Система для підготовки стовбурових клітин жирової тканини

Реферат: Винахід належить до системи для вилучення та обробки жирової тканини для генерування терапевтично ефективної кількості стовбурових клітин жирової тканини, яка містить пристрій для вилучення жирової тканини, який містить першу модифіковану центрифужну пробірку (100, 200), що містить стерильні вхідні ліпоаспіратові фітинги (110, 111), щонайменше один із стерильних вхідних фітингів для обробки рідини (120, 125, 129), стерильний всмоктуючий фітинг (115, 116, 117) та щонайменше один стерильний екстракційний фітинг (121, 122, 126, 127), функціонально сполучений з трубкою для вилучення маси (130, 131), та екран (210), який включає в себе сукупність отворів (211), розташованих у межах згаданої першої модифікованої центрифугальної пробірки, розділюючи таким чином внутрішній об'єм згаданої пробірки на верхню частину та нижню частину, при цьому екран придатний для дисоціації жирової тканини та отримання суміші клітин, яка збагачена стовбуровими клітинами, у зазначеній нижній частині, при цьому ліпоаспірат переміщений до першої модифікованої центрифужної пробірки за допомогою стерильного переносу, етапи обробки виконані через щонайменше один стерильний фітинг (125) для очищення і відокремлення ліпоаспірата, причому клітинна маса, що містить збагачену фракцію стовбурових клітин, отримана за допомогою центрифугування в модифікованій центрифужній пробірці та виділена через щонайменше один із зазначених стерильних екстракційних фітингів (126, 127). UA 114815 C2 (12) UA 114815 C2 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь застосування винаходу Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки США з серійним номером №61/505,936 під назвою "Комплект для підготовки стовбурових клітин жирової тканини", поданої 8 липня 2011р., повний опис винаходу якої введений тут як посилання. Передумови створення винаходу 1. Область техніки Загалом даний винахід належить до систем для отримання і використання стовбурових клітин, одержаних з жирової тканини, стовбурових клітин жирової тканини, одержаних за допомогою такого комплекту, способів застосування таких стовбурових клітин жирової тканини та композицій, що містять такі стовбурові клітини жирової тканини. 2. Обговорення сучасного стану Регенеративна медицина може бути визначена як клінічно цілеспрямоване освоєння регенеративних механізмів організму, використовуючи їх, як такі, що не є частиною нормального лікувального механізму або за допомогою штучно посилених звичайних механізмів. Класичний приклад даного процесу можливо знайти в трансплантації кісткового мозку, де гемопоетичні стовбурові та прогеніторні клітини зібрані у донора і поміщені в реципієнт, в якому нормальні гемопоетичні регенеративні механізми були піддані абляції або значно виснажені або порушені, таким чином, замінивши або регенерувавши кровотворний потенціал реципієнта. Цей підхід був застосований і до негемопоетичних стовбурних клітин з різних джерел для багаточисельних терапевтичних чи профілактичних цілей. Зокрема, показано, що жирова тканина легко може бути використана як джерело мультипотентних мезенхімальних стовбурових клітин, придатних для терапевтичного або профілактичного застосування. Мезенхімальні стовбурові клітини (далі - МСК) є плюрипотентними стовбуровими клітинами, які легко можуть диференціюватися в такі кліткові лінії як остеобласти, міоцити, хондроцити, адипоцити, ендотеліальні клітини і бета-клітини панкреатичних острівців (Pittenger, et al., Science, Vol. 284, pg. 143 (1999); Haynesworth, et al., Bone, Vol. 13, pg. 69 (1992); Prockop, Science, Vol. 276, pg. 71 (1997)). МСК також відомі у літературі як стовбурові клітини кісткового мозку, скелетні стовбурові клітини, а також мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини, є негемопоетичними прогенітирними клітинами, що виділені з тканин дорослих та охарактеризовані in vitro екстенсивною проліферативною здатністю в некомітованому стані одночасно зберігати потенціал до диференціювання за різними клітковими лініями мезенхімального походження, включаючи хондроцитову, остеобластитову, адипоцититову лінії у відповідь на відповідні стимули. Дослідження in vitro продемонстрували здатність МСК до диференціювання в м'язові (Wakitani, et al., Muscle Nerve, Vol. 18, pg. 1417 (1995)), нейронноподібні попередники (Woodbury, et al., J. Neurosci. Res., Vol. 69, pg. 908 (2002); Sanchez-Ramos, et al., Exp. Neurol., Vol. 171, pg. 109 (2001)), кардіоміоцити (Toma, et al., Circulation, Vol. 105, pg. 93 (2002); Fakuda, Artif. Organs, Vol. 25, pg. 187 (2001)) та, ймовірно, інші типи клітин. МСК присутні в багатьох тканинах організму, які походять від ембріональної мезодерми (наприклад, гемопоетичні клітини і сполучна тканина). Таким чином, плюрипотентні клітини можуть бути виділені з будь-якого з цих тканинних джерел і можуть бути індуковані до диференціювання в будь-який з цих типів клітин. Відповідним