Аптамери до b-ngf і їх застосування при лікуванні b-ngf-опосередкованих захворювань і розладів

Реферат: Винахід стосується аптамерів, здатних зв'язуватися з β-NGF; фармацевтичних композицій, що містять такі аптамери до β-NGF; і їх застосування. UA 105290 C2 (12) UA 105290 C2 UA 105290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднені заявки У даній заявці заявлений пріоритет згідно з попередньою заявкою США з серійним номером 61/323,145, поданою 12 квітня 2010 року, яка в повному об'ємі включена в даний опис шляхом посилання. Включеним в даний опис у вигляді посилання в повному об'ємі є список послідовностей, озаглавлений як "Sequence_listing_ST25.txt", складений 1 квітня 2011 року, розміром в 126 кілобайт. Галузь винаходу Даний опис загалом пов'язаний з галуззю нуклеїнових кислот, більш конкретно, з аптамерами, здатними зв'язуватися з фактором росту нервів, і, більш конкретно, з субодиницею фактора росту нервів ("-NGF"), і придатними як терапевтичні засоби для запобігання, лікування або поліпшення стану при свербежі (свербці), патологічних станах, що супроводжуються свербежем, і/або інших захворюваннях або станах, в розвиток яких залучений -NGF. Крім того, опис даного винаходу пов'язаний з матеріалами і способами введення аптамерів, здатних зв'язуватися з -NGF. Попередній рівень техніки У подальшому описі представлена коротка інформація, що стосується даного винаходу, і в ньому не передбачено, щоб яка б то не було представлена в ньому інформація або вказані тут публікації були віднесені до попереднього відносно даного винаходу рівня техніки. Тяжкий свербіж щодня негативно позначається на якості життя мільйонів людей. Тяжкий свербіж може бути асоційований з різними станами здоров'я, включаючи стани шкірного свербежу, такі як короста, екзема, ксероз, псоріаз і кропивниця, а також з системними захворюваннями, включаючи хронічний гепатит або ниркове захворювання або лімфому. Схожим чином, біль є загальним виявом, будучи однією з основних причин візитів до лікаря. Біль може бути асоційований з численними типами пошкоджень або станів, і невдача в лікуванні гострого болю може привести до розвитку хронічного болю, а також до імунних і метаболічних розладів. Крім погіршення якості життя індивіда, що страждає на свербіж і/або біль, це істотно позначається на бюджеті охорони здоров'я, зокрема, в зв'язку зі станами шкірного свербежу, а також з хронічними шкірними розладами. У цей час спроби контролювати або лікувати свербіж і/або біль багатьма признаються неадекватними. Наукові дослідження по нейрофізіології підтвердили відмінність метаболічних шляхів при свербежі від шляхів метаболізму при розвитку болю. Чутливість до свербежу сприймається і передається спеціалізованими С-нейронами, які відрізняються від больових рецепторів, які зумовлюють чутливість до болю (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Потім спеціалізовані С-нейрони передають стимул свербежу на спеціалізований клас нейронів заднього рогу, проектованих на таламус (Stander and Schmelz, Eur. J. Pain 10: 473, 2006). Стверджується, що на закінченнях периферичних нервів немає спеціального рецептора свербежу, і специфічність С-нейронів свербежу зумовлена їх спинномозковими зв'язками з метаболічними шляхами при свербежі. Між виявами свербежу і болю спостерігаються відмінності в характері активації мозку, такі як відсутність помітної активації таламічної і соматосенсорноі кори тім'яної частки головного мозку при відчутті свербежу (Yosipovitch et al., Lancet 361: 690, 2003). Звичайно біль класифікується або як гострий, або як хронічний. Гострий біль звичайно є відповіддю на пошкодження тканини, що характеризується короткочасністю, і вона розсмоктується, як тільки заживає первинне пошкодження. Хронічний біль є персистуючим, і при цьому може не спостерігатися видимого зв'язку з травмуючою подією. Крім того, біль, включаючи ноцицептивний і неноцицептивний, може бути класифікований на основі механічної природи болю. Ноцицептивний біль опосередкований специфічними рецепторами (ноцицептивні рецептори), які активуються специфічним стимулом (пошкодженням, запаленням, хімічним стимулом, і т. п.). Ноцицептивний біль може додатково бути класифікований як соматичний або вісцеральний. Соматичний біль виникає в таких тканинах, як шкіра, м'язи, суглоби, кістки або зв'язки. Соматичний біль звичайно є гострим і локалізованим. Сучасні способи лікування включають застосування опіоїдів і нестероїдних протизапальних лікарських засобів (NSAID). Вісцеральний біль виникає у внутрішніх органах. Часто він є слабко локалізованим болем, і звичайно його лікують за допомогою опіоїдів. Неноцицептивний біль може бути додатково поділений на невропатичний або симпатичний. Невропатичний біль може виникати в периферичній або центральній нервовій системі. Невропатичний біль може бути асоційований з дегенеративними станами, запаленням або з інфекційними захворюваннями. Такий тип болю приводить до гіперчутливості (гіпералгезії) і часто описується як простріл або пекучий біль. Варіанти лікування включають антагоністи N 1 UA 105290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метил-D-аспартату (NMDA), протиаритмічні засоби, протиконвульсивні засоби або антидепресанти. Невропатичний біль часто резистентний до дії анальгетиків, що звичайно застосовуються. Симпатичний біль виникає в симпатичній нервовій системі, а також в периферичній і центральній нервовій системах, і звичайно він асоційований з певним типом пошкодження. На місці пошкодження може виявлятися підвищена гіперчутливість і аномальна температура. Лікування звичайно включає схему багаторазового прийому декількох лікарських засобів, включаючи блокатори симпатичних нервів, вазодилятатори, протиконвульсивні засоби, протоаритмічні засоби і антидепресанти. Загальноприйняте і пролонговане лікування болю опіоїдними анальгетиками не рекомендується з побоювань, що потенційно можливі звикання, побічні ефекти, толерантність і залежність від опіоїдів. Побічні ефекти опіоїдів можуть включати нудоту, блювання, закрепи, пригнічення дихання і т. д. В сполученні з багатьма сучасними способами лікування можливі відсутність ефективності, тяжкі побічні ефекти і неспроможність способів доставки лікарських засобів в наданні допомоги в адекватному усуненні болю. Вказані проблеми підкреслюють необхідність в більш довершеній терапії відносно усунення болю. Незважаючи на те, що свербіж і біль являють собою абсолютно різні відчуття, між свербежем і болем є важливі взаємозв'язки. Добре відомо, що свербіж можна зменшити провокуючим біль відчуттям, що викликається розчісуванням. Крім того, анальгетики, такі як опіоїди, діючи шляхом зменшення больових відчуттів, насправді можуть посилювати відчуття свербежу. Таким чином, деякі терапевтичні засоби відносно болю можуть загострювати симптоми свербежу, що додатково свідчить про необхідність в поліпшенні терапевтичних засобів, здатних чинити лікувальний вплив як відносно свербежу, так і відносно болю. Фактор росту нервів (NGF) стосується сімейства нейротрофічних цитокінів, або нейротрофінів. Нейротрофіни відіграють ключову роль в розвитку і підтримці периферичної і центральної нервової системи шляхом регуляції виживаності клітин, їх диференціювання і апоптозу. Крім вказаних функцій нервової системи, NGF, як було показано, посилює вивільнення гістаміну, продукування огрядних клітин, а також ріст і диференціювання Влімфоцитів. Було показано також, що NGF модулює базофільну продукцію певних ліпідних медіаторів. Апоптоз нейтрофілів може також бути пригнічений впливом NGF. Всі вказані фактори свідчать про роль NGF в імунній системі, а також в нервовій системі. Тільки бета-ланцюг NGF -NGF відповідальний за активність NGF, стимулюючу ріст нервів. В клітині -NGF існує у вигляді димера і зв'язується з двома типами рецепторів клітинної поверхні в нервових і ненервових клітинах. Третинна структура вказаного білка основана на трьох цистеїнових дисульфідах і двох антипаралельних -ланцюгах. Амінокислотна гомологія між білками людини, миші і щурів становить приблизно 90 %. -NGF, як і всі нейротрофіни, зв'язується з клітинним рецептором p75 з наномолярною (нM) афінністю. -NGF зв'язується також з одним з тирозинкіназних рецепторів (Trk), зокрема, TrkA, з пікомолярною (пM) афінністю. Реакція з рецептором p75 може викликати загибель клітини, тоді як зв'язування з TrkA сприяє виживанню клітин. Зв'язування -NGF з TrkA приводить до фосфорилування рецептора і внутрішньоклітинних білків. -NGF інтерналізується шляхом рецепторопосередкованого ендоцитозу. Рецептори Trk виявляються в багатьох не-нервових тканинах. Фактор росту нервів (NGF), що вивільняється з кератиноцитів в шкірі, є одним з основних медіаторів, які підвищують дермальну щільність нервів і діють на морфологію, крім іншого, стимулюючи проростання нервових волокон (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi: 10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Було виявлено, що у пацієнтів з хронічним свербежем підвищена інтрадермальна щільність нервових волокон. Крім того, було виявлено, що NGF підвищує чутливість периферичних нейронів, крім іншого, шляхом запуску рецептора NGF, тирозинкінази TrkA (Stander and Schmelz, Eur. J. Pain 10: 473, 2006). Важлива роль NGF в опосередкуванні свербежу, а також болю виявляється увисоких концентраціях NGF, що вимірюються в атопічних умовах, які можуть служити симптомами як свербежу, так і болі. Пацієнти з атопічним дерматитом мають істотно підвищені рівні NGF в сироватці, які позитивно корелюють з тяжкістю стану. Пацієнти з контактним дерматитом мають більш підвищені локальні концентрації NGF, а у пацієнтів з вузлуватим свербцем також виявляються вищі рівні NGF і рівні активації TrkA (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi: 10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Були досліджені ефекти анти-NGF-антитіл, що вводяться системно шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції, відносно симптомів на мишачих моделях атопічного дерматиту, і результати "дають основи передбачати, що анти-NGF-антитіла блокують ефекти NGF на периферії нервової системи і пригнічують епідермальну інервацію, дерматит і розчісування" (Takano et al. J. Pharmacol Sci 99: 277: 284, 2005). Крім того, у вказаному дослідженні було 2 UA 105290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виявлено, що анти-NGF-антитіла не спричиняють зміни сироваткових рівнів NGF, вони не знижували концентрацію NGF в тестованих ділянках шкіри і не спричиняли повне усунення розчісування. Таким чином, залишається потреба в більш повному послабленні або усуненні розчісування, асоційованого з атопічним дерматитом. Все більше даних вказує на те, що NGF функціонує як медіатор певних больових станів. Було показано, що анти-NGF-антитіла можуть викликати тривалий термічний і хімічний анальгезуючий ефект, а також блокувати гіпералгезію, яка розвивається при карагенаніндукованому запаленні (McMahon et al., Nat. Med.1: 774, 1995). Дослідження низькомолекулярних антагоністів рецепторів NGF відносно блокування біологічної активності NGF виявили наявність анальгезуючого ефекту при невропатичних станах і станах запалення, що супроводжуються болем (Owolabi et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 289: 1271, 1999). У дослідженні Owolabi et al. показано, що анальгезуючий ефект низькомолекулярного інгібітору активності NGF може бути слабшим за ефект морфіну, залежно від шляху введення. Оскільки опіоїди, такі як морфін, надають багато небажаних побічних ефектів, залишається потреба в забезпеченні знеболення при різних больових станах, опосередкованих NGF, яке було б більш гнучким у виборі шляху введення. Короткий опис винаходу Даний опис пов'язаний з різними аптамерами, які зв'язуються з бета-субодиницею фактора росту нервів, що індивідуально згадуються тут як "аптамер до -NGF", або "-NGF-аптамер", і зі способами застосування таких аптамерів, як -NGF, для лікування -NGF-опосередкованих захворювань і розладів, включаючи лікування болю і свербежу, а також станів, асоційованого із свербежем. Включені також фармацевтичні композиції або склади, що містять -NGF або його фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. Композиції згідно з даним описом можуть бути отримані у вигляді будь-якої з фармацевтично прийнятних лікарських форм. Описані тут композиції і дози підібрані з таким розрахунком, щоб максималізувати клінічну ефективність при лікуванні різних станів, таких як біль і свербіж, а також станів, асоційованих із свербежем, і при цьому одночасно знизити або мінімізувати небажані побічні ефекти. Крім того, даний опис пов'язаний зі способами запобігання (профілактики), лікування або поліпшення стану при захворюванні або стані, опосередкованому -NGF, де вказані способи включають введення аптамеру до -NGF або фармацевтичної композиції аптамеру до -NGF хребетного, зокрема, ссавця, більш конкретно, людини. Зокрема, даний опис пов'язаний зі способами лікування, запобігання або послабленню болю і свербежу, а також станів, асоційованих із свербежем. У певних аспектах -NGF-опосередковане захворювання або стан є захворюванням або станом, при яких активність -NGF може безпосередньо або опосередковано викликати свербіж на певних стадіях захворювання. У деяких варіантах здійснення захворюванням або станом, який мається намір лікувати, запобігти або полегшити, є дерматит або екзема. У інших варіантах здійснення захворюванням або станом, який мається намір лікувати, запобігти або полегшити, є атопічний дерматит. У одному з варіантів здійснення терапевтичний ефект (наприклад, лікування, профілактика або полегшення болю і станів, асоційованих із свербежем) може бути досягнутий шляхом введення аптамеру до -NGF, так, щоб аптамер був експонований і міг би зв'язуватися з -NGF, незалежно від способу введення вказаного аптамеру лікуванню, що піддається пацієнту. У аналогічному варіанті здійснення терапевтичний ефект може бути досягнутий шляхом введення аптамеру до -NGF, так, щоб він був експонований і зв'язувався з -NGF, і таким чином запобігав би або зменшував би зв'язування -NGF з одним або декількома з його різних клітинних рецепторів. У одному з варіантів здійснення вказаним клітинним рецептором є p75. У іншому варіанті здійснення вказаним клітинним рецептором є рецептор Trk. Ще в одному з варіантів здійснення вказаним клітинним рецептором є TrkA. У іншому варіанті здійснення аптамер до -NGF запобігає або знижує рівень фосфорилування рецептора -NGF і інших внутрішньоклітинних білків. Способи, що пропонуються включають введення аптамеру до -NGF в сполученні з одним або декількома вторинними активними засобами. Таке введення може бути послідовним або в складі поєднаної композиції. У іншому аспекті в даному описі запропонований спосіб діагностики in vitro, що включає приведення аптамеру до -NGF в контакт із зразком, в якому мається на увазі наявність -NGF. У іншому аспекті в даному описі запропонований спосіб діагностики in vivo, що включає відповідним чином мічений аптамер до -NGF, ін'єктування вказаного аптамеру індивіду, у якого мається на увазі наявність -NGF-опосередкованого захворювання або розладу, і детектування 3 UA 105290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 міченого аптамеру з метою діагностики або оцінки стану здоров'я вказаного індивіда. Використовувана мітка буде вибрана відповідно до модальності зображення, що буде використано. Короткий опис графічного матеріалу На фігурі 1 приведені криві зв'язування аптамеру 2426-66 ( ) (SEQ ID NO: 1) в порівнянні з випадково вибраною бібліотекою (o). На фігурах 2A і 2B зображені аптамерні консенсусні послідовності, ідентифіковані за допомогою секвенування-454 для аптамеру 2426-66 (SEQ ID NO: 1). На фігурі 3 проілюстрована стратегія димеризації #1 для аптамеру до -NGF. На фігурі 4 проілюстрована стратегія димеризації #2 для аптамеру до -NGF. На фігурі 5 графічно проілюстрована здатність різних аптамерів інгібувати індуковане людським -NGF диференціювання клітин PC12, що тестується шляхом аналізу росту нейриту, описаного в прикладі 4. На фігурі 6 графічно проілюстроване інгібування -NGF-опосередкованого росту нейриту як функція від концентрації аптамеру 2426-66 ( ) (SEQ ID NO: 1) і зрізаного варіанту 2426-66-50 (о) (SEQ ID NO: 2), що вимірюється так, як описано в прикладі 4. На фігурі 7 графічно проілюстроване інгібування росту нейриту, опосередкованого людським -NGF, мишачим -NGF і щурячим -NGF, під дією аптамеру 2426-66 (SEQ ID NO: 1) і зрізаних варіантів 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) і 2426-66-53 (SEQ ID NO: 43). Всі три аптамери інгібували мишачий -NGF приблизно з такою ж ефективністю, що і людський -NGF, а щурячий -NGF інгібували в меншій мірі. На фігурі 8 графічно проілюстровані результати аналізу фосфорилування TrkA, зробленого за допомогою аптамерів 2426-66 (SEQ ID NO: 1) і зрізаних варіантів 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) і 2426-66-3 (SEQ ID NO: 5). На фігурі 9 графічно проілюстрований аналіз фосфорилування TrkA у випадку зрізаного аптамеру 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) з використанням мишачого і щурячого -NGF. На фігурі 10 зображені С-5-піримідинові модифікації, що використовуються для отримання описаних тут аптамерів. На фігурі 11 графічно проілюстроване зменшення частоти почухування через чотири тижня у хворих мишей, оброблених аптамером 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) (●), на відміну від необроблених мишей ( ) або мишей, оброблених гідрофільною маззю (HO, hydrophilic ointment) (▲), як описано в прикладі 5. Статистично достовірні відмінності (р