Композиція на основі гібридного білка glp-1fc

Реферат: Винахід стосується композиції, придатної для лікування діабету та ожиріння, а також ряду інших станів або розладів, яка знаходиться у вигляді стабільного розчину, що містить терапевтично ефективну кількість гібридного білка GLP-1-Fc у цитратному буфері з полісорбатом-80 та манітом, причому рН згаданого розчину становить від приблизно 6 до 7. UA 97673 C2 (12) UA 97673 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід має відношення до комерційної композиції на основі аналога глюкагоноподібного пептиду, що є злитим з Fc-фрагментом імуноглобуліну. Ця композиція може застосовуватись для лікування діабету та ожиріння, а також ряду інших станів або розладів. Передумови створення винаходу Аналоги та похідні глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1) при проведенні клінічних випробувань продемонстрували свою перспективність щодо лікування діабету типу 2. GLP-1 спричинює численні біологічні ефекти, такі як стимулювання секреції інсуліну, пригнічення секреції глюкагону, пригнічення спорожнення шлунка, пригнічення рухової функції шлунка або перистальтики кишечнику та стимулювання схуднення. Суттєвою властивістю GLP-1 є його здатність до стимулювання секреції інсуліну без пов'язаного із цим ризику гіпоглікемії, що спостерігається при застосуванні інсулінотерапії або пероральних лікарських засобів певних типів, дія яких грунтується на підвищенні експресії інсуліну. Прийнятність лікування із застосуванням пептидів GLP-1 обмежується тим, що GLP-1(1-37) має низьку активність, а два природні скорочені пептиди, GLP-1(7-37)OH та GLP-1(7-36)NH2, мають високий рівень кліренсу in vivo та надзвичайно короткий час напіввиведення in vivo. Відомо, що ендогенно продукована дипептидилпептидаза IV (DPP-IV) інактивує циркулюючі пептиди GLP-1 шляхом видалення N-кінцевих залишків гістидину та аланіну і є головною причиною короткого часу напіввиведення in vivo. Для подовження періоду напіввиведення пептиду GLP-1 або зниження рівня кліренсу пептиду з організму із одночасним збереженням біологічної активності вдавались до різних методів. У одному з методів застосоване злиття пептиду GLP-1 з Fc-фрагментом імуноглобуліну. Імуноглобуліни, як правило, мають тривалий період напіввиведення з кровообігу in vivo. Наприклад, молекули IgG можуть мати період напіввиведення у людей до 23 днів. Fcфрагмент імуноглобуліну несе часткову відповідальність за цю стабільність in vivo. Гібридні білки GLP-1-Fc набувають перевагу стабільності, що надається Fc-фрагментом імуноглобуліну, з одночасним збереження біологічної активності молекули GLP-1. Незважаючи на придатність цього методу для одержання лікарських засобів на основі GLP-1 (дивись WO 02/46227), існує загальна занепокоєність щодо антигенності різних гібридних білків при повторному введенні впродовж тривалих періодів часу. Особливе занепокоєння викликають лікарські засоби на основі гібридних білків GLP-1-Fc, оскільки пацієнт, що страждає на діабет, після діагностування цього захворювання, повинен лікуватись впродовж усього свого життя. Крім того, лікарські засоби на основі гібридного білка Fc можуть викликати занепокоєння, якщо Fc-фрагмент зберігає небажані ефекторні функції. Цей метод знаходиться у центрі уваги PCT/US04/15595 (WO2005/000892), де проблеми, пов'язані з потенційною імуногенністю та ефекторною активністю, що пов'язуються із введенням гібридних білків GLP-1-Fc, вирішуються шляхом виявлення специфічних гібридних білків GLP-1-Fc, що мають знижений ризик спричинення імунної реакції після повторного та тривалого введення і більше не мають ефекторної функції. Гібридні білки цієї природи у технічному відношенні є занадто великими та складними для продукування синтетичним або рекомбінантним шляхом у бактеріальних клітинах. Ці гібридні білки, як правило, продукуються у клітинах ссавців, таких як клітини СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка), клітини лінії 293 або клітини лінії NS0. Спостерігалось, що гібридні білки, продуковані у клітинах ссавців, є