Застосування інгібіторів вазопептидази при лікуванні нефропатії

1. Застосування сполуки формули (І) 2 для лікування і/або профілактики діабетичної нефропатії гломерулонефриту, гломерулярного склерозу, нефротичного синдрому, гіпертензивного нефросклерозу і термінальної стадії ниркової недостатності, або для лікування і/або профілактики резистентності до інсуліну або порушень обміну речовин, пов'язаних з кінцевими продуктами посиленого глікозилування, або для лікування і/або профілактики атеросклерозу і ендотеліальної дисфункції. 2. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (II) B1 B2 B1 O OR 2 , (І) де А = Н, C1-C8-алкіл, CH2ОСН2CH2OСН3, -(С1-С4алкіл)арил; R1 є водень, -СН2OС(O)С(СН3)3 або ацильна група; R2 є водень, -СН2OС(O)С(СН3)3; С1-С4-алкіл; арил; -(С1-С4-алкіл)арил або дифенілметил; Х є -(СH2)n, де n є цілим числом 0 або 1, -S-, -O-, R3 O -N- або -N H O R4 , де R3 є водень, С1-С4-алкіл, арил або арил(С 1-С4алкіл), і R4 є -СF3 , С1-С10-алкіл, арил або арил(С 1-С4-алкіл); B1 і В2 являють собою кожний незалежно водень, гідрокси, -OR5, де R5 є С1-С4-алкіл, арил або (С1С4-алкіл)арил або, де В1 і В2 приєднані до суміжних атомів вуглецю, В1 і В2 разом з вказаними суміжними атомами вуглецю, можуть утворювати бензольне кільце або метилендіоксигрупу, OH , (ІІ) і R1 є ацетил. 3. Застосування за п. 2, де R1 є водень. 4. Застосування за п. 2, де B1 і/або В2 є водень. 5. Застосування за п. 2, де Х є -СН2 . 6. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІ-А) O С (13) O OR2 O 82845 O SR 1 (11) N H X UA S R1 N X N SR 1 N H N O O , (II-A) де R1 є ацетил або водень. 7. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІ-В) (19) O A N H C2 B2 3 82845 4 13. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІІ-А) H O O S H N N H O O O N H OH (II-B). 8. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІ-С) SR 1 N O O OH , (III-A) де R1 є ацетил або водень. 14. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІІ-В) H O SH H N N H O O O OH (II-C). 9. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (III) B1 B2 O SR1 N H N N H S O O OH O (III-B). 15. Застосування за п. 1, де сполука формули (І) є сполукою формули (ІІІ-С) H X O O O N OR2 , (III) і R1 є ацетил. 10. Застосування за п. 9, де R1 є водень. 11. Застосування за п. 9, де В1 і/або В2 є водень. 12. Застосування за п. 9, де Х є -СН2. Застосування інгібіторів вазопептидази при лікуванні порушень обміну речовин, нефропатії і захворювань, пов'язаних з АСЕ. Ангіотензинперетворювальний фермент (АСЕ) є пептидилдипептидазою, яка каталізує конверсію ангіотензину І до ангіотензину II. Ангіотензин II є вазоконстриктором, який також стимулює секрецію альдостерону корковою речовиною надниркової залози. Інгібування АСЕ запобігає як конверсії ангіотензину І до ангіотензину II, так і метаболізму брадикініну, що приводить до зменшення концентрацій циркулюючого ангіотензину II, альдостерону і збільшенню концентрації циркулюючого брадикініну. У доповнення до даних нейрогормональних змін спостерігається зниження загального периферичного опору судин і кров'яного тиску, особливо у осіб з високими концентраціями реніну. Ін ші фармакологічні ефекти, пов'язані з інгібуванням АСЕ, включають в себе регресію гіпертрофії лівого шлуночка, полегшення клінічних симптомів серцевої недостатності і зниження рівня смертності у пацієнтів із застійною серцевою недостатністю (CHF) або дисфункцією лівого шлуночка після інфаркту міокарда. SH N H N O O OH (III-C). Нейтральна ендопептидаза (NEP) є ферментом, відповідальним за метаболізм передсердного натрійуретичного пептиду (ANP). Інгібування NEP приводить до збільшення концентрацій ANP, яке, в свою чергу, приводить до виведення натрію, діурезу і зменшення інтраваскулярного об'єму, венозного повернення або кров'яного тиску. ANP секретується міоцитами передсердя у відповідь на розтягнення передсердя або підвищений внутрішньосу динний об'єм. Було показано, що підвищені концентрації ANP в плазмі є потенційним компенсаторним механізмом при різних хворобливих станах, що включають застійну серцеву недостатність, ниркову недостатність, есенціальну гіпертензію і цироз. Секреція ANP міоцитами передсердя спричиняє розширення кровоносних судин, ді урез, виведення натрію і інгібування секреції реніну і секреції альдостерону. На відміну від цього, ангіотензин II приводить до звуження судин, реабсорбції натрію і води і виробленню альдостерону. Дві дані гормональні системи взаємодіють рівносильним і взаємоврівноважувальним чином для підтримки нормальної фізіологічної судинної і гемодинамічної відповідей. 