Спосіб одержання кардіопротекторного засобу на основі ліпосомальних наночастинок

Реферат: Спосіб одержання ліпосомального препарату з фармакологічною дією включає етапи, на яких розчин природного фосфатидилхоліну в етиловому спирті висушують у вакуумі, емульгують у водному середовищі, диспергують емульсію, додають лактозу у вигляді водного розчину в процесі диспергування, стерилізуючої фільтрації через каскад фільтрів та ліофільно висушують. Суміш розчину природного фосфатидилхоліну та дипальмітоїлфосфатидилгліцерину у співвідношенні (1:0,1-0,12) та убіхінону в етиловому спирті при масовому співвідношенні фосфоліпіди: убіхінон (1:0,1-0,2) висушують у вакуумі. Масовий вміст лактози в емульсії ліпосом складає від 70,0 мг/мл до 80,0 мг/мл. UA 91702 U (12) UA 91702 U UA 91702 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до способу одержання кардіопротекторного та антиоксидантного засобу, що може використовуватися для лікування серцево-судинних захворювань (ССЗ), а також в інших напрямках медицини. В основу засобу входять природні фосфоліпіди, з яких складається ліпосомальна наночастинка, та убіхінон (Q 10), який знаходиться у бішарі ліпосоми. При лікуванні ССЗ та інших напрямів медицини актуальним є застосування гідрофобних антиоксидантів для нормалізації процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та відновлення структури біологічних мембран клітин. Відомо, що з цілого ряду антиоксидантів, Q 10 перевершує всі інші природні антиоксиданти і тому вважається найбільш перспективним для застосування в клінічній практиці [1]. Крім того, відомо, що Q 10 є коферментом, який синтезується в організмі людини, проте з віком його концентрація істотно знижується [7], через що зростає ризик розвитку ССЗ. Однак, застосування Q10 в медичній практиці обмежено через його низьку біодоступність, що, насамперед, пов'язано з його гідрофобними властивостями. На нашу думку збільшити біодоступність Q10 можливо, створивши водорозчинну ін'єкційну форму даного препарату, що представляє безперечний інтерес для кардіології (нестабільна і стабільна стенокардія, міокардит) та інших захворювань, наприклад, в офтальмології (запальні захворювання очей, поранення та післяопераційні рани, кератити). На нашу думку, включення Q10 в ліпосомальні наноконтейнери, в мембрані яких буде знаходитися гідрофобна субстанція Q 10, є досить перспективним, оскільки дозволить створити водорозчинну форму Q 10. Крім того, створення препаратів на основі ліпосомальних наночастинок є одним з перспективних напрямків сучасної фармації. Ліпосоми мають ряд безсумнівних переваг: захищають клітини організму від токсичної дії лікарських речовин; пролонгують дію введеного в організм лікарського препарату; захищають лікарські речовини від деградації; сприяють прояву націленої специфічності за рахунок селективного проникнення з крові в тканини, що призводить до виборчої їх концентрації в зоні осередку ураження; змінюють фармакокінетику лікарських препаратів, підвищуючи їх фармакологічну ефективність; дозволяють створити водорозчинну форму ряду гідрофобних лікарських субстанцій, збільшуючи тим самим їх біодоступність [2]. Для виготовлення ліпосомальної форми препаратів використовується як ліпосомоутворюючі компоненти природні та синтетичні фосфатидилхоліни. Використання фосфатидилхолінів виправдано ще й тому, що вони характеризуються як високою мембранопротекторною активністю, так і антиоксидантною дією. Відомо ряд препаратів кардіопротекторної дії на основі убіхінонів, які застосовуються як при пероральному введенні, так і у вигляді ін'єкційних розчинів. Так, наприклад, у Росії відомий препарат "Кудесан" у вигляді крапель 3 % та "Кудесан" Форте у вигляді розчину виробництва компанії "Аквіон". "Кудесан" у вигляді крапель 3 %, містить Q10, α-токоферолу ацетат, аскорбіл пальмітат, макроголу гліцерилгідроксистеарат (кремофор RH-40), натрію бензоат, лимонну кислоту (харчову), воду очищену. "Кудесан" Форте відрізняється від "Кудесану" крапель 3 % тим, що в ньому міститься вдвічі більше Q10. Даний засіб має ряд недоліків: є біологічно активною добавкою, має низький кардіопротекторний ефект, низьку антиоксидантну активність, приймається per os. Відомі також засоби Liquid Q LiQsorb Liposomal CoQ10 Drops та Liquid QH Liposomal Ubiquinol CoQ10 виробництва Tishcon Corp. До складу Liquid Q LiQsorb Liposomal CoQ10 Drops входить: убіхінон, альфа-токоферол, вода очищена, тригліцериди із середнім ланцюгом, соєвий лецитин, полісорбат 80, лимонна кислота, сорбат калію. До складу Liquid QH Liposomal Ubiquinol CoQ10 входить: убіхінон, вода очищена, тригліцериди із середнім ланцюгом, соєвий лецитин, полісорбат 80, аскорбіл пальмітат, аскорбінова кислота, лимонна кислота, сорбат калію і альфа-токоферол. Дані засоби мають ряд недоліків: є біологічно активними добавками, не є лікарськими засобами, мають низький кардіопротекторний ефект, нестабільність фізико-хімічних властивостей в процесі зберігання (високий індекс окислення, високий вміст лізопродуктів); приймаються per os, що значно знижує біодоступність Q 10 та потребує прийому великої кількості продукту. Найбільш близьким до засобу, одержаного за способом згідно з корисною моделлю, є антигіпоксичний препарат, що характеризується кардіопротекторною дією [8]. Препарат випускається в Україні під назвою "Ліпін". Сьогодні препарат рекомендований для лікування гострого інфаркту міокарда та нестабільної стенокардії [2]. Застосування препарату "Ліпін" в ранньому періоді інфаркту міокарда значно знижує ризик розвитку небезпечних порушень ритму шлуночка, підвищує ефективність і безпеку лікування найбільш важкої категорії хворих. Ліпін знижує процеси ПОЛ, підтримує активність антиоксидантних систем організму, проявляє 1 UA 91702 U 5 10 15 20 25 30 35 мембранопротекторну дію. У хворих, яким для зменшення негативної дії реперфузії вводився "Ліпін", не було відзначено порушень ритму серця, проявів серцевої недостатності, випадків розвитку аневризми. Використання препарату може дозволити підвищити ефективність лікування та безпеку тромболітичної терапії у хворих похилого віку [2, 4]. Механізм антигіпоксичної дії ліпосом може бути обумовлений тим, що фосфоліпіди ліпосом є конкурентним субстратом для фосфоліпаз та продуцентів продуктів перекисного окислення. При цьому фосфоліпіди м'язових клітин залишаються неушкодженими. Ймовірно, існує певна тропність фосфатидилхолінових ліпосом до ішемічної тканини. Таким чином, запропоновано використовувати Ліпін як кардіопротектор при лікуванні інфаркту міокарда. Однак даний препарат має ряд істотних недоліків: фармакологічна та антиоксидантна активність заснована тільки на властивостях фосфатидилхоліну і не може повністю забезпечити захисний ефект серцевого м'яза людини; термін придатності продукту 1 рік, що пов'язано з процесами ПОЛ, які відбуваються в препараті, що також обмежує його застосування. Одним з істотних недоліків препарату є низький вміст у ньому кріопротектора, що, в свою чергу, не дозволяє зберегти розмір ліпосом в нанодіапазоні при заморожуванні та ліофілізації. Зазначені обставини знижують ефективність засобу з відомого рівня техніки як для способу його одержання, так і його стабільності та якості - ліпосомального препарату з фармакологічними властивостями. В основу корисної моделі поставлена задача забезпечення такого способу одержання кардіопротекторного засобу на основі природних фосфоліпідів та Q 10, взятих в певному співвідношенні, в якому забезпечується високий мембранопротекторний та антиоксидантний ефект. Ліпосомальна форма Q10 дозволить підвищити його біодоступність за рахунок ін'єкційного введення. Крім того, присутність в препараті фосфатидилхоліну підвищує антиоксидантну та мембранопротекторну властивості, що особливо важливо для відновлення біологічних мембран. Поставлена задача вирішується тим, що забезпечується спосіб одержання ліпосомального препарату з фармакологічною дією, що включає етапи, на яких розчин природного фосфатидилхоліну в етиловому спирті висушують у вакуумі з одержанням ліпідної плівки, одержану ліпідну плівку емульгують у водному середовищі з одержанням емульсії, диспергують вказану емульсію, причому в ході диспергування додають лактозу у вигляді водного розчину, одержану дисперговану емульсію піддають стерилізуючій фільтрації через каскад фільтрів з одержанням ліпосомального препарату, після чого вказаний ліпосомальний препарат ліофільно висушують, який відрізняється тим, що перед висушуванням у вакуумі до розчину природного фосфатидилхоліну додають розчин дипальмітоїлфосфатидилгліцерину у співвідношенні 1:0,10,12 та убіхінон в етиловому спирті при масовому співвідношенні (фосфатидилхолін+дипальмітоїлфосфатидилгліцерин):убіхінон 1:0,1-0,2, а масовий вміст лактози в емульсії ліпосом складає від 70,0 мг/мл до 80,0 мг/мл. Убіхінон (Q10) - природна речовина, що є вітаміноподібним коферментом (формула 1) O H3C H3C CH3 O H O CH3 O 10 40 45 50 . Формула 1 - Убіхінон (Q10). Biн належить до надзвичайно поширених коферментів, присутніх у всіх живих клітинах тварин, рослин, грибів та мікроорганізмів. Q 10 - ендогенний субстрат, бере участь у переносі електронів у транспортному ланцюжку окислювально-відновних процесів, в процесі обміну енергії, в реакції окислювального фосфорилювання в дихальному ланцюжку мітохондрій клітин. Бере участь у процесах клітинного дихання, збільшуючи синтез АТФ. Надає клінічно значиму антиоксидантну дію, а також відновлює антиоксидантну активність вітаміну Е α-токоферолу. Захищає ліпіди клітинних мембран від процесів ПОЛ. Скорочує зону пошкодження міокарда в умовах ішемії. Q10 перешкоджає подовженню інтервалу QT, покращує переносимість фізичних навантажень. Q10 розчинний у діетиловому ефірі, дуже слаборозчинний в етанолі, практично не розчиняється у воді. Повільно розкладається і змінює колір під дією кисню, УФ- або денного світла. 2 UA 91702 U 5 Як мембраноутворюючий фосфоліпід використовується фосфатидилхолін. При цьому фосфатидилхолін містить 90-98 мас. % основної речовини. Як відомо, фосфатидилхолін (формула 2) - ефіри холіну та дигліцеридфосфатних кислот, одна з основних фракцій фосфоліпідів. Молекули фосфатидилхолінів утворені залишками гліцеролу, жирних кислот (головним чином стеаринової, пальмітинової, олеїнової та лінолевої) і холіну O O O O O H P O O N+ O Формула 2 - Фосфатидилхолін 10 15 20 25 30 Поряд з негативно зарядженою фосфатною групою у фосфатидилхоліні знаходиться позитивно заряджений атом нітрогену. За рахунок врівноваження зарядів їх молекули в цілому нейтральні. Фосфатидилхоліни - гігроскопічні воскоподібні поверхнево-активні речовини, добре розчинні у спиртах, діетиловому та петролейному етерах, нерозчинні в ацетоні. Широко представлені в організмах тварин (в усіх органах і тканинах), яйцях птахів, а також у рослинах (найбільше у насінні сої та соняшника). Фосфатидилхоліни в організмі беруть