Рослина brassica, яка містить мутантні алелі з комплексом жирний ацил-білок, що переносить ацил (ацил-acp), тіоестерази

Реферат: UA 99471 C2 (12) UA 99471 C2 Винахід належить до мутантних алелів гена, що кодують FATB білки. Винахід також належить до рослин Brassica, що містять зазначені алелі, та способів ідентифікації зазначених алелів. Зазначені мутантні алелі забезпечують знижений вміст насичених жирних кислот в олії зазначених рослин, в порівнянні з вмістом ненасичених жирних кислот. UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується галузі виробництва сільськогосподарської продукції, зокрема агрокультур, насіння яких містить нові композиції ліпідів. Пропонуються молекули нуклеїнових кислот дикого типу і мутантні молекули нуклеїнових кислот, що кодують в рослині Brassica В білки комплексу жирний ацил-ацилпереносник білку (АСР) тіоестерази, і ці білки як такі. Також пропонуються рослини, тканина и насіння, які містять щонайменше три мутантні алелі fatB (з щонайменше трьох різних генів, що кодують FATB білок) в своєму геномі, завдяки чому суттєво змінюється склад чи профіль жирних кислот в отриманій з насіння олії. Крім того, пропонуються способи генерації рослин Brassica, що дають насіння, олія з якого має знижені рівні насичених жирних кислот, а також олія, отримувана з такого насіння. Олія з такого насіння не вимагає подальшого змішування чи модифікації і може позначатись як «олія з низьким вмістом насичених жирних кислот» або як «олія, що не містить насичених жирних кислот» згідно з класифікацією Управління з контролю за продуктами і ліками Міністерства охорони здоров’я і соціального забезпечення США. Пропонуються також інструменти для виявлення (комплекти) і способи для виявлення присутності одного чи більше мутантних fatB та/або FATB алелів дикого типу в рослинах Brassica, їх тканині (тканинах) і насінні, а також способи для перенесення одного чи більше мутантних fatB та/або FATB алелів дикого типу в інші рослини Brassica і способи комбінування різних fatB та/або FATB алелів в рослинах. Зокрема, йдеться про способи для комбінування відповідної кількості мутантних fatB алелів, які кодують не функціональні FATB білки та/або FATB білки, що мають суттєво знижену активність in vivo, таким чином, щоб значно зменшити відносну кількість загальних насичених жирних кислот та/або конкретних насичених жирних кислот, які накопичуються в олії з насіння Brassica. Крім всього цього, даний винахід пропонує використання таких рослин або їх частин та/або їх потомства, насіння і олії з насіння, а також способи та/або комплекти за цим винаходом. Рівень техніки Економічне значення рослинних олій постійно зростає, оскільки вони широко використовуються в харчуванні людини і тварин, а також мають численні застосування у промисловості. Однак жирно-кислотний склад цих олій часто не є оптимальним для багатьох з цих застосувань. Оскільки і для харчових, і для промислових цілей необхідні особливі олії з конкретним жирно-кислотним складом, існує значний інтерес до модифікації складу олії шляхом селекції рослин та/або за рахунок використання нових молекулярних інструментів біотехнології рослинництва (дивись, наприклад, Scarth & Tang, 2006, Crop Science 46:1225-1236, стосовно модифікації олії з Brassica). Специфічні характеристики і корисність для здоров’я харчових олій визначаються в основному їх жирно-кислотним складом. Більшість рослинних олій, отримуваних з технічних видів рослин, складаються з пальмітинової (16:0), стеаринової (18:0), олеїнової (18:1), лінолевої (18:2) і ліноленової (18:3) кислот. Пальмітинова і стеаринова кислоти є насиченими жирними кислотами з, відповідно, 16 і 18 атомами вуглецю. Олеїнова, лінолева і ліноленова є ненасиченими жирними кислотами з 18 атомами вуглецю, які містять один, два чи три подвійних зв’язків, відповідно. Олеїнова кислота вважається моно-ненасиченою жирною кислотою, тоді як лінолева і ліноленова – полі-ненасиченими жирними кислотами. Олійні види Brassica, такі як Brassica napus (B. napus) і Brassica juncea (B. juncea), загальновідомі як рапс і гірчиця, тепер займають друге місце серед олійних культур після сої (FAO, 2005; Raymer (2002) у книзі J. Janick & A. Whipkey (ред.) Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA Raymer, p. 122-126). Рапсова олія, що виробляється з традиційних культурних олійних сортів Brassica (B. napus, B. rapa і B. juncea) (Shahidi (1990) у книзі Shahidi (ред.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 3-13; Sovero (1993) у книзі J. Janick & J.E. Simon (ред.) New crops. John Wiley & Sons, New York, p. 302-307), типово має в своєму жирно-кислотному складі 5% пальмітинової кислоти (С16:0), 1% стеаринової кислоти (С18:0), 15% олеїнової кислоти (С18:1), 14% лінолевої кислоти (С18:2), 9% ліноленової кислоти (С18:3) і 45% ерукової кислоти (С22:1) за вагою від загального вмісту жирних кислот (тобто, у ваг. %) (Ackman (1990) у книзі Shahidi (ред.) Canola and rapeseed: Production, chemistry, nutrition, and processing technology. Van Nostrand Reinhold, New York, p. 81-98). Ерукова кислота є небажаною з точки зору харчування жирною кислотою, і її вміст було зменшено до дуже низьких рівнів в олії Brassica для їстівних цілей. Типова відносна кількість насичених жирних кислот становить приблизно від 6,5 до 7,5% від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння, і представлені вони в основному пальмітиновою кислотою і стеариновою кислотою. У Канаді селекціонери сфокусували свої зусилля на створенні так званих «подвійно низьких» різновидів, які мають низький вміст ерукової кислоти в олії з насіння і низький вміст 1 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глюкозинолатів в твердій муці, що залишається після екстракції олії (тобто, вміст ерукової кислоти нижчий ніж 2 ваг. % і вміст глюкозинолатів нижчий ніж 30 мікромолів на 1 грам муки). Ці форми рапсу підвищеної якості, розроблені в Канаді, відомі як канола. Олія з каноли характеризується відносно низьким рівнем насичених жирних кислот (в середньому біля 7 ваг. %), відносно високим рівнем моно-ненасичених жирних кислот (біля 61 ваг. %) і проміжним рівнем полі-ненасичених жирних кислот (біля 32 ваг. %) з хорошим співвідношенням між лінолевою кислотою, тобто омега-6 жирною кислотою (біля 21 ваг. %), и альфа-ліноленовою кислотою, тобто омега-3 жирною кислотою (біля 11 ваг. %). Головна причина сучасної зацікавленості щодо харчового жиру криється в отриманні свідчень про зв’язок між високим споживанням жирів, особливо насиченого жиру, і коронарною хворобою серця. Високі рівні холестерину у крові, особливо «поганого» холестерину (ліпопротеїну низької щільності або ЛНЩ) становлять один з головних факторів ризику розвитку коронарної хвороби серця. Результати кількох досліджень засвідчили, що дієти з високим вмістом моно-ненасиченого жиру і низьким вмістом насиченого жиру можуть приводити до зниження рівня «поганого» холестерину (ліпопротеїну низької щільності або ЛНЩ), в той самий час підтримуючи рівень «хорошого» холестерину (ліпопротеїну високої щільності або ЛВЩ) (Nicolosi & Rogers, 1997, Med. Sci. Sports Exerc. 29:1422-1428). Рекомендації щодо харчування в Північній Америці і Європі закликають зменшити загальне споживання жирів до 30% чи менше, а споживання насичених жирів – до менше ніж 10% від загальної енергії (21 C.F.R. 101.75 (b) (3)) (порівняно зі споживанням насичених жирів біля 1520% від загальної кількості спожитих калорій в більшості індустріальних країн). З метою кращої поінформованості споживачів теперішні керівні вказівки щодо маркування, розроблені Управлінням з контролю за продуктами і ліками Міністерства охорони здоров’я і соціального забезпечення США, тепер вимагають, щоб рівень загальних насичених жирних кислот становив 1 г чи менше на стандартну кількість, яка звичайно споживається, і щоб не більше ніж 15% калорій від насичених жирних кислот приймати з продуктами, які мають маркування «низький рівень насиченого жиру» чи «низький насич.» (21 C.F.R. 101.62 (c) (2)), і менше ніж 0,5 г трансжирних кислот (тип ненасиченої жирної кислоти, отриманий (частковою) гідрогенізацією рослинних олій, який вважають нездоровим, оскільки він підвищує ризик розвитку коронарної хвороби серця, не дивлячись на те, що це ненасичена жирна кислота) на стандартну кількість, яка звичайно споживається, і на порцію страви з маркуванням «не містить (або нуль) насиченого жиру» чи «немає (або нуль) насич.» (21 C.F.R. 101.62 (c) (1)). Це означає, що загальний вміст насичених жирних кислот (ваговий відсоток насичених жирних кислот від загальної кількості жирних кислот в олії), тобто сума лауринової кислоти (С12:0; додеканова кислота), міристинової кислоти (С14:0; тетрадеканова кислота), пальмітинової кислоти (С16:0; гексадеканова кислота), стеаринової кислоти (С18:0; октадеканова кислота), арахідинової кислоти (С20:0; ейкозанова кислота), бегенової кислоти (С22:0; докозанова кислота) і лігноцеринової кислоти (С24:0; тетракозанова кислота), в рослинних оліях має бути меншою, ніж 7 ваг. %, щоб отримати маркування «низький вміст насич.», і менше ніж 3,5 ваг. %, щоб отримати маркування «немає насич.» (виходячи зі стандартної кількості 15 мл чи 14 г олії – 21 C.F.R. 101.12). Олія з каноли містить всього близько 7 ваг. % насичених жирних кислот, що менше у порівнянні з рівнем насичених жирних кислот в інших широко вживаних харчових рослинних оліях, таких як сафлорова олія (8 ваг. %), лляна олія (9 ваг. %), соняшникова олія (12 ваг. %), кукурудзяна олія (13 ваг. %), оливкова олія (15 ваг. %), соєва олія (15 ваг. %), арахісова олія (19 ваг. %), бавовняна олія (27 ваг. %), пальмова олія (51 ваг. %) і кокосова олія (91 ваг. %) (джерело: POS Pilot Plant Corporation). Для подальшого зниження цього рівня насичених жирних кислот застосовувались різні підходи. Модифікація рослинних олій може здійснюватись хімічним способом: в патенті США № 4,948,811 описаний склад тригліцеридного салатного/кулінарного жиру, в якому жирнокислотний вміст тригліцериду цього жиру включає менше ніж 3 ваг. % насичених жирних кислот, отримуваний шляхом хімічної реакції або фізичним відділенням насичених вуглеводнів. Однак хімічна модифікація рослинних олій для зниження рівня насичених жирних кислот є не тільки більш дорогою, ніж екстракція рослинної олії з олійних культур Brassica (або з іншої олійної культури), модифікованих для забезпечення поліпшеної харчової ендогенної рослинної олії, як тепер встановлено, але може не бути бажаним шляхом поліпшення якості олій для споживання людиною через потенційну ненавмисну присутність залишків від використовуваних хімічних продуктів і невстановлених побічних продуктів. Інша можливість модифікації жирно-кислотного складу олії пов’язана з використанням генної інженерії. Наприклад, заявка на патент США № 2004/0132189 описує зниження рівня насичених 2 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жирних кислот в лініях Brassica, які одночасно експресують послідовності