5 82845 6 У [патенті США 5430145, Європейському патенті EP 481522 і міжнародній заявці РСТ/ЕР 02/03668] розкриті трициклічні похідні меркаптоацетиламіду формули (І), корисні як інгібітори АСЕ і NEP, тобто для лікування і/або профілактики серцевої недостатності і гіпертензії. Даний винахід відноситься до застосування сполуки формули (І) де A = H, С1-С8-алкіл, CH2OCH2CH2OCH3, -(С1-С4алкіл) арил; R1 являє собою водень, -СН2ОС(О)С(СН3)3 або ацильну груп у; R2 являє собою водень, -СН2ОС(О)С(СН3)3; С1-С4-алкіл; арил; -(C1-C4-алкіл)арил; або дифенілметил; X являє собою -(СН2)п, де n є цілим числом 0 або 1, -S-, -О-, де R3 являє собою водень, С1-С4-алкіл, арил або арил (С1-С4-алкіл) і R4 являє собою -CF3, С1С4-алкіл, арил або арил (С1-С4-алкіл); B1 і B2 являють собою кожний незалежно водень, гідрокси, -OR5, де R5 являє собою С1-С4алкіл, арил або (С1-С4-алкіл) арил або, де B1 і B2 приєднані до суміжних атомів вуглецю, B 1 і B2 , разом з вказаними суміжними атомами вуглецю, можуть утворювати бензольне кільце або метилемдіоксигрупу, для лікування і/або профілактики нефропатії у пацієнтів, страждаючих або не страждаючих діабетом, включаючи діабетичну і недіабетичну нефропатію, гломерулонефрит, гломерулярний склероз, нефротичний синдром, гіпертензивний нефросклероз, мікроальбумінурію або термінальну ниркову недостатність, або до способу лікування і/або профілактики резистентності до інсуліну або порушень обміну речовин, пов'язаного з кінцевими продуктами посиленого глікозилювання, діабетичними ускладненнями, такими як діабетична нейропатія, діабетична нефропатія, діабетична ретинопатія, катаракти, інфаркт міокарда і/або діабетична кардіоміопатія, або до способу лікування і/або профілактики атеросклерозу або ендотеліальної дисфункції. Відповідно до ще одного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (II), яке відрізняється сполукою формули (II) де R1 являє собою ацетил. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (II), де R1 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (II), де R2 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (II), де B 1 і/або B2 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (II), де X являє собою -CH2. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (І), яке відрізняється сполукою формули (II-А): де Rj являє собою ацетил або водень. Структура переважних сполук формули (H-A) представлена формулою (H-B), також названою як сполука (H-B) або сполука (H-B), і формулою (HC), приведеними нижче: У наступному втіленні даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (І), яке відрізняється сполукою формули (III) 7 82845 де R1 являє собою ацетил. Відповідно до іншого втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (III), де R1 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (III), де R2 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (III), де Bi і/або B2 являє собою водень. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (III), де X являє собою -CH2. Відповідно до наступного втілення даний винахід відноситься до вказаного вище застосування сполуки формули (І), яке відрізняється сполукою формули (III-А): де R1 являє собою ацетил або водень. Структура переважних сполук формули (HI-A) представлена формулами (III-B) і (ІП-С), приведеними нижче: Використаний тут термін «С1-С4-алкіл» відноситься до насиченого лінійного або розгалуженого одновалентного вуглеводневого ланцюга з одного, двох, трьох або чотирьох атомів вуглецю і включає метил, етил, пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, трет-бутил і подібні групи. Термін «С1-С10-алкіл» відноситься до насиченого лінійного або розгалуженого одновалентного вуглеводневого ланцюга з 8 одного-десяти атомів вуглецю і включає метил, етил, пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, третбутил, пентил, ізопентил, гексил, 2,3-диметил-2бутил, гептил, 2,2-диметил-3-пентил, 2-метил-2гексил, октил, 4-метил-3-гептил і подібні групи. Використаний тут термін «С1-С4-алкокси» відноситься до одновалентного замісника, який складається з лінійного або розгалуженого алкільного ланцюга, що має від 1 до 4 атомів вуглецю, зв'язаних через ефірний кисень і що мають вільну валентність біля ефірного кисню, і включає метокси, етокси, пропокси, ізопропокси, бутокси, вторбутокси, трет-бутокси і подібні групи. Використаний тут термін «арил» відноситься до фенільної або нафтильної групи, незаміщеної або заміщеної