додавання HCl або гістидину. У іншому втіленні, буфер є присутнім уконцентрації0.1-100мM, переважно 1-50 мM та більш переважно, уконцентрації 5-25 мM.Частиною заявленого винаходу також призначені бути й діапазони проміжних значень вищезазначених концентрацій.Також заявлений винахід охоплює, наприклад, включення діапазонів значень з застосуванням комбінації будь-яких вищезазначених концентрацій у якості верхньої та/або низької межі. У окремому втіленні, буфер повинен бути присутнім у кількості, достатній для підтримання фізіологічно прийнятного значення pH. На додачу до стабілізатора, рідкий препарат згідно з заявленим винаходом може також додатково містити ізотонічний агент. Як тут застосовано, термін" ізотонічний аген" має відношення до компоненту, якого застосовують для часткового підтримання ізотонічності препарату та рівня білка та часткового підтримання рівня, діапазону або відсотка присутнього упрепараті терапевтично активного поліпептиду. Ізотонічний агент має такий саме осмотичний тиск, як і плазма крові, отже його можна внутрішньовенно ввести суб'єкту шляхом вливання (інфузії) без змінення осмотичного тиску плазми крові суб'єкта. Дійсно, у одному втіленні згідно з заявленим винаходом, ізотонічнийагент є присутнім у кількості, достатній, щоб зробити препарат придатним для внутрішньовенного вливання. Часто ізотонічний агент також застосовують у якості наповнювача. Таким чином, ізотонічний агент може дозволити білку подолати різні несприятливі дії, як-то заморожування та механічне подразнення. При введенні розчину етанерцепту у організм, ізотонічний агент виконує функцію підтримання у ньому відповідного осмотичного тиску. Приклади ізотонічних агентів можуть охоплювати, але без обмеження, речовини, що зазвичай застосовують з цією метою, як-то хлорид натрію, хлорид калію, борну кислоту, борат натрію, маніт, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, мальтозу, сахарозу, еритрит, арабіт, ксиліт, сорбіт та глюкозу. У окремому втіленні, ізотонічним агентом є NaCl. Ці ізотонічні агенти можуть бути застосовані або поодинці абоу комбінаціях з двома або декількома такими речовинами. У іншому втіленні, ізотонічний агент (наприклад, NaCl) є присутнім з концентрацією у 11000мM, переважно 10-500 мM табільш переважно 50-250 мM.Частиною заявленого винаходу також призначені бути й діапазони проміжних значень вищезазначених концентрацій. Також заявлений винахід охоплює, наприклад, включення діапазонів значень з застосуванням комбінації будь-яких вищезазначених концентрацій у якості верхньої та/або низької межі. Ізотонічний агент повинен бути присутнім у кількості, достатній для підтримання осмосу препарату. 6 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рідкий препарат згідно з заявленим винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний наповнювач. Приклади наповнювачів можуть охоплювати цукри та поліоли, поверхнево-активні речовини, полімери тощо. Приклади цукрів та поліолів можуть охоплювати цукрозу, трегалозу, лактозу, мальтозу, галактозу, маніт, сорбіт та гліцерин. Приклади поверхнево-активних речовини можуть охоплювати неіонніповерхнево-активні речовини, як-то полісорбат20,полісорбат80 таполоксамер.Приклади полімерів можуть охоплювати декстран, поліетиленгліколь, карбоксильну метилцелюлозу, гіалуронову кислоту та циклодекстрин. Рідкий препарат згідно з заявленим винаходом також може додатково містити консервант. Консервант є хімічною сполукою, яку додають до фармацевтичного препарату у якості протимікробного агенту. Приклади консерванту можуть охоплювати, але без обмеження, хлорид бензалконію, бензетоній, хлоргексидин, фенол, м-крезол, бензиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлорбутанол, ο-крезол, ρ-крезол, хлорокрезол, фенілртутьнітрат, тимеросал та бензойну кислоту. Ці консерванти можуть бути застосовані або поодинці або у комбінації з двох або декількох консервантів. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить1-100мг/ мл етанерцепту, 0.1-250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферута1-1000 мМ хлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є стійким рідким препаратом, що містить 1-100мг/ мл етанерцепту, 0.1100 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-50 мМ фосфатного буферу та 1500 мМ хлориду натрію з pH 6.0-6.6. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить1-100мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі0.1-100 мМфосфатного буферута1-1000 мМхлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100мг/мл етанерцепту, 0.1100 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-50 мМ фосфатного буферута 1500 мМ хлориду натрію з pH 6.0-6.6. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100мг/ мл етанерцепту, 0.1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферу та1-1000 мМ хлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100мг/ мл етанерцепту, 0.1100 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-50 мМ фосфатного буферута 1500 мМ хлориду натрію зpH 6.0-6.6. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить1-100мг/ мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферу та 1-1000 мМ хлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100мг/млетанерцепту, 1-50 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 1-100 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-50 мМ фосфатного буферута1-500 мМ хлориду натрію з pH 6.0-6.6. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить1-100 мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-100 мМ фосфатного буферута 1-1000 мМ хлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100 мг/мл етанерцепту, 1-50 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, 1-100 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0.1-50 мМ фосфатного буферута 1-500 мМ хлориду натріюз pH 6.0-6.6. У окремому втіленні, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100 мг/мл етанерцепту, 0.1-250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0,1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, 0,1-100 мМ фосфатного буферута 1-1000 мМ хлориду натрію. Точніше кажучи, препарат заявленого винаходу є рідким стійким препаратом, що містить 1-100 мг/мл етанерцепту, 1-50 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 1-50 мМ лізинуабо його фармацевтично прийнятної солі, 0.150 мМ фосфатного буферута 1-500 мМ хлориду натріюз pH 6.0-6.6. Препарат заявленого винаходу може бути застосовано для лікування захворювання, у якому етанерцепт є терапевтично ефективним. Етанерцепт є біологічним модулятором запалення, що пригнічує TNF-α – опосередковані імунні відповіді та препарат заявленого винаходу застосовують, але без обмеження, для лікування ревматоїдного артриту, псоріазу, анкілозуючого спондилоартриту, васкуліту, хвороби Альцгеймерв або хвороби Крона. Препарат заявленого винаходу може бути введено, але без обмеження, перорально або парентерально, 7 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 тобто підшкірним, внутрішньом'язовим, інтра-абдомінальним, внутрішньочеревним, трансдермальним та/або внутрішньовенним шляхом. У іншому аспекті, заявлений винахід передбачає спосіб підвищення стійкостіетанерцепту з застосуванням рідкого препарату, що містить один або декілька стабілізаторів, вибраних з групи, що охоплює метіонін, лізин, гістидин та їх фармацевтично прийнятні солі. Рідкий препарат може підвищувати стійкість зберігання етанерцепту шляхом зменшення кількості побічних продуктів етанерцепту, що виникають внаслідок його денатурації під час зберігання. Заявлений винахід буде більш детально описано з посиланням на наступні Приклади, наведені тут виключно з ілюстративною метою та не призначені для обмеження обсягу заявленого винаходу. Приклад 1. Перевірка стійкості водного препарату етанерцепту у залежності від додавання стабілізатора. Для дослідження оптимального стабілізатора для отримання стійкого водного препарату етанерцепту, гістидину якості стабілізатора додали до 5 мМ фосфатного розчину, до якого додали етанерцепт до концентрації у 50 мг/мл. Для отримання препарату 1до цієї суміші також додали хлорид натрію у якості ізотонічного агенту. На додачу до цього, етанерцепт додали до 10 мМ фосфатного розчину доконцентрації у 50 мг/мл та до цієї суміші також