участь в утворенні біологічних мембран. Фосфатидилхоліни використовуються в складі фармацевтичних засобів для запобігання розвитку захворювань печінки, серцево-судинної системи, нервової тканини. Вони мають мембранопротекторні властивості. Значимість препаратів, що містять фосфатидилхолін, визначається роллю останнього в біологічних мембранах: інгібуванням процесів ПОЛ; прискоренням регенерації пошкоджених клітинних мембран, наприклад, використанням фосфоліпідів як "будівельний" матеріал для пошкоджених органів. Фосфатидилхолін (лецитин) добре відомий компонент багатьох ін'єкційних лікарських препаратів: "Фосфоглів" (Фармстандарт, Росія), "Ессенціале форте Н" (Sanofi Aventis), "Ліпостабіл" (Aventis Pharma, Франція), "Ліпофундин" (Braun Melsungen, Німеччина), "Інтраліпід" (Fresenius Kabi, Австрія/Німеччина). У препаратах для парентерального харчування входить яєчний фосфатидилхолін [2]. Стаття, присвячена яєчним фосфоліпідам, описана в USP. Фосфатидилхолін утворює штучні мембрани (ліпосоми), в які вбудовуються гідрофобні сполуки, зокрема, убіхінони. До складу препарату введена лактоза, яка визначає стабільність ліпосоми при ліофілізації, виконуючи роль кріопротектора. Лактоза використовується для виробництва різних фармацевтичних препаратів: розчинів для ін'єкцій та інфузій, таблеток, капсул та ін. Лактоза - вуглевод групи дисахаридів, міститься в молоці і молочних продуктах (формула 3) OH CH2OH CH2OH O O OH 1  O 40 OH OH OH OH 35 . Формула 3 - Лактоза . Молекула лактози складається із залишків молекул глюкози і галактози. З хімічної точки зору лактоза належить до класу відновлювальних вуглеводів, які здатні віддавати електрони з розривом власного кисневого зв'язку. Лактоза міститься в багатьох ліках. Вона використовується як наповнювач, щоб придати консистенцію субстанції для таблетування в більш ніж 20 % ліків, а також використовується як кріопротектор. 3 UA 91702 U Фосфатидилгліцерини (формула 4) - одні з основних фосфоліпідів рослин та водоростей (до 60 % по масі від усіх фосфоліпідів у хлоропластах), а також більшості бактерій (до 70 % від усіх фосфоліпідів); в тканинах тварин - зазвичай мінорний фосфоліпід, який міститься в основному в мітохондріях, наприклад, в серцевому м'язі 5 O O O O O H P OH O OH O O Формула 4 - Фосфатидилгліцерин 10 15 20 25 30 35 40 45 50 . Таким чином, до складу кардіопротекторного засобу входять природні фосфоліпіди, Q 10, дипальмітоїлфосфатидилгліцерин компоненти, які забезпечують високий мембранопротекторний та антиоксидантний ефект. У варіанті здійснення способу одержання кардіопротекторного засобу, що заявляється, спосіб включає наступні етапи, на яких: Зважують фосфатидилхолін, дипальмітоїлфосфатидилгліцерин та Q 10. Сировину завантажують в ємність і в неї з мірника доливають етиловий спирт. Суміш перемішують протягом 2 годин при кімнатній температурі до повного розчинення сировини. Суміш компонентів в етиловому спирті фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм та концентрують у вакуумі при певній температурі до повного випарювання етанолу, а потім залишкові кількості розчинника випаровуються в струмі азоту. Одержану в результаті цього тонку ліпідну плівку гідратують у водному розчині або в розчині лактози на водяній бані при температурі 40-42 °C до одержання гомогенної суспензії. Гомогенізацію проводять шляхом проведення екструзії на установці типу "Microfluidics-110" при тиску 800 атм при температурі 3843 °C. Даний режим дозволяє отримати ліпосоми стандартного складу, основна маса яких представлена частинками з розміром 120-160 нм (80-90 % всіх ліпосом) до ліофілізації та (140180 нм) після ліофілізації. Критичними параметрами є температура, тиск у гомогенізаторі, кількість проведених циклів. Потім проводять стерилізуючу фільтрацію через фільтри з діаметром пор 0,8/0,22 мкм. Емульсію розливають у флакони і проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Як кріопротектор використовують лактозу при різних співвідношеннях фосфоліпіди:кріопротектор. Одержані стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального убіхінону розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат представляє гомогенну емульсію біло-жовтого кольору. Усі інгредієнти, що використовують для одержання кардіопротекторного засобу, дозволені до застосування у складі лікарських препаратів: - фосфатидилхолін - (яєчний); (USP) - дипальмітоїлфосфатидилгліцерин; (USP) - убіхінон (Q10); (USP) - лактоза; (USP, Ph Eur, ДФУ). На підставі проведених досліджень визначені та обґрунтовані оптимальні значення характеристик, що забезпечують досягнення технічного результату (табл. 1-7). Спочатку нами були складені модельні основи, що містять різні ліпіди, які потім були використані при одержанні ліпосомальних зразків. Основним фактором, що може пошкоджувати структуру ліпіду є процес гомогенізації при високому тиску, що супроводжується підвищенням температури, аерацією водної емульсії, наявністю тиску. Нами вивчено вплив зазначених чинників на фізико-хімічні та біологічні властивості фосфоліпідів. Ми використовували фосфатидилхолін концентрацією від 10 мг/мл до 30 мг/мл, виділений з трьох природних джерел: яєчного жовтка, сої та соняшнику, а також синтетичні фосфатидилхоліни: дипальмітоїлфосфатидилхолін (ДПФХ) та диміристоїлфосфатидилхолін (ДМФХ). Зазначені ліпіди найбільш часто використовуються в складі ліпосомальних лікарських препаратів [2]. Ми використовували наступні умови гомогенізації ліпідних емульсій: температура гомогенізації від 40 °C до 50 °C, гомогенізацію проводили протягом 10 циклів при 1200 атм. Одержані дані наведено в табл. 1. 