одним-трьома замісниками, вибраними з групи, що складається з метилендіокси, гідрокси, С1-С4-алкокси, фтору і хлору. Термін «(С1-С4-алкіл)арил» включає фенілметил (бензил), феніл етил, п-метоксибензил, п-фторбензил і пхлорбензил. Використаний тут термін «галоген» або «Hal» відноситься до сімейства фтор у, хлору, брому або йоду. Використаний тут термін «ацильна група» відноситься до аліфатичних або ароматичних ацильних гр уп і даних похідних від ге тероциклічних сполук. Наприклад, ацильна група може бути нижчою або (С1-С4) алканоїльною групою, такою як формільна або ацетильна, ароїльна група, така як бензоїльна або гетероциклічна ацильна група, що включає один або більше гетероатомів O, N і S, така як група Використаний тут термін «стереоізомер» є головним терміном, що використовується для всіх ізомерів окремих молекул, які відрізняються тільки орієнтацією їх атомів в просторі. Термін стереоізомер включає ізомери, що є дзеркальними відображеннями один одного, (енантіомери), геометричні (цис/транс або E/Z) ізомери і ізомери сполук з більш ніж одним хіральним центром, які не є дзеркальними відображеннями один одного (діастереомери). Використані тут «R» і «S» використовуються як широко використовувані в органічній хімії для позначення конкретних конфігурацій хірального центра. Термін «R» (rectus) відноситься до такої конфігурації хірального центра, при якій падіння старшинства груп відбувається за годинниковою стрілкою (від старшої до другої молодшої), якщо дивитися вздовж напряму зв'язку з молодшою групою. Термін «S» (sinister) відноситься до такої конфігурації хірального центра, при якій падіння старшинства гр уп відбувається проти годинникової (від старшої до др угої молодшої) стрілка, якщо дивитися вздовж напряму зв'язку з молодшою групою. Старшинство груп визначається на основі послідовних правил, де визначення пріоритету проводиться на основі атомного номера (в порядку збільшення атомного номера). Перелік і обговорення пріоритетів знаходиться в [Stereochemistry 9 82845 of Organic Compound, Ernest L. EHeI, Samuel H. Wilen and Lewis N. Mander, editors, WileyInterscience, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994]. У доповнення до (R)-(S) системи, для позначення абсолютної конфігурації також тут може бути використана стара D-L система, особливо по відношенню до амінокислот. У даній системі проекція Фішера орієнтована так, що вуглець номер 1 головного ланцюга знаходиться зверху. Префікс «D» використовується для позначення абсолютної конфігурації ізомеру, в якому функціональна (що визначає) група знаходиться з правого боку від вуглецю хірального центра і «L» такий ізомер, в якому він з лівого боку. Використані тут терміни «лікувати» або «лікування» означають будь-яке лікування, включаючи, але не обмежуючись ними, полегшення симптомів або повне або тимчасове усунення причини симптомів, або запобігання або сповільнення появи симптомів і прогресування згаданого захворювання, розладу або стану. Описаний тут термін «пацієнт» відноситься до теплокровних тварин, таких як ссавці, які страждають певним захворюванням, розладом або станом. Очевидно, що свині, собаки, кішки, щури, миші, коні, велика рогата худоба, вівці і люди, страждаючі дракункульозом, є прикладами тварин, позначених за допомогою даного терміну. Використаний тут термін «фармацевтично прийнятна сіль» застосовується до будь-якої солі, або раніше відомої або такої, яка буде відкрита в майбутньому, яка використовується фахівцями в даній галузі і є нетоксичною органічною або неорганічною адитивною сіллю, прийнятною для застосування як фармацевтична. Ілюстративні основи, які утворюють відповідні солі, включають гідроксиди лужних або лужноземельних металів, таких як натрій, калій, кальцій або магній; аміак і аліфатичні, циклічні або ароматичні аміни, такі як метиламін, диметиламін, триетиламін, діетиламін, ізопропілдіетиламін, піридин і піколін. Ілюстративні кислоти, які утворюють прийнятні солі, включають неорганічні кислоти, такі як, наприклад, хлористоводнева, бромистоводнева, сірчана, фосфорна і подібні кислоти, і органічні карбонові кислоти, такі як, наприклад, оцтова, пропіонова, гліколева, молочна, піровиноградна, малонова, янтарна, фумарова, яблучна, винна, лимонна, аскорбінова, малеїнова, гідроксималеїнова і дигідроксималеїнова, бензойна, фенілоцтова, 4-амінобензойна, 4гідроксибензойна, антранілова, корична, саліцилова, 4-аміносаліцилова, 2-феноксибензойна, 2ацетоксибензойна, мигдалева і подібні кислоти, і органічні сульфонові