більш сприйнятливими до розкладання ендогенними протеазами та хімічної зміни, порівняно з негібридними білками, продукованими у бактеріальних клітинах. Цю проблему намагались вирішити у заявці PCT/US2005/045376 (WO2006/068910), у якій було описано, що композиція, яка містить гібридний білок GLP-1-Fc, забуферена при рН від приблизно 6 до приблизно 8,5, забезпечувала підвищену хімічну стабільність. І все ж, навіть якщо нестабільність, спричинювана протеазами клітини-хазяїна, утримується під контролем, композиція, якщо вона є фізично нестабільною, може бути неприйнятною. Іншою проблемою, яку спостерігав автор цього винаходу, є утворення розчинних агрегатів та нерозчинних частинок при довгостроковому зберіганні композиції у вигляді розчину. Цю проблему намагаються вирішити специфічною комбінацією наповнювачів та специфічною концентрацією гібридного білка GLP-1-Fc. Для вирішення проблеми розчинних агрегатів та нерозчинних частинок при довгостроковому зберіганні композиції у вигляді розчину гібридного білка GLP-1-Fc автор цього винаходу розробив композицію у вигляді фізично та хімічно стійкого розчину, що містить від приблизно 0,5 мг/мл до приблизно 10 мг/мл гібридного білка GLP-1-Fc, від 5 мМ до 20 мМ цитратного буфера, від 0,01 % до 0,05 % (у відношенні маси до об'єму) полісорбату-80 та від 4,0 % до 5,3 % (у відношенні маси до об'єму) маніту, і має рН 6-7. Ця композиція надавала неочікуваний і 1 UA 97673 C2 5 10 15 20 25 значно менший рівень розчинних агрегатів та нерозчинних частинок при довгостроковому зберіганні. Крім того, автор цього винаходу відкрив, що ця композиція у вигляді розчину після тривалого зберігання є більш стабільною у шприці, ніж у ампулі. Цей винахід включає також способи лікування пацієнтів, які страждають на діабет та ожиріння, а також ряду інших станів або розладів, що включають введення композиції на основі гібридного білка GLP-1-Fc. Гібридний білок GLP-1-Fc за цим винаходом містить сполуку GLP-1, С-кінець якої за допомогою пептидного лінкера злитий з N-кінцем аналога Fc-фрагмента імуноглобуліну. Згаданий гібридний білок є біологічно активним як мономер або як гомодимер і має більш тривалий період напіввиведення, порівняно з нативним GLP-1. Гібридний білок GLP-1-Fc, якому віддається перевага, містить амінокислотну послідовність, що представлена послідовністю (SEQ ID NO: 1). Гібридний білок GLP-1-Fc, якому віддається більша перевага, складається по суті з амінокислотної послідовності, що представлена послідовністю (SEQ ID NO: 1). Гібридний білок GLP-l-Fc, якому віддається найбільша перевага, складається з амінокислотної послідовності, що представлена послідовністю (SEQ ID NO: 1). Дисульфідні зв'язки можуть існувати усередині ланцюга (на будь-якому з ланцюгів — А або В) та/або між ланцюгами (між обома ланцюгами — А та В). Прикладами внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків є: Cys90A-Cysl50A, Cysl96A-Cys254A, Cys90B-Cysl50B, Cysl96B-Cys254B. Прикладами міжланцюгових дисульфідних зв'язків є: Cys55A-Cys55B, Cys58A-Cys58B. Біологічна активність означає здатність гібридного білка до зв'язування з рецептором GLP-1 і його активації in vivo та викликання реакції. Реакції охоплюють (але ними не обмежуються) секрецію інсуліну, пригнічення глюкагону, пригнічення апетиту, схуднення, викликання почуття 2 UA 97673 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ситості, пригнічення апоптозу, спричинення проліферації бета-клітин підшлункової залози та диференціювання бета-клітин підшлункової залози. Композиція на основі гібридного білка GLP-1-Fc містить від приблизно 0,25 мг/мл до приблизно 10 мг/мл гібридного білка GLP-1-Fc. Концентрація згаданого гібридного білка, якій віддається перевага, у мг/мл, становить від приблизно 0,5 до 10, від 0,5 до 5, від 0,5 до 2,5, від 0,5 до 2, від 0,5 до 1,67, від 0,5 до 1,5, від 0,5 до 1,25, від 0,5 до 1, від 0,5 до 0,9, від 0,5 до 0,8, 0,5 до 0,75, від 0,6 до 2, від 0,7 до 2, від 0,8 до 2, від 0,9 до 2, від 0,5 до 3, від 0,6 до 3, від 0,7 до 3, від 0,8 до 3, від 0,9 до 3, від 0,5 до 