джерелом жирової тканини є жирова тканина, отримана в результаті ліпосакційної хірургії. Дійсно, велика частка плюрипотентних клітин може бути отримана шляхом простої аспірації з жирової тканини, наприклад, із ліпоаспіратичних зразків отриманих вилученнями естетичного характеру. Винахід відноситься, зокрема, до системи виділення МСК з жирової тканини. Використаний тут термін "жирова тканина" відноситься до тканини, яка містить безліч типів клітин, включаючи адипоцити та мікросудинні клітини. Жирова тканина містить стовбурові клітини і ендотеліальні клітини-попередники. Таким чином, жирова тканина відноситься до жиру, включаючи сполучну тканину, у якій відкладається жир. Встановлено, що жирова тканина є особливо багатим джерелом стовбурових клітин. Це відкриття може бути зумовлено, принаймні частково, легкістю видалення основного нестовбурово-клітинного компонента жирової тканини, адипоциту. Тим не менш, обробка жирової тканини з метою відокремлення плюрипотентних клітин, ріст та (додатково) диференціація отриманої стовбурово-клітинної популяції, відповідно до систем і способів, відомих в даній галузі, як правило, вимагає дорогого спеціалізованого обладнання та в рівній мірі дорогих спеціалізованих процесів. Витрати, пов'язані зі спеціально побудованим пристроєм для повторного вилучення стовбурових клітин з жирової тканини, отриманих шляхом, наприклад, ліпосакції з живої людини-донора, обмежили використання збагаченого стовбуровими клітинами середовища для терапевтичних цілей у великих лікарнях та науково 1 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дослідних установах. В результаті, лікування на основі стовбурових клітин жирової тканини невеликими лікарнями або іншими практиками у цій галузі було неможливим і неекономічним. Крім того, використання покращеного косметологічного технічного обладнання, працюючого на основі стовбурових клітин жирової тканини, було обмеженим через високу вартість і низьку доступність систем і способів в даний час в даній області техніки для вилучення і культивування стовбурових клітин, отриманих з жирової тканини. Необхідними являються способи і системи, які сприяють економічному і безпечному вилученню терапевтично або косметично корисних кількостей стовбурових клітин жирової тканини або в чистому вигляді, або як частина насиченого стовбуровими клітинами середовища, і, зокрема, способи і системи, які підходять для використання в невеликих професійних практиках, не вимагаючи капітальних вкладень спеціалізованих установ. Суть винаходу Винахідником розроблено і практично реалізовано систему і різні способи підготовки стовбурових клітин жирової тканини, які направлені на задачі і проблеми з рівня техніки, описаного вище. Клітинна популяція з жирової тканини людини може бути використана в якості джерела клітин для терапевтичного та косметичного застосування. Між іншим, стовбурові клітини жирової тканини або в чистому вигляді (лише стовбурові клітини), або у збагаченому вигляді (клітинні культури з підвищеною фракцією стовбурових клітин в порівняні з тими, які виникають в жирових тканинах in vivo) можуть бути використані для регенеративної медицини, а саме лікування захворювань, які можуть бути полегшені або вилікувані за допомогою використання регенеративних клітин. Клітини препарованої популяції можна вводити пацієнтові без інших адипоцитів або сполучної тканини, або вони можуть бути введені перемішаними з жировою тканиною в концентрованій кількості, як зазначено в даному описі. Даний винахід відноситься до системи для отримання очищеної фракції жирової тканини, мезенхімальних стовбурових клітин з жирової тканини та введення назад очищеної фракції пацієнту: людині або тварині. Даний винахід стосується системи для вилучення жирової тканини (ліпоаспірата) та її обробки для генерації обробленого ліпоаспірата (PLA), який містить стовбурові клітини з груповою частотою щонайменше 0,1 %, та частіше більше, ніж 0,5 %. PLA може бути отриманий за допомогою декількох варіантів здійснення способу, і містити при цьому від близько 2-12 % стовбурових клітин до 100 % клітин PLA в популяції, складеної зі стовбурових клітин, що є можливим відповідно до винаходу. Даний винахід відноситься до системи для отримання по суті очищеної і збагаченої фракції мезенхімальних стовбурових клітин з жирової тканини в клінічних умовах, а також до композицій, способів і систем для використання стовбурових клітин, отриманих з жирової тканини, які є введеними безпосередньо реципієнту разом з такими добавками, які можуть бути необхідні для покращення, виникнення або сприяння терапевтичного, структурного або косметичного ефекту. Варіанти здійснення даного винаходу забезпечують багатокомпонентну систему для екстрагування і обробки жирової тканини з метою створення терапевтично ефективної кількості стовбурових клітин жирової тканини для повторного введення в організм пацієнта. Переважно, система не вимагає повного операційного обладнання