синтази І і IV білку, що переносить бета-кетоацил-ацил Cuphea pullcherima, а також дельта-9 десатуразу сафлору приблизно до 3,0 ваг. % і менше 3,4 ваг. % у порівнянні з рівнем насичених жирних кислот в нетрансформованих контрольних лініях (приблизно 6,0 ваг. %). В публікації WO 06/042049 описані культури Brassica з відсутніми насиченими сполуками або зниженим рівнем цих сполук жирних кислот в насінні, що експресують ген дельта-9 десатурази. Однак недоліком трансгенних підходів для комерційного використання є необхідність отримання регуляторного дозволу і різне їх сприйняття в різних частинах світу. Жирно-кислотний склад рослинних олій можна модифікувати також шляхом застосування традиційних методик селекції. Ці методики використовують зародкову плазму в якості джерела природних мутацій, які впливають на жирно-кислотний склад. Наприклад, Raney et al. (1999, в працях 10-ого Міжнародного конгресу з рапсу: Нові горизонти для старої культури, Канберра, Австралія) описують популяції, виведені шляхом міжвидових схрещувань B. napus з B. rapa і B. oleracea, в яких рівень насичених жирних кислот, виражений як сума міристинової, пальмітинової, стеаринової, арахідинової, бегенової і лігноцеринової кислот, був знижений до менше ніж 6 ваг. % і в яких рівень насичених жирних кислот, виражений як сума міристинової, пальмітинової і стеаринової кислот, був знижений до менше ніж 5 ваг. %. Були спроби збільшити пул наявних мутацій і вибирати з них бажані характеристики за допомогою мутагенів. Наприклад, в публікації WO 91/15578 описані культури рапсу, які після самозапилення здатні формувати насіння, що дає олію з вмістом насичених жирних кислот, не більшим ніж 4 ваг. % у вигляді пальмітинової і стеаринової кислот, які були створені шляхом хімічного мутагенезу з наступною селекцією. В рослинах синтез жирних кислот de novo локалізується виключно у стромі пластид, де ацилові ланцюги ковалентно зв’язуються з розчинним білком, що переносить ацил (АСР), під час циклів видовження. Видовження вуглецевого ланцюга можна припинити, перенісши ацилову групу на гліцерин-3-фосфат і тим самим залишивши її в пластидному, «прокаріотичному» провідному шляху біосинтезу ліпідів. Альтернативно, специфічні тіоестерази можуть заступати прокаріотичний (пластидний) провідний шлях, гідролізуючи новоутворений ацил-АСР на вільну жирну кислоту і ацил. Згодом ця вільна жирна кислота виходить з пластид і попадає в цитоплазматичний «евкаріотичний» провідний шлях біосинтезу ліпідів. Цей провідний шлях локалізується в ендоплазматичному ретикулумі і є відповідальним за формування фосфоліпідів, тригліцеридів та інших нейтральних ліпідів. Отже, гідролізуючи ацил-АСР і вивільнюючи жирну кислоту, ацил-АСР тіоестерази каталізують перший комітований етап на евкаріотичному провідному шляху біосинтезу ліпідів в клітинах рослин і відіграють вирішальну роль в розподіленні de novo синтезованих ацилових груп між цими двома провідними шляхами (Lohden & Frentzen, 1988, Planta 176:506-512; Browse & Somerville, 1991, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:467-506; Gibson et al., 1994, Plant Cell Environ 17:627-637). Jones et al. (1995, Plant cell 7:359-371) і Voelker et al. (1997, Plant Physiology 114:669-677) описують два різні, але споріднені класи генів тіоестерази у вищих рослинах, названі FATA і FATB. Ці два класи тіоестерази можна відрізнити, порівнявши послідовності, та/або за їх специфічністю/преференцією щодо субстрату. Тіоестерази FATA (їх називають також тіоестеразами І класу) демонструють чітку преференцію до С18:1 ацил- або олеоїл-АСР і тільки незначну активність щодо С18:0 ацил- і С16:0 ацил-АСР (тобто, преференція до ацилу становить 18:1 >> 18:0 >> 16:0). З іншого боку, представники FATB (їх називають також тіоестеразами ІІ класу) віддають перевагу насиченим групам ацил-АСР в якості субстрату, і довжина ланцюга субстрату коливається в широких межах від С8 до С18 ацил-АСР (Mayer & Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627). Крім того, представників FATB можна далі розбити на дві функціональні групи. Певні ферменти FATB є специфічними до насичених ацилАСР в межах від С8 до С14 (тіоестерази, які віддають перевагу ацил-АСР з середньою довжиною ланцюга) і виявляються у видах, які продукують ланцюги середньої довжини, з експресією, обмеженою тканинами, що продукують ланцюги середньої довжини. Ферменти другої групи FATB, які віддають перевагу ацил-АСР в межах від С14 до С18 (головним чином пальмітоїл-АСР, наприклад ферменти з преференцією C16:0 > C18:1 > C18:0; тіоестерази, які віддають перевагу ацил-АСР з довгим ланцюгом), є присутніми мабуть у всіх основних частинах рослини і не обмежуються видами, які продукують ланцюги середньої довжини (Jones et al., 1995, Plant cell 7:359-371). Чому рослини мають ці різні типи тіоестераз і в чому полягають їх індивідуальні ролі, все ще залишається в основному нез’ясованим. Гени FATA були виділені з низки видів рослин, включаючи види Brassica. Наприклад, патенти США №№ 5,530,186, 5,530,186 і 5,945,585 описують гени FATA з соєвих бобів; Hellyer et al. (1992, Plant Mol. Biol. 20: 763-780) описують ферменти FATA з Brassica napus; Loader et al. 3 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (1993, Plant Mol. Biol. 23(4): 769-778) описують виділення і дослідження характеристик двох клонів ацил-АСР тіоестерази з бібліотеки ембріональної кДНК Brassica napus з використанням олігонуклеотидів, отриманих за даними щодо білкової послідовності олеоїл-АСР тіоестерази Brassica napus. Також і Mandal et al. (2000, Bioch. Soc. Transactions 28(6): 967-968) описують клонування послідовностей гену ацил-АСР тіоестерази з B. juncea, які демонструють гомологію з генами FATA з інших видів. Гени FATB, що кодують FATB ферменти, специфічні до насичених ацил-АСР в межах від С8 до С14 (тіоестерази, які віддають перевагу ацил-АСР з середньою довжиною ланцюга), були виділені з низки видів рослин, що продукують ланцюги середньої довжини, як це описано в наступних джерелах: WO 91/16421 описує виділення тіоестерази, яка віддає перевагу лауроїл (С12:0)-АСР з дерева Каліфорнія Бей (Umbellularia californica), тіоестерази, яка віддає перевагу C10:0 ацилАСР з камфори (Cuphea hookeriana), і тіоестерази, яка віддає перевагу стеароїл (С18:0)-АСР з сафлору (Carthamus tinctorius), і експресію тіоестерази з дерева Каліфорнія Бей в насінні Brassica, результатом чого є підвищений рівень лаурату у порівнянні з таким рівнем в насінні не трансгенної Brassica. WO 92/20236 описує виділення тіоестераз, які віддають перевагу ацил-АСР від С8:0 до С14:0, і експресію тіоестерази, яка віддає перевагу лауроїл (С12:0)-АСР, з дерева Каліфорнія Бей в Arabidopsis і Brassica campestris, результатом чого є підвищені рівні лаурату. Voelker et al. (1992, Science 257: 72-74) описують експресію кДНК FATB (Uc FATB1), що кодує лауроїл (С12:0)-АСР тіоестеразу з дерева Каліфорнія Бей – виду, який акумулює капронову (С10:0) і лауринову кислоту (С12:0) в олії з насіння, в насінні Arabidopsis thaliana, який звичайно не акумулює лаурат, що має своїм результатом накопичення лаурату в стиглому насінні. Voelker et al. (1996, Plant J. 9:229-241) описують трансформацію того самого FATB трансгену в Brassica napus, що має своїм результатом накопичення лаурату приблизно до 60 моль % тригліцеридних ацильних груп. Eccleston & Ohlrogge (1998, Plant cell 10:613-621) описують експресію С12:0 ацил-АСР тіоестерази з Umbellularia californica в насінні Brassica napus, що забезпечує отримання з насіння олії, яка містить від 1,8 моль % до 59,6 моль % лаурату (С12:0). WO 94/10288 описує виділення тіоестераз, які віддають перевагу ацил-АСР в межах від С8:0 до С10:0. Martini et al. (1995, в працях 9-ого Міжнародного конгресу з рапсу, Кембридж, Велика Британія, с. 461-463) описують два гени FATB з Cuphea lanceolata, окремо трансформовані в Brassica napus, які привели до накопичення каприлової (С8:0) і капринової кислоти (С10:0) в олії з насіння Brassica в низьких концентраціях. Denesh et al. (1996, Plant J. 9(2):167-172) описують експресію кДНК FATB (Ch FATB2) з мексиканського куща Cuphea hookeriana, який накопичує до 75 моль % каприлату (С8:0) і капрату (С10:0) в олії з насіння, в насінні трансгенної каноли, яка звичайно не накопичує цих жирних кислот, що має своїм результатом накопичення каприлату (С8:0), капрату (С10:0) і лаурату (С12:0) до 11, 27 і 2 моль %, відповідно. Гени FATB, що кодують FATB ферменти, специфічні до насичених ацил-АСР чи такі, що віддають перевагу насиченим ацил-АСР в межах від С14 до С18 (тіоестерази, які віддають перевагу ацил-АСР з довгим ланцюгом), були виділені з низки видів рослин: WO 95/13390 описує виділення послідовностей пальмітоїл (С16:0)-АСР тіоестерази з цибуліпорею, манго, в’язу і камфорного дерева та їх використання для підвищення і зниження рівнів насичених жирних кислот в соєвих бобах і канолі шляхом генетичної трансформації. Jones et al. (1995, Plant cell 7:359-371) описують експресію кДНК пальмітоїл (С16:0)-АСР тіоестерази з камфорного дерева (Ch FATB1) в трансгенних рослинах Brassica napus, результатом чого було зростання рівнів пальмітату (С16:0) з 6 моль % до 35 моль %. Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) описують експресію ацил-АСР тіоестерази від С14:0 до С18:0 з мускатного горіха (Myristica fragrans), який накопичує головним чином олію, що містить міристат (14:0), в насінні Brassica napus, що забезпечує отримання з насіння олії, збагаченої насиченими сполуками від С14 до С18. Voelker et al. (1997, Plant Physiol. 114:669-677) описують також експресію ацил-АСР тіоестерази С10:0 і С16:0 з в’язу (Ulmus americana), який накопичує головним чином олію, що містить капрат (10:0), в насінні Brassica napus, що забезпечує отримання з насіння олії, збагаченої насиченими сполуками від С10 до С18, головним чином пальмітат (С16:0), міристат (С14:0) і капрат (С10:0). 4 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO 96/23892 описує послідовності міристоїл (С14:0)-АСР тіоестерази з Cuphea palustris, камфорного дерева і мускатного горіха і їх використання для продукції міристату в клітинах рослин. WO 96/06936 описує кДНК пальмітоїл (С16:0)-АСР тіоестерази соєвих бобів і каноли та їх використання для підвищення і зниження рівнів насичених жирних кислот в соєвих бобах і канолі шляхом генетичної трансформації. Dormann et al. (2000, Plant Physiol 123:637-643) описують надекспресію кДНК ацил-АСР з довгим ланцюгом з Arabidopsis (AtFATB1) з використанням специфічного до насіння промотору в Arabidopsis, яка забезпечила накопичення в насінні великих кількостей пальмітату (С16:0) (з 10 моль % в контрольних рослинах дикого типу до 38,6 моль %). Антизначеннєва експресія кДНК FATB1 Arabidopsis під дією промотору мозаїчного вірусу цвітної капусти 35S мала своїм результатом значне зменшення вмісту пальмітату в насінні (з 11 моль % в контрольних рослинах дикого типу до 6 моль %), вмісту пальмітату в квітах і тільки незначні зміни вмісту жирних кислот в листі і корінцях. Bonaventure et al. (2003, Plant Cell 15:1020-1033) описують, що вміст пальмітату (С16:0) в гліцероліпідах мутанту Arabidopsis з Т-ДНК вставкою в гені FATB (в Arabidopsis наявними є два гени для FATA, але тільки один ген для FATB; дивись Mekhedov et al. 2000, Plant Physiol. 