кислоти, такі як метансульфонова і п-толуолсульфонова кислоти. Використаний тут термін «фармацевтичний носій» відноситься до відомих фармацевтичних ексципієнтів, застосовних для приготування композицій фармацевтично активних сполук для введення, і які є істотно не токсичними і не сенсибілізуючими в умовах застосування. Точне співвідношення даних ексципієнтів визначається розчинністю і хімічними властивостями активної 10 сполуки, вибраним способом введення, так само як і стандартним фармацевтичним застосуванням. Композиції сполуки формули (І) даного винаходу можуть бути введені суб'єкту, потребуючому лікування, різними загальноприйнятими способами введення, включаючи пероральний, місцевий, парентеральний, наприклад, внутрішньовенний, підшкірний або інтрамедулярний. Надалі активні композиції даного винаходу можуть бути введені інтраназально, у вигляді ректального супозиторію або з використанням складу швидкої дії, тобто лікарського засобу, що розчиняється у роті без необхідності використання води. Активні композиції даного винаходу можуть бути введені окремо або в поєднанні з фармацевтично прийнятними носіями, розчинниками або розріджувачами, одиничними або багаторазовими дозами. Прийнятні фармацевтичні носії, розчинники і розріджувачі включають інертні тверді розріджувачі або наповнювачі, стерильні водні розчини і різні органічні розчинники. Фармацевтичні композиції, що отримуються змішуванням активних композицій даного винаходу і фармацевтично прийнятних носіїв, розчинників або розріджувачів, потім легко вводять в різних дозованих формах, таких як таблетки, порошки, пастилки, сиропи, розчини для ін'єкції і тому подібне. Дані фармацевтичні композиції при бажанні можуть містити додаткові інгредієнти, такі як ароматизатори, зв'язуючі речовини, ексціпієнти і тому подібне. Таким чином, для перорального введення можуть бути використані таблетки, що містять різні ексціпієнти, такі як цитрат натрію, карбонат кальцію і фосфат кальцію, нарівні з різними розпушувачами, такими як крохмаль, альгінова кислота і певні складні силікати, разом із зв'язуючими агентами, такими як полівінілпіролідон, сахароза, желатин і камедь. Додатково, пом'якшувальні агенти, такі як стеарат магнію, лаурилсульфат натрію і тальк, часто є корисними для таблетування. Тверді композиції подібного типу можуть також бути використані як наповнювачі в м'яких і твердих заповнених желатинових капсулах. Переважні матеріали для цього включають лактозу або молочний цукор і поліетиленгліколь високої молекулярної маси. Якщо для перорального введення необхідні водні суспензії або еліксири, то основний активний інгредієнт в них може бути об'єднаний з різними підсолоджувальними речовинами або ароматизуючими агентами, барвниками або забарвлювальними речовинами і, за бажанням, емульгуючими або суспендуючими агентами, разом з розріджувачами, такими як вода, етанол, пропіленгліколь, гліцерин і їх комбінації. Для парентерального введення можуть бути використані розчини активної композиції даного винаходу в кунжутній або арахісовій олії, водному пропіленгліколі або стерильні водні розчини. Такі водні розчини повинні бути відповідним чином забуферені при необхідності, а рідкий розріджувач спочатку зроблений ізотонічним достатньою кількістю солей або глюкози. Дані окремі водні розчини особливо підходять для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного і внутрішньочеревинного введення. У зв'язку з цим стерильні водні 11 82845 середовища, що використовуються, можуть бути легко приготовані за допомогою стандартних методик, відомих фахівцям в даній галузі. У основному, композицію даного винаходу вводять перорально, парентерально (наприклад, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно або інтрамедулярно) або місцево. Для інтраназального ведення або введення інгаляцією одну або більше сполук винаходу зручно вводити в формі розчину або суспензії з балончика розбризкувача, який впорскується або нагнітається пацієнтом, або як аерозольний струмінь, що випускається з балончика, який знаходиться під тиском, або розпилювача з використанням відповідного газу-витісника, наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану, діоксиду вуглецю або інших прийнятних газів. У випадку аерозолю, що знаходиться під тиском, дозована форма може бути визначена за допомогою постачання клапаном длядоставки відміряної кількості. Балончик, що знаходиться під тиском, або розпилювач може містити розчин або суспензію активної сполуки. Можуть бути приготовані