Спосіб скринінгу резистентності латуку до фізіологічних розладів

Реферат Винахід належить до способу скринінгу популяції рослин на предмет наявності у тій таких рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, порівняно із контрольною рослиною, де популяцію насіння пророщують у темряві у присутності етилену з одержанням розсади, яку, якщо вона має гіпокотилі більш довгі, ніж гіпокотилі вихідного етилен-чутливого контролю в атмосфері етилену, добирають як рослини, що проявляють знижену чутливість до дії етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння. Винахід також належить до рослин, відібраних таким чином. UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способу скринінгу популяції рослин на предмет наявності серед них таких, що мають змінену реакцію на вплив етилену. Даний винахід додатково стосується рослин та частин рослин, особливо листових овочів, ідентифікованих таким чином. Більш конкретно, даний винахід стосується латуку (Lactuca sativa L), що проявляє змінену реакцію на вплив етилену, що призводить до зниженої чутливості цих видів сільськогосподарських рослин до таких фізіологічних розладів, як іржа та пожовтіння. Даний винахід також стосується насіння цих рослин та частин рослин. Розмноження листових овочів, таких, як латук, направлено на продукування комерційних сортів, оптимально адоптованих для одержання ринкової продукції. Протягом селекції до уваги має бути прийнято велику кількість характеристик, що відносяться як до вхідних та вихідних характеристик. Одна з найбільш важливих характеристик для цього стосується збереження якості після збору врожаю, зокрема, терміну зберігання. Уникнення фізіологічних розладів, більш конкретно, іржі та пожовтіння, є важливими елементами, що можуть продовжити термін зберігання врожаю латуку або його частин. Етилен є рослинним гормоном, що, як відомо, стимулює фізіологічні процеси, що відносяться до старіння. У латуку таке стимулювання стає очевидним завдяки прояві таких симптомів, як іржа та пожовтіння. Іржа як розлад характеризується виникненням бурих плям уздовж головної жилки листя, тоді як пожовтіння є загальним знебарвленням листя, що відбувається протягом процесу старіння як наслідок розкладання хлорофілів. Хоча відомо, що зрілі качани латуку виробляють тільки незначні кількості етилену, рослини є високочутливими до цього рослинного гормону. Тому, фізіологічні розлади, пов'язані із чутливістю до етилену, що знижують якість латуку після збору врожаю, головним чином, викликані зовнішніми джерелами етилену. Піддавання таким зовнішнім джерелам може відбуватися протягом збору врожаю, обробки та зберігання продукції. Наприклад, коли латук транспортують або зберігають поруч із фруктами, що виділяють етилен, такими, як яблука, груші або персики, може відбутися значне псування. Крім того, коли латук обробляють та використовують в упакованих свіжозрізаних сумішах, можуть бути обмеження щодо інгредієнтів, що можуть бути використані, через виділення етилену одним чи більше з цих інгредієнтів. Iржа є фізіологічним розладом, що проявляється у вигляді численних бурих плям уздовж головної жилки листа. Симптоми побуріння можуть поширюватися на весь лист під час стадій розвитку розладу. Відомо, що іржа зустрічається, особливо, якщо зрілі качани латуку зберігають при низьких температурах (5°С) у присутності низьких концентрацій (на рівні ррm) етилену. Утворенню симптомів можна протидіяти шляхом застосування рослинного гормону ауксину або кальцію. Крім того, модифіковані атмосфери з низьким рівнем кисню знижує швидкість розвитку цих симптомів. На біохімічному рівні іржа розвивається як наслідок місцевої стимуляції біосинтезу лігніну, що призводить до лігніфікації та стовщенню стінок клітин навколо тієї зони листа, де з'являються візуальні симптоми. Буре знебарвлення спричинено стимуляцією фенольного метаболізму. Фермент фенілаланін амоній ліаза (PAL), що, як було показано, індукується етиленом, каталізує першу обов'язкову стадію фенілпропаноїдного маршруту. Фенольні сполуки, що утворюються, головним чином включають похідні кавової кислоти, а також ряд таких флавндоїдів, таки, як (+) катехін, та (-)епікатехін. Наступне окислення цих сполук поліфенольною оксидазою (РРО) призводить до бурого знебарвлення, що типово спостерігається при іржі. Остаточно, симптоми можуть бути більш тяжкими через стягування тканин та апоптозу клітин. Старіння є еволюційним процесом, що зустрічається у природі у кінці життєвого циклу рослини або органу рослини, протягом якого метаболізм повторно програмується для повторної мобілізації ресурсів у таких репродуктивних структурах, як насіння. Хоча старіння є еволюційним процесом, спричиненим ендогенними факторами, такими, як фізіологічний вік, існує багато екзогенних факторів, що можуть модулювати старіння. Пожовтіння листя є найбільш видимим симптомом старіння, що є наслідком розпаду хлорофілів протягом відносно пізньої стадії старіння, що може бути прискорена етиленом, до якого листя є чутливим. Добре відомими іншими стимулюючими факторами старіння є поранення, темрява та харчова недостатність. Хоча етилен є найбільш важливим рослинним гормоном, відомим як такий, що стимулює старіння, інші гормони, такі, як жасмонат, можуть також бути задіяні у процесі. З моменту збору врожаю рослин латуку, до моменту його споживання, продукт може бути підданий дії різних екзогенних факторів, задіяних у старінні. Це може бути поранення під час 1 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збору та обробки врожаю, темрява та харчова недостатність під час зберігання та дія етилену під час обробки та зберігання. Ці фактори у значному ступеню стимулюють появу розладів після збору врожаю, що можуть проявлятися як іржа та пожовтіння. Хоча ці ефекти є, значною мірою, косметичними, продукт стає значно менш привабливим та, через це, неринковим. Для оцінки впливу псування, можна здійснити численну кількість заходів після збору врожаю, для зменшення цього впливу. Наприклад, можна зберігати зібраний латук при низьких температурах для уповільнення старіння. Хоча це може знизити швидкість пожовтіння, може бути підсилена іржа. Крім того, може бути вжиті логістичні заходи, що зменшують час транспортування, що потрібний на доставку з полів споживачеві, або що попереджають зберігання латуку поруч з джерелами етилену. Додатково, можна використовувати