122:389-402; і Beisson et al. 2003, Plant Physiol. 1342:681-697), було знижено на 42% в листі, на 56% у квітах, на 48% в корінцях і на 56% в насінні. Крім того, вміст стеарату (С18:0) було знижено на 50% у листі і на 30% в насінні. Швидкість росту мутанту суттєво зменшилась, і мутантні рослини давали насіння з низькою життєздатністю, зменшеним проростанням і зміненою морфологією насіння, що засвідчує важливість FATB для розвитку рослин і розвитку насіння. Bonaventure et al. (2004, Plant Physiol 135:1269-1279) описують, що швидкість синтезу жирних кислот у листі трансгенної мутантної рослини Arabidopsis з виключеним геном FATB збільшується на 40%, призводячи до приблизно такої самої кількості пальмітату, експортованої з плазмід, що й в дикому типі, але при збільшенні експорту олеату приблизно на 55%. Pandian et al. (2004, тези на постері, 4-тий Міжнародний конгрес з рослинництва) повідомляли про виділення послідовностей повної довжини гену FATB з B. napus (номер доступу в GenBank DQ847275) і B. juncea (номер доступу в GenBank DQ856315), конструювання інвертованої дуплікованої структури з сайленсингом (виключенням) гену (під контролем специфічного до насіння промотору) зі збереженим фрагментом 740 bp частини послідовності B. napus, який поділяв більше ніж 90% гомології послідовності з послідовностями B. juncea і Arabidopsis thaliana, але менше ніж 40% гомології з FATA генами цих трьох видів, та його трансформацію в Arabidopsis thaliana, B. napus і B. juncea. Метою було створення трансгенних рослин зі зниженим вмістом пальмітинової кислоти в олії з насіння. В цьому описі не йдеться про вплив структури з виключеним геном на кінцевий склад олії з насіння (результати не наводяться) або про альтернативні методи створення культур Brassica з низьким вмістом насичених вуглеводнів в олії з насіння. Mayer і Shanklin (2005, J. Biol. Chem. 280(5): 3621-3627) описують структурну модель FATB білку Arabidopsis, в якому N-термінальний домен містить залишки, що змінюють специфічність (дивись також Mayer і Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11), а С-термінальний домен містить каталітичні залишки. Не дивлячись на той факт, що послідовності певних FATB генів є відомими з досягнутого рівня техніки, залишається потреба в повному розумінні генів і ферментів, задіяних в продукції і накопиченні насичених жирних кислот в олії з насіння, та в розробці методів (зокрема, не трансгенних методів), спрямованих на зменшення відносної кількості загальних насичених жирних кислот та/або конкретних насичених жирних кислот в насінні, які не мали б негативного впливу на ріст і розвиток рослин. На сьогодні з досягнутого рівня техніки відомі (не трансгенні) агрокультури Brassica, з насіння яких отримують олію, що містить значно менше, ніж 7%, насичених жирних кислот. Отже, існує потреба в інструментах і методах для створення таких рослин і олійного насіння, які охарактеризовані далі в докладному описі, на малюнках, в прикладах та у формулі винаходу. Суть винаходу Авторами даного винаходу було встановлено, що рослини Brassica napus містять 6 різних FATB генів і що на рівні насичених жирних кислот в рослинах Brassica, зокрема в олії з насіння вказаних рослин Brassica, можна впливати шляхом контролю за кількістю та/або типами FATB генів/алелів, які є «функціонально вираженими» в насінні, тобто які забезпечують функціональний (біологічно активний) FATB білок. Комбінуванням мінімальної кількості мутантних алелів шести FATB генів («fatB алелів», при збереженні мінімальної кількості FATB 5 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алелів дикого типу, що забезпечує мінімальний рівень функціонального FATB білку, можна модифікувати рівень насичених жирних кислот в олії з насіння і, зокрема, значно зменшити відносні кількості насичених жирних кислот (в тому числі, кількість пальмітинової кислоти). Вважається, що якась мінімальна кількість FATB алелів дикого типу є необхідною для підтримання продукції мінімальної кількості насичених жирних кислот та/або конкретних насичених жирних кислот в специфічних тканинах, щоб забезпечувався нормальний ріст рослин і розвиток насіння. Отже, в одному своєму аспекті, даний винахід в одному варіанті здійснення стосується рослини Brassica (і її частин, таких як насіння), яка містить щонайменше три мутантні FATB алелі в своєму геномі, де ці мутантні FATB алелі є алелями з щонайменше трьох різних FATB генів, вибраних з групи, що складається з FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3, і насіння якої дає олію, що містить не більше ніж 6 ваг. %, 5 ваг. %, 4 ваг. % чи 3,5 ваг. % (наприклад, 3 ваг. %, 2 ваг. %, 1 ваг. % чи менше) насичених жирних кислот від загальної кількості жирних кислот в олії з насіння. В своєму іншому аспекті даний винахід стосується (виділених) послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують дикого типу та/або мутантні FATB білки, а також їх фрагментів і способів використання цих послідовностей нуклеїнової кислоти для модифікації складу олії з насіння Brassica. Також винахід стосується самих білків і їх використання. Даний винахід стосується також насіння Brassica, рослин Brassica і частин рослин, що містять щонайменше три (мутантні) fatB алелі і, отже, суттєво знижену кількість функціональних FATB білків у порівнянні з насінням, рослинами і тканинами, які містять FATB алелі, що кодують відповідні функціональні білки. Насіння містить олію з модифікованою відносною кількістю та/або модифікованим складом насичених жирних кислот. В одному аспекті особливо зменшеною є кількість пальмітинової кислоти (С16:0), порівняно з олією, отриманою з насіння, в якому відсутні (щонайменше три) мутантні fatB алелі (тобто такому, яке замість того містить FATB алелі дикого типу). В іншому аспекті даний винахід стосується олії з насіння з модифікованою відносною кількістю та/або модифікованим складом насичених жирних кислот, яку можна отримати шляхом збирання насіння з рослини Brassica за цим винаходом і екстрагування олії з цього насіння або шляхом екстракції з великої кількості насіння Brassica у відповідності з цим винаходом, і використання такої олії з насіння. В ще іншому аспекті даний винахід стосується способів створення і селекції рослин, частин рослин і насіння, що містять щонайменше три таких мутантних fatB алелі, присутніх в щонайменше трьох різних локусах в геномі (тобто, в щонайменше трьох різних локусах від щонайменше трьох різних FATB генів, вибраних з групи, що складається з FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3), на відміну від присутності мутантних fatB алелів і FATB алелів дикого типу в рослині чи частині рослини. Отже, пропонуються способи (такі як мутагенез та/або селекція з використанням маркерів) для створення та/або ідентифікації fatB алелів чи рослин чи частин рослини, що містять такі алелі, і для комбінування відповідної кількості fatB алелів та/або різних типів fatB алелів в одній рослині, в результаті чого значно знижуються рівні насичених жирних кислот в олії з насіння такої рослини. Також пропонуються способи використання таких рослин, насіння, частин рослин і т.п. за цим винаходом для отримання олії з «низьким вмістом насичених сполук» чи «без насичених сполук» з подрібненого насіння Brassica. Термін «продукт рослинного походження», як він тут застосовується, включає будь-що, отримане з рослини за цим винаходом, включаючи частини рослин, такі як насіння, мука з насіння, макуха з насіння, жири чи олії з насіння. Пояснюючі малюнки На Фіг. 1 представлено графік, який показує результати напівкількісного аналізу RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою) з Прикладу 3. Вказані інтервали (11, 21 і 34 дні після цвітіння) (вісь Х) і рівень експресії кожного FATB гену в насінні (виходячи з 10 нг РНК), виражений як кількість геномної ДНК (в нг), що генерує інтенсивність полоси, співставну з інтенсивністю полоси специфічного до FATB гену продукту RT-PCR (вісь Y). На Фіг. 2 схематично представлено FATB-А1 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 13). На Фіг. 3 схематично представлено FATB-А2 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 15). На Фіг. 4 схематично представлено FATB-А3 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 17). На Фіг. 5 схематично представлено FATB-С1 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 19). 6 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 6 схематично представлено FATB-С2 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 21). На Фіг. 7 схематично представлено FATB-С3 ген (з інтронами), що кодує FATB-А1 білок дикого типу з ярового олійного рапсу (S) Brassica napus (SEQ ID №: 23). На Фіг. 2-7 ексони показані сірими боксами, інтрони – горизонтальними лініями між інтронами; позиція мутацій, описаних в Прикладах (названих «EMSxx» згідно з їх відповідною назвою «FATB-Xx-EMSxx», як описано в Прикладах) показана вертикальними лініями; довжина і позиція FATB специфічно зонду з SEQ ID №: 25 і 28 показані вертикальними лініями під схематичним представленням FATB генів; позиція FATB специфічних праймерів (названих «ID xx» згідно з їх відповідним SEQ ID №: хх) показана стрілками; масштабний відрізок показує довжину відповідних FATB генів. На Фіг. 8 представлено графік, який показує кореляцію між присутністю від 0 до 4 мутантних FATB алелів в гомозиготному стані в рослинах Brassica і рівнем загальних насичених жирних кислот (тобто, жирних кислот С14:0, С16:0, С18:0, С20:0, С22:0 і С24:0) (у вагових відсотках від загальної кількості жирних кислот) в олії з насіння рослин Brassica. Піддані аналізу рослини Brassica були потомками рослин Brassica, що містили три або чотири мутантні FATB алелі, тобто алелі FATB-AX-EMSY чи FATB-CX-EMSY, як показано в Таблиці 23, в гетерозиготному стані, як вказано. Мутантні FATB алелі позначені як aX-Y і cX-Y або як aX чи cX; FATB алелі дикого типу позначені як АХ чи СХ. Загальні дефініції Олія «з низьким вмістом насичених сполук» означає отриману з насіння олію, яка містить (в середньому) менше ніж 7 ваг. % загальних насичених жирних кислот від загальної ваги жирних кислот в цій олії. Ваговий відсоток насичених жирних кислот може бути рівним або меншим ніж 5 ваг. %, 5 ваг. %, 4 ваг. %, або більшим ніж 3,5 ваг. % (наприклад, 3,6 ваг. %). Олія, що «не містить насичених сполук», означає отриману з насіння олію, яка містить (в середньому) менше ніж 3,6 ваг. % загальних насичених жирних кислот від загальної ваги жирних кислот в цій олії. Ваговий відсоток насичених жирних кислот в олії, що не містить насичених сполук, може бути рівним або меншим ніж 3,5 ваг. %, 3,0 ваг. %, 2,5 ваг. %, 2,0 ваг. %, 