4 UA 91702 U Таблиця 1 Вивчення впливу гомогенізації на властивості фосфоліпідів Тип фосфоліпіду Концентрація ФЛ в (ФЛ) емульсії мг/мл Яєчний ФХ Соєвий ФХ ФХ з соняшника ДПФХ 10-30 ДМФХ Яєчний +ДМФХ (1:1) Яєчний +ДПФХ (1:1) ФХ ФХ ДПФХ+ДМФХ (1:1) Гемолітична Індекс окислення Стабільність активність емульсії Вихідний/після емульсії ліпосом у іn vitro Вихідний/ обробки вигляді рідини після обробки Стабільна - не Відсутність 0,19/0,25 менше 2 годин активності Стабільна - не 0,35/0,48 + менше 2 годин 0,5/0,68 Не стабільна ++ Стабільна - не Відсутність 0,15/0,17 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,12/0,14 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,16/0,19 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,18/0,2 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,14/0,14 менше 2 годин активності Примітка ++++ - повний гемоліз; +++ 50 % - гемоліз; ++ 25 % гемоліз; + - початкова стадія гемолізу. 5 10 15 Дані, наведені в табл. 1, дозволяють використовувати для подальшої роботи зазначені ліпіди за винятком фосфатидилхоліну, виділеного з сої та соняшнику. При їх використанні виявлені гемолітичні властивості, причому гемолітичну активність мали не тільки зразки після гомогенізації, а й емульсії, одержані без гомогенізації з вихідного фосфатидилхоліну сої та соняшнику. Можливо це пов'язано з високим вмістом в продукті лізоформ. Крім того, у соєвого фосфатидилхоліну високий індекс окислення (0,35/0,48), що свідчить про окислення жирних кислот фосфоліпідів. Нами також встановлена гемолітична активність продукту з фосфатидилхоліну соняшнику. Крім того, використання даного фосфоліпіду не дозволяє отримати стабільні ліпосомальні емульсії. Інші використані фосфоліпіди та їх суміші продемонстрували властивості, що дозволяють використовувати їх у складі ліпосом. У наступній групі експериментів нами вивчено включення убіхінонув ліпосомальні емульсії на основі фосфатидилхоліну. Використовували вихідне співвідношення фосфоліпіди:убіхінон 9:1 (табл. 2), оскільки у попередніх експериментах нами виявлено, що оптимальним є вміст у продукті убіхінону 10 % відносно вмісту фосфоліпідного компонента. 5 UA 91702 U Таблиця 2 Залежність включення убіхінону від структури використовуваного фосфатидилхоліну Тип фосфоліпіду (ФЛ) Включення убіхінону в ліпосому, % Яєчний ФХ 64,0 ДПФХ 67,4 ДМФХ 65,7 Яєчний +ДМФХ (1:1) Яєчний +ДПФХ (1:1) ФХ ФХ ДПФХ+ДМФХ (1:1) 5 10 15 20 25 63,5 67,2 66,0 Гемолітична Стабільність активність емульсії Індекс окислення емульсії ліпосом у іn vitro після вигляді рідини обробки Стабільна - не Відсутність 0,22 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,17 менше 1,5 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,14 менше 1 години активності Стабільна - не Відсутність 0,19 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,2 менше 2 годин активності Стабільна - не Відсутність 0,14 менше 1 години активності Таким чином, результати проведених досліджень показали, що синтетичні фосфатидилхоліни утворюють менш стабільні ліпосоми порівняно з яєчним фосфатидилхоліном, що може бути обумовлено більш високою температурою фазового переходу у синтетичних ліпідів. Ступінь включення Q 10 в ліпосоми практично однакова. Індекс окислення збільшився до 0,22 (при вихідному 0,19), що дещо менше, ніж у раніше одержаних дослідах, табл. 1. Це може бути пов'язано з антиоксидантними властивостями Q 10. Тому в подальших експериментах та при розробці препарату нами використовувався фосфатидилхолін яєчного жовтка. В результаті проведених досліджень встановлено, що оптимальними умовами для одержання гомогенної стабільної емульсії є співвідношення Q 10 (1-2): фосфатидилхолін (8-10): дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (1-2) при температурі 38-43 °C, рН емульсії 6,5-7,0. Емульсія, яка одержана при зазначених параметрах, була стабільна і не розшаровувалася протягом від 2 до 4 годин. Використання ліпосом зазначеного розміру (120-160 нм (80-90 % всіх ліпосом) до ліофілізації та (140-180 нм) після ліофілізації) як лікарського засобу для внутрішньовенного введення можливо у зв'язку з їх розміром, низьким ступенем окислення і відсутністю продуктів гідролізу. Введення до складу ліпосом кислих фосфоліпідів, наприклад, дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, призводило до підвищення включення Q10. Нами виявлено, що збільшення кількості циклів або величини тиску призводить до нестабільності ліпосом, збільшення їх розмірів або злиття. Контроль процесу гомогенізації ми оцінювали за розміром ліпосом, і при збільшенні цього параметра процес слід припиняти. При одержанні ліпосомальної форми Q10 препаратів нами використовувався тиск 800 атм, кількість циклів не більше 5. Далі, нами проведено дослідження з вивчення впливу розміру ліпосом та їх заряду на ступінь включення субстанції. Виявлено, що на стабільність ліпосом і включення Q 10 до їх складу впливає іонна сила, величина рН, температура проведення технологічного процесу, заряд та розмір ліпосом (табл. 3). Крім того, самостійне значення має стабільність самого лікарського засобу на основі Q10, що включається до ліпосом. 