хімічну обробку, що попереджає псування після збору врожаю, хоча безпека їжі та сприйняття споживачами стає проблемою. Багато заходів, що вживають після збору врожаю, є деякою мірою успішними, проте все ще залишається простір для покращення Крім того, втрати можуть бути значними, що є іншою причиною для пошуку альтернатив, що зменшать потребу у використанні обробки після збору врожаю. Переважно, знайдено генетичне рішення, що зменшує чи знищує потребу у вживанні витратних профілактичних заходів, що у даний час використовують для зберігання якості після збору врожаю на високому рівні Задачею даного винаходу є забезпечення способу скринінгу, що дозволяє ідентифікацію етилен-нечутливих рослин. Додатковою задачею винаходу є забезпечення рослин, що можуть бути одержані цим способом. Ця задача досягається, згідно з даним винаходом, способом скринінгу популяції рослин на предмет наявності серед них таких рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржи та пожовтіння, порівняно із контрольною рослиною, де спосіб включає: a) забезпечення популяції насіння; b) пророщування насіння у темряві у присутності етилену з одержанням розсади; c) добору розсад, що має більш довгі гіпокотилі, ніж гіпокотилі етилен-чутливих контрольних рослин; d) самозапилення добраної розсади з одержанням насіння; e) пророщування однієї частини насіння, одержаного з кожної добраної розсади, у темряві у присутності етилену, та пророщування другої частини насіння з кожної добраної розсади у темряві на повітрі; та f) вимірювання відносного зростання гіпокотилів розсади, пророщеної в атмосфері етилену, порівняно із зростанням гіпокотилів розсади, пророщеної на повітрі, для розрізнення рослин, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль, як в атмосфері етилену, так і на повітрі, та рослин, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль, тільки в атмосфері етилену, де рослини, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль, тільки в атмосфері етилену, ідентифікують як рослини, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння. Даний винахід ґрунтується на гіпотезі, що рослини, чутливі до етилену, зокрема, латук, можуть бути резистентними до фізіологічних розладів після збору врожаю, таких, як іржа та пожовтіння. У переважному втіленні, спосіб за даним винаходом включає додаткову стадію аналізу сполук, що були ідентифіковані у попередній стадії як такі, що проявляють знижену чутливість до етилену, на предмет їх резистентності до іржі та/або пожовтіння . Довжину гіпокотилів та довжину коренів спостерігали шляхом порівняння зі стандартом та підрахунку, починаючи з 1, що означає ідентичність сорту стандарту, чутливому до дії етилену в атмосфері етилену, до 3, що означає ідентичність сорту стандарту, чутливому до дії етилену в атмосфері повітря. Необов'язково, можна проводити вимірювання у міліметрах. Використовуючи одне з цих вимірювань, можна виконати простий статистичний аналіз як перевірку за критерієм Стюдента, добре відому фахівцю у цій галузі, для встановлення того, чи має рослина чи група рослин значно меншу чутливість до етилену, ніж стандарт, чутливий до етилену, такий, як 'Troubadour' (Rijk Zwaan, De Lier, NL). Застосовний рівень значимості однобічного критерію становить 0,001. Для мутантів, статистичне порівнюють, переважно, довжину гіпокотилів, та, необов'язково, довжину коренів вихідного сорту, що був використаний для мутагенної обробки, що є найкращим наявним стандартом, та довжину гіпокотилів та коренів окремих мутантів та/або їх потомства. 2 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Для виявлення нечутливих до дії етилену рослин у наявному рослинному матеріалі, добирають один чи більше репрезентативних проб сортів, селекційних ліній та/або зразків генних банків. Потім проводять відповідне статистичне порівняння довжин гіпокотилів та коренів окремих зразків, що досліджують, та залишкової частини популяції. При проведенні статистичного аналізу рослин щодо значно подовжених гіпокотилів та/або коренів може потребуватися застосування множинних критеріїв порівняння для збереження належних загальних рівнів значимості, наприклад, множинні критерії порівняння Дуннетта із застосуванням одного стандарту (Dunnett, CW, J. Amer. Statist. Assoc. 50:1096-1121 (1955)). Рослини, що мають бути піддані скринінгу, є, зазвичай, листовими овочевими рослинами, зокрема, рослинами, що належать до роду Lactuca, та, зокрема, видів Lactuca sativa. Рослинна популяція є, переважно, популяцією мутантних рослин, через більш високу вірогідність виявлення рослини за даним винаходом у такій варіантній популяції. Проте, скринінгу за даним винаходом може бути піддана будь-яка інша популяції рослин, що відрізняється за своєю генетичною структурою. Популяцію мутантних рослин, переважно, одержують шляхом мутагенної обробки, з використанням хімічних речовин та/або випромінювання. Мутагенні обробки широко відомі та будуть більш детально описані у цьому документі нижче. Концентрація етилену у стадії b) становить, щонайменше, 10 мкг/літр, переважно, від 11 до 25 мкг/літр. Концентрація етилену у стадії d) становить, приблизно, 4-5 мкг/літр. Стадія селекції у способі скринінгу за даним винаходом заснована на збільшенні довжини гіпокотилів. Піддавання розсади, що була пророщена у темряві, дії етилену, спричиняє радіальне набрякання гіпокотилів та інгібування росту коренів та гіпокотилів. Це явище, загалом, має назву потрійної реакції (див., наприклад, Guzman, P & Ecker, J, Plant Cell 2:513-523 (1990)). Відтворюваність цієї реакції дозволяє проведення скринінгу мутантів, що проявляють змінену потрійну реакцію у присутності чи у відсутності етилену Крім вимірювання збільшення довжини гіпокотилів, або замість нього, селекція за даним винаходом може засновуватися на одному чи більше інших елементах аналізу потрійної реакції. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу, винахід забезпечує рослини, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі та пожовтіння, у порівнянні з контрольною рослиною, що може бути одержана шляхом піддавання популяції рослинного насіння способу скринінгу за даним винаходом та селекції рослин з популяції, що має більш довгі гіпокотилі порівняно із етилен-чутливим контролеві, як рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння . Рослина за даним винаходом являє собою, переважно, листову овочеву рослину, зокрема. Рослину, що належить до роду Lactuca, та, зокрема, до видів Lactuca sativa. За допомогою способу скринінгу за даним винаходом були ідентифіковані та добрані етилен-нечутливі мутанти. Насіння цих мутантів депоновано у NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA UK 3 січня 2007 p., та ним було присвоєно номери доступу, як вказано у Таблиці 1. Детальна інформація про потомство насіння депонентів надано у Прикладі 3 та у Прикладі 4. Ці депоненти було одержані, оскільки вони мають одинарну конкретну характеристику - значно знижену чутливість до етилену. їх не піддавали аналізу на DUS-критерії для реєстрації сортів, тобто, розрізняльної здатності, однорідності, резистентності всіх реєстраційних характеристик, та не очікується, що вони задовольняють цим критеріям будь-яким чином. 45 Таблиця 1 Рослина № 00D.7856 00D.6876 00D.7871 00D.6883 00D.6896 00D.7845 50 внутрішній номер (=NCIMB номер) 07D.826509 07D.826514 07D.826502 07D.826522 07D.826540 07D.826542 номер доступу NCIMB 41449 41450 41448 41451 41452 41453 Даний винахід додатково стосується рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння, та що можуть бути одержані шляхом схрещення рослини за даним винаходом з іншою рослиною того ж виду Ознака "знижена чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння" може, таким 3 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, бути введена іншим рослинам, що спочатку не мали такої ознаки. Оскільки рослини, одержані у результаті такого схрещення, є, дійсно, рослинами за даним винаходом, вони можуть бути проаналізовані шляхом піддавання скринінгу за даним винаходом. Даний винахід додатково стосується потомства батьківської рослини за даним винаходом, що проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння. Таким потомством може бути велика кількість поколінь, одержаних з батьківської рослини. За умови, наявності ознаки "знижена чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння", рослина потомства є рослиною за даним винаходом. Даний винахід додатково стосується частин рослин за даним винаходом Частинами рослини за даним винаходом є, наприклад, качани або листя, такі, як молоде листя, оброблені качани або зрізане листя. Частини рослин за даним винаходом можуть бути використані у тканинній культурі для регенерації рослин, що мають знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння, як знайдено для рослин, з яких одержували тканину для культивування. Такі регенеровані рослини також входять до даного винаходу. Даний винахід додатково стосується насіння рослини за даним винаходом З насіння може бути вирощена рослина, що також має ознаку "знижена чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння". Незалежно від того, чи зберегло насіння та, відповідно, рослини, вирощені з нього, цю ознаку, вони можуть бути проаналізовані способом скринінгу за даним винаходом. Даний винахід також стосується до наступних поколінь насіння, що зберігають знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння, як було знайдено для вихідного насіння. Відповідно до додаткового аспекту даного винаходу, він стосується овочевого продукту, що містить рослину або її частину, за даним винаходом. Переважно, рослиною є листова рослина, більш конкретно, овочем є латук. При проведенні скринінгу способом за даним винаходом, овочевий продукт проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння. Має бути відмічено, що спосіб скринінгу за даним винаходом є відносно простим способом. Рослини за даним винаходом, що мають знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння, можуть бути ідентифіковані у будь-якій варіантній популяції, що є достатньо великою. Для відтворення винаходу не потребується проведення додаткових експериментів, тому рослини за даним винаходом не мають трактуватися як такі, що обмежені депонованими рослинами. У результаті нечутливості до етилену, рослинний матеріал латуку, та насіння за даним винаходом, одержано з нього, проявляють значне підвищення якості після збору врожаю, особливо у тому, що стосується старіння, пов'язаного із такими явищами, як іржа та пожовтіння. Оскільки етилен є найбільш важливим рослинним гормоном, що стимулює старіння, та оскільки іржа та пожовтіння пов'язані із старінням, був здійснений генетичний підхід, за яким одержувати генетичні варіанти, що добирали за відсутністю чутливості до етилену. Було знайдено, що це опосередковано призводить до ідентифікації мутантів, що знаходяться під впливом реакції старіння після збору врожаю. У детальних дослідженнях з використанням таких моделей рослинних видів, як Arabidopsis thaliana, а також видів сільськогосподарських культур, було одержано інформацію щодо біохімічні маршрути, задіяні у біосинтезі та сприйнятті етилену. Велика кількість алельних форм була охарактеризована щодо участі у цьому маршруті, що показало складну картину функції етилену у рослинах. Етилен, подібно до інших рослинних гормонів, відіграє важливу роль у багатьох фізіологічних процесах, що включені до складних інтерактивних регуляторних мереж. Просторова та часова активність гормону, між іншим, визначається рівнем генної експресії, що складає основу біосинтезу етилену, сприйняття гормону, сигнальної трансдукції та активації нижніх ефекторних протеїнів. Алельні варіанти генів, задіяних на різних рівнях, можуть визначити силу реакції, а також рівень взаємного обміну з іншими сигнальними маршрутами. Оскільки біосинтез та сприйняття етилену мало охарактеризовані для латуку, та для того, щоб дозволити ідентифікацію сили різних реакцій та алельних варіантів, що складають їх основу, було обґрунтовано, що для цього може бути більш успішним об'єктивний підхід, порівняно із модифікацією генних мішеней. Такий об'єктивний підхід охоплює, переважно, процедуру хімічного або фізичного випадкового мутагенезу у сполученні з ефективним фенотипічним скринінгом та процедурою селекції, що ґрунтується на реакції етіолованої розсади з етиленом. Така заснована на розсаді система селекції є набагато кращою у термінах кількості сполук, що можуть бути оцінені людиною за годину, порівняно із використанням зрілих качанів латуку Додатково, час 4 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукування рослинного матеріалу для скринінгу є, очевидно, набагато меншим у випадку розсади, порівняно з зрілими качанами. Додатковою перевагою цього підходу є використання умов селекції на стадії розсади, як предикативного фенотипічного маркеру для характеристики після збору врожаю після ідентифікації успішного результату. Очевидний ризик полягає у тому, що селекція на стадії розсади може не призвести до утворення генетичних варіантів, що проявляють ознаку, що добирають, на зрілому рівні, після збору врожаю. Додатково визнано, що такі рослинні гормони, як етилен, задіяні у багатьох фізіологічних процесах, що можуть призвести до плейотропних ефектів. Вони можуть бути як позитивними, так і негативними, в залежності від сільськогосподарської культури та умов її культивування. Даний підхід, тому, переважно, включає такі стадії: 1. Генерування мутантної популяції шляхом обробки насіння або рослинних тканини мутагенним агентами, такими, як етан метилсульфонат (ems), або гамма-випромінювання. 