1,5 ваг. % чи 1 ваг. %. «Агрокультура» означає вид рослини, яка культивується як сільськогосподарська культура, така як Brassica napus (AACC, 2n=38), Brassica juncea (AABB, 2n=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), Brassica rapa (синонім B. campestris) (AA, 2n=20. Brassica oleracea (CC, 2n=18) чи Brassica nigra (BB, 2n=16). Ця дефініція не охоплює бур’яни, такі як Arabidopsis thaliana. Термін «послідовність нуклеїнових кислот» (або молекула нуклеїнової кислоти) стосується молекули ДНК чи РНК в одно- чи дволанцюговій формі, зокрема ДНК, що кодує білок чи фрагмент білку за цим винаходом. «Послідовність ендогенних нуклеїнових кислот» стосується послідовності нуклеїнових кислот, що знаходиться в клітині рослини, наприклад ендогенний алель FATB гену знаходиться в ядерному геномі клітини Brassica. Термін «ген» означає послідовність ДНК, яка містить ділянку (ділянку, що транскрибується), яка транскрибується в молекулу РНК (наприклад, пре-мРНК, що містить послідовності інтрону, яка після сплайсингу стає зрілою мРНК) в клітині, функціонально зв’язану з регуляторними ділянками (наприклад, промотором). Отже, ген може включати кілька функціонально зв’язаних послідовностей, таких як промотор, 5’ лідерна послідовність, що включає, наприклад, послідовності, задіяні в ініціюванні трансляції, (білок) кодуючу ділянку (кДНК чи геномну ДНК) і 3’ не трансльовану послідовність, що містить, наприклад, сайти термінації транскрипції. «Ендогенний ген» використовується для диференціювання від «чужого гену», «трансгену» чи «химерного гену» і стосується гену від рослини певного роду, виду чи різновиду, який не було введено в цю рослину шляхом трансформації (тобто, він не є «трансгеном»), але який звичайно є присутнім в рослинах цього роду, виду чи різновиду або який було введено в цю рослину від рослин іншого роду, виду чи різновиду, в яких він звичайно є присутнім, методами звичайної селекції чи шляхом соматичної гібридизації, наприклад злиттям протопластів. Подібно до цього, «ендогенний алель» гену не є введеним в рослину чи тканину рослини шляхом трансформації, а є створеним, наприклад, мутагенезом та/або селекцією або отриманим шляхом скринінгу природних популяцій рослин. «Експресія гену» стосується процесу, в ході якого ділянка ДНК, функціонально зв’язана з відповідними регуляторними ділянками, зокрема з промотором, транскрибується в молекулу РНК. Ця молекула РНК потім обробляється далі (в ході пост-транскрипційних процесів) всередині клітини, наприклад шляхом сплайсингу РНК, ініціації трансляції і трансляції в амінокислотний ланцюг (поліпептид) і термінації трансляції кодонами припинення трансляції. Термін «функціонально експресований» використовується тут для того, щоб вказати на 7 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукування функціонального білку; термін «не функціонально експресований» вказує на те, що продукується білок зі зниженою функціональністю чи без функціональності (біологічної активності) або що не продукується жодного білку (дивись також далі). Терміни «білок» чи «поліпептид» використовуються взаємозамінно і стосуються молекул, які містять ланцюг амінокислот, без вказівки на якийсь специфічний спосіб дії, розмір, 3-мірну структуру чи походження. «Фрагмент» чи «частина» FATB білку також можуть називатись «білком». Термін «виділений білок» використовується для позначення білку, який більше не знаходиться в своєму природному середовищі, наприклад in vitro або в рекомбінантній бактеріальній чи рослинній клітині-хазяїні. «Фермент» – це білок, який володіє ферментативною активністю, такий як функціональні FATB білки, здатні гідролізувати субстрат (субстрати) жирний ацил-АСР на вільні жирні кислоти і АСР (ЕС_номер 3.1.2.). Терміни «цільовий пептид» чи «транзитний пептид» стосуються амінокислотних послідовностей, які націлюють білок на внутрішньоклітинні органели, такі як пластиди. FATB білки дикого типу включають пластидний цільовий пептид (чи пластидний транзитний пептид) на своєму N-термінальному кінці. «Зрілий білок» чи «зрілий FATB білок» стосується функціонального FATB ферменту без пластидного транзитного пептиду. «Білок-попередник» стосується зрілого білку з його транзитним пептидом. «FATB ген» стосується тут послідовності нуклеїнових кислот, що кодує білок, який зв’язується з жирною ацил-АСР тіоестеразою типу ІІ (тобто, FATB білок). Функціональний «FATB білок» володіє активністю щодо жирної ацил-АСР тіоестерази, тобто здатний гідролізувати жирні ацил-АСР субстрати, переважно насичені жирні ацил-АСР субстрати (наприклад, пальмитоїл-АСР; С16:0-АСР), на вільну жирну кислоту (наприклад, С16:0) і АСР, що можна тестувати за допомогою кількісного визначення біологічної активності. Для визначення функції та/або функціональності конкретного FATB гену/білку можна скористатись, наприклад, бактеріальною системою експресії, як вона описана у Salas & Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34), або колориметричним скринінгом на основі агарових чашок на активність тіоестерази, описаним у Mayer & Shanklin (2007, BMC Plant Biology 7(1):111). Для визначення загальної FATB активності в рослині чи тканині рослини проби на активність жирного ацил-АСР можуть проводитись на екстрактах рослин, як описано, наприклад, Bonaventure et al. (2003, Plant Cell 15:1020-1033) і Eccleston & Ohlrogge (1998, Plant Cell 10:613-622). Термін «алель», як він тут використовується, означає будь-яку з одної чи більше альтернативних форм гену в конкретному локусі. В диплоїдній (чи амфідиплоїдній) клітині організму алелі даного гену локалізуються в специфічному місці чи локусі на хромосомі. Один алель є присутнім на кожній хромосомі з пари гомологічних хромосом. Термін «гомологічні хромосоми», як він тут використовується, означає хромосоми, які містять інформацію щодо тих самих біологічних ознак і містять ті самі гени в тих самих локусах, але можливо різні алелі цих генів. Гомологічні хромосоми є хромосомами, які утворюють пару під час мейозу. «Негомологічні хромосоми», які репрезентують всі біологічні ознаки організму, утворюють комплект, і кількість комплектів в клітині називають плоїдністю. Диплоїдні організми містять два комплекти негомологічних хромосом, з яких кожна гомологічна хромосома успадкована від іншого батька. У амфідиплоїдних видів існують по суті два комплекти диплоїдних геномів, в силу чого хромосоми цих двох геномів називають гомеологічними хромосомами (і, подібним чином, локуси чи гени цих двох геномів називають гомеологічними локусами чи генами). Диплоїдний чи амфідиплоїдний рослинний вид може містити велику кількість різних алелів в одному конкретному локусі. Термін «гетерозиготний», як він тут використовується, означає генетичний стан, який існує тоді, коли два різних алелі знаходяться в одному конкретному локусі, але позиціонуються індивідуально на відповідних парах гомологічних хромосом в клітині. З іншого боку, термін «гомозиготний», як він тут використовується, означає генетичний стан, який існує тоді, коли два ідентичних алелі знаходяться в одному конкретному локусі, але позиціонуються індивідуально на відповідних парах гомологічних хромосом в клітині. Термін «локус», як він тут використовується, означає специфічне місце чи місця або сайт на хромосомі, де, наприклад, знаходиться ген чи генетичний маркер. Наприклад, «локус FATB-A1» стосується позиції на хромосомі геному А, де знаходиться FATB-A1 ген (і два FATB-A1 алелі). Коли йдеться про «рослину» чи «рослини» за цим винаходом, слід розуміти, що ці терміни охоплюють також частини рослини (клітини, тканини чи органи, насіння, а також частини, що відділяються, такі як корінці, листя, квіти, пилок і т.п.), потомків рослин, які зберігають відмінні ознаки батьків (зокрема, склад олії з насіння), таких як насіння, отримане самозапиленням чи 8 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перехресним запиленням, наприклад гібридне насіння (отримане при перехресному запиленні двох інбредних батьківських ліній), гібридні рослини і отримані з них частини рослин, якщо відсутні інші вказівки. «Молекулярний аналіз» (або тест) стосується аналізу, який показує (прямо чи непрямо) присутність чи відсутність одного чи більше конкретних FATB алелів в одному чи більше FATB локусів (тобто, в одному чи більше локусів FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 та/або FATB-С3). В одному варіанті здійснення даного винаходу він дозволяє визначити, чи є конкретний алель (дикого типу чи мутантний) гомозиготним чи гетерозиготним в даному локусі будь-якої окремої рослини. Термін «FATB дикого типу» (наприклад, FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 чи FATB-С3 дикого типу) означає алель природного походження, виявлений в рослинах Brassica, який кодує функціональний FATB білок (наприклад, функціональний FATB-А1, FATB-А2, FATBА3, FATB-С1, FATB-С2 чи FATB-С3 білок, відповідно). З іншого боку, «мутантний FATB» (наприклад, мутантні FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 чи FATB-С3) стосується FATB алелю, який не кодує функціональний FATB білок, тобто FATB алелю, який кодує нефункціональний FATB білок (наприклад, не функціональний FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 чи FATB-С3 білок, відповідно) чи кодує не-FATB білок. Такий «мутантний FATB алель» є FATB алелем дикого типу, який містить одну чи більше мутацій в своїй послідовності нуклеїнових кислот, причому ці мутації переважно мають своїм результатом суттєво знижену (абсолютну чи відносну) кількість функціонального FATB білку в клітині in vivo. Мутантні алелі послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують FATB білок, позначаються тут як «fatB» (наприклад, fatB-a1, fatB-a2, fatB-a3, fatB-c1, fatB-c2 чи fatBc3, відповідно). Мутантні алелі можуть бути або «природними мутантними» алелями, які є мутантними алелями, знайденими у природі (наприклад, утвореними спонтанно без застосування людиною мутагенів), або «індукованими мутантними» алелями, зобов’язаними своєю появою втручанню людини, наприклад шляхом мутагенезу. «Суттєво знижена кількість функціонального FATB білку» (наприклад, функціонального FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 та/або FATB-С3 білку) стосується зниження кількості функціонального FATB білку, продукованого клітиною, що містить мутантний FATB алель, щонайменше на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% чи 100% (тобто, клітина зовсім не продукує функціонального білку), у порівнянні з кількістю функціонального FATB білку, продукованого клітиною, що не містить мутантного FATB алелю. Отже, ця дефініція охоплює продукцію «не функціонального» білку (наприклад, процесованого білку, тобто білку, підданого пост-трансляційній модифікації), що не має біологічної активності in vivo, зниження абсолютної кількості функціонального білку (наприклад, відсутність продукції функціонально білку через мутацію в гені) та/або продукцію білку зі зниженою біологічною активністю, тобто неправильно функціонуючого білку (такого як процесований білок чи білок, продукований в результаті сплайсингу альтернативної мРНК), у порівнянні з активністю функціонального білку дикого типу. Подібно до цього, термін «мутантний FATB білок» охоплює білок, закодований мутантною послідовністю нуклеїнових кислот («fatB алель»), коли ця мутація призводить до суттєво зниженої та/або відсутньої ферментативної активності FATB in vivo, у порівнянні з активністю білку, закодованого не мутантною послідовністю дикого типу («FATB алель»). Термін «мутагенез», як він тут використовується, стосується процесу, в ході якого рослинні клітини (наприклад, насіння чи тканини Brassica, такі як пилок і т.