капсули і касети (виготовлені, наприклад, з желатину) для використання в інгаляторах або інсуфляторах, що містять порошок суміші сполуки винаходу і прийнятної порошкової основи, такий як лактоза або крохмаль. Для трансдермального (наприклад, місцевого) введення отримують розбавлені стерильні, водні або частково водні розчини (звичайно в концентрації від 0,1% до 5%), в іншому випадку подібні до перерахованих ви ще розчинів для парентерального введення. Способи отримання різних фармацевтичних композицій з певною кількістю активного інгредієнта відомі або стануть очевидні, в світлі даного розкриття, фа хівцям в даній галузі. Наприклад, способи отримання фармацевтичних композицій див. в [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995)]. Нефропатія Нефропатія є хронічним захворюванням, яке визначається як аномальна екскреція альбуміну з сечею у пацієнтів, страждаючих або не страждаючих діабетом. Норми екскреції альбуміну з сечею у здорових людей менші або дорівнюють 40 мг/24 години. Клінічними стадіями нефропатії є мікроальбумінурія, клінічна нефропатія (альбумінурія) і термінальна ниркова недостатність (ESRD). Поширеною формою нефропатії є діабетична нефропатія. Діабетична нефропатія розвивається у 35-40% пацієнтів, страждаючих цукровим діабетом 1 типу, і у 10-60% пацієнтів, страждаючих цукровим діабетом 2 типу, в залежності від етнічної групи, яка вивчається, і є найбільш поширеною причиною термінальної ниркової недостатності в Сполучених Штата х. Прийнято вважати, що діабе 12 тична нефропатія є результатом гіперглікемії або окремо, або в поєднанні з іншими чинниками, такими як гіпертонія і генетична схильність до ниркових захворювань. Було показано, що відповідна антигіпертензивна терапія істотно знижує рівень смертності при нирковій і можливій серцевосудинній недостатності у пацієнтів, страждаючих цукровим діабетом 1 типу з протеїнуричною стадією діабетичної нефропатії, так само як сповільнює темп зниження швидкості клубочкової фільтрації у деяких пацієнтів з порушеною функцією нирок [Lewis et al., N. Engl. J. Med. 1993, 329, 1456-1462]. Таким чином, звичайний догляд за пацієнтами з діабетичною нефропатією полягає в інтенсивному глікемічному контролі і нормалізації кров'яного тиску з використанням переважно інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту (АСЕ), такого як раміприл. Було показано, що деякі інгібітори вазопептидази виявляють більшу нефропротективну дію, ніж інгібітори АСЕ окремо [Molinaro et al., Сшт. Оріп. Pharmacol. 2002, 2, 131-141], такі як омапатрилат, як один з відкритих раніше і найширше вивчений інгібітор вазопептидази. Chen et al [Hypertension 2001, 38, 187-191] визначили ниркову дію екстреного лікування омапатрилатом і інгібітором АСЕ фозиноприлатом, де омапатрилат показав більшу натрійуретичну відповідь, ніж інгібітор АСЕ. У іншій роботі інгібітор вазопептидази CGS 30440 [Novartis, Switzerland] виявив більший нирковий захисний ефект, ніж інгібітор АСЕ беназеприл [Cohen et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 32, 87-95]. Було показано, що інгібітори вазопептидази формули (І) володіють великою нефропротективною дією на швидкість екскреції сечового альбуміну і, отже, є корисними при лікуванні і/або профілактиці нефропатії у пацієнтів, страждаючих і не страждаючих діабетом, включаючи діабетичну нефропатію, гломерулонефрит, гломерулярний склероз, нефротичний синдром, гіпертензивний нефросклероз, мікроальбумінурію і термінальну ниркову недостатність. Ефект сполуки (П-В) в 6-8 разів вищий, ніж такий, що спостерігається, в інгібітора АСЕ раміприлу. Приклад 1: Полегшення протеїнурії лікуванням сполукою формули (H-B) Екскрецію білка і креатиніну визначають в сечі самців щурів лінії Zuker з ожирінням (ZDF Gmi fa/fa) і гетерозиготних контрольних тварин (ZDF Gmi-/+) у віці 10, 17, 27 і 37 тижнів. Наступним групам діабетичних щурів постійно дають або раміприл (1 мг/кг/день, питна вода), або сполуку формули (H-B) (30 мг/кг/день, їжа) протягом періоду від 10 до 37 тижнів. Тварин вбивають через 37 тижнів і їх нирки досліджують гістологічно. 