2. Забезпечення ефективного фенотипічного скринінгу, в якому селекція заснована на реакції етіолованої розсади рослин, зокрема, латуку, на дію етилену, що характеризується значним скороченням росту гіпокотилів, укороченим потовщеним корінням та надмірною кривизною апікального крючку. Ця реакція має назву потрійної реакції, що є типовою для етіолованої розсади, та що, як було знайдено, відбувається у різному ступеню у багатьох рослинних виду, коли їх піддають впливу атмосфери, що містить етилен (див., наприклад, Ecker J, Science 268 (5211) :667-675 (1995)). 3. Характеристику модифікованих мутантів, у, щонайменше, одному аналізі їх потрійної реакції, на предмет псування після збору врожаю, де псування включає іржу та пожовтіння. Необов'язково, визначення плейотропних ефектів модифікації, для виключення негативних плейтропних ефектів, що можуть вплинути на вартість рослин. У способі скринінгу за даним винаходом, популяція рослинного насіння, що має бути проаналізована, є, таким чином, популяцією мутантного насіння, що може бути одержано способом, що включає: a) обробку насіння М0 видів рослин, що мають бути модифіковані, мутагенним агентом з одержанням насіння М1; b) вирощування рослин з одержаного таким чином насіння М1 з одержанням рослин М1; c) одержання рослин М2 шляхом самозапилення рослин М1; та d) необов'язковим повтором стадій b) та с) п разів з одержанням насіння М1+n. Насіння М1+n, одержане таким чином, потім пророщували у темряві у присутності високих концентрацій етилену, з одержанням розсади. Після цього, добирають розсаду, що не проявляє реакцію на дію етилену. Реакція, яку можна виміряти, є розвитком гіпокотилів, довжина яких подовжилася порівняно із довжиною гіпокотилів етилен-чутливої розсади. Потім, потомство кожної добраної рослини розділюють та пророщують у темряві: половину потомства в етилені, а половину - на повітрі. Відносний ріст гіпокотилів в атмосфер) етилену порівняно із ростом на повітрі вимірювали для кожного потомства в обох атмосферах. Ці спостереження використовували для розрізнення потомства, що має більш довгі гіпокотилі, порівняно із вихідним етилен-чутливим контролем, як в атмосфері етилену, так і в атмосфері повітря, та на підставі цього робили висновок про чутливість до етилену та небажаність, та відбирали з потомства, що дійсно мало знижену чутливість до етилену. Прикладом добре відомого мутагену є ems. Ems алкілує, головним чином, G залишки спіралі ДНК, що протягом реплікації ДНК спричиняє спарювання Т замість С. Тому, спарювання основ GC змінюється на спарювання основ AT з частотою, що визначається ефективною дозою ems та активністю системи репарації помилково спарених основ у рослині. Ефективна доза ems залежить від застосованої концентрації, розміру насіння та інших фізичних властивостей та часу інкубування насіння у розчині ems. Насіння, оброблене ems, типово, має назву насіння М1. Як результат обробки, тканини насіння М1 містять випадково-точкові мутації у геномах їх клітин та випадково-точкові мутації, наявні у субпопуляції клітин, що призводитимуть до утворення тканини зародкової лінії (зародкових клітин), будуть перенесені у наступне покоління, що має назву М2. Мутації або їх комбінації, що є гаплонедостатніми, та, через це, призводять до стерильності, або що викликають летальність зародків, не будуть перенесені у покоління М2. Процедуру, подібну описаній вище для використання ems, застосовують також для інших мутагенних агентів. Популяція М2 може бути використана у процедурах скринінгу, направлених на знижену потрійну реакцію етіолованої розсади. Іншими мутагенними агентами, зокрема, алкілуючими мутагенними агентами, є діетилсульфат (des), етиленімін (еі), пропан сульфон, N-метил-N-нітрозоуретан (mnu), Nнітрозо-N-метилсечовина (NMU), N-eтил-N-нiтpoзoceчoвинa (enu), азид натрію. 5 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно, мутації викликають шляхом випромінювання, що вибирають, наприклад, з рентгенівського випромінювання, швидких нейтронів, УФ випромінювання. В іншому втіленні даного винаходу, мутації викликають за допомогою методів генної інженерії, таких, як використання химерних олігонуклеотидів, гомологічної рекомбінації, введення модифікованих генів-мішеней, що конкурують з ендогенним продуктом, дезактивації через втручання РНК та інш. Технологія, що дозволяє модифікувати генні мішені, наявні у геномі рослини особливим чином, відома фахівцям у цій галузі. Наприклад, було показано, що химерні олігонуклеотиди є ефективними мутагенами зі специфічним режимом дії. Інший підхід полягає у модифікації генних мішеней через гомологічну рекомбінацію або направлений вплив на гени. Використовуючи цей підхід, фрагмент гену замінюють шляхом введення фрагменту ДНК, що містить бажану модифікацію. Також придатними є трансгенні підходи, де вводять модифіковані гени-мішені, що конкурують з ендогенним продуктом. Це може призвести до виникнення домінантних негативних ефектів. Більш специфічну дезактивацію генної експресії є можна здійснити шляхом РНК інтерференції. У випадку мутагенних олігонуклеотидів, коли направлений вплив на гени, або трансгенні підходи, використовують для модифікації генетичного фактору, задіяного у функціонуванні етилену, очевидно, має бути відома первинна структура релевантних генів. На даний час, проте, відомості про такі гени у латуку є обмеженими. Переважно, винахід додатково включає пірамідні алелі зниженої чутливості до етилену. На продукування насіння М1 та