додали хлорид натрію у якості ізотонічного агенту. Для отримання препаратів 2–12 до зразків додали по окремості лізин, аргінін, метіонін, гліцин, полісорбат 20, полісорбат 80, полоксамер 188, поліетиленгліколь, протамінсульфат, цукрозутагуанідин- HCl. Нарешті, для отримання вільного від стабілізатора препарату, хлорид натрію у якості ізотонічного агенту додали до 10 мМ фосфатного розчину, до якого додали етанерцепт доконцентрації у 50 мг/мл. Композиції стабілізаторів препаратів наведені у наступній Таблиці 1. Зразки отриманого препарату (по 0.5 мл) зберігали у скляних 1.0 мл шприцах у запечатаному стані при 50°C. Таблиця 1 препарат1 препарат2 препарат3 препарат4 препарат5 препарат6 препарат7 препарат8 препарат9 препарат10 препарат11 препарат12 вільний від стабілізатора препарат 30 35 40 Композиція стабілізатора 10 мM гістидин 25 мМ лізин 25 мМ аргінін 25 мМ метіонін 1 % гліцин 0.1 %Tween 20 0.1 % Tween 80 0.1 % F68 0.1 % поліетиленгліколь 0.03 % протамінсульфат 2 % цукроза 0.2 % гуанідин - HCl Через 7 днів після зберігання при 50°C, наведені у Таблиці1препарати1-12 та вільний від стабілізатора препарат були піддані аналізу шляхом ексклюзійної ВЕРХ - хроматографії для дослідження типів продуктів з малою молекулярною масою та продуктів з великою молекулярною масою, як-то олігомерів та агрегатів, що виникають внаслідок денатурації етанерцепту та загальна кількість цих продуктів наведена тут у вигляді загального вмісту домішок. На додачу, за допомогою ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії були досліджені структурні змінення етанерцепту. Отримані за допомогою цього способу дані свідчать про те, що споріднені з етанерцептом речовини були розділені на чотири піки, в тому числіна попередній пік, пік 1, пік 2 тапік 3.Попередній пік та пік 1 відображають продукти з малою молекулярною масою, пік 2відображає етанерцепт тапік 3 відображає димери з низьким ступенем агрегації або активності. Отже, загальна кількість попереднього піку, піку 1 та піку 3 зображена у вигляді загального вмісту домішок. Результати наведені, відповідно, у Таблицях 2 та 3. 8 UA 113172 C2 Таблиця 2 Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії (%) день досліджень Препарат 1 Препарат 2 Препарат 3 Препарат 4 Препарат 5 Препарат 6 Препарат 7 Препарат 8 Препарат 9 Препарат 10 Препарат 11 Препарат 12 вільний від стабілізатора препарат 0 7 4.6 4.7 4.6 4.6 4.6 4.7 4.6 4.6 4.7 4.6 4.8 4.7 22.2 24.8 24.2 20.8 28.5 29.4 29.0 28.8 27.8 29.4 28.4 27.5 4.7 30.2 Таблиця 3 день досліджень Препарат 1 Препарат 2 Препарат 3 Препарат 4 Препарат 5 Препарат 6 Препарат 7 Препарат 8 Препарат 9 Препарат 10 Препарат 11 Препарат 12 вільний від стабілізатора препарат 5 10 Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії (%) 0 7 14.7 33.7 14.6 34.9 15.0 34.3 15.2 30.3 14.8 36.6 15.2 35.5 15.2 36.2 15.4 35.5 15.2 35.1 15.0 36.9 14.9 35.1 15.1 34.8 14.4 41.9 Як свідчать наведені у Таблиці 2 результати ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, при зберіганні протягом тижня з температурою 50°C, препарат 1, що містив гістидину якості стабілізатора мав загальний вміст домішок 22.2 %, препарат 2, що містив лізину якості стабілізатора мав загальний вміст домішок 24.8 %, препарат 3, що містив аргінін у якості стабілізатора мав загальний вміст домішок 24.2 % та препарат 4, що містивметіоніну якості стабілізатора мав загальний вміст домішок 20.8 %. Всі ці препарати показали помітно низький загальний вміст домішок порівняно з препаратом, вільним від стабілізатора, загальний вміст домішок якого дорівнював 30.2 %.При порівнянні цих препаратів з препаратом 3, де у якості стабілізатора було застосовано L- аргінін (US Patent No. 7,648,702), то препарат 2, що містив 9 UA 113172 C2 5 10 15 20 25 лізин показав схожій загальний вміст домішок у 24.8 %, а препарат 1, що містив гістидин та препарат 4,що містив етіонін показали зменшений загальний вміст домішок, що дорівнював 22.2 % та 20.8 %,відповідно. Наведені у Таблиці 3 результати, отримані за допомогою способу ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії є подібними до результатів, отриманих за допомогою способу ексклюзійної ВЕРХ - хроматографії. Препарат, вільний від стабілізатора показав загальний вміст домішок 41.9 %. На відміну від цього, препарати 1, 2, 3 та 4 показали, відповідно, загальний вміст домішок у 33.7 %, 34.9 %, 34.3 % та 30.3 %, що свідчить про те, що додані у ці препарати гістидин, лізин, L-аргінін таметіонін ефективно впливають на запобігання денатурації етанерцепту. Зокрема, препарат 4, який містив метіонін показав найнижчий загальний вміст домішок, що свідчить про те, що метіонін є найбільш ефективним у стабілізації етанерцепту. Отже, заявлений винахід демонструє, щолізин, гістидин та метіонін впливають на стабілізацію етанерцепту шляхом запобігання його денатурації та ця дія єеквівалентною або сильнішою, ніж дія L- аргініну та, зокрема, метіонін є більш ефективним у стабілізації етанерцепту, ніж L- аргінін. Приклад 2. Перевірка стійкості водного препарату етанерцепту у залежності від концентрації метіоніну. Для визначення оптимальної концентрації метіоніну для стабілізації етанерцепту, до 10 мМ фосфатних розчинів додали 120 мМ хлорид натрію з наступним окремим додаванням відповідно 25 мМ та 12.5 мМ метіоніну, після чого, для отримання, відповідно, препаратів 13 та 14 до них також додали етанерцепт зконцентрацією у 50 мг/мл. Для отримання комерційно доступного водного препарату етанерцепту спочатку отримали контрольну суміш шляхом додавання 25 мМ L- аргініну до 100 мМ хлориду натрію та 1 % цукрози у 10 мМ фосфатному розчині з наступним додаванням етанерцепту доконцентрації у 50 мг/мл.Зразки препарату об'ємом по 0.5 мл зберігали при відповідних температурах (40°С, 25°С та 4°С)у скляних 1.0 мл шприцаху запечатаному стані. Композиції отриманих водних препаратів наведені у наступній Таблиці 4. Таблиця 4 препарат13 препарат14 контроль 30 Композиція 50мг/мл етанерцепту, 10мMфосфатного розчину, 120мMNaCl, 25 мМ метіоніну(pH 6.3) 50мг/мл етанерцепту, 10мMфосфатного розчину, 120мMNaCl, 12, 5 мМ метіоніну(pH 6.3) 50мг/мл етанерцепту, 25мM фосфатного розчину, 100мM NaCl, 1 % цукроза, 25 мМ L- аргінін (pH 6.3) Потім, кожен з препаратів 13, 14 та контроль зберігали протягом 1 та 3 тижнів при температурі 40°C та окремо протягом 4 та 8 тижнів при температурі 25 °C, після чого було проведено вимірювання їх загального вмісту домішок шляхом ексклюзійної ВЕРХ хроматографії та ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії, як наведено у Прикладі 1.Результати наведені, відповідно, у Таблицях 5 та 6. 35 Таблиця 5 час (тижнів) препарат13 препарат14 контроль Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ексклюзійної ВЕРХ хроматографії (%). 4 °C 25 °C 4 °C 0 1 3 0 4 8 0 4 5.5 11.5 20.5 5.5 14.8 18.8 5.5 8.8 5.5 12.5 22.0 5.5 16.0 19.9 5.5 8.9 5.5 13.4 23.3 5.5 16.2 20.4 5.5 8.8 10 8 10.2 10.5 10.3 UA 113172 C2 Таблиця 6 час (тижнів) препарат13 препарат14 контроль 5 10 15 20 25 30 Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії (%). 4 °C 25 °C 4 °C 0 1 3 0 4 8 0 4 8 10.0 15.9 21.6 10.0 15.3 18.5 10.0 11.0 11.9 9.9 17.0 23.3 9.9 16.7 19.8 9.9 11.3 11.6 10.2 18.0 25.5 10.2 17.4 20.6 10.2 10.0 11.9 Як видно з результатів, наведених у Таблицях 5 та 6, препарат 13 та препарат 14,що містили метіонін у якості стабілізатора показали низький рівень виникнення домішок у всіх умовах зберігання при температурах 40 °C, 25 °C та 4°C у порівнянні з контрольною групою, отриманою у відповідності зі способом отримання комерційно доступного водного препарату етанерцепту. Точніше кажучи, результати, отримані шляхом ексклюзійної ВЕРХ - хроматографії та ВЕРХ-хроматографії гідрофобної взаємодії показали, що препарат 13, який містив25 мМ метіонін та препарат 14, який містив 12.5 мМ метіонін показали зниження виникнення домішок у порівнянні з контролем в умовах трьохтижневого зберігання при 40 °C та восьмитижневого зберігання при 25 °C та подібні до контролю рівні виникнення домішок в умовах восьмитижневого зберігання при 4 °C. Ці результати свідчать про те, що препарат заявленого винаходу, який містить метіонін є більш стійким препаратом для підтримки активності етанерцепту протягом тривалого періоду часу, ніж комерційно доступний