30 6 UA 91702 U Таблиця 3 Залежність фізико-хімічних властивостей ліпосом, що містять убіхінон, від умов одержання Характеристика Ліпосом включення Q10 в ліпосому при 800 атм та 5 циклах, мг/мл включення Q10 в ліпосому при 800 атм та 7 циклах, мг/мл розмір ліпосом, які містять Q10, при 800 атм та 5 циклах, нм розмір ліпосом, які містять Q10, при 800 атм та 7 циклах, нм включення Q10 в ліпосому при 800 атм, 5 циклах та температурі 3843 °C, мг/мл включення Q10 в ліпосому при 800 атм, 5 циклах та температурі 4550 °C мг/мл Індекс окислення при 800 атм, 5 циклах та температурі 3843 °C Індекс окислення при 800 атм, 5 циклах та температурі 4550 °C 5 10 15 Q10:ФX 1:9 Q10:ФX 2:8 Q10:ФX:ДПФГ 1:9:1 Q10:ФX: ДПФГ 1:8:2 0,65 0,64 0,86 0,84 0,42 0,46 0,52 0,5 120-180 120-200 100-160 100-140 80-150 100-150 60-120 50-120 0,67 0,64 0,88 0,83 0,60 0,56 0,70 0,73 0,31-0,35 0,32-0,35 0,33-0,37 0,34-0,39 0,44-0,5 0,42-0,52 0,46-0,57 0,45-0,57 Як видно з наведених у таблиці 3 даних, включення в ліпідний бішар Q10 при використанні співвідношень Q10:фосфатидилхолін (1:9) та Q10:фосфатидилхолін (2:8) не відрізнялося, що свідчить про максимальну насиченість антиоксидантом мембрани ліпосом. Однак, нами виявлено, що включення в ліпосоми дипальмітоїлфосфатидилгліцерину дозволило збільшити включення Q10 в ліпосоми на 30 %. Оптимальна кількість циклів, що дозволяє отримати ліпосоми в нанодіапазоні становить не більше 5. При цьому одержано наночастинки з розміром до 200 нм, що дозволяє проводити стерилізуючу фільтрацію через мембрани 0,22 мкм. Збільшеннякількості циклів, хоча і призводить до зменшення розмірів ліпосом, знижує включення Q10 в мембрану. Визначено температуру гомогенізації емульсії 38-43 °C, при якій індекс окислення практично не відрізняється від індексу окислення вихідної суміші ліпідів. Підвищення температури до 45-50 °C призводить до підвищення індексу окислення ліпідів практично в два рази. Таким чином, до складу препарату введений негативно заряджений фосфоліпід дипальмітоїлфосфатидилгліцерин. Його присутність дозволяє, по-перше, збільшити включення Q10 в мембрану ліпосом, по-друге, підвищує стабільність ліпосомальної емульсії. Крім того, 7 UA 91702 U 5 10 дипальмітоїлфосфатидилгліцерин поліпшує фільтрування емульсії через мембрани з порами розміром 0,22 мкм. Стабілізуюча речовина - кріопротектор для ліпосомального препарату - у кожному конкретному випадку має бути визначена експериментальним шляхом. Для ліпосомальних препаратів найкращі результати одержані при використанні сполук вуглеводної природи цукрів. З метою вивчення впливу введення цукрів у ліпідну емульсію на ступінь включення Q 10 в ліпідну мембрану проведена наступна група експериментів (табл. 4). Нами використані три кріопротектори: лактоза, трегалоза, сахароза, які найбільш часто використовуються при ліофілізації наноструктур. Цукри використовувалися в різних концентраціях від 20 до 80 мг/мл. Таблиця 4 Вплив різних цукрів на включення Q10 на різних стадіях Найменування цукру Сахароза Трегалоза Лактоза 15 20 25 Введення цукру Введення цукру при регідратації Включення Q10, % Включення Q10, % при гомогенізації плівки Від 20 до 80 мг/мл 48-57 Від 20 до 80 мг/мл 60-64 Від 20 до 80 мг/мл 55-60 Від 20 до 80 мг/мл 65-70 Від 20 до 80 мг/мл 55-58 Від 20 до 80 мг/мл 65-70 Цукри вводили як на першому етапі, при гідратації ліпідної плівки водним розчинником, так і між 3 та 4 циклами. Цукри вводили у формі концентрованих стерильних розчинів. Виявлено, що введення досліджуваних розчинів цукрів на стадії гідратації призводить до зниження включення Q10 до складу ліпосом. Додавання розчинів цукрів (лактози та трегалози) у процесі гомогенізації приводить до включення Q10 в ліпосоми до 65-70 %. Таким чином, кріопротектори вуглеводної природи (наприклад, лактоза або трегалоза) можуть на першому етапі призвести до небажаної зміни розміру ліпосом та знизити включення до них лікарської активної фармакологічної субстанції. При цьому особливу увагу потрібно приділяти досягненню необхідного розміру ліпосом та виключенню їх агрегації. Враховуючи, що сахароза дає дещо менше включення Q 10 в ліпосоми, надалі ми використовували як кріпротектор лактозу (тому що трегалоза на відміну від лактози не описана в фармакопеях України, Європи, США та ін., як наслідок, ми не використовували розчини трегалози в нашій роботі). Таким чином, основним критерієм підбору кріопротекторів є збереження ліпосомою стабільних розмірів при дегідратації мембран ліпосом. Для визначення оптимальної концентрації лактози в препараті проведені експерименти, в яких додавання розчину лактози до складу емульсії ліпосом проводили між 3 та 4 циклами гомогенізації до кінцевої концентрації цукру 20, 40 та 80 мг/мл (табл. 5). Таблиця 5 Вплив концентрації лактози на стабільність нанорозмірів ліпосом Концентрація лактози, мг/мл 20,0 40,0 80,0 Включення Q10 в ліпосоми до ліофілізації, % 68-73 66-70 65-70 Розмір ліпосом до ліофілізації, нм 130-180 130-180 130-180 Включення Q10 в ліпосоми після ліофілізації, % 58-62 60-66 65-68 Розмір ліпосом після ліофілізації, нм 175-240 170-230 140-180 30 35 40 Як видно з таблиці 5, використання різних концентрацій лактози призводить до одержання близьких розмірів ліпосом до ліофілізації. У той же час після проведення процесу ліофілізації препаратів збереження розмірів наночастинок у нанодіапазоні спостерігається тільки при концентрації кріопротектора (лактози) у кінцевій концентрації 80 мг/мл. Після формування ліпосом, що містять лікарський препарат, виникає необхідність поділу суміші, яка складається з "вільного" препарату і "навантажених" ліпосом. Після одержання ліпосомальної емульсії на основі Q10 перед нами стояло завдання відділення не включеної в ліпосоми субстанції. Враховуючи гідрофобні властивості Q10, нами використані два методи: центрифугування емульсії (при 10 тис. об./хв. і температурі 6-10 °C) з метою осадження нерозчинного у воді Q10 та відділення його за допомогою фільтрації через мембрани з розміром 8 UA 91702 U пор 0,45 мкм або 0,22 мкм. Використовуючи обидва методи, вдається відділити вільну форму Q10. Для підтвердження повноти видалення "вільного" Q10 було проведено визначення вмісту речовини в ліпосомальній емульсії, а також в осаді, одержаному при центрифугуванні та в розчині, одержаному при змиві з фільтра органічним розчинником (табл. 6). 