п.) контактують один чи більше разів з мутагенним агентом, таким як хімічна речовина (така як етилметилсульфонат (EMS), етилнітрозосечовина (ENU) і т.п.) чи іонізуюче випромінювання (нейтрони, такі як в мутагенезі під дією швидких нейтронів, і т.п.), гамма-промені (такі як продуковані джерелом Кобальту 60), рентгенівські промені і т.п.) або комбінація вищезгаданих чинників. Якщо мутації, створювані опроміненням, часто являють собою крупні делеції чи інші значні ураження, такі як транслокації чи складні перебудови, то мутації, викликані хімічними мутагенами, часто являють собою більш дискретні ураження, такі як точкові мутації. Наприклад, EMS алкилює гуанінові основи, що призводить до помилкового спарювання основ: алкильований гуанін буде спарюватись з тіаміновою основою, результатом чого є головним чином переходи G/C в А/Т. Після мутагенезу рослини Brassica регенерують з оброблених клітин за відомими методиками. Наприклад, отримане у такий спосіб насіння Brassica може бути висаджене за звичайними методиками вирощування, і після самозапилення на рослинах розвивається насіння. Як варіант, сіянці з подвійним гаплоїдом можуть бути піддані екстракції, щоб негайно сформувати гомозиготні рослини. Додаткове насіння, яке розвивається в результаті такого самозапилення в поточному чи наступному поколінні, може бути зібране і піддане скринінгу на присутність мутантних FATB алелів. Відомими є кілька методик проведення скринінгу на специфічні мутантні алелі, 9 UA 99471 C2 TM 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад Deleteagene (Delete-a-gene; Li et al., Plant J 27: 235-242) використовує полімеразну ланцюгову реакцію (PCR) для скринінгу на мутанти з делецією, отримані за допомогою мутагенезу під дією швидких нейтронів; TILLING (цільові індуковані локальні ураження в геномах; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457) ідентифікує викликані EMS точкові мутації і т.п. Додаткові методики скринінгу на присутність специфічних мутантних FATB алелів будуть описані в Прикладах далі. Термін «ортолог» гену чи білку стосується тут гомологічного гену чи білку, виявленого у іншого виду, який має таку саму функцію, що й даний ген чи білок, але (звичайно) розійшовся щодо послідовності від якогось моменту часу, коли види, що містили ці гени, розійшлися (тобто, гени еволюціонували від загального предка шляхом видоутворення). Отже, ортологи FATB генів Brassica napus можуть бути ідентифіковані в інших видах рослин (наприклад, Brassica juncea і т.п.) на основі порівнянь обох послідовностей (наприклад, на основі відсотку тотожності послідовностей по всій послідовності чи по специфічних доменах) та/або функціонального аналізу. Термін «різновид» використовується тут у відповідності до конвенції UPOV (Союзу для захисту різноманітності рослин) і стосується угрупування рослин в єдиному ботанічному таксоні найнижчого відомого рангу, яке можна визначити шляхом експресії характеристик, що є результатом даного генотипу чи комбінації генотипів, можна відрізнити від будь-якого іншого угрупування рослин шляхом експресії щонайменше однієї з вказаних характеристик і яке вважається за одиницю по відношенню до його придатності розповсюджуватись незмінним (стабільним). Термін «що включає» слід інтерпретувати як такий, що вказує на присутність встановлених частин, етапів чи компонентів. Отже, план, що включає певну ознаку, може включати додаткові ознаки. Зрозуміло, що, коли якесь слово вживається в однині (наприклад, рослина чи корінь), множина також включається (наприклад, множина рослин, множина корінців). Отже, згадування якогось елементу в однині не виключає можливості присутності більше ніж одного елементу, якщо контекст чітко не вимагає, щоб наявним був один і тільки один з елементів. Вживання слова в однині звичайно означає «щонайменше один...». Для цілей даного винаходу «тотожність послідовностей» двох споріднених нуклеотидних чи амінокислотних послідовностей, виражена як відсоток, стосується кількості позицій в двох оптимально зіставлених послідовностях, які мають ідентичні залишки (х100), поділеній на кількість позицій, що порівнюються. Пропуск, тобто позиція в зіставленні, коли залишок, присутній в одній послідовності, є відсутнім в іншій, вважається позицією з неідентичними залишками. «Оптимальне зіставлення» двох послідовностей встановлюють шляхом зіставлення цих двох послідовностей по всій довжині у відповідності до алгоритму глобального зіставлення Needleman і Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53), який можна знайти в пакеті високоякісного програмного забезпечення з відкритим кодом для аналізу послідовностей EMBOSS (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; дивись, наприклад, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) з використанням установок за умовчанням (штраф за відкриття пропуску = 10 (для нуклеотидів) / 10 (для білків) і штраф за подовження пропуску = 0,5 (для нуклеотидів) / 0,5 (для білків)). Для нуклеотидів використовуваною матрицею замін за умовчанням є EBLOSUM62. «Суттєво ідентична» чи «суттєво подібна», як тут використовується, стосується послідовностей, які при оптимальному зіставленні, як описано вище, поділяють щонайменше певний мінімальний відсоток тотожності послідовностей (далі буде визначено докладніше). «Суворі умови гібридизації» можуть бути використані для ідентифікації нуклеотидних послідовностей, що є суттєво ідентичними даній нуклеотидній послідовності. Суворі умови залежать від послідовності і будуть різними за різних обставин. Загалом, суворі умови 0 вибирають такими, щоб температура була приблизно на 5 С нижчою, ніж температура термального плавлення (Tm) для конкретних послідовностей при певній іонній силі і рН. T m є температурою (при певній іонній силі і рН), при якій 50% цільової послідовності гібридизуються до довершено підібраного зонду. Типово суворі умови будуть вибиратись такими, при яких концентрація солі становить біля 0,02 моля при рН 7, і температура становить щонайменше 0 60 С. Зниження концентрації солі та/або підвищення температури збільшують суворість умов. Суворі умови для гібридизацій РНК-ДНК (Нозерн блотинг з використанням зонду з, наприклад, 100 нт) є для прикладу такими, які включають щонайменше одне промивання в 0,2Х SSC при 0 63 С впродовж 20 хвилин, чи еквівалентними умовами. 0 «Дуже суворі умови» можуть бути забезпечені, наприклад, гібридизацією при 65 С у водному розчині, який містить 6х SSC (20х SSC містять 3,0М NaCl, 0,3M натрію цитрату, рН 7,0), 10 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5х Denhardt’s (100X Denhardt’s містить 2% Ficoll, 2% полівініл пиролідону, 2% альбуміну бичачої сироватки), 0,5% натрію додецил сульфату (SDS) і 20 мкг/мл денатурованого носія ДНК (одноланцюгова ДНК спермію риби з середньою довжиною 120-3000 нуклеотидів) в якості неспецифічного конкурента. Після гібридизації промивання високої суворості має бути виконане в кілька етапів, з кінцевим промиванням (біля 30 хвилин) при температурі гібридизації в 0,2-0,1 х SSC, 0,1% SDS. «Помірно суворі умови» стосуються умов, еквівалентних гібридизації у вище описаному 0 розчині, але при температурі біля 60-62 С. Промивання помірної суворості має бути виконане при температурі гібридизації в 1 х SSC, 0,1% SDS. «Умови зниженої суворості» стосуються умов, еквівалентних гібридизації у вище описаному 0 розчині, але при температурі біля 50-52 С. Промивання в умовах зниженої суворості має бути виконане при температурі гібридизації в 2 х SSC, 0,1% SDS. Дивись також Sambrook et al. (1989) та Sambrook & Russell (2001). Докладний опис винаходу Авторами винаходу було встановлено, що Brassica napus (геном ААСС, 2n=4x=38), що є алотетраплоїдним (амфідиплоїдним) видом, який містить по суті два диплоїдних геноми (геном А і геном С) завдяки своєму походженню від диплоїдних предків, включає всього шість FATB локусів і FATB генів в своєму геномі, три гени на геномі А (які тут позначені «FATB-A1», «FATBA2» і «FATB-A3») і три гени на геномі С (які тут позначені «FATB-С1», «FATB-С2» і «FATB-С3»). Кажуть, що ген FATB-A1 є «гомеологічним» по відношенню до гену FATB-С1, FATB-A2 є «гомеологічним» по відношенню до FATB-С2, а FATB-A3 є «гомеологічним» по відношенню до FATB-С3,тобто «гени А» знаходяться на геномі А і походять від диплоїдного предка B. rapa (AA), тоді як «гени С» знаходяться на геномі С Brassica napus і походять від диплоїдного предка B. oleracea (CC). Як у будь-якому диплоїдному геномі, два «алелі» можуть бути присутніми на кожний FATB ген в кожному FATB локусі в геномі (один алель, будучи послідовністю гена, знаходиться на одній хромосомі, а другий – на гомологічній хромосомі). Нуклеотидна послідовність цих двох алелів може бути ідентичною (гомозиготною) чи різною (гетерозиготною) у будь-якої даної рослини, хоча кількість різних можливих алелів, існуючих для кожного FATB гену, може бути значно більшою, ніж два, у даного виду в цілому. Більш того, було встановлено, що рослини, які містять мутацію, що викликає суттєве зменшення кількості функціонального FATB білку, закодованого еквівалентом дикого типу мутантного fatB алеля, тільки в одному чи двох з цих шести FATB генів, не здатні значно зменшити відсоток (ваг. %) насичених жирних кислот в олії з насіння. Вважається, що щонайменше три мутантних fatB алелів трьох різних FATB генів (вибраних з FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3) повинні міститись в рослині, яка дає олію з насіння з низьким вмістом чи без вмісту насичених сполук. Отже, в одному варіанті здійснення даного винаходу, пропонуються рослини, що містять щонайменше три мутантних fatB алелі трьох різних FATB генів, в результаті чого ці мутантні fatB алелі забезпечують суттєво знижену кількість функціонального FATB білку того типу, який закодовано еквівалентом дикого типу цих мутантних алелів, а отже і суттєво знижену кількість функціональних FATB білків, продукованих в клітинах рослини, зокрема в насінні, що розвивається, in vivo. Комбінуючи достатню кількість копій специфічних мутантних fatB алелів з достатньою кількістю копій специфічних FATB алелів дикого типу в одній рослині, можна тонко настроїти кількість та/або тип функціональних FATB білків, що виробляються, а це, в свою чергу, впливає на експорт (кількість та/або тип) вільних насичених жирних кислот з пластиди і, відповідно, на жирно-кислотний склад отримуваної з насіння олії. Абсолютна і відносна кількість кожного з шести FATB білків може регулюватись у такий спосіб так, щоб отримати рослини, які продукують достатньо FATB білків для росту і розвитку рослини і при цьому виробляють і запасають в насінні бажану кількість та/або тип жирних кислот. Отже, в одному варіанті здійснення даного винаходу, пропонуються рослини і частини рослин, які містять щонайменше один функціонально виражений FATB алель, вибраний з FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATBС1, FATB-С2 і FATB-С3, який кодує повністю функціональний FATB білок, тоді як решта алелів можуть бути мутантними fatB алелями. Отже, в одному аспекті даного винаходу, пропонуються рослини чи частини рослин, що містять n-кратну кількість мутантних fatB алелів (шести FATB генів), де n ≤ 12, краще n ≤ 11 (наприклад, n = 10, 9 чи 8), так що щонайменше один алель продукує функціональний FATB білок. 