препарат. На закінчення слід зауважити, що заявлений винахід демонструє той факт, що водний препарат етанерцепту, який містить метіонін запобігає денатурації етанерцепту з підтриманням його активності протягом тривалого часу та метіонін є дуже ефективним у якості стабілізатора у водному препараті етанерцепту. Приклад 3. Перевірка стійкості водного препарату етанерцепту, що містить гістидин та лізин або гістидин та метіонін. Для отримання препарату 15, до 10 мМ фосфатного розчину з доданим до концентрації 50 мг/мл етанерцептом додали 5 мM гістидин та 25 мM лізин у якості стабілізатора, після чого до суміші додалихлорид натрію у якості ізотонічного агенту. Для отримання препарату 16, до 10 мМ фосфатного розчину з доданим до концентрації 50 мг/мл етанерцептом додали 5 мM гістидин та 25 мM метіонін у якості стабілізатора, після чого до суміші додали хлорид натрію у якості ізотонічного агенту. Для отримання вільного від стабілізатора препарату, хлорид натрію у якості ізотонічного агенту додали до 10 мМ фосфатного розчину та до отриманої суміші додали етанерцепт до концентрації 50 мг/мл. Зразки отриманого препарату (по 0.5 мл) зберігали у скляних 1.0 мл шприцах у запечатаному стані при 50 °C. Композиції стабілізаторів препарату наведені у наступній Таблиці 7. Таблиця 7 Композиція стабілізатора 5 мМ гістидин + 25 мМ лізин 5 мМ гістидин + 25 мМ метіонін препарат15 препарат16 вільний стабілізатора препарат 35 від Через сім днів після зберігання при температурі 50 °C, наведені у Таблиці 7 препарати 15, 16 та вільний від стабілізатора препарат піддали аналізу шляхом ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, як наведено у Прикладі 1 для вимірювання їх загального вмісту домішок. Результати наведені у Tаблиці 8. 11 UA 113172 C2 Таблиця 8 день досліджень препарат15 препарат16 вільний від стабілізатора препарат 5 10 15 20 25 30 Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ексклюзійної ВЕРХ - хроматографії (%). 0 7 4.7 21.5 4.7 20.9 4.7 30.2 Як свідчать результати ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, наведені у Таблиці 8,препарат 16, який містив гістидин у якості стабілізатора при зберіганні протягом тижня при 50 °C мав загальний вміст домішок 21.5 % та показав помітно нижчий загальний вміст домішок порівняно з вільним від стабілізатора препаратом, що показав загальний вміст домішок 30.2 %. Препарат 16показав помітно нижчий загальний вміст домішок порівняно з препаратом 1,що містив 10 мM гістидин, який показав загальний вміст домішок 22.2 % та препаратом 2, що містив 25 мM лізин, який показав загальний вміст домішок 24.8 %. Отже, у заявленому винаході показано, що препарат, який містить гістидинталізин значним чином дуже добре впливають на запобігання денатурації етанерцепту шляхом зменшення кількості загального вмісту домішок під час зберігання у порівнянні з вільним від стабілізатора препаратом та з будь-яким препаратом, що містить, відповідно, гістидин, лізин та метіонін. На додачу, як свідчать результати ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, наведені у Таблиці 8, препарат 16, який містив гістидин у якості стабілізатора при зберіганні протягом тижня при 50 °C %, мав загальний вміст домішок 20.9 % та показав помітно нижчий загальний вміст домішок порівняно з вільним від стабілізатора препаратом, що мав загальний вміст домішок 30.2 %. Зокрема, препарат 16 показав нижчий загальний вміст домішок порівняно з препаратом 15, що містив гістидин та лізину якості стабілізатора. Отже, у заявленому винаході показано, що препарат, який містить гістидинта метіонін помітно впливає на запобігання денатурації етанерцепту шляхом зменшення кількості загального вмісту домішок протягом зберігання у порівнянні з вільним від стабілізатора препаратом. Приклад 4. Перевірка стійкості водного препарату етанерцепту, що містить метіонінталізин. Для отримання препарату 17, до 10 мМ фосфатного розчину з доданим до концентрації 50 мг/мл етанерцептом додали 12,5 мM метіонін та 12,5 мM лізин у якості стабілізатора, після чого до суміші додали хлорид натрію у якості ізотонічного агенту. Для отримання вільного від стабілізатора