5 Таблиця 6 Результати видалення "вільного" убіхінону з ліпосомальної емульсії (*) Метод видалення "вільного" Q10 Центрифугування емульсії Фільтрація емульсії Об'єм емульсії (мл) та кількість Q10 (мг) Вміст ліпосомального Q10 в емульсії (мг) Вміст "вільного" Q10 (мг) Всього Q10 (мг) 100 мл/100 мг 84,5 16,0 100,5 100 мл/100 мг 82,6 17,2 99,8 * наведені середні дані з трьох експериментів 10 15 20 Як видно з наведених даних (табл. 6), центрифугування та мембранна фільтрація призводять до близьких результатів: вміст "вільного" Q 10 становить 16-17,2 % від доданого в емульсію Q10. Нами для подальших досліджень використовувалася фільтрація через мембранні фільтри. Останнє пов'язано з тим, що центрифугування призводить до додаткової технологічної стадії та необхідності в промисловому обладнанні. Фільтрація є необхідною стадією при одержанні стерильного препарату. Тому був введений каскад фільтрів (0,8 мкм, 0,45 мкм та 0,22 мкм) для видалення "вільного" Q10 та одержання стерильної емульсії ліпосом. Необхідно відзначити, що вказана фільтрація дозволяє так само проводити стандартизацію препарату ліпосом, відокремлюючи крім "вільного" Q 10 незначну кількість більших ліпосомальних частинок. Дані, одержані нами, свідчать, що втрати ліпосом складають не більше 0,5-0,7 % (визначення проводили за вмістом ліпідного фосфору у вихідній емульсії та емульсії, що пройшла стерилізуючу фільтрацію). Після проведення досліджень, до складу препарату була введена лактоза (ДФУ, USP, Ph Eur), яка визначає стабільність ліпосоми при ліофілізації, виконуючи роль кріопротектора. Одержаний ліпосомальний препарат на основі Q10 являє собою наноемульсію з розміром частинок 140-180 нм. Після ліофілізації, завдяки лактозі, препарат зберігає нанорозміри. У таблиці 7 наведені характеристики ліпосомальних зразків Q 10 до та після ліофілізації. Таблиця 7 Характеристика ліпосомальних зразків Q10 до та після ліофілізації Q10 мг/мл % ДПФГ в ЛС ФХ мг/мл Лактоза мг/мл Включення Q10 в ЛС, % 1,0 1,0 1,0 1,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 80,0 70,0 85,0 60,0 80-85 80-85 80-85 80-85 Розмір ЛС, Включення Розмір ЛС, нм до Q10 в ЛС, % нм ліофілізації п/ліофілізації п/ліофілізації 130-160 80-85 140-180 130-160 80-85 140-180 130-160 80-85 140-180 130-160 80-82 165-210 25 30 35 Як видно з таблиці 7, оптимальний вміст кріопротектора лактози в суміші знаходиться в межах від 70 мг/мл до 80 мг/мл. Зниження вмісту лактози (менше 70 мг/мл) в емульсії призводило до збільшення розміру наночастинок після ліофілізації 165-210 нм. Підвищення вмісту лактози (85 мг/мл) не приводило до стабілізації розмірів ліпосом, в порівнянні з 80 мг/мл лактози в емульсії. Можливість здійснення способу, який заявляється, ілюструється наступними прикладами, а для порівняння - прикладом за способом-прототипу. Приклад 1 Зважують компоненти на об'єм препарату - 1 літр емульсії: 9 грам фосфатидилхоліну, 0,9 грам дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, 1,0 грам Q 10, 70 грам лактози. Фосфатидилхолін та дипальмітоїлфосфатидилгліцерин розчиняють в 200 мл етанолу. Суміш перемішують до повного розчинення при температурі 30-35 °C. До розчину додають Q10 та суміш перемішують 9 UA 91702 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при кімнатній температурі до повного розчинення. Суміш гідрофобних компонентів в етанолі фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержаний стерильний розчин концентрують на вакуумному роторному випарнику при температурі 37-40 °C до повного видалення етанолу, а потім ліпідну плівку обробляють газоподібним азотом. Одержану ліпідну плівку гідратують водою для ін'єкцій в об'ємі 0,8 літра. Проводять перемішування емульсії до повного видалення плівки та одержання гомогенної емульсії. 80 грам лактози розчиняють у воді для ін'єкцій при температурі 50-60 °C. Розчин доводять до кінцевого об'єму 0,2 л. Розчин лактози фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержану гомогенну емульсію диспергують на установці "Microfluidics-110" при тиску 800 атм і температурі 38-43 °C. Проводять 5 циклів гомогенізації. Між 3 та 4 циклами додають стерильний розчин лактози. Кінцевий об'єм після гомогенізації складає 1,0 літр. Одержують гомогенну емульсію з розміром частинок 130-160 нм. Потім одержану емульсію фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Вміст Q10 в 1 мл складає 0,835 мг (з урахуванням включення). Емульсію розливають по 24 мл (20 мг) у флакони та проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Одержані стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального Q10 розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат являє собою