13 82845 14 Таблиця 1 Сечова екскреція альбуміну і креатину у щурів з ожирінням і без ожиріння, підданих дії раміприлу або сполуки формули (H-B) Сечова екскреція Тижні Група 1 з ожирінням Середнє S COC N Група 2 без ожиріння середнє S COC N Критерій Стьюдента Група 4 Раміприл середнє s COC N Критерій Стьюдента Група 7 спол. (ІІ-В) середнє S COC N Критерій Стьюдента Альбумін мг/кг/год 17 0 7 0,35 0,24 0,06 15 1,78 1,09 0,28 15 9,24 6,70 2,02 11 14,23 7,69 2,32 11 55,27 41,58 10,74 15 404,78 349,65 90,28 15 975,60 714,38 215,40 11 1543,25 819,04 246,95 11 0,121 0,041 0,009 20 0,090 0,069 0,015 20 0,070 0,033 0,008 16 0,079 0,051 0,014 13 -' 12,828 4,206 0,940 20 9,573 6,010 1,344 20 5,754 2,772 0,693 16 7,313 4,541 1,260 13 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,24 0,12 0,03 15 0,122 1,36 1,28 0,33 15 0,338 6,26 4,71 1,42 11 0,242 10,11 7,20 2,17 11 0,209 37,31 17,20 4,44 15 0,133 207,35 198,42 51,23 15 0,067 694,20 510,20 153,83 11 0,300 1077,88 742,86 223,98 11 0,178 0,27 0,18 0,05 15 0,293 0,09 0,04 0,01 15 0,000 0,41 0,18 0,05 11 0,000 1,39 1,67 0,50 11 0,000 48,56 28,69 7,41 15 0,611 14,30 5,38 1,39 15 0,000 44,63 16,47 4,97 11 0,000 152,71 174,93 52,74 11 0,000 Гістологічні результати; У прикладеній таблиці перерахований короткий опис отриманих даних по нирках після 6-ти C1: Контроль С2: Контроль D1: Раміприл D4: спол. (ІІ-В) Отримані гістологічні результати тут: 27 0 Альбумін/Креатин мг/ммоль 7 17 27 місячного періоду лікування. Групами, що вивчаються, були: щури лінії Zuker з ожирінням щури лінії Zukeip з ожирінням щури лінії Zuker з ожирінням 1,0мг/кі щури лінії Zuker з ожирінням 30мг/кг приведені - клітини Арманні-Ебпггейна в ниркових канальцях, що свідчать про діабетичний стан обміну речовин. - Гломерулосклероз що свідчить про хронічне ураження нирки внаслідок діабетичного стану обміну речовин. - Атрофія: канадець загальна, спонтанна, дегенеративна лезія нирок. - Циліндри: каналець загальна, спонтанна лезія-нирок. - Розширення: ниркова загальна, спонтанна лезія нирок, що миска розглядається, як спадкова аномалія, що розвивається Клітини Арманні-Ебштейна не були присутнім у контрольних щурів лінії Zuker без ожиріння, але були присутнім у кожної групи оброблених щурів лінії Zuker з ожирінням. Гломерулосклероз не був знайдений у контрольних щурів лінії Zuker без ожиріння і також не був присутнім у тварин, підданих дії сполуки (ІІ-В). Відповідно, дегенеративні лезії, атрофія канальців і циліндри канальцевого походження були знайдені в невеликих кількостях у даних тваринних. У порівнянні з контрольним щурами лінії Zuker з ожирінням, підданих дії Раміприлу або MDL 100,240 не було відмінностей в частоті виникнення гломерулосклерозу або супутніх дегенеративних лезій. Дані результати показують, що лікування сполукою (ІІ-В) може запобігти розвитку «діабетичного» гломерулосклерозу і супутні х дегенератив 15 82845 них лезій. Лезії у контрольних щурів лінії Zuker з ожирінням були присутнім з досить низькою мірою тяжкості. Крім того, висока частота виникнення розширення ниркової миски була відмічена у тварин, підданих дії сполуки (ІІ-В). 16 Умовні позначення Умовні позначення, що використовуються для тварин: KO = Група, в якій тварин умертвляли після закінчення повного терміну дослідження Таблиця 2 Отримані гістологічні результати Кількість тварин з даними мікроскопічного дослідження по органу/гр упі/статі Результати розтину: Група, в якій тварин терміну дослідження (KO) умертвляли після закінчення повного Стать Група по дозі Самці C1 С2 D1 D4 Кількість тварин на групу по дозі 12 6 9 9 Нирки Кількість вивчених 12 6 9 8 клітини Арманні-Ебштейна 7 8 Гломерулосклероз 6 6 1 Атрофія: нирковий канадець 6 9 2 Циліндри: нирковий канадець 1 6 8 3 Розширення: ниркова миска 3 2 5 7 Сумарна захворюваність по органу /гр упі/статі Результати розтину: Група, в якій тварин умертвляли після закінчення повного терміну дослідження (KO) Стать Самці Група по дозі C1 С2 D1 D4 Кількість тварин на групу по дозі 12 6 9 9 Нирки Кількість вивчених 12 6 9 8 клітини Арманні-Ебштейна Міра 1 2 1 Міра 2 3 6 5 Міра3 1 3 загальна кількість уражених 6 7 8 Середня тяжкість 1,8 1,9 2,4 Гломерулосклероз Міра 1 1 1 Міра 2 3 4 Міра3 2 2 1 загальна кількість уражених 6 6 1 Середня тяжкість 2,2 2,3 1,0 Атрофія: нирковий канадець Міра 1 2 4 1 Міра 2 2 4 Міра 3 1 1 1 Міра 4 1 загальна кількість уражених 6 9 2 Середня тяжкість 2,2 1,7 2,0 Циліндри: нирковий канадець Міра 1 1 1 1 2 Міра 2 4 7 1 Міра3 1 загальна кількість уражених 1 6 8 3 Середня тяжкість 1,0 2,0 1,9 1,3 Розширення: ниркова миска Міра 2 3 1 1 Міра3 1 2 5 Міра 4 1 2 1 загальна кількість уражених 3 2 5 7 Середня тяжкість 2,0 3,5 3,2 3,0 17 82845 18 Таблиця 3 Сечова екскреція альбуміну і креатину у щурів лінії Zuker з ожирінням (ZDF), підданих дії раміприлу і щурів, підданих дії сполуки формули (H-B), початому у віці тварини 6 місяців. Щури лінії Zuker з ожирінням є моделлю