11 UA 99471 C2 5 В іншому аспекті даного винаходу, пропонуються такі рослини чи частини рослин, як гомозиготний FATB потрійний мутант (n=6, тобто гомозиготний у відношенні мутантних алелів трьох генів, вибраних з шести FATB генів), гомозиготний FATB чотирикратний мутант (n=8) та/або гомозиготний FATB п’ятикратний мутант (n=10), де мутантні алелі вибираються з FATBА1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3 генів. Відповідно, в одному аспекті даного винаходу, пропонуються гомозиготні FATB потрійно мутантні рослини, де генотип рослини може бути описаний як: 10 12 UA 99471 C2 В іншому варіанті здійснення даного винаходу пропонуються гомозиготні FATB 4-кратно мутантні рослини, де генотип рослини може бути описаний як: 5 13 UA 99471 C2 В ще іншому варіанті здійснення даного винаходу пропонуються гомозиготні FATB 5-кратно мутантні рослини, де генотип рослини може бути описаний як: 5 10 В подальшому аспекті цього винаходу гомозиготні FATB потрійно (n=6), чотирикратно (n=8) та/або п’ятикратно (n=10) мутантні рослини чи частини рослин включають один додатковий мутантний алель, причому мутантні рослини чи частини рослин є гетерозиготними для цього додаткового мутантного FATB алеля (тобто, n=7, n=9 і n=11, відповідно), і цей мутантний алель вибирається з решти FATB генів дикого типу (тобто, з FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3 генів). Отже, в подальшому варіанті здійснення цього винаходу, пропонуються гомозиготні FATB потрійно мутантні рослини, включають один додатковий мутантний FATB алель, де генотип рослини може бути описаний як: 15 14 UA 99471 C2 15 UA 99471 C2 16 UA 99471 C2 5 В ще іншому варіанті здійснення даного винаходу пропонуються гомозиготні FATB чотирикратно мутантні рослини, включають один додатковий мутантний FATB алель, де генотип рослини може бути описаний як: 17 UA 99471 C2 18 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 В ще іншому варіанті здійснення даного винаходу пропонуються гомозиготні FATB п’ятикратно мутантні рослини, включають один додатковий мутантний FATB алель, де генотип рослини може бути описаний як: Наступним кроком тут пропонуються послідовності нуклеїнових кислот дикого типу і мутантні FATB гени/алелі від виду Brassica, а також дикого типу і мутантні FATB білки. Крім того, пропонуються способи створення і комбінування мутантних і дикого типу FATB алелів в рослинах Brassica, а також рослини і частини рослин Brassica, які містять специфічні комбінації дикого типу і мутантних FATB алелів в своєму геномі, завдяки чому ці рослини продукують насіння, олія з якого містить малу кількість або не містить насичених сполук. При цьому, рослини ростуть переважно нормально і мають нормальний фенотип. Використання цих рослин для перенесення мутантних FATB алелів в інші рослини становить ще один аспект даного винаходу, як і продукти рослинного походження з будь-яких описаних тут рослин. На додачу, пропонуються набори і способи для вибору за допомогою маркеру (MAS) для комбінування чи виявлення FATB генів та/або алелів. Кожний з варіантів здійснення даного винаходу буде докладно описаний далі. Послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом Пропонуються як послідовності нуклеїнових кислот дикого типу (FATB), що кодують функціональні FATB білки, так і мутантні (fatB) послідовності нуклеїнових кислот (які включають одну чи більше мутацій, переважно таких, що призводять до суттєво зниженої біологічної активності закодованого FATB білку чи до відсутності продукції FATB білку) FATB генів від видів Brassica, зокрема від Brassica napus, але також від інших видів Brassica, що культивуються як продуктивні рослини. Наприклад, види Brassica, які містять геном А та/або геном С, можуть включати різні алелі FATB-A чи FATB-C генів, які можуть ідентифікуватись і комбінуватись в одній рослині за цим винаходом. Крім того, методи мутагенезу можуть бути використані для генерування мутацій в FATB алелях дикого типу і створення мутантних алелів за цим винаходом. Оскільки специфічні FATB алелі переважно комбінуються в рослині Brassica napus шляхом схрещування і селекції, в одному варіанті здійснення пропонуються FATB та/або fatB 19 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності нуклеїнових кислот в рослині Brassica (тобто ендогенно), яка може бути схрещена з Brassica napus або яка може бути використана для створення «синтетичної» рослини Brassica napus. Гібридизація між різними видами Brassica є описаною в літературі (дивись, наприклад, Snowdon, 2007, Chromosome research 15:85-95). Міжвидова гібридизація може бути використана, наприклад, для перенесення генів з, наприклад, геному С в Brassica napus (ААСС) в геном С в B. carinata (BBCC) або навіть з, наприклад, геному С в Brassica napus (ААСС) в геном В в B. juncea (AABB) (спорадична подія незаконної рекомбінації між їх геномами С і В). «Ресинтезовані» чи «синтетичні» лінії Brassica napus можуть бути отримані схрещуванням вихідних предків B. oleracea і B. rapa. Міжвидові, а також міжродові, бар’єри несумісності можуть бути успішно подолані в схрещуваннях між продуктивними видами Brassica та їх родичами, наприклад шляхом використання техніки ембріонального рятунку (застосовується при схрещуванні неспоріднених видів рослин для недопущення кросинговера між неспорідненими хромосомами) чи техніки злиття протопластів (дивись, наприклад, Snowdon вище). Пропонуються також виділені FATB і fatB послідовності нуклеїнових кислот (наприклад, виділені з рослини шляхом клонування або створені шляхом синтезу ДНК), їх варіанти і фрагменти будь-якої з них, оскільки вони можуть бути використані для визначення того, яка послідовність є присутньою ендогенно в рослині чи частині рослини, чи кодує дана послідовність функціональний білок, білок з суттєво зниженою функціональністю чи білок без функціональності (наприклад, шляхом експресії в рекомбінантній клітині-хазяїні і ферментного імуносорбентного аналізу), та для відбору і перенесення специфічних алелів з однієї рослини Brassica до іншої для того, щоб створити рослину з бажаною комбінацією функціональних і мутантних алелів. Послідовності нуклеїнових кислот FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATBС3 були виділені з озимого олійного рапсу (WOSR) і ярового олійного рапсу (SOSR) Brassica napus, як показано в переліку послідовностей. Зображені FATB послідовності дикого типу, тоді як мутантні fatB послідовності і послідовності, суттєво подібні до них, будуть описані далі і в Прикладах з посиланням на FATB послідовності дикого типу. Геномна ДНК, що кодує FATB білок, і відповідна пре-мРНК, містить 5 ексонів (які нумеруються від 1 до 5, починаючи з 5’ кінця), які перериваються 4 інтронами (які нумеруються від 1 до 4, починаючи з 5’ кінця). В кДНК і відповідній обробленій мРНК (тобто, сплайсированій РНК) інтрони є видаленими, а ексони – з’єднаними, як показано в переліку послідовностей. Послідовності ексонів є більш збереженими в ході еволюції і тому менш варіабельними, ніж послідовності інтронів. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-А1» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-А1» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 2 (WOSR FATB-A1) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 14 (SOSR FATB-A1) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 1 (WOSR FATB-A1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 13 (SOSR FATB-A1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-А2» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-А2» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 4 (WOSR FATB-A2) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 16 (SOSR FATB-A2) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 3 (WOSR FATB-A2) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 15 (SOSR FATB-A2) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-А3» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-А3» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 6 (WOSR FATB-A3) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 18 (SOSR FATB-A3) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які 20 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 5 (WOSR FATB-A3) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 17 (SOSR FATB-A3) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-С1» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-С1» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 8 (WOSR FATB-С1) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 20 (SOSR FATB-С1) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 7 (WOSR FATB-С1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 19 (SOSR FATB-С1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-С2» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-С2» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 10 (WOSR FATB-С2) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 22 (SOSR FATB-С2) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 9 (WOSR FATB-С1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 21 (SOSR FATB-С1) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. «Послідовності нуклеїнових кислот FATB-С3» чи «варіантні послідовності нуклеїнових кислот FATB-С3» за цим винаходом є послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 12 (WOSR FATB-С3) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього та/або з SEQ ID №: 24 (SOSR FATB-С3) при зіставленні з транзитним пептидом чи без нього, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 95%, 98%, 99% чи 100% тотожність з SEQ ID №: 11 (WOSR FATB-С3) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них та/або з SEQ ID №: 23 (SOSR FATB-С3) при зіставленні з інтронами 1-4 чи без них. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також «суттєво подібними» чи «суттєво ідентичними» з FATB послідовностями, наведеними в переліку послідовностей. Отже, даний винахід пропонує послідовності нуклеїнових кислот, що кодують дикого типу, функціональні FATB-А1, FATB-А2, FATB-А3, FATB-С1, FATB-С2 і FATB-С3 білки, включаючи їх варіанти і фрагменти (як докладніше буде визначено далі), а також мутантні послідовності нуклеїнових кислот з будь-якої з них, причому мутація в послідовності нуклеїнових кислот переважно має своїм результатом вставку, делецію чи заміщення однієї чи більше амінокислот, у порівнянні з білком дикого типу. Переважно, мутація (мутації) в послідовності нуклеїнових кислот приводить до заміни однієї чи більше амінокислот (тобто, по відношенню до амінокислотної послідовності дикого типу, відбувається вставка, делеція чи заміщення однієї чи більше амінокислот), внаслідок чого біологічна активність FATB білку значно знижується. Значне зниження біологічної активності мутантного FATB білку називають зниженням ферментативної активності (тобто активності ацил АСР-тіоестерази) щонайменше на 30%, щонайменше на 40%, 50% чи більше, щонайменше на 90% чи 100% (відсутність біологічної активності), у порівнянні з активністю білку дикого типу. Даний винахід пропонує як ендогенні, так і виділені послідовності нуклеїнових кислот. Також пропонуються фрагменти FATB послідовностей і FATB варіантних послідовностей нуклеїнових кислот, визначених вище, для використання в якості праймерів або зондів і в якості компонентів комплектів у відповідності до іншого аспекту цього винаходу (докладніше буде далі). «Фрагмент» FATB чи fatB послідовності нуклеїнових кислот або її варіант (як визначено) може мати різну довжину, таку як щонайменше 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 стичних нуклеотидів FATB чи fatB послідовності (або варіантної послідовності). Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують FATB білки 21 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовності нуклеїнових кислот, наведені в переліку послідовностей, кодують функціональні FATB білки дикого типу від Brassica napus. Отже, ці послідовності є ендогенними для WOSR і SOSR рослин, з яких їх було виділено. Інші продуктивні види Brassica, різновиди, селекційні лінії чи дикі поповнення можуть бути піддані скринінгу на інші FATB алелі, які кодують ті самі FATB білки чи їх варіанти. Наприклад, методики гібридизації нуклеїнових кислот (наприклад саузерн блотинг з використанням суворих умов гібридизації) чи методики, що базуються на ПЛР, можуть бути використані для ідентифікації FATB алелів, ендогенних для інших рослин Brassica, таких як різновиди Brassica napus, лінії чи поповнення, але також рослини і тканини Brassica juncea (особливо FATB алелі на А-геномі), Brassica carinata (особливо FATB алелі на С-геномі), а також Brassica rapa (А-геном) і Brassica oleracea (С-геном) можуть бути піддані скринінгу на інші FATB алелі дикого типу. Для проведення скринінгу таких рослин і тканин рослин на присутність FATB алелів можуть бути використані FATB послідовності нуклеїнових кислот, наведені в переліку послідовностей, або варіанти чи фрагменти будь-якої з них. Наприклад, цілі послідовності чи фрагменти можуть бути використані як зонди чи праймери. Наприклад, специфічні чи «вироджені» праймери можуть бути використані для ампліфікації послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують FATB білки з геномної ДНК рослини чи тканини рослини. Ці FATB послідовності нуклеїнових кислот можуть бути виділені і впорядковані за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Потім може бути здійснений біоінформаційний аналіз, щоб охарактеризувати алель (алелі), наприклад щоб визначити, якому FATB алелю відповідає дана послідовність і який FATB білок чи варіант білку кодується цією послідовністю. Чи кодує послідовність нуклеїнових кислот функціональний FATB білок, можна проаналізувати методами рекомбінантної ДНК, відомими спеціалістам в цій галузі, наприклад експресією молекули нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні (наприклад, бактерії, такої як E. coli) з наступним аналізом ацил-АСР тіоестерази та/або специфічності до субстрату отриманого білку чи клітин. Наприклад, гідроліз жирного ацил-АСР після рекомбінантної експресії в E. coli є описаним Doermann et al., 2000 (Plant Physiology 123: 637-643) і Doermann et al., 1995 (Arch Biochem Biophys 316: 612-618), Yuan et al. (1995, PNAS Vol 92: 10639-10643), Salas & Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403: 25-34) і Mayer & Shanklin (2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11). Крім того, дослідження гідролізу жирного ацилу-АСР (АСР = білок, що переносить ацил) з використанням неочищених гомогенатів тканини рослин було описано Eccleston & Ohlrogge (стосовно гідролізу С12:0- і С18:1-АСР; 1998б Plant Cell 10: 613-622), Salas & Ohlrogge (2002, Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34) і Bonaventure et al. (стосовно гідролізу С16:0-АСР і С18:1-АСР; 2003, Plant Cell 15:1020-1033). До того ж, зрозуміло, що FATB послідовності нуклеїнових кислот та їх варіанти (або фрагменти будь-чого з них) можуть бути ідентифіковані in silico, шляхом скринінгу баз даних нуклеїнових кислот на суттєво подібні послідовності. Крім цього, послідовність нуклеїнових кислот можна синтезувати хімічним шляхом. Фрагменти молекул нуклеїнової кислоти за цим винаходом, які докладно буде описано далі, також можуть бути використані. Фрагменти включають послідовності нуклеїнових кислот, які кодують тільки зрілий білок, або менші фрагменти, які включають всі або частину послідовностей ексону та/або інтрону і т.д. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують мутантні FATB білки Послідовності нуклеїнових кислот, що містять одну чи більше делецій, вставок чи заміщень нуклеотидів по відношенню до послідовностей нуклеїнових кислот дикого типу, становлять ще один варіант здійснення даного винаходу, як і фрагменти таких мутантних молекул нуклеїнової кислоти. Такі мутантні послідовності нуклеїнових кислот (позначені як fatB послідовності) можуть бути створені та/або ідентифіковані за допомогою різних відомих методів, як буде докладніше описано далі. І знову, такі молекули нуклеїнової кислоти пропонуються як в ендогенній формі, так і у виділеній формі. В одному варіанті здійснення мутація (мутації) призводить до однієї чи більше змін (делецій, вставок та/або заміщень) в амінокислотній послідовності закодованого FATB білку (тобто, це не «мовчазна мутація»). В іншому варіанті здійснення мутація (мутації) в послідовності нуклеїнових кислот призводить до суттєво зниженої чи повністю анульованої біологічної активності закодованого FATB білку відносно білку дикого типу. Отже, молекули нуклеїнової кислоти можуть включати одну чи більше мутацій, таких як: (а) «міссенс мутація», що є такою зміною в послідовності нуклеїнових кислот, яка призводить до заміщення амінокислоти іншою амінокислотою; (б) «нонсенс мутація» або «мутація стоп-кодону», що є такою зміною в послідовності нуклеїнових кислот, яка призводить до введення незрілого стоп-кодону і, отже, до закінчення трансляції (що має результатом процесований білок, тобто білок, який піддався пост 22 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансляційній модифікації); рослинні гени містять функцію термінації трансляції (що має результатом процесований білок); рослинні гени містять стоп-кодони трансляції «TGA» (UGA в РНК), «ТАА» (UAA в РНК) і «» (UAG в РНК); отже, будь-яке заміщення, вставка чи делеція в нуклеотиді, які приводять до того, що коли один з цих кодонів транслюється в зрілу мРНК (в рамку зчитування), трансляція припиняється; (в) «інсерційна мутація» однієї чи більше амінокислот внаслідок додавання одного чи більше кодонів в кодуючу послідовність нуклеїнової кислоти; (г) «делеційна мутація» однієї чи більше амінокислот внаслідок делеції одного чи більше кодонів в кодуючій послідовності нуклеїнової кислоти; (д) «мутація зміщення рамки», яка призводить до того, що послідовність нуклеїнових кислот транслюється в іншу рамку, яка передує мутації. Мутація зміщення рамки може мати різні причини, такі як вставка, делеція чи дуплікація одного чи більше нуклеотидів, але також і мутації, які порушують сплайсинг мРНК (мутації місця зрощування), можуть призводити до зміщень рамки; (е) «мутація місця зрощення», яка змінює чи анулює правильний сплайсинг послідовності пре-мРНК, призводячи до утворення білку з іншою амінокислотною послідовністю, ніж у дикого типу. Наприклад, один чи більше ексонів можуть бути пропущені під час сплайсингу РНК, призводячи до утворення білку без амінокислот, закодованих пропущеними ексонами. Як варіант, рамка зчитування може бути зміненою через неправильний сплайсинг, або один чи більше інтронів можуть залишитись, або можуть утворитись інші донори чи акцептори сплайсированого фрагменту, або сплайсинг може початись в іншому місці (наприклад, в інтроні), або можуть генеруватись інші сигнали поліаденілювання. Правильний сплайсинг премРНК є складним процесом, який можуть пошкодити різні мутації в нуклеотидній послідовності гену, що кодує FATB. У вищих евкаріотів, таких як рослини, головна сплайсингосома з’єднує інтрони, що містять GU в 5’ сайті сплайсингу (донорний сайт) і AG в 3’ сайті сплайсингу (акцепторний сайт). Це правило GU-AG (або GT-AG правило; дивись Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp885-920, ISBN 0198577788) дотримується приблизно в 99% сайтів сплайсингу ядерних евкаріотичних генів, тоді як інтрони, які містять інші динуклеотиди в 5’ і 3’ сайтах сплайсингу, такі як GC-AG і AU-AC, відповідають тільки за приблизно 1% і 0,1%, відповідно. Як вже згадувалось, бажано, щоб мутація (мутації) в послідовності нуклеїнових кислот переважно мали своїм результатом мутантний білок, що має значно знижену ферментативну активність in vivo або зовсім її не має. В основному, будь-яка мутація, яка приводить до утворення білку, що містить щонайменше одну амінокислотну вставку, делецію та/або заміщення відносно білку дикого типу, може призвести до суттєво зниженої ферментативної активності чи її відсутності. Однак зрозуміло, що мутації в певних частинах білку з більшою вірогідністю будуть мати своїм результатом знижену функцію мутантного FATB білку, такі як мутації, які призводять до процесованих (тобто підданих пост-трансляційній модифікації) білків, внаслідок чого втрачається значна частина функціональних доменів, таких як каталітичний домен. FATB білки Brassica, описані тут, мають приблизно 412-424 амінокислоти завдовжки і містять низку структурних (і функціональних) доменів. Вони включають наступне: цільовий пептид N-термінальної пластиди з приблизно 60 амінокислот, за яким йде гідрофобна ділянка з приблизно 18 амінокислот (припускалось, що вона утворює спіральний трансмембранний якір). За цією N-термінальною частиною з грубо 90 амінокислот всього слідує те, що становить зрілий FATB білок (починаючи з N-термінальних амінокислот LPDWSM). Він містить тандемну дуплікацію спіраль/4-нитчатий складчастий домен («HEEEE» або «4НВТ», також «мотив сандвічу»), відділений лінкерною ділянкою (Mayer & Shanklin, 2005, J. Biol. Chem. 280(5): 36213627). Перший (N-термінальний) спіраль/4-нитчатий складчастий домен (який кодується частиною ексону 1, цілими ексонами 2 і 3 та частиною ексону 4) містить амінокислотні залишки, які вважають такими, що впливають на специфічність щодо субстрату, зокрема два збережені метіоніни (Met чи М), збережений лізин (Lys чи К), збережений валін (Val чи V) і збережений серин (Ser чи S) (Mayer & Shanklin, 2007, BMC Plant Biology 7(1):1-11), а другий (С-термінальний) спіраль/4-нитчатий складчастий домен (кодований в основному ексоном 5) містить каталітичні амінокислотні залишки, зокрема подібну до папаїну каталітичну тріаду зі збереженого аспарагіну (Asn чи N), збереженого залишку гістидину (His чи Н) і збереженого цистеїну (Cys чи С). Ця каталітична тріада локалізується в другому спіраль/4-нитчатому складчастому домені, закодованому ексоном 5 цього білку. Другий НЕЕЕЕ домен містить і інші амінокислотні залишки, які вважають такими, що впливають на специфічність щодо субстрату, зокрема збережений триптофан (Trp чи W) (Mayer & Shanklin, 2007, supra). 