М1+n, відповідно, впливає самозапилення Винахід додатково відноситься до рослин або частин рослин, геноми яких містять генетичну інформацію, що відповідає за знижену чутливість до фізіологічних розладів, таких, як іржа та пожовтіння, та що була знайдена у геномі рослини латуку, як показано у Таблиці 1. Потомство рослин, що заявляються, також входить до даного винаходу. Термін "потомство", як вживається у цій заявці, призначений для охоплення усіх рослин, що мають однаково або подібним чином знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема, іржі або пожовтіння, таких, як вихідні рослини, описані у цій заявці, та рослини, одержані з них будь-яким чином, таким, як статеве розмноження, таке, як самозапилення чи перехресне запилення іншою рослиною того ж роду, або вегетативне розмноження, таке, як живцювання, культивування тканин, культивування гаплоїдів, культивування протопластів, злиття протопластів або інші методи. Таке потомство являє собою, таким чином, перше покоління рослин, ідентифікованих за даним винаходом, а також перше покоління рослин, одержаних за одним чи більше таких методів, але також кожне наступне покоління рослин, одержаних за одним чи більше таких методів, за умови, що одержані рослини мають знижену чутливість. Для визначення реакції етіолованої розсади латуку на дію етилену, використовували спеціально розроблені пластикові контейнери, в яких вирощували розсаду латуку на фільтрувальному папері в атмосфері, в якій можна варіювати рівні етилену. Дійсно, було знайдено, що розсада латуку реагувала на присутність етилену шляхом зменшення росту гіпокотилів, що, у принципі, надасть можливість селекції етилен-нечутливих мутантів у випадку, коли такі мутанти присутні у наявній популяції, та у випадку, коли нечутливість експресується фенотипічно на рівні розсади за експериментальних умов, що були застосовані. Шляхом вирощування великої кількості етіолованої розсади латуку з популяції, що містить випадково викликані мутації в етиленвмісній атмосфері, було знайдено, що може бути одержана та добрана розсада, що проявляє знижену чутливість до етилену порівняно із чутливістю до етилену вихідної популяції. Було відібрано розсаду, що проявляла збільшення довжини гіпокотилів у ступені, порівнянному з ситуацією, коли атмосфера містила тільки повітря, без етилену. Розсаду, ідентифіковану таким чином, кваліфікували як таку, що є нечутливою до дії етилену. Для того, щоб підтвердити, що етилен-нечутливі мутанти є резистентними до іржі та пожовтіння, мутантів ідентифікували за допомогою скринінгу та аналізували на предмет їх резистентності до іржі та/або пожовтіння. Аналіз на іржу, відповідно, включає зберігання зібраних зрілих качанів у закритому контейнері при температурі 8°С у темряві, та піддавання їх дії газоподібного етилену у концентрації від 6 до 7 об.ч/м (об'ємних частинок на мільйон) та оцінку наявності симптомів іржі через 7 днів, переважно, через 9 днів. Відповідно, етилен-чутливий контрольний качан інкубували разом із рослинами, що мали бути проаналізовані, та порівнювали іржу останніх із контролем. Аналіз пожовтіння включав зберігання зрілих качанів рослин латуку, що мають бути проаналізовані, у камері зберігання, що не містила етилену, при 8°С, та оцінку пожовтіння 6 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основного листя через 10 днів, переважно, через 14 днів. Рослини, резистентні до пожовтіння, являють собою рослини, що не проявляють пожовтіння основного листя через 14 днів. Відповідно, етилен-чутливий контрольний качан інкубували разом із рослинами, що мали бути проаналізовані, та реакцію пожовтіння рослин, що мали бути проаналізовані, порівнювали із реакцією контролю. Як проілюстровано у Прикладах, у перший раз було показано, що нечутливість до дії етилену призводить до резистентності до іржі та резистентності до пожовтіння, що не викликаються етиленом. Несподівано, було також знайдено, що розсада, що проявила реакцію збільшення довжини, що була зменшена порівняно із контрольними умовами, але збільшена порівняно із чутливим контролем, розглядалася як нечутлива до дії етилену, хоча й частково. Змінні рівні нечутливості до етилену, що спостерігалися, можуть відображати наявність або різних мутантних локусів, або різних алельних форм ідентичних локусів, що впливають на цю ознаку у вихідній популяції У випадку рецесивної мутації ці дві можливості можна легко розрізнити шляхом проведення аналізу алельності, що включає схрещення двох результуючих мутацій та визначення фенотипу гібриду. У випадку алельності мутацій, нечутливість до етилену буде очевидною у F1, тоді як у випадку визначення фенотипу у мутантів різними рецесивними локусами, це не так. Оскільки випадковий мутагенез був використаний як переважний засіб одержання вихідної популяції, то мутації генетичного фону можуть також робити внесок у варіацію фенотипу розсади за експериментальних умов. Для того, щоб розрізнити одинарні мутації різної інтенсивності та сполучений ефект мутації у генетичному фоні, мають бути здійснені зворотні схрещування для створення однорідного генетичного фону для різних випадків нечутливості до етилену. Така процедура є додатково релевантною для визначення того, чи задіяні мутації у конкретних локусах у чутливості до етилену, що проявляється як плейотропні ефекти. Мутанти М2, добрані таким чином, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, використовували для пророщування насіння М3. У деяких випадках, рослини М3, вирощені з насіння М3, добирали, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, за допомогою аналізу потрійної реакції, та самозапилювали з одержанням насіння М4 Це декілька разів повторювали з одержанням у деяких випадках М5. В одному випадку рослину М3, вирощену з насіння М3, добирали, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, за допомогою аналізу потрійної реакції, та схрещували з чутливою до етилену та чутливою до іржі батьківськоїрослини з одержанням насіння F1. Рослину F1, вирощену з насіння F1, самозапилювали з одержанням насіння F2. Рослину F2, вирощену з цього насіння F2, добирали, - добирали, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, за допомогою аналізу потрійної реакції, та самозапилювали з одержанням насіння F3. Цю лінію F3 додавали до набору інбредних ліній М3 та М4. Відповідно, інбредні лінії, одержані з етиленнечутливих