препарату, хлорид натрію у якості ізотонічного агенту додали до 10 мМ фосфатного розчину та до отриманої суміші додали етанерцепт до концентрації 50 мг/мл. Зразки отриманого препарату (по 0.5 мл) зберігали у скляних 1.0 мл шприцах у запечатаному стані при 50 °C. Композиції стабілізаторів препарату наведені у наступній Таблиці 9. Таблиця 9 Композиція стабілізатора 12.5 мM метіонін+ 12.5 мM лізин Препарат 17 вільний стабілізатора препарат від 35 Через сім днів після зберігання при температурі 50 °C, наведені у Таблиці 9 препарат 17 та вільний від стабілізатора препарат піддали аналізу шляхом ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, як наведено у Прикладі 1 для вимірювання їх загального вмісту домішок. Результати наведені у Tаблиці 10. 40 12 UA 113172 C2 Таблиця 10 Загальний вміст домішок, обчислений шляхом ексклюзійної ВЕРХ - хроматографії (%). день досліджень 0 7 препарат17 5.2 27.0 вільний від стабілізатора препарат 5.2 32.8 5 Як свідчать результати ексклюзійної ВЕРХ – хроматографії, наведені у Таблиці 10, препарат 17, який містив метіонін та лізин у якості стабілізатора при зберіганні протягом тижня при 50 °C мав загальний вміст домішок 27 % та показав помітно нижчий загальний вміст домішок порівняно з вільним від стабілізатора препаратом, що показав загальний вміст домішок 32,8 %. Отже, у заявленому винаході показано, що препарат, який містить метіонін та лізин помітно впливає на стабілізування етанерцепту шляхом зменшення кількості загального вмісту домішок у порівнянні з вільним від стабілізатора препаратом. 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 30 35 40 1. Рідка композиція етанерцепту, що містить етанерцепт і метіонін або його фармацевтично прийнятні солі як стабілізатор і яка має підвищену стійкість при зберіганні етанерцепту у порівнянні з композицією без стабілізатора завдяки зменшенню побічних продуктів етанерцепту, що утворюються внаслідок його денатурації під час зберігання. 2. Рідка композиція за п. 1, яка додатково містить один або більше стабілізаторів, вибраних з групи, що складається з лізину, гістидину і їх фармацевтично прийнятних солей. 3. Рідка композиція за п. 1, у якій стабілізатор є присутнім у кількості від 0,1 до 250 мМ. 4. Рідка композиція за п. 1, у якій етанерцепт є присутнім у кількості від 1 до 100 мг/мл. 5. Рідка композиція за п. 1, яка додатково містить одну або декілька речовин, вибраних з групи, що складається з буферу, ізотонічного агента, наповнювача або консерванта. 6. Рідка композиція за п. 5, у якій буфер вибраний з групи, що складається з цитрату, фосфату, сукцинату, тартрату, фумарату, глюконату, оксалату, лактату, ацетату, гістидину та Tris. 7. Рідка композиція за п. 5, у якій буфер є присутнім у кількості від 0,1 до 100 мМ. 8. Рідка композиція за п. 5, у якій ізотонічний агент вибраний з групи, що складається з хлориду натрію, хлориду калію, борної кислоти, борату натрію, маніту, гліцерину, пропіленгліколю, поліетиленгліколю, мальтози, сахарози, еритриту, арабіту, ксиліту, сорбіту та глюкози. 9. Рідка композиція за п. 5, у якій ізотонічний агент є присутнім у кількості від 1 до 1000 мМ. 10. Рідка композиція за п. 1, що містить від 1 до 100 мг/мл етанерцепту, від 0,1 до 250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, від 0,1 до 100 мМ фосфатного буферу та від 1 до 1000 мМ хлориду натрію. 11. Рідка композиція за п. 1, яка містить етанерцепт, метіонін і лізин як стабілізатор. 12. Рідка композиція за п. 1, яка містить етанерцепт, метіонін і гістидин як стабілізатор. 13. Рідка композиція за п. 2, яка містить від 1 до 100 мг/мл етанерцепту, від 0,1 до 250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0,1-250 мМ гістидину або його фармацевтично прийнятної солі, від 0,1 до 100 мМ фосфатного буферу та від 1 до 1000 мМ хлориду натрію. 14. Рідка композиція за п. 2, яка містить від 1 до 100 мг/мл етанерцепту, від 0,1 до 250 мМ метіоніну або його фармацевтично прийнятної солі, 0,1-250 мМ лізину або його фармацевтично прийнятної солі, від 0,1 до 100 мМ фосфатного буферу та від 1 до 1000 мМ хлориду натрію. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13