діабету II типу мг/ммоль Базальний Плацебо Щури ZDF середнє s COC N Сполука (H-B) Щури ZDF середнє s COC N Раміприл Щури ZDF середнє s COC N Альбумін/Креатин 6 тижнів лікування 12 тижнів лікування 1330,99 797,55 230,23 12 1068,25 778,81 224,82 12 1193,47 633,10 182,76 12 1330,99 797,55 230,23 12 135,08 40,28 11,63 12 100,86 59,27 17,11 12 1330,99 797,55 230,23 1249,59 1036,03 299,07 12 841,69 1124,24 324,54 12 Приклад 2: Визначають екскрецію альбуміну і креатину у щурів Goto-Kakizaki (GK). Щури GK є моделлю діабету II типу. Одн у гр упу не піддають дії препа рату, одн у гр упу піддають дії інгібітору ACE/NEP формули (H-B) і одну групу піддають дії інгібітору АСЕ раміприлу. Таблиця 4 Сечова екскреція альбуміну і креатину у щурів GK, підданих дії раміприлу і щурів, підданих дії сполуки формули (H-B), початому у віці тварини 6 місяців Назальний Плацебо Щури GK середнє s COC N Сполука (H-B) Щури GK середнє s COC N Раміприл Щури GK середнє s COC N Альбумін/Креатин мг/ммоль 6 тижнів лікування 12 тижнів лікування 103,95 71,42 20,62 12 329,37 230,17 66,44 12 1183,19 637,71 184,09 12 103,95 71,42 20,62 12 17,70 6,01 1,74 12 24,28 14,41 4,16 12 103,95 71,42 20,62 12 161,71 112,42 32,5 12 244,89 146,00 44,0 11 Приклад 3: Визначають екскрецію альбуміну ч креатину у щурів лінії Wistar. Одну групу не піддають дії препарату, одну груп у піддають дії інгібітору ACE/NEP формули (H-B) і одну групу піддають дії інгібітору АСЕ раміприлу. Щури лінії Wistar є недіабетичними, і у них розвивається протеїнурія і структурні пошкодження нирок в період зрілості. Щури лінії Wistar, таким чином, є моделлю недіабетичної нефропатії. На Фіг.1 показана вікова недіабетична нефропатія у щурів лінії Wistar, підданих дії плацебо (нирка щура, піддана дії плацебо, що демонструє зниження канальцевих внутрішньотканинних лезій (білкові циліндри в канальцях, інфільтрація клітини запалення, базофільні канальці)). 19 82845 20 Таблиця 5 Сечова екскреція альбуміну і креатину у щурів лінії Wistar, підданих дії раміприлу і щурів, підданих дії сполуки формули (H-B), початому у віці тварини 6 місяців Базальний Плацебо Щури Wistar середнє S COC N Сполука (H-B) Щури Wistar середнє S COC N Раміприл Щури Wistar середнє S COC N Альбумін/Креатин мг/ммоль 6 тижнів лікування 12 тижнів лікування 130,45 285,53 90,29 10 149,82 231,12 64,10 13 290,10 265,69 73,69 13 130,45 285,53 90,29 10 18,07 17,64 4,89 13 21,21 29,49 8,18 13 130,45 285,53 90,29 10 184,27 171,87 149,62 12 188,40 146,47 42,28 12 На недіабетичній моделі сполука формули (ПВ) виявляє значно більшу нефропротективну дію, ніж раміприл, як визначено за допомогою тривалості протеїнурії. Вікові захворювання Інкубація білків або ліпідів з альдозами приводить до неферментативного глікозилювання і окислення аміногруп білків до адуктів Амадорі. Через деякий час адукти зазнають додаткового перегрупування, дегідратацій і перехресного зшиття з іншими білками з утворенням комплексів, відомих як кінцеві продукти посиленого глікозилювання (АСЕ). Утворення АСЕ може бути також описане як реакції Майяра (Maillard). Чинники, які спричиняють утворення АСЕ, включають сповільнення білкового обміну (наприклад, як у амілоїдоз), накопичення макромолекул з високим вмістом лізину і високий рівень глюкози в крові (наприклад, як при діабеті) [Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)]. Під АСЕ мають на увазі різні розлади, включаючи ускладнення, пов'язані з діабетом і звичайним старінням. АСЕ виявляють специфічне і насичуване зв'язування з рецепторами клітинної поверхні ендотеліальних клітин мікроциркуляторного русла, моноцитів і макрофагів, гладком'язових клітин, мезангіальних клітин і нейронів. Рецептор кінцевих продуктів посиленого глікозилування (RAGE) є членом суперсімейства імуноглобулінів молекул, розташованих на клітинній поверхні. Підвищені рівні RAGE виявлені в старіючих тканинах [Schleicher et al., J. СИп. Invest. 