результатів, повторно оцінювали на предмет їх реакції на дію етилену. Рівень нечутливості кожної інбредної лінії підраховували, виходячи з відносного росту розсади в атмосфері, що містить етилен, порівняно з атмосферою повітря. Виходячи цього критерію, 12/54 ліній, що раніше вважалися етилен-нечутливими, тепер класифікували як етилен-чутливі. Цих фальшивих позитивних результатів протягом початкового скринінгу на рівні М2, можна легко позбутися протягом повторної оцінки випадків у наступному поколінні. Інбредні лінії, що проявляли підтверджену та значну нечутливість в етиленовому аналізі повторно висівали та вирощували у теплиці за стандартних умов продукування латуку з одержанням зрілих качанів, які оцінювали на наявність іржі та пожовтіння (див. також Приклади). Як негативний контроль вирощували етилен-чутливі рослини, що походять з популяції, яку використовували для добору етилен-нечутливих випадків. Несподівано, насіння усіх етиленнечутливих мутантів пророщували стандартно, тобто порівняно з насінням майже ізогенної етилен-чутливої контрольної рослини, при висаджуванні у торф'яний фунт. Це дуже контрастує з ситуацією для інших видів рослин, таких, як Arabidopsis thaliana, що проявляють значне зниження здатності до проростання при висаджуванні у торф'яний фунт (Harpham, N.J.V. et al (1991) Annals of Botany 68, 55-61). Очевидно, для латуку можливе вирощування етилен-нечутливих мутантів відповідно до стандартної практики культивування, що у багатьох випадках включає висівання у торф'яні блоки або торф'яний фунт. Після культивування, зрілі качани збирали та піддавали дії етилену. Інкубування качанів протягом одного тижня після збору врожаю при 8°С в атмосфері, що містила етилен, призвело до значного стимулювання іржі качанів етилен-чутливих контрольних рослин. Проте, 29 з 37 етилен-нечутливих результатів, що були проаналізовані, не проявили ознак іржі взагалі, що 7 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 несподівано продемонструвало, що резистентність до дії етилену, за якою було здійснено селекцію на рівні розсади, може зменшувати фізіологічні розлади на рівні зрілої рослини, навіть на стадії після збору врожаю. Резистентність до пожовтіння може бути показана для ряду етилен-нечутливих випадків, в умовах зберігання в атмосфері, що не містить етилену, при субоптимальній температурі. Це є несподіваним, оскільки до теперішнього часу повідомлялося про резистентність до пожовтіння тільки у присутності етилену (Saltveit et al., Postharvest Biology and Technology 27: 277-283 (2003)). Даний винахід буде проілюстрований Прикладами, що наведені нижче, та що не призначені для будь-якого обмеження винаходу. Більш конкретно, експерименти, наведені у Прикладах, були виконані для латуку, проте винахід є застосовним більш широко для інших видів рослин, що мають аналогічні проблеми після збору врожаю при контактуванні з етиленом. У прикладах наведені посилання на наступну Фігуру. Фігура: Фенотип зрілих качанів латуку після піддавання дії етилену при 8°С у темряві протягом 9 днів. На лівій панелі показано репрезентативний зразок резистентних до етилену (Етилен R) та чутливих до дії етилену контрольних (- контроль) качанів сорту Troubadour. На правій панелі наведено аналогічне зображення мутантів, одержаних з сорту Apache. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1 Генетична модифікація латуку за допомогою етил метан сульфонату (ems) Насіння сортів латуку Troubadour, Apache та Yorvik (усі три одержані від Rijk Zwaan, De tier, Нідерланди) обробляли ems шляхом занурення приблизно 2000 насіння кожного сорту у аерований розчин або 0,05% (в/в), або 0,07% (в/в) ems протягом 24 годин при кімнатній температурі. Приблизно 1500 насіння кожного сорту обробленого однією дозою ems пророщували, та одержані у результаті рослини вирощували у теплиці у Нідерландах з травня по вересень з одержанням насіння. Після дозрівання, насіння М2 збирали та насипали групами кожного сорту для кожної обробки. Одержані у результаті 6 груп насіння М2 використовували як вихідний матеріал для ідентифікації окремих рослин М2, що містили алелі зі зниженою чутливістю. Ефективність процедури генної модифікації оцінювали шляхом визначення наявності знебарвлених рослин, що були ознакою втрати хлорофілу через модифікації генів, безпосередньо чи опосередковано задіяні в утворенні або накопиченні хлорофілу. В усіх 6 групах насіння М2 спостерігалися окремі знебарвлені рослини, що було ознакою того, що обробка призвела до утворення генетичних модифікацій. ПРИКЛАД 2 Ідентифікація рослин латуку, в яких було одержано алелі зниженої чутливості до етилену Насіння латуку М2 пророщували на папері у невеликому пластиковому контейнері при концентрації етилену 10-20 об.п./м (об'ємних частин на мільйон) при 16°С у темряві. 1 об.п./м містить 0,41 мкмоль/літр або 1,14 мкг/літр. Етилен-нечутливі мутанти порівнювали з етиленчутливими контрольними рослинами, та добирали, виходячи зі збільшення довжини гіпокотилів та/або коренів (тобто, з аналізу потрійної реакції). Ці етилен-нечутливі мутанти вирощували з одержанням ліній М3 шляхом самозапилення. Ці М3 лінії повторно аналізували за допомогою аналізу потрійної реакції з метою підтвердження нечутливості до етилену. При виділенні етилен-нечутливої лінії, добирали рослини з наступним проведенням одного чи двох додаткових циклів інбридингу, та, за можливістю, проводили кінцевий аналіз потрійної реакції для добору гомозиготних етилен-нечутливих ліній. В одному випадку рослину М3, вирощену з насіння М3, добирали, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, за допомогою аналізу потрійної реакції, та схрещували з чутливою до етилену та чутливою до іржі батьківською рослиною Troubadour з одержанням насіння F1 Рослину F1, вирощену з насіння F1, самозапилювали з одержанням насіння F2. Рослину F2, вирощену з цього насіння F2, добирали, виходячи зі зниженої реакції на дію етилену, за допомогою аналізу потрійної реакції, та самозапилювали з одержанням насіння F3. Одержану лінію F3 додавали до набору з 53 інбредних ліній М3, М4 та М5. У цьому випадку лінія F3 являла собою тільки вихідну мутантну рослину М2, оскільки самозапиленого насіння цієї рослини не залишилося. Цей набір з 54 ліній М3 та М4 з Прикладу 1 пророщували у торф'яних блоках у закритих контейнерах при концентраціях етилену від 4 до 4,5 об.