гомогенну емульсію білого-жовтого кольору. Одержаний препарат містить у флаконі 20 мг Q 10. Співвідношення фосфоліпіди:Q10 складає 1:0,1. Співвідношення між фосфатидилхоліном:дипальмітоїлфосфатидилгліцерином складає 1:0,1. Вміст лактози в емульсії складає 70 мг/мл. Розмір наночастинок після ліофілізації складає 153,6 нм (98,25 %). Індекс окислення складає 0,33. Включення Q10 в ліпосоми 83,5 %. Приклад 2 Зважують компоненти на об'єм препарату - 1 літр емульсії: 9 грам фосфатидилхоліну, 1,35 грама дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, 1,148 грама Q 10, 75 грам лактози. Фосфатидилхолін та дипальмітоїлфосфатидилгліцерин розчиняють в 250 мл етанолу. Суміш перемішують до повного розчинення при температурі 30-35 °C. До розчину додають Q10 і суміш перемішують при кімнатній температурі до повного розчинення. Суміш гідрофобних компонентів в етанолі фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержаний стерильний розчин концентрують на вакуумному роторному випарнику при температурі 37-40 °C до повного видалення етанолу, а потім ліпідну плівку обробляють газоподібним азотом. Одержану ліпідну плівку гідратують водою для ін'єкцій в об'ємі 0,8 літра. Проводять перемішування емульсії до повного видалення плівки та одержання гомогенної емульсії. 75 грам лактози розчиняють у воді для ін'єкцій при температурі 50-60 °C. Розчин доводять до кінцевого об'єму 0,2 л. Розчин лактози фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержану гомогенну емульсію диспергують на установці "Microfluidics-110" при тиску 800 атм і температурі 38-43 °C. Проводять 5 циклів гомогенізації. Між 3 та 4 циклами додають стерильний розчин лактози. Кінцевий об'єм після гомогенізації складає 1,0 літр. Одержують гомогенну емульсію з розміром частинок 130-160 нм. Потім одержану емульсію фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Вміст Q10 в 1 мл складає 0,976 мг (з урахуванням включення). Емульсію розливають по 21,0 мл (20 мг) у флакони та проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Одержані стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального Q10 розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат представляє гомогенну емульсію біло-жовтого кольору. Одержаний препарат містить у флаконі 20 мг Q 10. Співвідношення фосфоліпіди:Q10 складає 1:0,11. Співвідношення фосфатидилхолін:дипальмітоїлфосфатидилгліцерин складає 1:0,15. Вміст лактози в емульсії складає 75 мг/мл. Розмір наночастинок після ліофілізації складає 147,3 нм (96,7 %). Індекс окислення складає 0,35. Включення Q10 в ліпосоми складає 85,0 %. Приклад 3 Зважують компоненти на об'єм препарату - 1 літр емульсії: 9 грам фосфатидилхоліну, 1,8 грам дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, 1,3 грама Q 10, 80 грам лактози. Фосфатидилхолін та дипальмітоїлфосфатидилгліцерин розчиняють в 200 мл етанолу. Суміш перемішують до повного розчинення при температурі 30-35 °C. До розчину додають Q10 та суміш перемішують при кімнатній температурі до повного розчинення. Суміш гідрофобних компонентів в етанолі фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержаний стерильний розчин концентрують на вакуумному роторному випарнику при температурі 37-40 °C до повного видалення етанолу, а потім ліпідну плівку обробляють газоподібним азотом. Одержану ліпідну плівку гідратують водою для ін'єкцій в об'ємі 0,8 літра. Проводять перемішування емульсії до повного видалення плівки та одержання гомогенної емульсії. 80 грам лактози розчиняють у воді для ін'єкцій при температурі 50-60 °C. Розчин доводять до кінцевого об'єму 0,2 л. Розчин лактози фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. 10 UA 91702 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одержану гомогенну емульсію диспергують на установці "Microfluidics-110" при тиску 800 атм та температурі 38-43 °C. Проводять 5 циклів гомогенізації. Між 3 та 4 циклами додають стерильний розчин лактози. Кінцевий об'єм після гомогенізації складає 1,0 літр. Одержують гомогенну емульсію з розміром наночастинок 130-150 нм. Потім одержану емульсію фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Вміст Q10 в 1 мл складає 1,089 мг (з урахуванням включення). Емульсію розливають по 18,5 мл (20 мг) у флакони та проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Одержані стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального Q10 розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат представляє гомогенну емульсію біло-жовтого кольору. Одержаний препарат містить у флаконі 20 мг Q 10. Співвідношення фосфоліпіди:Q10 складає 1:0,12. Співвідношення фосфатидилхолін:дипальмітоїлфосфатидилгліцерин складає 1:0,2. Вміст лактози в емульсії складає 80 мг/мл. Розмір наночастинок після ліофілізації 153,6 нм (95,5 %). Індекс окислення складає 0,33. Включення Q10 в ліпосоми складає 83,8 %. Приклад 4 Зважують компоненти на об'єм препарату - 1 літр емульсії: 9 грам фосфатидилхоліну, 2,5 грама дипальмітоїлфосфатидилгліцерину, 1,2 грама Q 10, 60 грам лактози. Фосфатидилхолін та дипальмітоїлфосфатидилгліцерин розчиняють в 200 мл етанолу. Суміш перемішують до повного розчинення при температурі 30-35 °C. До розчину додають Q10 та суміш перемішують при кімнатній температурі до повного розчинення. Суміш гідрофобних компонентів в етанолі фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержаний стерильний розчин концентрують на вакуумному роторному випарнику при температурі 37-40 °C до повного видалення етанолу, а потім ліпідну плівку обробляють газоподібним азотом. Одержану ліпідну плівку гідратують водою для ін'єкцій в об'ємі 0,8 літра. Проводять перемішування емульсії до повного видалення плівки та одержання гомогенної емульсії. 