4, від 0,6 до 4, від 0,7 до 4, від 0,8 до 4, від 0,9 до 4, від 1 до 2, від 1,1 до 2, від 1,2 до 2, від 1,3 до 2, від 1,4 до 2, від 1,5 до 2, від 1,6 до 2, від 0,7 до 1,67, від 0,9 до 1,1, від 1 до 4, від 0,5 до 5, від 0,25 до 7, від 0,25 до 5, від 0,25 до 4, від 0,25 до 3, від 0,25 до 2, від 0,25 до 1,5, від 0,25 до 1, від 0,25 до 0,5. Концентрація гібридного білка GLP-1-Fc, якій віддається перевага, у мг/мл, становить приблизно 0,25, приблизно 0,42, приблизно 0,5, приблизно 0,6, приблизно 0,67, приблизно 0,7, приблизно 0,75, приблизно 0,8, приблизно 0,83, приблизно 0,9, приблизно 1, приблизно 1,1, приблизно 1,2, приблизно 1,25, приблизно 1,3, приблизно 1,4, приблизно 1,5, приблизно 1,6, приблизно 1,67, приблизно 1,7, приблизно 1,8, приблизно 1,9, приблизно 2, приблизно 2,5, приблизно 3, приблизно 3,33, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6,67 або приблизно 10. Композиція на основі гібридного білка GLP-1-Fc є забуференою цитратним буфером, концетрація якого становить від приблизно 5 мМ до 20 мМ. Концентрація цитратного буфера, якій віддається перевага, у мМ, становить від приблизно 5 до 15, від 5 до 12,5, від 5 до 10, від 7,5 до 20, від 7,5 до 15, від 7,5 до 12,5, від 7,5 до 10, від 8 до 20, від 8 до 15, від 8 до 12,5, від 8 до 11, від 8 до 10, від 9 до 20, від 9 до 15, від 9 до 12,5, від 10 до 20, від 10 до 17,5, від 10 до 15, від 10 до 12,5, від 6 до 14, від 7 до 13, від 8 до 12, від 9 до 11, від 12 до 20, від 14 до 20, від 16 до 20 та від 18 до 20. Концентрація цитратного буфера, якій віддають особливу перевагу, становить від приблизно 9 мМ до приблизно 11 мМ та від приблизно 8 мМ до приблизно 12 мМ. Концентрація цитратного буфера, якій віддають особливу перевагу, становить приблизно 10 мМ або приблизно 10,0 мМ. Показник рН встановлюють у межах від приблизно 6 до 7 для забезпечення прийнятної стабільності, для підтримання розчинності та інсулінотропної активності гібридного білка GLP-1Fc та прийнятності для парентерального введення. Показник рН можна регулювати шляхом додання кислоти, такої як НС1, або основи, такої як NaOH, до досягнення бажаного рівня рН, або можна додати комбінацію цитратного буфера та лимонної кислоти для досягнення як бажаної концентрації буфера, так і бажаного рівня рН. Значення рН, якому віддається перевага, становить від приблизно 6,3 до 6,7, від 6,25 до 6,75, від 6,2 до 6,8, від 6,15 до 6, 85, від 6,1 до 6,9. Значення рН, якому віддається перевага, становить приблизно 6,5. Композиція на основі гібридного білка GLP-1-Fc також містить маніт як ізотонічний агент. Концентрація маніту становить від 4,0 % до 5,3 % (у відношенні маси до об'єму). Згаданий термін "(у відношенні маси до об'єму)" означає масу складника на об'єм кінцевої композиції. Таким чином, композиція, що має концентрацію маніту 4,6 % (у відношенні маси до об'єму), має 46 мг маніту на мл композиції, або, інакше кажучи, вона має 4,6 г маніту, розчинених у загальному об'ємі 100 мл композиції. Концентрація маніту, якій віддається перевага, у відсотках (у відношенні маси до об'єму), становить від приблизно 4,0 до приблизно 4,1, від приблизно 4,1 до приблизно 4,2, від приблизно 4,2 до приблизно 4,3, від приблизно 4,3 до приблизно 4,4, від приблизно 4,4 до приблизно 4,5, від приблизно 4,5 до приблизно 4,6, від приблизно 4,6 до приблизно 4,7, від приблизно 4,55 до приблизно 4,75, від приблизно 4,5 до приблизно 4,8, від приблизно 4,4 до приблизно 4,9, від приблизно 4,3 до приблизно 5,0, від приблизно 4,2 до приблизно 5,1, від приблизно 4,1 до приблизно 5,2, від приблизно 4,7 до приблизно 4,8, від приблизно 4,8 до приблизно 4,9, від приблизно 4,9 до приблизно 5,0, від приблизно 5,0 до приблизно 5,1, від приблизно 5,1 до приблизно 5,2, від приблизно 5,2 до приблизно 5,3. Концентрація маніту, якій віддається перевага, у відсотках (у відношенні маси до об'єму) становить приблизно 4,3, приблизно 4,5, приблизно 4,55, приблизно 4,6, приблизно 4,65, приблизно 4,64, приблизно 4,7, приблизно 4,75, приблизно 4,8, приблизно 4,9, приблизно 5,0, приблизно 5,1, приблизно 5,2 або приблизно 5,3. Композиція на основі гібридного білка GLP-1-Fc також містить полісорбат-80 як солюбілізатор та/або стабілізатор. Концентрація полісорбату-80 становить від приблизно 0,01 % до 0,05 % (у відношенні маси до об'єму) (або, якщо виражати у одиницях мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 0,5 мг/мл). Ця концентрація полісорбату-80 була визначена у комбінації з гібридним білком GLP-1-Fc та манітом для мінімізування утворення розчинних агрегатів та нерозчинних частинок. Концентрація полісорбату-80, якій віддається перевага, у відсотках (у відношенні маси до об'єму), становить від приблизно 0,01 до 0,04, від 0,01 до 0,03, від 0,015 до 0,025. 3 UA 97673 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Концентрація полісорбату-80, якій віддається перевага, становить від приблизно 0,018 % до приблизно 0,022 % (у відношенні маси до об'єму). Інша концентрація полісорбату-80, якій віддається перевага, становить від приблизно 0,015 % до приблизно 0,025 % (у відношенні маси до об'єму). Концентрація полісорбату-80, якій віддають особливу перевагу, становить приблизно 0,02 % (у відношенні маси до об'єму). Композиція, якій віддають особливу перевагу, містить гібридний білок GLP-Fc, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, з концентрацією від приблизно 0,25 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, цитратний буфер із концентрацією приблизно 10 мМ, полісорбат-80 з концентрацією приблизно 0,02 % (у відношенні маси до об'єму), маніт з концентрацією приблизно 4,6 % (у відношенні маси до об'єму), і має рН приблизно 6,5. Інша композиція, якій віддають особливу перевагу, містить гібридний білок GLP-Fc, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, з концентрацією від приблизно 0,25 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, цитратний буфер із концентрацією приблизно 10 мМ, полісорбат-80 із концентрацією приблизно 0,02 % (у відношенні маси до об'єму), маніт із концентрацією приблизно 4,6 % (у відношенні маси до об'єму), і має рН приблизно 6,5. Інша композиція, що заслуговує особливої уваги, містить гібридний білок GLP-Fc, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, із концентрацією від приблизно 0,25 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, цитратний буфер із концентрацією від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ, полісорбат-80 із концентрацією приблизно 0,02 % (у відношенні маси до об'єму), маніт із концентрацією від приблизно 4,5 % до приблизно 4,8 % (у відношенні маси до об'єму), і має рН від приблизно 6,3 до приблизно 6,7. Інша композиція, що заслуговує особливої уваги, містить гібридний білок GLP-Fc, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, із концентрацією від приблизно приблизно 0,25 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, цитратний буфер із концентрацією від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ, полісорбат-80 із концентрацією приблизно 0,02 % (у відношенні маси до об'єму), маніт із концентрацією від приблизно 4,5 % до приблизно 4,8 % (у відношенні маси до об'єму), і має рН від приблизно 6,3 до приблизно 6,7. Введення композицій може здійснюватись будь-яким шляхом, відомим пересічному лікарю як ефективний. Одним із таких способів є введення периферичним парентеральним шляхом. Під парентеральним введенням у медичній літературі як правило розуміється введення дозованої лікарської форми до організму за допомогою стерильного шприца або певного іншого механічного пристрою, такого як насос для вливання. Периферичні парентеральні шляхи можуть охоплювати внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний та внутрішньоочеревинний шляхи введення. Підшкірне введення є шляхом, якому віддається перевага. Композиція за цим винаходом може застосовуватись для лікування суб'єктів з інсулінонезалежним діабетом або тих, що належать до групи ризику розвитку інсулінонезалежного діабету, інсулінозалежного діабету або ожиріння. Ефективною кількістю гібридного білка GLP-1-Fc у контексті композиції, опис якої наведений, є кількість, яка забезпечує одержання бажаного терапевтичного та/або профілактичного ефекту без спричинення неприйнятних побічних ефектів при введенні суб'єкту, який потребує стимулювання рецептора GLP-1. За варіантом, якому віддається перевага, згадані гібридні білки повинні вводитись один раз на два тижні або один раз на тиждень. У залежності від захворювання, яке піддають лікуванню, може виникнути необхідність більш частого введення гібридного білка, наприклад, двічі або тричі на тиждень. Нижче цей винахід буде описуватись лише як необмежувальний приклад з посиланням на наведені нижче Приклади. Приклади In vitro аналіз активації рецептора GLP-1 Клітини НЕК-293 (культура клітин нирки людського ембріона), що стабільно експресують рецептор людського GLP-1, із застосуванням системи CRE-люцифераза, висівають (30000 клітин/лунка/80 мкл середовища DMEM F12 (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла) з низьким вмістом сироватки) на 96-лункові планшети. Через день після висівання 20 мкл аліквоти експериментального білка, розчинені у 0,5 % BSA (бичачий сироватковий альбумін), змішують, та інкубують із клітинами впродовж 5 год. Загалом для кожного експериментального білка одержують 12 розведень з 5х концентрацією, що містять від 3 пМ до 3 нМ, перед доданням до клітин для одержання кривої залежності "доза-ефект", за якою визначають значення ЕС5о- Після інкубування безпосередньо до кожного планшета додають 100 мкл люциферази, і обережно перемішують впродовж 2 хв. Планшети вносять до люмінометра Trilux, і обчислюють світлову віддачу, що є результатом експресії люциферази. 4 UA 97673 C2 5 10 15 20 25 30 35 Аналітичне випробування композиції на основі гібридного білка GLP-Fc Стабільність композиції на основі гібридного білка GLP-Fc оцінюють за допомогою наведених нижче методів: ультрафіолетова спектрометрія (UV), хроматографія з оберненою фазою (RP), гель-хроматографія за розміром молекул, аніонообмінна хроматографія, обмежене розщеплення із хроматографією з оберненою фазою, визначення оптичної густини при 550 нм, динамічне розсіювання світла, випробування за методом Instron, випробування НІАС та диференціювальна сканувальна калориметрія (microDSC). Хроматографія з оберненою фазою (RP) застосовується для контролювання утворення скорочених форм GLP-Fc, окиснення на ділянці Fc та відповідної втрати інтактного головного піка. Високоефективну гельхроматографію за розміром молекул (SE) застосовують для контролювання утворення полімеру (розчинний агрегат) та відповідної втрати мономеру. Аніонообмінну високоефективну рідинну хроматографію хроматографію (АЕХ HPLC) застосовують для контролювання однорідності заряду, зокрема, при утворенні кислих варіантів (AV), що як правило відповідає деамідуванню та відповідній, втраті головного піка. Обмежене розщеплення застосовують для контролювання продуктів розкладу, специфічних для пептидної (GLP-1) частини молекули GLP-Fc, наприклад, N-кінцевої делеції НІ (His у положенні 1 послідовності SEQ ID NO: 1) та/або G2 (Gly у положенні 2 послідовності SEQ ID NO: 1), протеазних вирізок на F22 (Phe у положенні 22 послідовності SEQ ID NO: 1) та/або W25 (Тгр у положенні 25 послідовності SEQ ID NO: 1), пірувілування на Nкінці, окиснення на W25 (Тгр у положенні 25 послідовності SEQ ID NO: 1) та фосфорилування на S46 (Ser у положенні 46 послідовності SEQ ID NO: 1). До визначення оптичної густини при 550 нм вдаються для контролювання мутності розчину унаслідок утворення нерозчинних частинок. Динамічне розсіювання світла застосовують для визначення рівня великого розчинного агрегату. Випробування за методом Instron застосовують для визначення опору фільтрації. Це напівкількісний метод спочатку розроблений для визначення утворення гелеподібних структур у розчині глюкагону. Цей метод широко застосовують для оцінювання фізичної нестабільності розчину пептиду GLP-1. Оскільки гібридний білок GLP-Fc являє собою комбінацію аналога GLP1 з Fc-ланцюгом IgG4, випробування опору фільтрації може надати додаткові дані щодо природи фізичної нестабільності. Це випробування здійснюють для визначення противотиску при проштовхуванні розчину у шприці через мембранний фільтр з PVDF (полівініліденфторид) діаметром 13 мм з порами 0,2 мкм. Графік зворотного зв'язку за тиском не має нахилу, якщо немає опору або агрегування. Підвищення нахилів із часом вказує на збільшення рівня агрегування та/або гелеутворення. Для спрощення порівняння серій випробувань у цьому описі надаються лише максимальні значення опору. НІАС (система для парентерального підрахунку частинок) функціонує за методом обмеження світла, який широко застосовується при розробці парентеральних композицій для контролювання утворення нерозчинної речовини у вигляді частинок. Диференціювальну сканувальну калориметрію застосовують для контролювання характеристик розгортання за температурою фазового переходу, коли білок починає зазнавати структурного переходу. Композиції на основі гібридного білка GLP-Fc одержують за наведеною нижче таблицею: 40 Композиція на основі гібридного білка GLP-Fc, 1 мг/мл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 45 РН 6 6,5 7 6 6,5 7 7,5 7,5 8 Буфер 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ гістидиновий 10 мМ гістидиновий 10 мМ фосфатний 10 мМ фосфатний 10 мМ трометаміновий 10 мМ трометаміновий Композиції на основі гібридного білка GLP-Fc фільтрують в стерильних умовах через мембрану з полівініліденфториду (PVDF) з порами 0,22 мкм. Розчини зберігають у 5 мл скляних ампулах при температурі 5 °C, 15 °C, 25 °C, 37 °C та 45 °C до проведення аналізу або не більш ніж 20 тижнів. Вплив рН на стабільність GLP-Fc: У наведеній нижче таблиці показані константи швидкості утворення скорочених форм гібридного білка GLP-Fc при температурі 37 °C за визначенням засобами хроматографії з оберненою фазою. 5 UA 97673 C2 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Константа швидкості першого порядку при температурі 37 °C 1 (тиждень- ) -3 4,84 × 10 -3 5,22 × 10 -3 7,01 × 10 -3 3,83 × 10 -3 5,05 × 10 -3 1,28 × 10 -3 1,85 × 10 -3 6,43 × 10 -3 8,89 × 10 У наведеній нижче таблиці показані константи швидкості утворення кислих варіантів гібридного білка GLP-Fc при температурі 37 °C за визначенням засобами АЕХ HPLC. 5 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Константа швидкості першого порядку при температурі 37 °C 1 (тиждень" ) -2 4,25 × 10 -2 4,05 × 10 -2 4,73 × 10 -2 2,36 × 10 -2 4,18 × 10 -2 4,31 × 10 -2 5,06 × 10 -2 5,27 × 10 -2 6,46 × 10 Наведена нижче таблиця показує утворення розчинних агрегатів (відсоток полімеру) гібридного білка GLP-Fc після 20-тижневого зберігання при температурі 37 °C за визначенням засобами SE HPLC. 10 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Відсоток полімеру після 20 тижнів при температурі 37 °C 4,6 2,4 1,4 2,6 1,4 2,2 1,1 0,6 0,3 У наведеній нижче таблиці показані константи швидкості N-кінцевого скорочення (дез H1/H1G2) при температурі 37 °C при обмеженому розщепленні. Композиція № 1 2 3 4 5 6 7* 8 9 Константа швидкості нульового порядку при -1 температурі 37 °C (% тиждень ) 0,42 0,32 0,32 0,39 0,36 0,43 0,52 0,31 0,29 15 6 UA 97673 C2 5 Розчинність та в'язкість У наведеній нижче таблиці показано вплив рН на розчинність та в'язкість композиції на основі гібридного білка GLP-Fc. Спочатку у відповідному буфері одержують розчин, регулюють рН, після чого згаданий розчин концентрують шляхом центрифугування за допомогою концентратора Centricon. Згаданий розчин піддають візуальній перевірці на ознаки досягнення межі розчинності розчину. Концентрацію визначають за оптичною густиною в ультрафіолетовій -1 -1 частині спектра. В'язкість вимірюють у пуазах (Р), де 1 Р=1 гсм с . Вода при температурі 20 °C -1 -1 має в'язкість приблизно 0,01 гсм с , що відповідає 1 сантипуазу (сР). Буфер 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний РН 5,5 5,8 6,0 6,5 7,0 Розчинність (мг/мл) 27,1 146,2 179,4 156,9 158,1 В'язкість (сР) Не визначалась Не визначалась 8,3 5,9 7,7 10 15 20 Порівняння стабільності розчинних композицій Дослідження, організоване за методом планування експерименту (DoE), здійснюють для виявлення взаємозв'язку між ключовими параметрами композицій та властивостями молекули, такими як хімічна/фізична стабільність. На підставі одержаних даних розробляють кількісну модель для (і) визначення оптимальної цільової композиції щодо таких властивостей, як хімічна та фізична стабільність; (іі) дослідження факторного простору композиції для визначення діапазону параметрів для продукту з прийнятними властивостями; та (ііі) встановлення адекватної сталості властивостей композиції у межах факторного простору, який вивчали під час проведення дослідження. Усі композиції, які були випробувані при проведенні дослідження, організованого за методом планування експерименту, узагальнені у наведеній нижче таблиці. Одержують різні композиції, які фільтрують в стерильних умовах через мембрану з полівініліденфториду (PVDF) з порами 0,22 мкм. Композиції зберігають у 3 мл скляних ампулах при температурі 5 °C, 25 °C та 40 °C до проведення аналізу або не більш ніж 3 місяці. 25 Буфер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ цитратний 10 мМ гістидиновий 10 мМ гістидиновий рН GLP-Fc (мг/мл) 6,5 7,0 7,0 7,0 7,0 6,5 6,0 6,0 6,0 6?5 7,0 6,0 6,5 6,0 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ізотонічний ЕтиленПолісорбат -80 агент Маніт (50 діамінтетра(мг/мл) мг/мл) NaCl (150 оцтова кислота мМ) (EDTA), (%) 0,05 Маніт 0 0,35 NaCl 0 0,05 Маніт 0 0,35 Маніт 0 0,05 NaCl 0 0,35 Маніт 0 0,35 NaCl 0 0,05 NaCl 0 0,35 Маніт 0 0,2 Маніт 0 0,2 Маніт 0 0,2 Маніт 0 0,2 NaCl 0 0,05 Маніт 0 0,2 Маніт 0 0,2 NaCl 0 0,2 Маніт 0,01 0,2 NaCl 0,01 0,2 Маніт 0,01 0,2 NaCl 0,01 Стабільність композицій оцінюють шляхом контролювання зменшення відсотка головного піка засобами хроматографії з оберненою фазою (RP). Константи швидкості для усіх композицій подані у наведеній нижче таблиці. 7 UA 97673 C2 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 5 Існує два типи скорочених форм, які можуть контролюватись засобами хроматографії з оберненою фазою. Першим зі згаданих типів є скорочені протеазами для видалення залишків форми на F22 та/або W25 у межах ділянки GLP. Другий згаданий тип скорочується на лінкерній ділянці хімічним механізмом. Константи швидкості для усіх композицій подані у наведеній нижче таблиці за визначенням засобами хроматографії з оберненою фазою. Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 Константа швидкості нульового порядку при -1 температурі 40 °C (% місяць ) 7,65 9,78 9,08 8,44 9,06 8,16 7,41 6,90 7,03 6,98 8,31 7,10 7,42 7,97 7,41 7,30 4,92 5,52 5,69 5,52 Константа швидкості нульового порядку при -1 температурі 40 °C (% місяць ) 2,02 3,27 3,02 2,79 3,29 2,07 1,77 1,73 1,75 1,83 2,81 1,75 2,02 1,90 1,92 1,97 1,51 1,61 1,52 1,45 Утворення розчинних агрегатів контролюється засобами високоефективної гельхроматографії за розміром молекул. Константи швидкості зменшення вмісту мономеру при температурі 40 °C подані у наведеній нижче таблиці. 8 UA 97673 C2 Константа швидкості нульового порядку при -1 температурі 40 °C (% місяць ) 1,08 2,18 1Д9 1,21 1,63 1,38 2,39 1,93 2,11 1,01 1,04 2,25 1,66 2,35 1Д4 1,69 0,54 1,15 0,53 1,00 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 N-кінцеве скорочення шляхом обмеженого розщеплення у межах ділянки GLP контролюється шляхом аналізу обмеженого розщеплення. Константи швидкості для дез H1/H1G2 подані у наведеній нижче таблиці. 5 Композиція № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 Константа швидкості нульового порядку при температурі -1 40 °C (% місяць ) 2,39 2,77 2,45 2,47 2,35 2,72 2,84 2,51 2,83 2,37 2,38 2,86 2,37 2,64 2,48 2,44 1,82 2,17 1,66 2,17 Утворення розчинних агрегатів після перемішування на ротаційному струшувальному пристрої при 400 об/хв впродовж 24 год. контролювали засобами високоефективної гельхроматографії за розміром молекул. Результати визначення відсотка мономеру подані у наведеній нижче таблиці. Композиція № 1 2 Відсоток мономеру 94,5 98,0 9 UA 97673 C2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 5 96,1 98,1 97,8 98,2 97,9 97,3 98,0 98,0 98,2 97,9 98,1 94,4 98,1 98,1 98,2 98,1 98,5 98,3 Головне занепокоєння щодо стабільності при перемішуванні викликає утворення нерозчинної речовини у вигляді частинок, які можуть контролюватись шляхом вимірювання з використанням НІАС. Результати, які були одержані з використанням НІАС після перемішування на ротаційному струшувальному пристрої при 400 об/хв впродовж 24 год., подані у наведеній нижче таблиці. Композиція № Кількість частинок із розміром 10 мкм, визначена з використанням НІАС 400 10 361 5 918 7 205 1251 17 4 10 26 29 1218 24 2 14 16 9 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Порівняння композицій з NaCl та манітом у шприцах і ампулах 10 Композиція 1 2 Склад 1 мг/мл GLP-Fc, 10 розчин NaCl, 0,02 % мМ цитратний буфер, рН 6,5, (у відношенні маси до об'єму) 150 мМ полісорбату-80 1 мг/мл GLP-Fc, 10 мМ цитратний буфер, рН 6,5, 5 % (у відношенні маси до об'єму) маніту, 0,02 % (у відношенні маси до об'єму) полісорбату-80 10 UA 97673 C2 Порівняння стабільності двох вищезгаданих композицій, які містять маніт та NaCl, при зберіганні у шприцах та ампулах при температурі 5 °C. 5 °C Час (місяців) 0 1 3 6 5 °C Час (місяців) 0 1 3 5 °C Час (місяців) 6 Композиція 1 Шприц 77,4 ND 76,9 76,4 Композиція 1 Шприц 0,3 ND 0,3 Композиція 1 Шприц 0,4 Відсоток головного піка Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 77,1 77,4 ND 77,1 77,2 76,7 76,4 75,8 Відсоток скорочення Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 0,2 0,3 ND 0,3 0,2 0,2 Відсоток скорочення Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 0,4 0,4 Композиція 2 Ампула 77,1 77,4 76,5 75,9 Композиція 2 Ампула 0,2 0,2 0,3 Композиція 2 Ампула 0,4 5 °C Час (місяців) 5 Відсоток мономеру Композиція 1 Композиція 2 Композиція 1 Композиція 2 Шприц Шприц Ампула Ампула 0 98,1 97,1 98,1 97,1 1 96,6 95,3 ND ND 3 97,9 97,9 97,6 97,8 6 97,7 98 96,6 97,1 ND=He визначалось Порівняння стабільності двох вищезгаданих композицій, які містять маніт та NaCl, при зберіганні у шприцах та ампулах при температурі 25 °C. 25 °C Час (місяців) 0 1 3 6 25 °C Час (місяців) 0 1 3 6 25 °C Час (місяців) Композиція 1 Шприц 77,4 ND 64,0 46,7 Відсоток головного піка Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 77,1 77,4 ND 72,9 68,0 53,8 59,6 39,3 Композиція 2 Ампула 77,1 73,5 64,1 41,9 Композиція 1 Шприц 0,3 ND 2,4 7Д Відсоток скорочення Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 0,2 0,3 ND 1,0 1,8 4,9 3,4 10,1 Композиція 2 Ампула 0,2 0,8 2,5 9,1 Відсоток Композиція 2 Шприц 97,1 95,0 94,1 91,7 Композиція 2 Ампула 97,1 ND 92,9 81,7 Композиція 1 Шприц 0 98,1 1 95,0 3 91,8 6 82,2 ND=He визначалось 11 мономеру Композиція 1 Ампула 98,1 ND 85,4 76 UA 97673 C2 Порівняння стабільності двох вищезгаданих композицій, які містять маніт та NaCl, при зберіганні у шприцах та ампулах при температурі 40 °C. 40 °C Час (місяців) 0 1 40 °C Час (місяців) 3 40 °C Час (місяців) 0 1 3 Композиція 1 Шприц 24,2 Відсоток головного піка Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 77,1 77,4 ND 37,6 Відсоток головного піка Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 30,2 24,4 Композиція 1 Шприц 0,3 ND 17,3 Відсоток скорочення Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 0,2 0,3 ND 10,5 14,9 17,1 Композиція 2 Ампула 0,2 9,7 16,8 Відсоток мономеру Композиція 2 Композиція 1 Шприц Ампула 97,1 98,1 91,3 ND 86,5 80,5 Композиція 2 Ампула 97,1 ND 85,2 Композиція 1 Шприц 77,4 ND 40 °C Час (місяців) Композиція 1 Шприц 0 98,1 1 86,3 3 82,2 ND=He визначалось Композиція 2 Ампула 77,1 39 Композиція 2 Ампула 22,5 5 10 Визначення концентрації маніту Концентрація маніту, необхідна для досягнення цільової тонічності 290 міліосмоль/кг для композиції на основі гібридного білка GLP-Fc, визначається за допомогою експериментів із титрування. У наведеній нижче таблиці узагальнюється визначена у результаті осмоляльність в залежності від концентрації маніту. На підставі лінійного регресійного аналізу результатів визначення осмоляльності у залежності від концентрації маніту із статистичним значенням р