ч./м у темряві. Етилен-нечутливих мутантів ідентифікували за їх більш довгими гіпокотилями порівняно із чутливими контрольними 60 8 UA 97791 C2 5 сортами (Troubadour, Apache, Yorvik, Sensal). Результати наведено у Таблиці 1. 42 з 54 ліній, що були ідентифікованими за допомогою аналізу потрійної реакції, були, щонайменше, частково нечутливими до дії етилену, при проведенні аналізів на вплив етилену. Ці лінії являють собою 40 рослин М2, оскільки 2 М2 рослини були представлені двічі. Результати наведено у Таблиці 2. Таблиця 2 Реакція на дію етилен мутантних ліній при проведенні аналізу в закритому контейнері та аналізу потрійної реакції (trt). Спостереження гіпокотилів та коренів вказані окремо, якщо показано відсутність узгодженої реакції. Проміжну реакцію вказували як часткову. R=етилен-нечутливий; S=етилен-чутливий; R/3=сортування, T=Troubadour; A=Apache; Y=Yorvik; hypo=гіпокотилі схема 1 2 насіння № YORVIK TROUBADOUR 3 APACHE 4 00D.88531 5 джерело етилен S S S S схема 32 01D.85755 T R/S S S 33 01D.85762 А частково R R/S R hypo; S корені Υ S R/S hypo; R корені 34 03D.90452 A R R 00D.88539 Υ S S 35 01D.85764 A частково R/S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 01D.85717 01D.85720 01D.85732 00D.88533 00D.88538 03D.74008 02D.90749 00D.88550 01D.85739 00D.88565 02D.91445 Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ T T S S S S S R S S S R R 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 02D.90070 03D.90457 01D.85768 02D.90128 02D.90129 02D.90130 03D.90462 03D.90464 02D.90133 02D.90134 00D.88600 A A A A A A A A A A A R R R R R R R R R R R/S 17 00D.88577 T R/S R R S S R S S S S R R R hypo; S корені R hypo; S корені R R R R R R R R R R R 47 02D.91479+ A R R 18 02D.91446 T R R 48 01D.85772 A R 19 02D.91447 T R R 49 04D.800957 A R 20 01D.85754 T S? R/S 50 02D.90091 A R 21 02D. 90047 T R R 51 04D.800960 A R 22 23 24 01D.85758 00D.88564 02D.91442 T T T R S R R S R 52 53 54 04D.800960 01D.85780 01D.85756 A A Τ R R R 25 00D.88569 T R R 55 02D.90036 Τ Частково R 26 00D.88573 T R R 56 04D.801660 Υ Частково R 27 00D. 88578 Т R R 58 04D 800900 Т R 28 29 30 00D.88582 01D.85748 01D.85750 Т T T R R/S S R R/S R 59 60 03D.90323 Sensai T R S trt 9 насіння № джерело етилен trt S hypo; R корені S hypo; R корені R S hypo; R корені R R R S hypo; R корені R/S hypo; S корені S hypo; R корен R S UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПРИКЛАД 3 Ідентифікація рослин латуку, що одержали алелі зниженої чутливості до іржі Тридцять сім етилен-нечутливих ліній з сорока двох ліній, виявлених у Прикладі 2, висіювали у теплиці з одержанням зрілих качанів у стандартних умов одержання латуку (місцезнаходження: Maasdijk, the Netherlands, висівання: 10 січня; висаджування розсади. 17 лютого; збір врожаю: 18 квітня). Зібрані зрілі качани зберігали у закритому контейнері при температурі 8°С у темряві. Їх піддавали дії газоподібного етилену у концентрації від 6 до 7 об.ч./м (об'ємних часток на мільйон). 1 об.ч./м містить 0,41 мкмоль/літр або 1,14 мкг/літр. Через 9 днів ідентифікували рослини, що проявляли ознаки іржі. Усі контрольні рослини, крім Yorvik, проявляли ознаки іржі 29 з 37 проаналізованих ліній проявляли відсутність іржі або меншу кількість іржі порівняно із вихідним сортом (Таблиця 3). Було дібрано шість ліній для розмноження та депонування у NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen A821 9УА, UK. Першій ліній було присвоєно номер 02D.91445. Лінія М4 походила від етилен-нечутливої рослини -Troubadour-M2 00D 7856. Етиленнечутливу рослину М4 добирали з 02D.91445 в аналізі у закритому контейнері в Прикладі 2, та самозапилювали з одержанням насіння М5. Шістнадцять рослин М5 вирощували з цих рослин з одержанням партії насіння М6 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 07D.826509 та депоновано під номером NCIMB 41449 (перша лінія). Другій лінії було присвоєно номер 02D. 90047. Лінія М4 походила від етилен-нечутливої рослини Troubadour-M2 00D.6876. Етилен-нечутливу рослину М4 добирали з 02D. 90047 в аналізі у закритому контейнері у Прикладі 2 та самозапилювали з одержанням насіння М5. Шістнадцять рослин М5 вирощували з цього насіння з одержанням партії насіння М6 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 070.826514 та депоновано під номером NCIMB 41450 (друга лінія). Відсутність іржі для цього джерела встановлювали за допомогою аналізу лінії М5 03D.90323, що походила і рослини М4 02D. 90047. Третій лінії було присвоєно номер 00D. 88578. Лінія М3 походила від етилен-нечутливої рослини Troubadour-M2 00D.7871. Шістнадцять рослин М3 вирощували з 00.88578 з одержанням партії насіння М4 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 07D.826502 та депоновано під номером NCIMB 41448 (третя лінія). Четвертій лінії було присвоєно номер 03D. 90452. Лінія М5 походила від етилен-нечутливої рослини Apache-M2 00D.6883. Етилен-нечутливу рослину М5 добирали з 03D.90542 в аналізі у закритому контейнері в Прикладі 2, та самозапилювали з одержанням насіння М6. Шістнадцять рослин М6 вирощували з цього насіння з одержанням партії насіння М7 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 070.826522 та депоновано під номером NCIMB 41451 (четверта лінія). П'ятій лінії було присвоєно номер 01D.85780. Лінія М3 походила від етилен-нечутливої рослини Apache-M2 00D.6896. Етилен-нечутливу рослину М3 добирали з 01D.85780 в аналізі у закритому контейнері в Прикладі 2, та самозапилювали з одержанням насіння М4. 16 М4 вирощували з цього насіння з одержанням М5 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 070.826540 та депоновано під номером NCIMB 41452 (п'ята лінія). Шостій лінії було присвоєно номер 04D.801660. Лінія F3 одержували шляхом схрещування етилен-нечутливої рослини Yorvik М3 02D.8484 та рослини етилен-чутливого сорту Troubadour. Рослина М3 02D.8484 походила від етилен-нечутливої рослини Yorvik-M2 00D.7845. Етиленнечутливу рослину F3 добирали з 04D.801660 в аналізі у закритому контейнері в Прикладі 2, та самозапилювали з одержанням насіння F4. 16 рослин F4 вирощували з цього насіння з одержанням партії насіння F5 шляхом самозапилення. Цій партії насіння було присвоєно номер 07D. 826542 та депоновано під номером NCIMB 41453 (шоста лінія). На Фіг. 1 показано резистентні та контрольні рослини. ПРИКЛАД 4 Ідентифікація рослин латуку, що проявляють менше пожовтіння після збору врожаю Етилен-нечутливі лінії, вирощені у тепличних умовах, як описано у Прикладі 3, збирали, а зрілі зрізані качани зберігали в атмосфері, що не містила етилену, у камері зберігання при 8°С. Через два тижні основні листя зелених контрольних сортів Yorvik та Troubadour починали жовтіти. На цей час та навіть через 1 тиждень три лінії мали менш пожовтіле основне листя, ніж їх вихідні сорти, що були використані у цьому аналізі як контрольні. Ці лінії одержали номери 04D.800900, 03D.90323, 04D.801660. Хоча про взаємозв'язок між пожовтінням листя та присутністю етилену повідомлялося (Saltveit et al. (2003) Postharvest Biology and Technology 27:277 283), несподіваним було те, що 10 UA 97791 C2 навіть у відсутність етилену деякі з етилен-нечутливих ліній проявляли фенотип з меншим пожовтінням. Таблиця 3 Спостереження іржі зрілих качанів через 9 днів зберігання в атмосфері етилену, 0=симптоми відсутні; 1=слабкі симптоми; 2=значні симптоми; NA=немає у наявності насіння № 01D.85762 етилен частково R 04D.800963 01D.85780 trt R hypo; S корені R R R/S частково R hypo; R S корені R R R R R R R R R R R R R R S S R R R R R R R/S R R R R S hypo; R корені R S hypo; R корені R R R S hypo; R корені R R R R Apache S 03D.90452 01D.85764 02D.90070 03D.90457 01D.85768 02D.90128 02D.90129 02D.90130 03D.90462 Apache 03D.90464 02D.90133 02D.90134 00D.88600 02D.91479 01D.85772 04D.800957 02D.90091 04D.800960 5 10 15 20 S 2 іржа насіння № етилен 00D.88565 R 0 1 02D.91445 00D.88577 R R/S 0 0 0 2 2 2 2 2 0 2 2 NA 0 0 02D.91446 02D.91447 01D.85754 01D.85756 02D.90047 01D.85758 02D.91442 Troubadour 00D.88569 00D.88573 00D.88578 00D.88582 01D.85748 R R S? R R R R S R R R R R/S 0 02D. 90036 trt R іржа 0 R 0,5 R hypo; S 0 корені R 0 R 0 R/S 0 R 0 R NA R 0 R 0 S 1 R 0 R 0 R 0 R 0 R/S 01 NA 0 0 частково R 01D.85755 R/S 04D.80090 0R 2 0 03D.90323 4D.801660 0 02 2 Yorvik &hypo; R корені R/S S hypo; R корені R R частково R/S hypo; R S корені S S NA 0,5 0 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб скринінгу популяції рослин на предмет наявності у ній таких рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, порівняно із контрольною рослиною, де спосіб включає: a) забезпечення популяції насіння; b) пророщування насіння у темряві у присутності етилену з одержанням розсади; c) селекцію розсади, що має гіпокотилі більш довгі, ніж гіпокотилі етилен-чутливого контролю; d) самозапилення добраної розсади з одержанням насіння; e) пророщування однієї частини насіння, одержаного з кожної добраної розсади, у темряві у присутності етилену, та пророщування іншої частини насіння, одержаної з кожної добраної розсади у темряві на повітрі; та f) вимірювання відносного збільшення довжини гіпокотилів розсади, пророщеної в атмосфері етилену, порівняно зі збільшенням довжини гіпокотилів розсади, пророщеної на повітрі, для розрізнення рослин, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль, як в атмосфері етилену, так і на повітрі, та рослин, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль тільки в атмосфері етилену, де рослини, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж вихідний етилен-чутливий контроль тільки в атмосфері етилену, ідентифікують як рослини, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння. 11 UA 97791 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 g) аналізу рослин, ідентифікованих як такі, що проявляють знижену чутливість до етилену, на предмет виявлення резистентності до іржі та/або пожовтіння. 2. Спосіб за п. 1, де рослинами є листові овочеві рослини. 3. Спосіб за п. 2, де рослини належать до роду Lactuca та, зокрема, до видів Lactuca sativa. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, де популяція рослин є популяцією мутантних рослин, колекцією ідіоплазм або популяцією трансгенних рослин. 5. Спосіб за п. 4, де популяцію мутантних рослин одержують шляхом мутагенної обробки з використанням хімічних речовин та/або випромінювання. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, де концентрація етилену на стадії b) становить щонайменше 10 мкг/літр, переважно від 11 до 25 мкг/літр. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, де концентрація етилену на стадії d) становить, приблизно, 4-5 мкг/літр. 8. Рослина, що проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, порівняно із контрольною рослиною, де рослину можна одержувати шляхом піддавання популяції насіння рослин способу скринінгу за будь-яким з пп. 1-7 та селекції з популяції рослин, що мають більш довгі гіпокотилі, ніж етилен-чутливий контроль, як рослин, що проявляють знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння. 9. Рослина за п. 8, де рослина є листовою овочевою рослиною. 10. Рослина за п. 9, де рослина належить до роду Lactuca та, зокрема, до виду Lactuca sativa. 11. Рослина за будь-яким з пп. 7-9, де насіння рослини депоновано у NCIMB 3 січня 2007 р. та йому було присвоєно номер доступу, наведений у Таблиці 1. 12. Рослина за будь-яким з пп. 8-10, де рослину можна одержувати шляхом схрещування рослини за п. 11 з іншою рослиною того ж виду. 13. Потомство батьківської рослини за будь-яким з пп. 8-12, що має знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння. 14. Частина рослини за будь-яким з пп. 8-12. 15. Частина за п. 14, де частину вибирають з листя, качанів, зрізаного листя, оброблених качанів та молодого листя. 16. Рослина, одержана з частини рослини за п. 14 або 15, що має знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, що була знайдена у батьківської рослини. 17. Насіння рослини за будь-яким з пп. 8-12. 18. Потомство насіння за п. 17, що проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, що була знайдена у батьківської рослини. 19. Овочевий продукт, що містить рослина або її частина, що проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння, порівняно з контрольною рослиною, за будь-яким з пп. 8-12. 20. Овочевий продукт за п. 19, де овочем є листовий овоч. 21. Овочевий продукт за п. 20, де овочем є латук. 22. Овочевий продукт за будь-яким з пп. 19-21, де овочевий продукт при проведенні скринінгу способом за будь-яким з пп. 1-7 проявляє знижену чутливість до етилену та фізіологічних розладів, зокрема іржі та пожовтіння. 12 UA 97791 C2 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, УкраїнаДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13