Кон’югат рекомбінантних поліпептидів-аналогів білків антигенів вірусу гепатиту с, мічених ферментом пероксидазою

Кон'югат рекомбінантних поліпептидіваналопв білків антигенів вірусу гепатиту С, мічених ферментом пероксидазою, що містить фермент пероксидаза, який відрізняється тим, що окислена перйодатом натрію пероксидаза з'єднується з рекомбінантними поліпептидами-аналогами білків вірусу гепатиту С - NS3, NS4, NS4-core, NS5 Винахід належить до імунохімії, біологи, охорони здоров'я та може бути використаний при створенні діагностичних тест-систем для визначення наявності специфічних антитіл усіх класів імуноглобулінів до вірусу гепатиту С у зразках сироваток та плазмі крові людини методом імуноферментного аналізу ВІДОМІ пероксидазні кон'югати, які містять специфічні або антивидові антитіла, а також білок А Staphylococcus aureus [1] В основу винаходу поставлено завдання створити високоефективні пероксидазні кон'югати, що містять рекомбінантні поліпептиди-аналоги антигенів вірусу гепатиту С, які можливо було б використати для створення діагностичних тестсистем з метою виявлення специфічних проти вірусу гепатиту С імуноглобулінів усіх класів методом імуноферментного аналізу Поставлене завдання вирішують шляхом кон'югації рекомбінантних поліпептидів-аналопв білків вірусу гепатиту С - NS3, NS4, NS5, NS4-core - з окисленою пероксидазою Приклад 1 Спосіб отримання кон'югату рекомбшантного поліпептиду Gag, що є аналогом білку-антигену вірусу гепатиту С, з пероксидазою Синтез кон'югату проводять за відомою методикою [2] До розчину пероксидази в 0,1 М ІЧаНСОз (рН 8,1) з концентрацією 10 - 20мг/мл додають однаковий об'єм 8 - ЗОмМ розчину перйодату натрію, витримують у темряві при 20°С 2 години і потім змішують з розчином рекомбінантного поліпептиду NS3 a6oNS5 у 0,1 М карбонат бікарбонатному буфері (рН 9,6) у співвідношенні 2М/1М, ВІДПОВІДНО Переносять суміш у хроматографічну колонку з закритим вихідним отвором, додають сухий сефадекс G-25 у КІЛЬКОСТІ 1/5 від загальної ваги суміші, закривають колонку і витримують у темряві при 19 - 22°С від 3 до 19 годин Потім проводять елюцію кон'югату згаданим буфером, блокують ВІЛЬНІ реактивні групи, додаючи розчин NaBH4 у 0,1 мМ NaOH з концентрацією 5мг/мл - спочатку 1/20 частину від об'єму кон'югату (ЗО хвилин при 0°С), а потім 3/20 від об'єму кон'югату (1 година при 0°С) Після цього діалізують кон'югат при 4°С проти 0,1М фосфатного буферу (рН 7,2) 20 - 24 години Додають стабілізатори і зберігають кон'югат у рідкому стані при 0- 10°С 6 МІСЯЦІВ Приклад 2 Спосіб отримання кон'югату рекомбінантного поліпептиду NS4-core або NS4, що є аналогами білків антигенів вірусу гепатиту С, з пероксидазою Всі процедури виконують аналогічно прикладові 1 Пропоновані кон'югати порівнювали з кон'югатом білку А з пероксидазою Порівнювали чутливість та специфічність визначення антитіл проти антигенів вірусу гепатиту С в сироватках та плазмі крові людини Досліджено вибірку з 750 реактивних сироваток та вибірку з 1300 сироваток, що включають набір негативних та потенційно хибно реактивних сироваток, які не містять антитіл до вірусу гепатиту С сироватки отримано від різних контингентів осіб - донорів, СО 1 Ю 57293 вагітних жінок, від осіб, хворих на туберкульоз, ревматоїдний артрит, гепатит В, ВІЛ, а також від онкологічних хворих Визначення проводили за відомою методикою [3] твердофазного імуноферментного аналізу Показано, що пропоновані кон'югати підвищують чутливість тест-системи до 99,8%, а специфічність - до 99,5% в порівнянні з ВІДПОВІДНИМИ показниками - 99,0% і 98,2% при застосуванні пероксидазного кон'югату, до складу якого входить білок А Таким чином, пропоновані кон'югати забезпечують більш надійне виявлення антитіл проти ВІЛ (незалежно від класу імуноглобулінів - Ig G, Ід А Комп'ютерна верстка М Клюкш або Ід М) в сироватці та плазми крові людини Використана література 1 Wilson М В & Nakane Р К In the "Immunofluorescence and Related Techniques" (Knapp W , Holubar K, Wick G, eds), Elsevier, Amsterdam/New-York, P 215-221 2 Tijssen P and Kurstak E Highly efficient and simple methods for the preparetion of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays Analyt Biochem 1984, vol 136, pp 451 - 457 3 A T Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" - М "Наука", 1981 Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна