Застосування нерестриктованих соматичних стовбурових клітин (usscs) для виготовлення лікарських засобів

1. Застосування нерестриктованих соматичних стовбурових клітин (USSCs) для виготовлення лікарських засобів для лікування судинних захворювань, кардіальних хвороб або хвороб гладких м’язів, захворювань печінки, цукрового діабету типу 1, захворювань нервової системи, хвороби Паркінсона або гематологічних захворювань, причому нерестриктовані соматичні стовбурові клітини (USSCs) виділені із пуповинної крові, плацентарної крові і/або зразків крові немовляти і вони є: (і) негативними щодо CD45 і CD14 поверхневих антигенів; (іі) позитивними щодо CD13, CD29, CD44, CD49e антигенів; (ііі) викликають експресію YB1, AML-1, RUNX-1 і фібуліну-2; (іv) не викликають експресію гіалуронансинтази, фібромодуліну і 1NFLS. 2. Застосування за п.1, причому лікарський засіб додатково містить in vitro диференційоване потомство вказаних USSCs. UA (21) 2003044039 (22) 03.11.2001 (24) 10.01.2008 (86) PCT/EP01/12768, 03.11.2001 (31) 60/245 168 (32) 03.11.2000 (33) US (72) ВЕРНЕТ ПЕТЕР (73) КУРІОН ФЕРАПЬЮТІКС АГ (56) ERICES A ET AL: "Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood." BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, vol. 109, no. 1, April 2000 (2000-04), pages 235-242, XP002205332 ISSN: 0007-1048 ALFONSO Z Z C & FRASER J K: "Osteoblast precursor cells are found in the low- density fraction of umbilical cord blood." BLOOD, vol. 94, no. 10 Suppl. 1 Part 2, 15 November 1999 (1999-11-15), page 161b XP002231452 Forty-first Annual Meeting of the American Society of Hematology; New Orleans, Louisiana, USA; 3-7 December 1999 ISSN: 00064971 GUTIERREZ-RODRIGUEZ M ET AL: "Characterization of the adherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilical cord blood." STEM CELLS, vol. 18, no. 1, January 2000 (2000-01), pages 46-52, XP002231492 ISSN: 1066-5099 SIRCHIA G & REBULLA P: "Placental/umbilical cord blood transplantation." HAEMATOLOGICA, vol. 84, no. 8, August 1999 (1999-08), pages 738-747, XP002226904 ISSN: 0390-6078 SANCHEZ-RAMOS J R ET AL: "Expression of neural markers in human umbilical cord blood." EXPERIMENTAL NEUROLOGY, vol. 171, no. 1, September 2001 (2001-09), pages 109-115, XP002226905 ISSN: 0014-4886 2 (19) 1 3 Даний винахід стосується соматичної стовбурової клітини, безлічі стовбурових клітин, лікарського препарату, що містить стовбурову клітину відповідно до даного винаходу, і способу очищення, посіву та унікальної диференціаціїпотенціалу стовбурової клітини за даним винаходом. Хоча стовбурові клітини постійно самозаміщаються, вони в основному є повільно циклюючими. Склалася думка, що ці клітини активізують транзиторну підсилювальну клітинну популяцію (на проміжних стадіях диференціювання) з обмеженою самопідтримувальною здатністю до зростання кількості клітин, що пройшли диференціювання. Останнім часом виявляється інтерес до розміщення стовбурових клітин в організмі дорослої людини, тому в існуючій літературі показане використання ряду маркерів-замінників (наприклад, описані реакції, що формують колонії клітин, для гематопоієгачної лінії диференціації). Ряд патентів США, наприклад, [US 5,486,359; 5,591,625; 5,736,396; 5,811,094; 5,827, 740; 5,837,539; 5,908,782; 5,908,784; 5,942,225; 5,965,436; 6,010,696; 6,022,540; 6,087,113; 5, 858,390; 5, 804,446; 5, 846,796; 5,654,186; 6,054,121; 5,827,735; 5, 906,934] стосуються мезенхімних стовбурових клітин (MSC), які можуть бути диференційовані в декілька клітинпопередників, наприклад, м'язові клітинипопередники, клітини-попередники сполучних тканин або овальні клітини. М'язові клітинипопередники далі диференціюються в кардіальні, скелетні клітини, а також клітини гладких м'язів, при цьому клітина-попередник сполучної тканини може диференціюватися в кістку, хрящеподібну тканину і жир. Овальні клітини можуть диференціюватися в клітини печінки, підшлункової залози [Grompe et al., 2001]. Присутність негематопоієтичних стовбурових клітин в пуповинній крові є предметом дискусії [Mayant et al., 2000, Marechi et al., 2001]. Німецька патентна заявка [DE 198 03267] була першим документом, у якому були описані остеобластичні клітини-попередники та утворення кісткової тканини з пуповинної крові людини. Однак використання цих мезенхімних клітинпопередників в існуючому рівні техніки часто обмежене через те, що вони занадто еволюціонували у розвитку, щоб їх можна було успішно використовувати як засіб для генерування органів або тканин. Іншими словами, цілком ймовірно, вони занадто детерміновані і спеціалізовані, щоб забезпечити генерування органа або тканини. Технічною задачею даного винаходу є створення стовбурової клітини, яка здатна диференціюватися в різні клітини-попередники, наприклад, мезенхімні клітини, нервові клітини, клітини крові або ендотеліальні клітини. Ще однією технічною задачею даного винаходу є створення стовбурової клітини, яка позбавлена недоліків ембріональних стовбурових клітин. 81390 4 Було виявлено, що соматичні стовбурові клітини, ідентифіковані як нові, здатні вирішити зазначені вище технічні задачі. Соматична стовбурова клітина, відповідно до даного винаходу, утворюється з умбілікатної пуповинної крові, крові плаценти і/або крові новонародженої дитини, при цьому дана соматична стовбурова клітина, маючи відмітні ознаки, здатна диференціюватися в мезенхімні стовбурові клітини або клітини-попередники, стовбурові клітини або клітини-попередники гематопоієтичних ліній диференціації, нервові стовбурові клітини або клітини-попередники, ендотеліальні стовбурові клітини або печінкові клітини-попередники. Дані клітини являють собою клітину попередника гематопоієтичної лінії диференціації, мезенхімні стовбурові клітини, а також нервові стовбурові клітини. Ця унікальна багатофункціональна здатність і технологія розмноження цих нерестриктованих соматичних стовбурових клітин (USSC), похідних пуповинної крові (СВ) або у вигляді таких соматичних стовбурових клітин, або у вигляді детермінованих клітин (клітин, здатних диференціюватися в одному напрямку) чітко відповідно до протоколів диференціації дозволяє уточнити відбір характеристик, забезпечити стандартизацію та використання для виробництва і впровадження терапії на основі стовбурової клітини у напрямках медицини, що спеціалізуються на регенерації органів і тканин. На Фіг.1 подана фотомікрограма первинної культури USSC. Клітини розміщаються на чашці Петрі при низькій щільності. На Фіг.2 подана фотомікрограма отриманої при злитті культури USSC. На Фіг.3 поданий аналіз, виконаний із застосуванням активованого флюоресценцією аналізатора клітин (FACS) для антигену CD45 культури в пробірці. На Фіг.4 поданий аналіз, виконаний із застосуванням активованого флюоресценцією аналізатора клітин (FACS) для ембріонного маркера SSEA4. На Фіг.5 поданий аналіз, виконаний із застосуванням активованого флюоресценцією аналізатора клітин (FACS) для HLA-класу І (А, В, С), HLA DR і CD14. На Фіг.6 подана кінетична схема, виконана із застосуванням активованого флюоресценцією аналізатора клітин (FACS) для поверхневого маркера CD34. На Фіг.7 подана фотомікрограма клітини USSC після індукції нейроналу. На Фіг.8 показано, що клітини USSC відповідно до винаходу виявляють експресію nestin, antinestin імунофарбування маркера нервової стовбурової клітини. На Фіг.9 показані USSC, що генерують клітини нейронної лінії диференціації. На Фіг.10 показані USSC, що генерують клітини гліальної лінії диференціації. На Фіг.11 показані утворення мінералізованих "вузликів" після остеогенної індукції і після фарбування червоним алізарином (В). 5 81390 6 На Фіг.12 показане фарбування Alcian Blue Таблиця 1; Дослідження зразків транскрипції (блідо-блакитний) USSC-похідної культури, що USSC методом RT-PCR (RT-полімеразоосіла на стінках пробірки (або у вигляді гранул). ланцюжкової реакції). На Фіг.13 показане фарбування (колаген, тип Результати RT-PCR, отримані обумовленими II) (зелений) культур USSC після хондрогенної олігонуклеотидними праймерами і mRNA з USSC і диференціації. позитивною контрольною групою mRNA з інших На Фіг.14 показана ліпогенна диференціація тканин, типу кісткової, хрящеподібної, мозкової культур USSC, виявлених Oil Red-фарбуванням або одноядерних клітин пуповинної крові. (темно-червоним). На Фіг.15 подана фотомікрограма культур USSC перед і після міогенної диференціації. На Фіг.16 подана імуноцитохімія повільно діючого міозину після азацитидин-обробки. Найменування Результат PCR USSC На Фіг.17 показаний фенотип овальної клітини PDGFR альфа + USSC-похідних. IGFR + На Фіг.18 подані тривалість існування Нейрофіламент інтеграції культур USSC після ін'єкції в паренхіму CD105 + печінки SCID-миші. GFAP Соматичні стовбурові клітини, відповідно до Синаптофізин даного винаходу, можуть бути виділені і очищені Тирозингідроксилаза декількома способами, що включають операції YB1 + виділення шляхом градієнта щільності, Runx1 + застосування факторів росту культури клітин, що AML1C + прилипають, і субкультур, як описано у прикладі 1. BMPR ІІ + Після утворення конфлюентного клітинного шару Колаген, тип І + процес зростання для одержання клітини, відповідно до даного винаходу, звичайно постійно Cart-1 контролюється за допомогою фібробластоїдної Хондроадерин морфології і фенотипного аналізу з використанням CD49e + антитіл, спрямованих проти поверхневих антигенів CD13 (позитивний), CD14 (негативний), CD45 RNA-експресія препаратів USSC і MSC-похідні (негативний), а також CD29 (позитивний; див. кісткового мозку (Caplan, 1991) були піддані приклад 2). безпосередньому порівнянню методом Соматична стовбурова клітина, відповідно до використання мікроматриць Affimetrix GeneChip™ даного винаходу, вступає в негативну реакцію з для визначення кількісних ознак. Транскрипт гена маркерами, призначеними для мічення Fibulin-2 (номер у банку генів - Х82494) був гематопоієтичних ліній диференціації, наприклад, виявлений у USSC на високих рівнях експресії, CD45, і, отже, відрізняється від гематопоієтичних але не у MSC. Раніше одержання Fibulin-2 було стовбурових клітин, які також можуть бути виділені продемонстроване у фібробластах (Pan et al., з плацентарної пуповинної крові. CD14 являє 1993). Аналіз Northern blot (нозерн-блотінг) mRNA собою ще один поверхневий антиген, який може з тканин різних людських органів знайшов добрий бути виявлений на USSC. Стовбурова клітина, за транскрипт 4. 5-kb у тканинах серця, плаценти і даним винаходом, характеризується наявністю яєчника (Zhang et al., 1994). Протеїн локалізували набору антигенів, що присутні на поверхні клітини. на світлому мікроскопічному рівні у людському Такими антигенами є CD13, CD29, CD44 і CD49e. зародку строком 4-10 тижнів, використовуючи Препарати USSC додатково характеризуються поліклональні антитіла. Fibulin-2 був виявлений наявністю mRNA-транскрипторів для певних головним чином у нейропітелії, спинномозкових рецепторних молекул, подібно до рецептора (EGFвузлах і периферійних нервах (Miosge et al., 1996). R) фактора епідермального росту, рецептора У тваринній моделі пацюка міофібробласти альфа (PDGF-RA) тромбоцит-похідного фактора печінки пацюка (rMF) були локалізовані разом з росту, а також подібно до рецептора (IGF-R) Fibulin-2. Ці клітини розташовувалися в ділянці фактора росту інсуліну. Дані клітини, як правило, воріт органів, у стінках центральних вен і лише виявляють експресію факторів, наприклад, YB1 місцями у паренхімі (в основних функціонуючих (фактор 1 транскрипції Y-бокс), Runx1 (фактор 1 елементах внутрішніх органів). На ранніх стадіях транскрипції, що належить до карликового фіброзу rMF виявляли у межах рубців, що зростання), і AML1C (фактор транскрипції гострої розвиваються. На більш пізніх стадіях rMF був лейкемії, що має відношення до спинного або причиною виникнення великої кількості клітин, кісткового мозку), як було визначено при RT-PCR зосереджених у межах рубця (Knittel et al., 1999). (RT-полімеразо-ланцюжковій реакції). Проте На моделі іншої тварини протеїн Fibulin-2 миші препарати USSC, як правило, негативні щодо виявляє свою експресію в процесі епітеліальнотранскриптів для фактора Cart-1 хондрогенної мезенхімальної трансформації у матриці транскрипції та нейральних маркерів, таких як, закладення ендокарда під час формування серця наприклад, нейрофіламент, синаптофізин, ембріона. Fibulin-2 також був синтезований тирозингідроксилаза (ТН) і гліальний фібрилярний клітинами-попередниками формування гладкого кислотний протеїв (GFAP). м'яза судин дуги аорти, що розвиваються, і коронарними ендотеліальними клітинами, що + + + + + + + + + 7 81390 8 розвиваються з клітин нервового гребінця та Відповідно до винаходу створено лікарський епікардіальних клітин, відповідно (Tsuda et al., засіб (регенерувальна терапія), що включає 2001). соматичні стовбурові клітини, які відповідають Транскрипти гена Hyaluronan Synthase даному винаходу, а також безліч або суміші (D84424), гена Fibromodulin (U05291) і транскрипт соматичних стовбурових клітин за даним 1NFLS (WO3846) не були виявлені в USSC, однак винаходом. Лікарський засіб додатково може були виявлені тільки на високих рівнях MSC. містити речовини-носії або допоміжні речовини, Аналізи Northern blot (норзен-блотінг) засвідчили, прийнятні стосовно медичних і фармакологічних що Hyaluronan Synthase скрізь виявляє експресію вимог. Даний винахід стосується також способу в людських тканинах (Itano and Kimata, 1996). використання USSC або безлічі, або сумішей Продукт цього ензиму - Hyaluronan виконує різні стовбурових клітин за даним винаходом у генній функції, включаючи заповнення порожнин, терапії, заміні органів, тестуванні фармацевтичних змащення суглобів, а також забезпечення засобів, при вирощуванні кровоносних судин в діафрагми, через яку можуть мігрувати клітини пробірці, у васкулярній терапії, кістковій терапії, (Hall et al., 1995). Фібромодулін належить до при лікуванні гепатиту, панкреатиту і нервових сімейства малих інтерстиціальних протеогліканів. хвороб. Протеїн дуже поширений у тканинах при Наприклад, USSC за даним винаходом можуть найбільшому зосередженні в суглобових хрящах, бути застосовані локально на потрібній ділянці з сухожиллях і зв'язках (Sztrolovics et al., 1994). біоматеріалом або без нього. Транскрипт 1NFLS був клонований з печінки Залежно від виду захворювання, доречне людського ембріона. локальне або системне приймання USSC. USSC Ген CD24 (L33930) виявляє експресію на дуже можна приймати безпосередньо або разом з низькому рівні у USSC, у порівнянні з рівнями прийнятними носіями чи ад'ювантами. В окремих експресії у MSC. CD24 виявляє експресію у випадках може бути доцільним додавати додаткові багатьох клітинах В-лінії диференціації, а також на речовини, які сприяють подоланню захворювання. дозрілих гранулоцитах (гранулоцитах доношених Наприклад, при використанні в ортопедії разом з немовлят) (Van der Schoot et al., 1989). USSC можуть застосовуватися речовини, що У порівнянні з MSC соматичні клітини за даним поліпшують регенерацію кісткової тканини. винаходом відрізняються джерелом тканини, з В принципі способи, відомі щодо застосування якого вони впрошуються. Крім того, USSC MSC, можуть бути аналогічним шляхом характеризуються експресією людського використані й щодо USSC. На додаток слід лейкоцитозного антигену класу І (HLA-клас І). У сказати, що використання стовбурових клітин порівнянні з соматичними стовбуровими клітинами описане, наприклад, у такій літературі: [В. І. за даним винаходом раніше описані MSC, що Strauer et al. "Intracoronare humane autologe вирощувалися з кісткового мозку і м'язової Strammzelltransplantation zur Myocardreneration тканини, виявляють дуже високі рівні антигену nach Herzinfarkt", Dtsch. med. Wochenschr. 2001; HLA-класу І на поверхні їхніх клітин. Клітина за 126:932-938; Quarto R. et al. "Repair of Large Bone даним винаходом також виявляє експресію Defects with the Use of Autologous Bone Marrow етапного специфічного раннього антигену Stromal Cells", N. Engl. J. Med. 2001; 344:385-386; (SSEA4), (див Фіг.4). Vacanti С. A. "Brief Report: Replacement of an За звичай соматична стовбурова клітина, Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone", N. відповідно до винаходу, має форму клітини Engl. J. Med. 2001; 344:1511-1514, May 17,2001; фібробластоїда і розростається за типом щільного Hentz V. R. "Tissue-Engineering for Reconstruction of зчеплення. Thumb", N. Engl. J. Med. 2001; 344:1547-1548; У переважному прикладі здійснення винаходу Brittberg M. "Treatment of Deep Cartillage Defects in соматична стовбурова клітина (USSC), відповідно the Knee with Autologous Chorndrocyte до винаходу, присутня у безлічі сумішах, що Transplantation", N. Engl. J. Med. 1994; 331:889-895, являють собою попередників інших соматичних Oct. 6,1994; Freed С R. "Transplantation of стовбурових клітин, наприклад, гематопоієтичну Embrionic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's лінію диференціації, що, переважно, виявляє Disease", N. Engl. J. Med. 2001; 344:710-719; експресію АС133 і CD34, соматичні стовбурові Shin'oka T. "Transplantation of a Tissue-Engineered клітини мезенхімальних попередників, соматичні Pulmonary Artery", N. Engl. J. Med 2001; 344:532стовбурові клітини нейрональних попередників і їх 533; Shapiro A. M. "Islet Transplantation in Seven комбінації. Даний приклад здійснення має Patients with Type I Diabetes Mellitus Using a перевагу, оскільки він має високий Glucocorticoid-Free Immunosuppresive Regimen", N. регенерувальний потенціал, що базується на Engl. J. Med. 2000; 343:230-238. здатності диференціюватися в різні інші соматичні Викладені у даних документах ознаки включені стовбурові клітини або на присутності таких в матеріали заявки шляхом посилання. соматичних стовбурових клітин, які зазначені у Далі наводиться більш детальний опис переважному прикладі здійснення. Переважно, стовбурових клітин, що відповідають даному відповідно до даного винаходу, зі стовбурової винаходу. клітини шляхом диференціації утворюються Стовбурові клітини, відповідно до даного соматичні стовбурові клітини мезенхімальних винаходу, являють собою клітини, що прилипають, попередників або соматичні стовбурові клітини які мають оболонку, форма якої нагадує форму нейрональних попередників. клітини фібробластоїда, і два або три ядерця (див Фіг.1), отримані після трипсин-ЕDТА-обробки і 9 81390 10 характерному для гематопоієтичної диференціації, повторного посіву при наявності відповідних умов розвивалися типові змішані або гематопоієтичні вмісту культури (приклад 1), причому колонії попередників (CFU-GM і BFU-E) клітин спостерігається швидке поширення до утворення червоних та білих кров'яних тілець, порівнянні з злиттів розтягнутої по довжині морфології (Фіг.2). гематопоієтичними клітинами - попередниками На Фіг.1 подана фотомікрограма основної CD45+ (приклад 9). культури USSC. Клітини, посіяні за низької Якщо одноядерні клітини пуповинної крові, щільності, демонструють фібробластоїдну еліміновані для CD14, вирощують у середовищі з морфологію USSC. Ці клітини можуть бути легко високим вмістом глюкози, вони виявляють вирощені більш ніж на 14 пасажах культури. На властивості, характерні для нейральних Фіг.2 подана фотомікрограма злиття культури стовбурових клітин. На Фіг.7 подана USSC. Через майже повністю злитий шар клітин фотомікрограма клітин USSC після індукції USSC проглядається паралельна орієнтація нейроналу. USSC, за даним винаходом, клітин. культивовані у модифікованому за способом Фенотип поверхневого маркера первинного Дульбекко середовищі Голка з високим вмістом шару клітин, що прилипають, а також усіх глюкози, демонструють астроцит-подібну похідних, отриманих у наступних пасажах, є і морфологію. На Фіг.7 показаний приклад такої залишається негативним для маркера CD45. На культивованої клітини, що демонструє гліальну Фіг.3 поданий аналіз, виконаний із застосуванням морфологію, отриману в культурі після 13 днів активованого флюоресценцією аналізатора клітин (приклад 6). USSC після вирощування з РЕІ (FACS) для антигену CD45 культури в пробірці. виявляє експресію nestin-маркера нейральної CD45, характерний антиген маркера для стовбурової клітини. Перше спостереження гематопоієтичної клітини, майже не виявляється в показує, що nestin-фарбування найменш USSC з пізніх пасажів (Фіг.3 на 48,54 і 82-й день). виявляється після того, як клітини стимульовані Після застосування методу А щодо культури в речовинами для введення нейралу, наприклад, пробірці (приклад 1) препарати USSC стають смолоподібною кислотою (RA), основним позитивними стосовно до етапного специфічного фактором росту фібробласта, фактором росту раннього антигену 4 (SSEA4) і виявляють нерва (bFGF) β (NGF-β) (McKay, 1997). гомогенну експресію ембріонального маркера. На На Фіг.8 показано, що клітини USSC, Фіг.4 поданий аналіз, виконаний із застосуванням відповідно до винаходу, виявляють експресію активованого флюоресценцією аналізатора клітин nestin-маркера нервової стовбурової клітини. (FACS) для ембріонного маркера SSEA4. Клітини, USSC (А) були інкубовані у середовищі Н5100/РЕІ що розмножилися відповідно до методу А протягом 7 днів і піддавалися antinestin(приклад 1), дуже активно виявляють експресію стандартній імуногістохімічній обробці. Клітини (В) етапного специфічного раннього антигену 4 були інкубовані у середовищі Н5100/РЕІ протягом (SSEA4). У той самий час культури USSC 7 днів, наступних за 9 днями індукції RA, bFGF і залишаються негативними стосовно експресії NGF у Н5100. Слід зазначити, що інтенсивність поверхневого антигену HLA-класу І (Фіг.5А). nestin-фарбування знижується порівняно з Експресії антигену HLA DR (Фіг.5В), а також CD14 інтенсивністю зростання клітин при умовах (А). (Фіг.5С) негативні. На Фіг.5 поданий аналіз, Подальше дослідження цих клітин виявляє виконаний із застосуванням активованого також експресію характеристик протеїнів для флюоресценцією аналізатора клітин (FACS) для нейральних клітин, наприклад, γ-аміномасляної HLA-класу І (А, В, С), HLA DR і CD14. Культури кислоти (GABA, Фіг.9В), тирозингідроксилази USSC за даним винаходом після розмноження в (Фіг.9В), синаптофізину (Фіг.9D), нейрофіламенту пробірці залишаються негативними для антигенів (Фіг.9F) або типових гліальних антигенів, подібних HLA-класу І (панель А). Ці клітини залишаються до галактоцереброзидів (GalC, Фіг.10В) та також негативними для HLA DR (панель В) і CD 14 гліальних фібрилярних кислотних протеїнів (GFAP, (панель С) поверхневих антигенів, характерних Фіг.10D). На Фіг.9 показані USSC, за даним для антигендемонструючих клітин (HLA DR) і винаходом, що генерують клітини нейронної лінії моноцитів (CD14). диференціації. USSC, за даним винаходом, На Фіг.6 подана кінетична схема, виконана із вирощувалися протягом 7 днів у Н5100/РЕІ і застосуванням активованого флюоресценцією витримувалися протягом 27 днів на Н5100, що аналізатора клітин (FACS) для поверхневого містить RA, bFGF, NGF. Після стандартних маркера CD34. USSC вирощували в Н5100/РЕІ протоколів фіксації були застосовані нейрональні протягом більш 10 пасажів. специфічні антитіла. Показані контрастні за фазою На Фіг.7 подана фотомікрограма клітини USSC фотографії (А, С, D), флуоресцентні фотографії (В, після індукції нейроналу. Протягом цього періоду D, F) тих самих препаратів, що й при А, С, D. DNAрозвитку культури спостерігалося значне барвник DAPI (блакитний) використовують для зростання експресії антигену CD34. Стосовно фарбування клітинних ядер. Подвійна маркера CD34 гематопоієтичної стовбурової імунофлуоресцентна фотографія (В) виконана з клітини Фіг.6 підтверджує, що у пасажі 3 жодної використанням анти-GABА (червоний), позитивної клітини CD34 не може бути виявлено антитирозингідроксилази (ТН, зелений). (D) до 54-го дня. Навпаки, у сьомому пасажі на 82-й Фарбування (зелене) антисинаптофізину. (F) день з'являється нова позитивна субпопуляція Виявляється специфічне забарвлення (червоне) CD34.3 іншого боку, якщо такі позитивні антинейрофіламента нейрона. Проти різних попередники як CD34 і/або FIK1 були вирощені в підтипів нейрофіламента був використаний цитокін-культивованому середовищі, 11 81390 12 коктейль з антитіл. На Фіг.10 показані USSC, за Фіг.11А. Після закінчення індукції DAG може бути даним винаходом, що генерують клітини гліальної досягнута наступна диференціація до одержання лінії диференціації. Клітини піддавалися такому ж мінералізованих кісткових вузликів, як показано на впливу умов клітинної культури, який Фіг.11В за допомогою фарбування червоним продемонстрований на Фіг.9. DAPI - блакитний. (А, алізарином. С) -фотографії фазової контрастності. (В) Рухомість клітин за даним винаходом навіть відповідає тим самим клітинам, що показані під вище, ніж це було продемонстроване позначкою (А) і які піддавалися анти-GalСхондрогенною диференціацією після імунному фарбуванню (червоний). (D) відповідає культивування у середовищі DMEM з високим тим самим клітинам, що показані під позначкою (С) вмістом глюкози, що включає дексаметазон, з фарбуванням антигліальним фібрилярним пролін, натрійпіруват, ITS+Premix і TGF-β1 кислотним протеїном (GFAP, червоний). (Johnstone et al., 1998). За станом на 0 і 14-й день Однак, якщо описані вище універсальні експериментів, що стосуються даних стовбурові клітини узяті з будь-якого з пасажів диференціацій, клітини були зібрані та росту і внесені в DAG (дексаметазон, аскорбінова проаналізовані за допомогою RT-PCR (Таблиця 3, кислота, β-гліцеролфосфат), що містять умови приклад 4). культивування, або у фібронектин, що містить середовище, диференціація виникає уздовж Таблиця 3 остеогенної лінії диференціації (приклад 3). Як RT-PCR-дослідження у процесі хондрогенної показано у таблиці 2, кісткові специфічні маркерні диференціації USSC гени (алкалінфосфатаза, остеокальцин, колаген типу І) вільно вводяться і виявляються за Контрольний День 14 допомогою RT-PCR. β-актин (поз., + + Таблиця 2 контрольний) RT-PCR-дослідження у процесі остеогенної диференціації USSC Cart-1 β-актин (поз., контрольн.) Колаген, тип II Контрольний День 7 Хондроадерин + + Алкалінфосфатаза Колаген, тип ІІ Остеокальцин + Три гена-маркера остеогенної диференціації виявляються у зрослій mRNA-експресії на 7 день уведення DAG. β-актин служить за позитивний контроль. На Фіг.11 показані утворення мінералізованих "вузликів" після остеогенного введення і після фарбування червоним алізарином (В). Остеогенна диференціація шарів USSC, що майже злилися, була індукована шляхом додавання дексаметазону, аскорбінової кислоти і βгліцерофосфату в середовище культури Н5100. На 10-й день стимуляції з'являються характерні кісткові вузлики (11А). Мінеральне відкладення цих вузликів може бути продемонстроване за допомогою фарбування червоним алізарином (11В). В умовах остеогенної індукції клітини за даним винаходом піддаються повній остеогенній диференціації, як продемонстровано акумуляцією мінералізованої кістки в окремих вузликах (Фіг.11А), які можуть бути пофарбовані червоним алізарином (Фіг.11В). Як альтернатива, акумуляція гідроксіапатиту у культурі клітини може бути виявлена після 6 днів фарбування за von Kossa. На підставі отриманих результатів стає очевидним, що пуповинна кров містить дуже ранні стовбурові клітини, які до останнього часу не виявлялися і можуть розмножуватися в дуже великих кількостях. Крім того, дані клітини можуть бути індуковані для диференціації в MSC, а звідти в остеобласти, як вже було продемонстровано на День 14 + + + На 14-й день хондрогенної + стимуляції + виявляють експресію три характерних гена+ + маркера при проходженні хондрогенезу. Результати даних досліджень переконливо + демонструють позитивну активацію Cart-1, фактора специфічної хондрогенної транскрипції через 14 днів після хондрогенної стимуляції. Крім того, були активізовані mRNA-транскрипти для двох типових суглобових екстраклітинних протеїнів (колаген типу II і хондроадерин). Крім того, клітини за даним винаходом явно створили екстраклітинні протеогліканові молекули, типові для хондроцитозної диференціації, як показано за допомогою фарбування Alcian Blue (блідоблакитний). На Фіг.12 показане фарбування Alcian Blue USSC-похідної культури, що осіла на стінках пробірки (або у вигляді гранул). USSC вирощували під культурою осадження у середовищі хондрогенної диференціації. По закінченні 6 днів жодної більш менш значної кількості протеогліканів (PG) як характерних маркерів хондрогенної диференціації не було виявлено методом фарбування Alcian Blue (панель А). Навпаки, PG легко виявлялися, на що вказувала поява забарвлення блакитного/зеленого кольору (панель В). При цьому присутність суглобовоспецифічного колагену типу II могла бути продемонстрована на протеїновому рівні. На Фіг.13 показане забарвлення (колаген, тип II) (зелене) культур USSC після хондрогенної диференціації. USSC культивували у середовищі хондрогенної диференціації. Експресія екстраклітинного матричного протеїнового 13 81390 14 результатів на молекулярному і клітинному рівні, колагену типу II була продемонстрована на 14-й одержаних від нових фармакологічних засобів і, день методом флуоресцентної мікроскопії з нарешті, для заміни новими методами досліджень використанням первинного антитіла антиколагену ряду експериментальних досліджень на тваринах. типу II і FITC антимишиного вторинного антитіла Отже належним чином стандартизовані (Фіг.13В). стовбурові клітини і диференційовані клітини, Подальша рухомість нерестриктованої одержані з культур людської пуповинної крові, стовбурової клітини у даному випадку показана описані в даному документі, можуть бути шляхом диференціації таких культур, попередньо використані як оціночний тестовий реагент у вирощених відповідно до протоколу РЕІ, у жирові фармакологічній і біологічній галузях клітини з більш високими концентраціями промисловості. дексаметазону (приклад 5). На Фіг.14 показані Препарати USSC при певних відповідних жирові клітини, які можуть бути специфічно Oil умовах утримування культури забезпечують Red-пофарбовані в темно-червоний колір (Сигма). вирощування численних колоній різних Адипоцити характеризуються високою кількістю гематопоієтичних ліній диференціації, міжклітинних везикул і специфічним забарвленням забезпечуючи очевидність того, що дані клітини Oil Red у червоний колір. можуть активізувати кровотворення. Крім того, USSC після культивування протягом За певних умов культурне середовище з 24 годин у Н5100 з 10μΜ 5'-азацитидину, а потім з різними концентраціями VEGF, Flt 3L, SCGF 100нг/мл bFGF виявляє переконливе (фактор росту стовбурової клітини) і метилпідтвердження очевидності м'язової целюлози дані клітини розвивають змішані колонії диференціації. Зміна у м'язовій морфології клітин, позитивних також і щодо маркерів FLK1+ і супроводжується експресією повільно діючого АС133+, Тie1 і Тіе2. Відповідно до подальшої міозину (Фіг.15 і 16). Крім того, поява проліферації диференціації був розроблений профіль маркера, типових овальних кліток регулярно характерний для ендотеліальних клітин при спостерігається у пізніх пасажах (Фіг.17), коли РЕІнегативному АС133, CD31+, CD54+, VWF+, VEіндуковані USSC субклонуються з СD34+-популяції, Catherin+. поданої на Фіг.6 (приклад 8). Дані клітини у різному У даному описі заявляється про очевидну ступені виявляють, регульовану експресію користь таких ендотеліальних клітин для ферментної дипептидил-пептидази IV, яка вирощування в пробірці автологічних і алогенних означає, що такі овальні клітини можуть далі кровоносних судин для лікування васкулярних диференціюватися в клітини печінки. хвороб. USSC, вирощені в пробірці, виживають і У той самий час цілком зрозуміло, що дані залишаються життєздатними після ін'єкції в генеровані в пробірці і гомогенно вирощені регенерувальні печінки SCID-мишей з 50% попередники та їхні диференційовані клітини частковою резекцією печінки, а також в будуть служити на рівні клонування дуже неампутовані печінки, беручи до уваги, що важливим інструментом визначення ролі одноядерні клітини, похідні пуповинної крові, не специфічних генів і їхніх похідних у клітинній можуть бути виявлені навіть при трансплантації біології та наступних методах використання у 25-кратної кількості клітин. На Фіг.18 подані медицині на основі терапій на клітинному або тривалість існування та інтеграція культур USSC молекулярному рівні. після ін'єкції в паренхіму печінки SCID-миші. Лише незначної кількості даної унікального Фіг.18А: Червоне флуоресцентне забарвлення типу клітини досить, щоб генерувати велике число через 7 днів після трансплантації вказує на клітин USSC, що розростаються шляхом тривалість існування та інтеграцію людських USSC прилипання, які відповідають даному винаходу, і з мітками РКН26 за даним винаходом в тканину більш диференційованої мезенхімальноі печінки миші (без резекції). Навпаки, після стовбурової клітини для одержання прийнятних з трансплантації одноядерних клітин - похідних погляду медицини регенеративних типів клітин. пуповинної крові (MNC) ніякої червоної Одним із зовсім нових аспектів у даній галузі флуоресценції, що вказує на інтеграцію людських знань є той факт, що такі попередники можуть MNC, виявлено не було. Фіг.18В: кріосекція асиметрично розвиватися у двох або більше типах тканини печінки миші відповідної А: Світла клітин, що істотно відрізняються одна від одної. Це мікрограма трансмісії тканини печінки миші з відкриває нову біологічну концепцію Coінтегрованими людськими USSC. компонентної регуляції у функціонально Оскільки попередник клітин печінки та орієнтованій регенерації клітини, що відбувається панкреатичних β-острівкових клітин один і той навіть у пробірці. самий, такі СВ-похідні овальні клітини можуть бути Суть наступного застосування даного диференційовані в інсулінвиробляючі β-острівкові винаходу полягає у тому, що терапевтичні метода, клітини, перетворюючи їх у корисний інструмент засновані на використанні такої стовбурової для клітинної терапії хворих діабетом або клітини, повинні бути розроблені відповідно до пацієнтів з печінковою недостатністю. даної концепції і включати не тільки один тип На додаток до зазначених очевидних клінічних клональної клітини. Далі винахід ілюструється, але застосувань, будь-які з добре вивчених і належним не обмежується наступними прикладами чином узаконених стандартизованих компонентів здійснення винаходу. вирощених стовбурових клітин і їхніх попередників Приклад 1. Колекція пуповинної крові (СВ) можуть бути використані для контролюючих і визначальних дій, а також для досягнення 15 81390 16 фактор росту ВВ) і 10нг/мл rh-людського EGF Колекція пуповинної крові в акушерських (рекомбінантний людський епідермальний фактор відділеннях була створена з інформованої згода росту) (середовище РЕІ) при щільності від 1x104 матері. Після відторгнення дитини з плацентою до 1x105клітин/мл (метод вирощування А). Як пупковий канатик ще усередині матки був двічі альтернативний варіант препарати USSC можуть перетиснений і вирізаний розміром 7-10см з пупка. розмножуватися у середовищах, що забезпечують Після дезінфекції канатика пупкова вена була первинне зростання, А, В і С. пунктирована і поміщена в колекцію СВ, а саме, у Приклад 2. Визначення імунофенотипу клітин спеціальні судини для колекційних препаратів, що методом цитофторометрії містять цитратфосфатдекстрозу (CPD) як Щоб визначити імунофенотип USSC, клітини антикоагулянт. були пофарбовані FITC-кон'югованим анти-СD45 Виділення одноядерних клітин з пуповинної (Becton Dickinson, Coulter), РЕ-кон'югованим антикрові CD14 (PharMingen, Coulter), анти-SSEA-4 (MC-813Умбілікальна пуповинна кров була акуратно 70), міченим зображенням козерога F(ab')2 поміщена на розчин фікола (щільність 1,077г/см3). антимиша IgG+IgM (H+L)-FITC (Coulter), антиПотім було здійснене центрифугування градієнта CD10-PE (CALLA, PharMingen), анти-HLA-клac I щільності (450г, при кімнатній температурі (Coulter), міченим зображенням козерога F(ab')2 протягом 25 хвилин). Одноядерні клітини (MNC) антимиша IgG+IgM (H+L)-FITC, анти-CD13-PE інтерфази були зібрані і двічі промиті у (Becton Dickinson, Coulter); анти-СD29 (Coulter), фосфатному буферному фізіологічному розчині, анти-CD44 (Coulter), анти-СD49е (Coulter), антирН 7,3 (PBS). CD90 (Coulter), анти-HLА-клас II-FITC (Coulter). Генерування шарів фібробластоїдної Клітини були підраховані з використанням EPICS морфології, що прилипають XL (Coulter) або аналізатора FACS (Becton Одноядерні клітини були поміщені при Dickinson). щільності близько 5x103 клітин/см2 у колби з Приклад 3. Демонстрація потенціалу культурою Т25 (Nunclon) [Α.), В.), С.)]. Для остеогенної диференціації USSC ініціювання росту стовбурових клітин, що USSC, одержані відповідно до прикладу 1, прилипають, були використані чотири метода були культивовані у стандартному середовищі до вирощування культури: досягнення 70% злиття. Остеогенна А.) СВ-похідні MNC були спочатку диференціація цих клітин була індукована культивовані у середовищі Myelocult H5100 додаванням 10-7 Μ дексаметазону, 50μг/мл (StemCell Technologies, Vancouver/Canada), що аскорбінової кислоти і 10мМ β-гліцерофосфату містить 10-7 Μ дексаметазону. (Bruder et al., 1994, Jaiswal et al., 1977). На 10-й В.) СВ-похідні MNC були спочатку день стимуляції клітини виявляли осадження культивовані у середовищі Myelocult H5100 фосфату кальцію, в результаті чого утворювалися (StemCell Technologies, Vancouver/Canada), що кісткові вузлики. Мінералізовані кісткові вузлики містить10-7 Μ дексаметазону. були виявлені фарбуванням Alizarin Red С.) В-похідні MNC були спочатку культивовані відповідно до наступної технології: у середовищі DMEM з низьким вмістом глюкози Клітини культури, що прилипають, двічі (Bio-Whittaker) з 30% FCS, що містить 10-7 Μ промивали за допомогою PBS (фосфато-сольовим дексаметазону. буферним розчином), рН 7,3, і фарбували у 5мл D.) СВ-похідні MNC були поміщені при 0,1% розчину Alizarin Red протягом однієї години щільності 5x106/мл у 10мл середовища Myelocult при кімнатній температурі з подальшою обробкою H5100 (StemCell Technologies, Vancouver/Canada), 0,1% оцтовою кислотою та абсолютним етанолом, у 50-мілілітрові колби для вирощування культур також PBS. Фарбування за Alizarin Red і von Kossa (Nunclon) без дексаметазону. кальцію демонструє потенціал мінералізації цих Усі культури були інкубовані при 37°С у 5% клітин (Stanford et al., 1995, Rundby et al., 1993). СО2 у повністю зволоженій атмосфері і Остеогенна диференціація була також підгодовувалися один раз на тиждень шляхом продемонстрована RT-PCR з використанням видалення всього середовища з не прилиплими маркерів кістково-специфічної диференціації, клітинами і додаванням 10мл свіжого середовища. остеокальцину (ОС), остеопонтину (ОР), кістковоПісля декількох часових стадій клітини, що специфічної алкалінфосфатази (АР), сіалоприлипають, у формі веретена були вилучені протеїнової кістки (BSP), рецептора альфашляхом обробки 0,05% трипсину і 0,53 мМ EDTA тромбоцит-похідного фактора росту (PDGF-Ra), протягом 2 хвилин, промиті 50% середовищем, що рецептора епідермального фактора росту (EGFR) і містить сироватку, зібрані центрифугуванням при колагену типу І. 780г і підраховані методом проточної цитометрії Приклад 4. Демонстрація потенціалу або RT-PCR. Через період від двох до трьох хондрогенної диференціації USSC тижнів клітини фібробластоїдної морфології, що Для хондрогенної диференціації 2х105 розрослися і прилипають, становили близько 30% стовбурові клітини, що прилипають, були поміщені усіх клітинних культур. в культуру осадження у 15мл пропіленових Характеристики культури для зростання USSC трубках. DMEM з високою концентрацією глюкози, за даним винаходом що містить дексаметазон, пролін, натрійпіруват, USSC, що відповідають даному винаходу, ITS+Premix і TGF-β використовували як можуть бути розмножені у середовищі Н5100, що середовище клітинної культури (Johnstone et al., містить 10нг/мл IGF І (фактор росту І, подібний до 1998, Yoo et al., 1998). На 7,14 і 21-й день клітинні інсуліну), 10нг/мл PDGF-BB (тромбоцит-похідний 17 81390 18 фракції були досліджені за допомогою RT-PCR на флуоресцентної і просвічувальної оптичної суглобну специфічну генну продукцію, що кодує мікроскопії. Cart-1, колаген типу II і хондроадерин. Крім того, Приклад 7. Демонстрація потенціалу USSC були застосовані в культурах осадження. По диференціації у міоцитозних лініях диференціації закінченні двох тижнів депарафінізовані зрізи були 1x104 USSC культивували у середовищі Н5100 зафіксовані 4% параформальдегідом протягом 15 (StemCell Technology), доповненому 41нг/мл хвилин при кімнатній температурі і промиті PDGFBB, 10нг/мл EGF, 10нг/мл IGF при 37°С, 5% етанолом. Зрізи були пофарбовані 1% Аlcian CO2 доти, доки не досягали майже 70% злиття. Blue/3% оцтова кислота, рН 2,5 (Сигма) протягом 5 Після цього клітини інкубували з 10μΜ 5'хвилин і промиті у дистильованій воді. Вони ясно азацитидину (Сигма) протягом 24 годин, двічі продемонстрували позитивне забарвлення промивали PBS і культивували у середовищі специфічних протеогліканів, як показано Н5100, доповненому 100нг/мл bFGF (Сигма). забарвленням Аlcian Blue (Фіг.12) (Chao, G. et al., Через 1 тиждень морфологія клітин у середовищі 1993). Після 14-денного періоду хондрогенної диференціації змінилася (Фіг.15). Через 10 днів індукції клітини були зафіксовані відповідно до клітини були оброблені трипсином і перенесені у стандартного протоколу і досліджені методом покриті фібронектином предметні стекла з флуоресцентної мікроскопії (Roaenbaum et al., лунками для імунофарбування. 1998), демонструючи присутність специфічної Імуногістохімія екстраклітинної матриці колагену типу II (Фіг.13В). Клітини були зафіксовані 5% Приклад 5. Демонстрація потенціалу формальдегідом/PBS протягом 15 хвилин і двічі адипогенної диференціації USSC промиті в PBS, рН 7,3. Використовуючи 40пг/мл PDGFB, 10пг/мл EGF, 10пг/мл IGF. стандартний протокол, клітини інкубували USSC були культивовані в Н5100, що містить 10антискелетним міозин-(повільним)- специфічним 6 Μ дексаметазону, 50μг/мл аскорбінової кислоти і первинним антитілом (клон NOQ 7.5,4D, 1:400) 10мМ β-гліцерофосфату, результатом чого стала (фарбування у зелений колір) і первинним часткова диференціація USSC в адипоцити, що антитілом анти-CD13 (фарбування у червоний продемонстроване забарвленням Oil Red (Ramirez колір) або моноклональним антискелетним міазинZacarias et al., 1992). первинним антитілом (клон MY-32,1:4000). Приклад 6. Демонстрація потенціалу Забарвлення виявлялося позитивним для USSC, нейрогенної диференціації USSC культивованих відповідно до характерних Виділення клітини і характеристики культури особливостей культури (Фіг.16). для гліальних клітин Приклад 8. Одноядерні клітини пуповинної крові, одержані Людські клітини USSC, а також одноядерні описаними вище способами, були еліміновані для клітини, похідні пуповинної крові (MNC) були одержання клітин CD14+ за допомогою CD14/c марковані червоним забарвленням РКН26 RED використанням системи виділення шляхом Fluorescent Cell Linker Kit (за допомогою набору магнітного сортування клітин із застосуванням для клітинних досліджень) (Сигма, PKH26-GL). сепараційних колонок VS+, відповідно до інструкції 2x105 USSC і 5x106 MNC були введені в паренхіму виробника (Miltenyi Biotec, Bergich Gladbash). печінки SCID-миші з та без 50%-ї ампутації СD14-еліміновані одноядерні клітини були печінки. Через 7 днів після трансплантації була культивовані при щільності 2x106/мл у 10мл одержана повна регенерація тварин з частковою середовища з високим вмістом глюкози ампутацією печінки. Тканина печінки була (Dulbecco's MEM з 4500г/л глюкози) у колбі Т25 досліджена методом флуоресцентної мікроскопії для вирощування культури (Nunclon) і інкубовані або кріо-зрізу (секції) на наявність маркованих при 37°С у 5% CO2 з повністю зволоженою червоним забарвленням людських клітин (Фіг.8). атмосферою. Через 10-15 днів у культурі були Приклад 9. Демонстрація потенціалу виявлені клітини гліальної форми. диференціації USSC в гематопоієтичному ланцюзі Диференціація в нейральні клітини диференціації А) Клітини вирощувалися протягом 7 днів або Три різних препарати USSC (USSCксв55 у в одному Н5100 середовищі або за присутності середовищі DMEM, що містить 30% FCS; 40пг/мл PDGFB, 10пг/мл EGF, 10пг/мл IGF. Клітини USSCксв55 у середовищі Н5100, що містить були оброблені трипсином і поміщені на чашці дексаметазон; USSCксв55 у середовищі MesenCult, 3 2 Петрі при щільності близько 3,5x10 клітини/см у що містить РЕІ), які зростають на відповідному посуд для вирощування культури з 24 колодязями живильному середовищі протягом відповідних на покривному склі, покритому полі-Д-лізіном) періодів зростання (пасажі від 5 до 8), були висіяні (PDL) і ламініном (PDL/lam). Після цього у 250μл (2х104-2х105 клітин) клітинної суспензії на нейрональна диференціація була ініційована трьох абсолютно однакових чашках з 24 лунками у додаванням таких речовин, як олтрансретиноїдна гематопоієтичному специфічному культурному кислота (10-5 М), bFGF (20нг/мл) і NGF-β (50нг/мл). середовищі (Methocult 4434). Колонії більш ніж з Флуоресцентна мікроскопія 50 клітин були підраховані і класифіковані як Після завершення періоду індукції (27 днів) похідні клітини-попередників клітини були зафіксовані відповідно до гранулоцита/макрофага (CFU-GM), раннього стандартних протоколів (Rosenbaum et al., 1998) і еритроіда (BFU-E) або мультипотента (CFUпофарбовані антитілами проти специфічних GEMM) відповідно до встановлених критеріїв. антигенів. Зразки досліджувалися з використанням Формування клону у різних культурах помітно розпочиналося з першого тижня спостережень і 19 81390 20 тривало до трьох тижнів при умовах /Мезенхімальні стовбурові клітини у формуванні диференціації. Попередники USSC розвивали кістки, виправленні кістки і скелетної численні колонії різних клітинних ліній регенераційної терапії/. J. Cell. Biochem. 56; 284. диференціації, забезпечуючи очевидність того, що Caplan, ΑΙ., Mesenchymal stem cells дані клітини можуть активізувати гемопоез. /Мезенхімальні стовбурові клітини (1991)/. Orthop, Приклад 10. Молекулярні метода дослідження Res. 9: 641-50. нерестриктованих соматичних стовбурових клітин і Grompe, Μ and Finegold MJ. Liver Stem Cells продукти їх наступної диференціації /Стовбурові клітини печінки, /p. 455 - 497 from Stem Праймери PCR (полімеразно-ланцюжкової Cell Biology/ з біології стовбурової клітини, Cold реакції) для ампліфікації специфічних cDNASpring Harbor Laboratory Press, 2001. Grompe, M. послідовностей з остеокальцину, остеопонтину, and Finegold MJ. Liver stem cells /Стовбурові кісткового сіало-протеїну, алкалінфосфатази, клітини печінки, p. 455-497 from Stem Cell Biology/ з PDGFRa - і EGF-рецептора були селекціоновані з біології стовбурової клітини, Cold Spring Harbor різних відповідних екзонів з тим, щоб набути Laboratory Press, 2001. Hall, С. L.; Yang, В.; Yang, здатності розрізняти їх за розміром відновідним X.; Zhang, S.; Turley, M.; Samuel, S.; Lange, L. Α.; чином генерованих фрагментів DNA. Wang, C; Curpen, G. D,; Savani, R. C; Greenberg, A. За допомогою клонування в pCRL1-вектор H.; Turley, Ε. Α.: Overexpression of the hyaluronan (Invitrogen/USA) і подальшої трансформації в Е. receptor RHAMM is transforming and is also required соіі-штам TOP 10F відповідні специфічні cDNAfor H-ras transformation /Надлишкова експресія клони були одержані та охарактеризовані за hyaluronan-рецептора RHAMM перетворює, а допомогою циклового секвенування на також потрібна для H-ras-перетворення/. Cell 82: автоматичному секвенаторі (Applied Biosystems). 