1997, 99, 457-468], і в ретині, судинній мережі і нирці при діабеті [Schmidt et al., Nature Med. 1995, 10021004]. Активація RAGE в різних тканинах і органах приводить до ряду патофізіологічних наслідків. RAGE був залучений до різних станів, включаючи: гостре і хронічне роздратування [Hofmann et al., Cell 1999, 97, 889-901], розвиток ускладнень після діабету, таких як підвищена проникність судин, нефропатія, атеросклероз і ретинопатія, шляхом накопичення АСЕ в нирках і інших тканинах [Singh et al., Diabetologia 2001, 44, 129-146], так само як хвороба Альцгеймера [Yan et. al., Nature 1996, 382, 685-691], еректильна дисфункція, утворення пухлин і метастазування [Taguchi et al., Nature 2000, 405, 354-357]. Відомо, що інгібітор раміприл впливає:- на рівні кінцевих продуктів посиленого глікозилування в сироватці, приводячи до високого ризику для хворих ішемічною хворобою серця: результати з роботи HOPE [B. Kihovd, E.M. Hjerkinn, I. Seljeflot, TJ. Berg, A.A. Reikvam]. Тут було виявлено, що сполуки формули (І) значно знижують накопичення АСЕ в нирках і серці. Таким чином, сполуки формули (І) корисні для профілактики і/або лікування порушень обміну речовин, пов'язаної з кінцевими продуктами посиленого глікозилування, особливо діабетичних ускладнень, таких як діабетична нейропатія, діабетична нефропатія, діабетична ретинопатія, інфаркт міокарда, катаракти і діабетична кардіоміопатія. Кількість АСЕ в нирках була визначена за допомогою дот-блот-аналізу [Stracke et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabets 2002, 109, 330-336] і високоефективної рідинної хроматографії в обернених фазах або ОФ-ВЕРХ [Drusch et al., Food Chera. 1999, 65, 547-553]. Лікування діабетичних щурів сполукою формули (H-B) нормалізує кількості АСЕ (CML) в нирках, лікування М100,240 значно знижує кількість CML. Приклад 4: дот-блот-аналіз Зразки нирок для дот-блот-аналізу отримують у самців щурів лінії Zuker з ожирінням у віці 17 тижнів, контрольних щурів і щурів лінії Zuker з ожирінням, що піддаються дії 30мг/кг/день сполуки (H 21 82845 B) і 35мг/кг/день MDL 100,240 протягом семи тижнів. Умертвляють трьох тварин з кожної групи, нирки витягують і негайно заморожують в рідкому азоті. Подрібнення нирок проводять в рідкому азоті з використанням млина з охолоджуванням (Freezer 6750, СЗ Analysetechnik GmbH). 10мг зразка нирок розчиняють в 1мл сольових фосфатних буфери (СФБ, що містить 0,5г/л твін 20, 0,5мМ PMSF, 1мкг/мл). Розчин піддають дії ультразвукового дезінтегратора клітин (потужність 45%, Bandolin Sonoplus HD 2070) два рази по п'ять секунд, центрифугують 20 хвилин при 4000об./хв. і супернатант використовують для дот-блотаналізу. Нітроцелюлозну мембрану вміщують в пристрій для дот-блот-аналізу і добре промивають два рази 100мкл TBS. Кожний зразок, що містить 10мкг білки (концентрацію білка в зразку визначають з допомогою DC Protein assay, Bio Rad), розводять в 100мкл TBS і наносять на нітроцелюлозну мембрану (Amersham). Мембрану інкубують протягом ночі в TBST (20мМ Tris, 137мМ NaCl, 22 0,05%-об./об. твин 20) із 5% знежиреним сухим молоком при 4°C і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з використанням наступних концентрацій антитіл: анти-CML 011 (Biologo) 0,25мкг/мл, анти-CEL (Biologo) 0,25мкг/мл і антипентозидин 012 (Biologo) 0,25мкг/мл. Після тривалого промивання в TBST із 5% знежиреним сухим молоком мембрани обробляють антимишачими IgG антитілами, міченими лужною пероксидазою, (Dianova) протягом однієї години при кімнатній температурі. Мембрани промивають знов і піддають дії посиленої хемофлуоресціюючої системи детекції (Amersham), згідно з інструкціями виробника. Відносну флуоресценцію визначають з допомогою Fluor-Imager 595 (Molecular Dynamics) і кількісно визначають з використанням програмного забезпечення Image-Quant. Результати виражають як відносну флуоресценцію (rf), помножену на 105. Таблиця 6 Величини АСЕ-субтипів CML в нирці щурів лінії Zuker з ожирінням у віці 17 тижнів, контрольних щурів і щурів лінії Zuker з ожирінням, підданих дії сполуки (II-B) або MDL 100,240 Нирки щурів анти-CML 011 у віці 17 тижнів Без ожиріння контроль Щури ZDF ZDF спол. (H-B) ZDF MDL 100,240 n 3 3 3 3 середнє tf* 105 32,20 45,14 32,62 38,67 COC rf*105 1,22 3,23 0,34 1,38 Критерій Стьюдента прим. 0,0199 0,0182 0,1389 * * Таблиця 7 Величини АСЕ-субтипів CEL в нирці щурів лінії Zuker з ожирінням у віці 17 тижнів, контрольних щурів і щурів лінії Zuker з ожирінням, підданих дії сполуки (H-B) або MDL 100,240 Нирки щурів анти-CEL віком 17 тижнів n Без ожиріння контроль Щури ZDF ZDF спол. (H-B) ZDF MDL 100,240 3 3 3 3 cереднє rf*105 54,49 61,30 50,24 52,60 COC rf*105 2,55 1,12 0,46 1,16 Таблиця 8 Величини АСЕ-субтипів пентозидину в нирці щурів лінії Zuker з ожирінням у віці 17 тижнів, контрольних щурів і щурів лінії Zuker з ожирінням, підданих дії сполуки (П-В) або MDL 100,240 Нирки щурів анти-пентозидин 012 віком 17 тижнів N Без ожиріння контроль Щури ZDF ZDF спол. (H-B) ZDF MDL 100,240 3 3 3 3 Величини АСЕ-субтипів CML значно вищі в нирках щурів лінії Zuker з ожирінням в порівнянні з контрольними щурами (Р