80 грам лактози розчиняють у воді для ін'єкцій при температурі 50-60 °C. Розчин доводять до кінцевого об'єму 0,2 л. Розчин лактози фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержану гомогенну емульсію диспергують на установці "Microfluidics-110" при тиску 800 атм та температурі 38-43 °C. Проводять 5 циклів гомогенізації. Між 3 та 4 циклами додають стерильний розчин лактози. Кінцевий об'єм після гомогенізації складає 1,0 літр. Одержують гомогенну емульсію з розміром частинок 130-160 нм. Потім одержану емульсію фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Вміст Q10 в 1 мл складає 0,678 мг. Емульсію розливають по 30 мл (20 мг) у флакони та проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Одержані стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального Q 10 розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат представляє являє собою гомогенну емульсію біло-жовтого кольору. Одержаний препарат містить у флаконі 20 мг Q10. Співвідношення фосфоліпіди:Q10 складає 1:0,13. Співвідношення фосфатидилхолін:дипальмітоїлфосфатидилгліцерин складає 1:0,27. Вміст лактози в емульсії складає 60 мг/мл. Розмір наночастинок після ліофілізації складає 200,8 нм (88,25 %). Індекс окислення складає 0,33. Включення Q10 в ліпосоми складає 56,5 %. Як видно з наведених даних, порушення встановлених співвідношень призводить до низького включення Q10 в ліпосоми (збільшена кількість дипальмітоїлфосфатидилгліцерина та Q10), збільшення розмірів наночастинок при ліофілізації (зниження концентрації кріопротектора лактози в емульсії). Приклад 5 (За способом-прототипом) Зважують компоненти на об'єм препарату - 1 літр емульсії: 25 грам фосфатидилхоліну, 25 грам лактози. Фосфатидилхолін розчиняють в 200 мл етанолу. Суміш перемішують до повного розчинення при температурі 30-35 °C. Розчин фосфатидилхоліну в етанолі фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержаний стерильний розчин концентрують на вакуумному роторному випарнику при температурі 37-40 °C до повного видалення етанолу, а потім ліпідну плівку обробляють газоподібним азотом. Одержану ліпідну плівку гідратують водою для ін'єкцій в об'ємі 0,8 літра. Проводять перемішування емульсії до повного видалення плівки та одержання гомогенної емульсії. 25 грам лактози розчиняють у воді для ін'єкцій при температурі 50-60 °C. Розчин доводять до кінцевого об'єму 0,2 л. Розчин лактози фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Одержану гомогенну емульсію диспергують на установці "Microfluidics-110" при тиску 800 атм та температурі 38-43 °C. Проводять 8 циклів гомогенізації. Між 7 та 8 циклами додають стерильний розчин лактози. Кінцевий об'єм після гомогенізації складає 1,0 літр. Одержують гомогенну емульсію з розміром наночастинок 150-160 нм. Потім одержану емульсію фільтрують через мембрани з розміром пор 0,2 мкм. Емульсію розливають по 20 мл у флакони та проводять ліофілізацію з подальшою герметизацією в атмосфері інертного газу. Одержані 11 UA 91702 U 5 10 15 20 стерильні ліофілізовані зразки ліпосомального препарату розчиняють в стерильному водному розчиннику. Препарат представляє собою гомогенну емульсію біло-жовтого кольору. Вміст лактози в емульсії складає 25 мг/мл. Розмір наночастинок після ліофілізації складає 212,5 нм (90,25 %). Індекс окислення складає 0,46. Ефективність використання кардіопротекторного засобу, одержаним за способом, що заявляється, досліджувалась на тваринах (пацюках) в умовах інфаркту міокарда та ішемічної хвороби серця (ІХС) згідно з рекомендаціями [5, 6]. Всі маніпуляції, що призводили до болю, проводили під гексеналовим наркозом (60 мг/кг підшкірно), відповідно до міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів та інших наукових цілей [3]. Моделювання інфаркту міокарда робили шляхом одноразового внутрішньочеревного введення 0,25 мл 0,18 % розчину адреналіну гідрохлориду. Препарат вводили: а) одноразово, за 30 хв. до початку експерименту в дозі 10 мг/кг, внутрішньовенно, б) щоденно протягом 5 днів після моделювання в дозі 10 мг/кг, внутрішньовенно. ПОЛ оцінювали за вмістом ТБК - активних продуктів - малонового діальдегіду (МДА) та дієнових кон'югатів (ДК). Активність антиоксидантної системи (АОС) оцінювали за загальною антиоксидантною активністю (ЗАА). Також визначали вміст ізопростана-8 - маркера окисного стресу. Моделювання ІХС робили за методом, описаним Гаман Л.В.: щодня протягом 7 днів підшкірно вводили 0,1 мл 0,1 % розчину адреналіну гідрохлориду і 1 мл 2,5 % емульсії гідрокортизону ацетату. Препарат вводили щодня протягом 5 днів після моделювання в дозі 10 мг/кг, внутрішньовенно. Фармакологічна активність кардіопротекторного засобу, одержаного за способом, що заявляється, підтверджується відповідними експериментами. Дані наведені в таблиці 8. Таблиця 8 Результати дослідження антиоксидантної активності кардіопротекторного засобу, одержаного за способом, що заявляється, на моделі інфаркту міокарда (сироватка крові) Група Контроль, n=8 Інфаркт, n=8 Введення препарату, 5 днів n=8 Введення препарату порівняння*, 5 днів n=8 Одноразове введення n=8 Одноразове введення препарату порівняння*, n=6 ДК, мкмоль/л 52,34±2,02 1 92,14±6,34 60,48±3,11 Р