19-26,1995. Itano, Ν.; Kimata, К. Expression cloning RT-PCR-реакції були здійснені у два етапи. and molecular characterization of HAS protein, a 200нг загального числа RNA клітин спочатку були eukaryotic hyaluronan synthase /Експресійне піддані реверсивному транскрибуванню з клонування і молекулярна характеристика HASвикористанням 10 U AMV реверсивної протеїну, синтез евкаріотичного hyaluronan/. J. транскриптази (Promega, Mannheim), 1,5пмол 3'Biol. Chem. 271: 9875-9878, 1996. ген-специфічних праймерів, 1 mM dNTP і Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder буферного розчину (Promega, Mannheim), що SP. Osteogenic differentiation of purified, cultureподається, в обсязі 20μл протягом 1 години при expanded human mesenchymal stem cells in vitro температурі 50°С. PCR-реакція була здійснена з /Остеогенна диференціація очищених, вирощених використанням 2μл cDNA з використанням 1 U на культурі в пробірці людських мезенхімальних HotStarTaq DNA-полімерази, буферного розчину і стовбурових клітин./ J. Cell Biochem. 1997 Feb; Q-розчину (Quagen, Hilden), 1,5 мМ dNTP і 20пмол 64(2):295-312. 3'- і 5'-генспецифічного праймера. PCR-реакція Johnstone В, Hering TM, Caplan AI, Goldberg була здійснена при операції ініціювання протягом VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow15хв. при 95°С, при проведенні 37 циклів при 94°С derived mesenchymal progenitor cells /Хондрогенез протягом 30 секунд, при 56°С протягом 30 секунд, в пробірці мезенхімальних клітин-попередників, при 68°С протягом 1 хвилини, а остаточна похідних кісткового мозку/. Exp. Cell Res. 1998 Jan. операція полімеризації здійснювалася протягом 5 10; 238(1):265-72. хвилин при 68°С. Knittel Τ, Kobold D, Piscaglia F, Saile B, Таблиця 4: PCR-праймери для ампліфікації Neubauer K, Mehde M, Tirnpl R, Ramadori G. специфічних cDNA-послідовностей. Localization of liver myofibroblasts and hepatic У таблиці подані послідовності 3'- і 5'stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct праймера досліджуваних генів і передбачувана roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic довжина PCR-фрагмента в bр. tissue repair /Локалізація печінкових міофібробластів і печінкових клітин зірчастої структури у нормальній і хворій печінці пацюка: особлива роль (міо-) фібробластових субпопуляцій у поліпшенні будови тканини печінки/. Histochem Cell Biol., 1999 Nov.; 112(5) :387-401. Kritzik M.R. and Sarvetnick N. Pancreatic Stem Cells /Панкреатичні стовбурові клітини, p. 499 - 513 з біології стовбурової клітини/ from Stem Cell Biology, CoJd Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Mareschi K, Biasin E, Piacibello W, Aglietta M, Madon E, Fagioli F. Haematologica 2001 Oct.; 86(10): 1099100. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood /Виділення людських мезенхімальних стовбурових клітин: кістковий мозок у порівнянні з пуповинною кров'ю/. Pan, Т.-С; Sasaki, Т.; Zhang, R.-Z.; Fassler, R.; Посилання Timpi, R,; Chu, M.-L: Structure and expression of Bolder S., Fink DJ., and Caplan AI. (1994). fibulin-2, a novel extracellular matrix protein with Mesenchymal stem cells in bone formation, bone multiple EGF-like repeats and consensus motifs for repair, and skeletal regeneration therapy 21 81390 22 Typing IV: White Cell Differentiation Antigens calcium binding/Структура та експресія фібуліну-2, /Антигени диференціації білих кров'яних тілець/. нового позаклітинного матричного білка з Oxford: Oxford Univ. Press (pub.), 1989. Pp. 887-891. багатократними EGF-подібними повтореннями і Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, Solchaga L, мотиваціями для зв'язування кальцію/. J. Cell Biol. Caplan AI, Goldberg VM, Johnstone B. The 123; 1269-1277,1993. chondrogenic potential of human bone-marrowRamirez-Zacarias JL, Castro-Munozledo F, Kuriderived mesenchymal progenitor cells Harcuch W. Histochemfstry 1992 Jul.; 97(6):493-7, /Хондрогенний потенціал мезенхімальних клітинQuantitation of adipose conversion and triglycerides попередників, похідних кісткового мозку людини/. by staining intracytoplasmic lipids with Oil Red О J. Bone Joint Surg Am. 1998 Dec; 80(12): 1745-57. /Підрахунок перетворень тваринного жиру і Zhang, R.-Z.; Pan, T.-C; Zhang, Z.-Y.; Mattel, M.тригліцеридів шляхом забарвлення G.; Tirnpl, R.; Chu, M.-L.: Fibulin-2 (FBLN2): human інтрацитоплазменних ліпідів у червоний колір з cDNA sequence, mRNA expression, and mapping of використанням Oil Red О/. Rosenbaum, С., Kluwe, the gene on human and mouse chromosomes /DNAL, Mautner, VF., Friedrich, R.E., Muller, HW., послідовність людини, mRNA-експресія і Hanemann, CO. (1998): картографія гена на хромосомах людини та миші/. Enhanced proliferation and potassium Genomics 22:425-430, 1994. conductance of Schwann cells isolated from NF2 Скорочення schwannomas can be reduced by quinidine DAG середовище остеогенної /Прискорена проліферація і провідність калію диференціації, що містить Schwann-клітин, виділених з NF2-неврином можуть дексаметазон, аскорбінову бути зменшені на quinidine/. Neurobiol. Dis 5, 55-64. кислоту і β-гліцерофосфат Rungby J, Kassem M, Eriksen EF, Danscher G. HLA людський лейкоцитозний антиген Hfstochem J. 1993 Jun.; 2 5(6):446-51. The von Kossa reaction for calcium deposits: silver lactate MSC мезенхімальна стовбурова staining increases sensitivity and reduces клітина background. РЕІ середовище, що містить PDGF/Реакція von Kossa для осаджень кальцію: фарбування срібним лактатом підвищує чутливість BB, EGF і IGF SSEA4 етапно-специфічний ранній і зменшує фон/. Stanford CM, Jacobson PA, Eanes ED, Lembke антиген 4 LA, Midura RJ. J. Biol Chem 1995 Apr. 21; USSC нерестриктована соматична 270(16):9420-8. Rapidly forming apatitic mineral in an стовбурова клітина osteoblastic cell line /Мінерал апатит, що швидко PG протеоглікани. формується на остеобластній клітинній лінії (UMR 106-01 BSP). , Shapiro А.М. J., Lakey J. R.T,, Ryan Ε. Α., Korbutt G, S., Toth E., Wamock G. L, Kneteman N. M., Rajotte R. V. N Engi J Med 2000 Jul. 27; (343):230-235. Islet Transplantation in Seven Patients with, Type 1 Diabetes Mellitus Using a GlucocorticoidFree Immunosuppressive Regimen /Острівкові трансплантація Diabetes Mellitus типу 1 семи пацієнтам при використанні імунодепресивного режиму без застосування глюкокортикоїду/. Sztrolovics, R.; Chen, X.-IM.; Graver, J.; Roughley, P. J.; Korenberg, J. R.: Localization of the human fibromodulin gene (FMOD) to chromosome Iq32 and completion of the cDNA sequence /Локалізація гена людського фібромодуліну (FMOD) у хромосомі Iq32 і закінчення cDNA послідовності/. Genomics 23: 715-717, 1994. Tsuda T, Wang H, Timpi R, Chu ML. Fibulin-2 expression marks transformed mesenchymal pells in developing cardiac valves, aortic arch vessels, and coronary vessels /Мітки Fibulin-2 експресії що перетворили мезенхімальні клітини при розвитку кардіальних клапанів, судини дуги аорти, і коронарної судини/. Dev Dyn 2001 Sep.; 222(l):89100. Van der Schoot, C. E.; Huizinga, T. W. J,; Gadd, S. K.; Majdic, 0.; Wljmans, R; Knapp, W.; von dem Borne, A. E. G.: Identification of three novel Pi-linked proteins on granulocytes /Ідентифікація трьох нових Pi-зв'язаних білків на гранулоцитах/. In: Knapp, W.; Dorken, 6.; Gilks, W. R; Rieber, E. P.; Schmidt, R E.; Stein, H.; von dem Borne, A. E. G. K.: Leukocyte 23 81390 24 25 81390 26 27 81390 28 29 81390 30 31 81390 32 33 81390 34