23 UA 99471 C2 Таблиця 1а WOSR FATB білки – ділянки і позиції амінокислот (аа) Розмір білку (аа) N-термінал Зрілий білок аа, кодовані ексоном 1 аа, кодовані ексоном 2 аа, кодовані ексоном 3 аа, кодовані ексоном 4 аа, кодовані ексоном 5 4НВТ Лінкер 4НВТ Збережені Met (M) Lys (K) Val (V) Met (M) Ser (S) Trp (W) Asn (N) His (H) Cys (C) FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3 AtFATB SEQ ID:2 SEQ ID:4 SEQ ID:6 SEQ ID:8 SEQ ID:10 SEQ ID:12 SEQ ID:80 414 424 415 412 415 415 412 1-90 1-90 1-91 1-88 91-414 91-424 92-415 89-412 1-168 1-168 1-169 1-166 169-213 169-213 170-214 167-211 214-251 214-251 215-252 212-249 252-308 252-308 253-309 250-306 1-90 91-415 1-168 169-213 214-251 252-308 1-91 92-415 1-169 170-214 215-252 253-309 1-88 89-412 1-166 167-211 212-249 250-306 309-414 140-277 278-302 303-407 309-424 140-277 278-302 303-407 310-415 141-278 279-303 304-408 307-412 138-275 276-300 301-405 309-415 140-277 278-302 303-407 310-415 141-278 279-303 304-408 307-412 138-275 276-300 301-405 164 176 200 231 264 311 317 319 354 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355 162 174 198 229 262 309 315 317 352 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355 162 174 198 229 262 309 315 317 352 Таблиця 1b SOSR FATB білки – ділянки і позиції амінокислот (аа) Розмір білку (аа) N-термінал Зрілий білок аа, кодовані ексоном 1 аа, кодовані ексоном 2 аа, кодовані ексоном 3 аа, кодовані ексоном 4 аа, кодовані ексоном 5 4НВТ Лінкер 4НВТ Збережені Met (M) Lys (K) Val (V) Met (M) Ser (S) Trp (W) Asn (N) His (H) Cys (C) FATB-A1 FATB-A2 FATB-A3 FATB-C1 FATB-C2 FATB-C3 SEQ ID:14 SEQ ID:16 SEQ ID:18 SEQ ID:20 SEQ ID:22 SEQ ID:24 413 415 415 412 415 415 1-89 90-413 1-167 168-212 213-250 251-307 308-413 139-276 277-301 302-406 1-90 91-415 1-168 169-213 214-251 252-398 309-415 140-277 278-302 303-407 1-91 92-415 1-169 170-214 215-252 253-309 310-415 141-278 279-303 304-408 1-88 89-412 1-166 167-211 212-249 250-306 307-412 138-275 276-300 301-405 1-90 91-415 1-168 169-213 214-251 252-398 309-415 140-277 278-302 303-407 1-91 92-415 1-169 170-214 215-252 253-309 310-415 141-278 279-303 304-408 163 175 199 230 263 310 316 318 353 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355 162 174 198 229 262 309 315 317 352 164 176 200 231 264 311 317 319 354 165 177 201 232 265 312 318 320 355 24 UA 99471 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отже, в одному варіанті здійснення даного винаходу, пропонуються послідовності нуклеїнових кислот, що містять одну чи більше мутацій будь-якого описаного типу. В іншому варіанті здійснення пропонуються fatB послідовності, що містять одну чи більше делеційних мутацій, одну чи більше мутацій стоп-кодону (нонсенс мутацій) та/або одну чи більше мутацій сайту сплайсингу. Будь-яка з вищезгаданих мутантних послідовностей нуклеїнових кислот пропонується per se (в ізольованому вигляді), як пропонуються і рослини та частини рослин, які містять такі послідовності ендогенно. Делеційна мутація в FATB алелі, як тут використовується, є мутацією в FATB алелі, в результаті якої щонайменше 1, щонайменше 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 500, 1000 чи більше основ викидаються з відповідного FATB алелю дикого типу. Внаслідок такої делеції мутантний FATB алель транскрибується і транслюється в мутантний білок, який має суттєво знижену активність in vivo або зовсім її не має. Делеція може призводити до зміщення рамки та/або вона може вводити передчасний стоп-кодон, або може призводити до видалення однієї чи більше амінокислот (наприклад, великих частин) з кодуючої послідовності і т.п. Точний молекулярний механізм, який лежить в основі того, що делеція призводить до утворення мутантного білку зі зниженою біологічною активністю, не є важливим. Даний винахід пропонує також рослини і частини рослин, в яких специфічні FATB алелі є повністю видаленими, тобто рослини і частини рослин, в яких відсутній один чи більше FATB алелів. Нонсенс мутація в FATB алелі, як тут використовується, є мутацією в FATB алелі, в результаті якої один чи більше трансляційних стоп-кодонів вводяться в кодуючу ДНК і відповідну мРНК послідовність відповідного FATB алелю дикого типу. Трансляційними стопкодонами є TGA (UGA в мРНК), TAA (UAA) і TAG (UAG). Отже, будь-яка мутація (делеція, вставка чи заміщення), яка приводить до створення внутрішньорамочного стоп-кодону в кодуючій послідовності (послідовності ексону), буде мати своїм результатом припинення трансляції і процесингу амінокислотного ланцюга. В одному варіанті здійснення мутантним FATB алелем, що містить нонсенс мутацію, є FATB алель, в якому внутрішньорамочний стопкодон є введеним в послідовність FATB кодону заміщенням єдиного нуклеотиду, таким як мутація CAG на TAG, TGG на TAG, TGG на TGA чи CGA на TGA. В іншому варіанті здійснення мутантним FATB алелем, що містить нонсенс мутацію, є FATB алель, в якому внутрішньорамочний стоп-кодон введений в послідовність FATB кодону подвійним заміщенням нуклеотидів, таким як мутація CAG на TAA, TGG на TAA, CGG на TAG чи TGA, CGA на TAA. В ще іншому варіанті здійснення мутантним FATB алелем, що містить нонсенс мутацію, є FATB алель, в якому внутрішньорамочний стоп-кодон введений в послідовність FATB кодону потрійним заміщенням нуклеотидів, таким як мутація CGG на TAA. У процесованому білку відсутні амінокислоти, кодовані кодуючою ДНК, далі від місця мутації (тобто, в С-термінальній частині FATB білку), і збережені амінокислоти, кодовані кодуючою ДНК, вище від місця мутації (тобто, в N-термінальній частині FATB білку). В одному варіанті здійснення нонсенс мутація є присутньою будь-де перед збереженим залишком Cys каталітичної тріади, так що щонайменше збережений залишок Cys є відсутнім, що призводить до суттєво зниженої активності процесованого білку. Чим більше усіченим є мутантний білок у порівнянні з білком дикого типу, тим більша вірогідність того, що йому буде бракувати будь-якої ферментативної активності. Відповідно, в іншому варіанті здійснення, пропонується мутантний FATB алель, який містить нонсенс мутацію, що має своїм результатом процесований білок з менше ніж 350 амінокислотами (якому бракує збереженого Cys), з менше ніж 315 амінокислотами (якому бракує всіх трьох збережених амінокислот з подібної до папаїну каталітичної тріади), з менше ніж 300 амінокислотами (якому бракує другого домену 4НВТ), з менше ніж 262 амінокислотами (якому бракує збереженого Ser), зменше ніж 229 амінокислотами (якому бракує другого збереженого Met), з менше ніж 198 амінокислотами (якому бракує збереженого Val), з менше ніж 174 амінокислотами (якому бракує збереженого Lys), з менше ніж 162 амінокислотами (якому бракує першого збереженого Met) чи навіть з меншою кількістю амінокислот в довжину. В ще іншому варіанті здійснення даного винаходу така нонсенс мутація має своїм результатом те, що один чи більше ексонів не транслюються в білок, такий як ексон 5, ексони 4 і 5, ексони 3-5 чи навіть більше. Наведені далі таблиці описують діапазон можливих нонсенс мутацій в запропонованих тут послідовностях Brassica napus: 25 UA 99471 C2 Таблиця 2а Потенційні мутації стоп-кодону в FATB-A1 (WOSR, SEQ ID №: 1 і 2) Номер ексону Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 3 Ексон 2-3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 5 Ексон 5 Позиція амінокислоти 53 Позиція нуклеотиду 157 157+159 235 235+237 268 268+270 281 282 281+282 331 331+333 335 336 335+336 350 351 350+351 406 406+408 427 427+429 442+443 442+444 442+443+444 502 502+504 678 679 678+679 695 695+697 723 798 723+798 824 825 824+825 832 832+834 863 864 863+864 871 871+872 986 987 986+987 1039 1039+1040 1250 1251 79 90 94 111 112 117 136 143 148 168 198 204 213 222 225 235 238 253 271 311 26 Дикий тип → мутантний кодон cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cgg → tag cgg → tga cgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cga → tga cga → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cga → tga cga → taa tgg → tag tgg → tga UA 99471 C2 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 1250+1251 1270 1270+1272 1301 1302 1301+1302 1339 1339+1341 1399 1399+1401 1465 1465+1467 1483 1483+1485 1520 1521 1520+1521 1547 1548 1547+1548 318 328 341 361 383 389 401 410 tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg →taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa Таблиця 2b Потенційні мутації стоп-кодону в FATB-A1 (SOSR, SEQ ID №: 13 і 14) Номер ексону Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 1 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Ексон 2 Позиція амінокислоти 53 Позиція нуклеотиду 157 157+159 232 232+234 265 265+267 278 279 278+279 328 328+330 332 333 332+333 347 348 347+348 403 403+405 424 424+426 439+440 439+441 439+440+441 499 499+501 675 676 675+676 692 692+694 78 89 93 110 111 116 135 142 147 167 197 203 27 Дикий тип → мутантний кодон cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cgg → tag cgg → tga cgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa UA 99471 C2 Ексон 2 Ексон 3 Ексон 2-3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 3 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 4 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 Ексон 5 212 720 795 720+795 821 822 821+822 829 829+831 860 861 860+861 868 868+869 983 984 983+984 1036 1036+1037 1247 1248 1247+1248 1267 1267+1269 1298 1299 1298+1299 1336 1336+1338 1396 1396+1398 1462 1462+1464 1480 1480+1482 1517 1518 1517+1518 1544 1545 1544+1545 221 224 234 237 252 270 310 317 327 340 360 382 388 400 409 28 tgg → tag tgg → tga tgg → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cga → tga cga → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cga → tga cga → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa cag → tag cag → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa tgg → tag tgg → tga tgg → taa