або повномасштабнї ліпоаспірації і, отже, може працювати за межами лікарні або лабораторії. Таким чином, система підходить для малих і середніх медичних клінік, амбулаторних хірургічних центрів і лікарських офісів багатопрофільної спеціалізації. За одним з варіантів здійснення даного винаходу, система, названа системою Mini-Stem™, дозволяє малим лікарським клінікам, а також хірургічним центрам використовувати доступні способи для безпечного вилучення MSC з жирової тканини з будь-якого пацієнта для лікування або кріоконсервування (зберігання). Система містить засіб для виконання безпечного, стерильного та закритого процесу, в якому невеликий зразок жиру екстрагують (наприклад, за допомогою ліпосакції) як ліпоаспірат; матеріали для місцевої обробки та очищення фракцій MSC; і, можливо, інструменти для надання допомоги при якісному аналізі обробленого кінцевого ліпоаспірата. Система може бути задіяна лаборантом, відповідно до простих етапів способу, які можуть бути вивчені під час відповідної підготовки. За одним з варіантів здійснення даного винаходу, обробка жирової тканини відбувається в системі, яка підтримується закритим стерильним "рідина/тканина" шляхом. Це досягається за рахунок використання комплекту стерильних контейнерів та трубок, забезпечуючи таким чином транспортування тканини і елементів рідини замкнутим шляхом. Комплекс з переробки реагентів (наприклад, фізіологічний розчин, ферменти і т.д.) також надається, попередньо упакований для введення в стерильні контейнери, забезпечуючи простий контроль над додаванням реагентів, температури і часу обробки, таким чином, спрощується спосіб, за допомогою якого оператори вручну управляють цим процесом. У переважному варіанті 2 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення вся процедура від екстракції тканини з наступною обробкою до розміщення в реципієнт буде здійснюватись в одному ж і тому медичному закладі, більш того, навіть у межах однієї і тієї ж кімнати пацієнта, який проходить процедуру відповідно до винаходу. Відповідно до однієї з особливостей даного винаходу, невелику кількість сирої жирової тканини екстрагують з пацієнта в стерильний контейнер комплекту. Сира жирова тканина обробляється в одному або більше стерильних контейнерах комплекту для видалення в основному зрілих адипоцитів і сполучної тканини, таким чином, отримуючи гетерогенну сукупність клітин, отриманих з жирової тканини, придатних для розміщення в тілі реципієнта. Реагенти, необхідні для обробки жирової тканини, передбачені як частина комплекту і введені в один або більше стерильні контейнери відповідно до заздалегідь визначеної схеми для генерування обробленого ліпоаспірата, включаючи необхідну концентрацію стовбурних клітин жирової тканини. Стовбурові клітини жирової тканини, або модифікований ліпоаспірат, який збагачений підвищеною фракцією стовбурових клітин, ніж спостерігається in vivo, можуть бути потім поміщені до реципієнта в комбінації з іншими клітинами, тканинами, фрагментами тканин або іншими стимуляторами росту клітин та/або диференціації. У переважному варіанті здійснення винаходу, стовбурові клітини, з будь-якими з вищевказаних добавками, поміщено в людину, від якої вони були одержані в умовах одної оперативної процедури з метою отримання терапевтичного, структурного або косметичного ефекту для реципієнта. Відповідно до одного з варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано спосіб лікування пацієнта, який включає наступні стадії: а) забезпечення одноразової системи видалення тканини в якості компонента комплекту; б) видалення жирової тканини з пацієнта з використанням одноразової системи видалення тканини та жирова тканина, яка містить концентрацію стовбурових клітин; в) обробка в межах одного або більше стерильних контейнерів з комплекту щонайменше частини жирової тканини для отримання більш вищої концентрації стовбурових клітин, ніж концентрація стовбурових клітин жирової тканини до обробки; та г) введення пацієнту стовбурових клітин зі стерильного контейнера комплекту. Відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу, система вилучення та обробки жирової тканини для створення терапевтично ефективної кількості стовбурових клітин жирової тканини містить пристрій для екстракції жирової тканини та модифіковану центрифужну пробірку, яка містить сукупність вхідних ліпоаспіратових фітингів, сукупність вхідних фітингів для обробки рідини та сукупність трубок для екстракції маси. Пристрій для екстракції жирової тканини використовується для вилучення частки жирової тканини з людини, ліпоаспірат переміщається в першу модифікованому центрифужну пробірку шляхом стерильного переносу, сукупність стадій обробки виконується для очищення і відокремлення ліпоаспірата, і маса, яка містить підвищену частку стовбурових клітин, отримується центрифугуванням в модифікованій центрифужній пробірці. Маса перерозчинюється в рідині і вводиться пацієнту-людині з терапевтичною або косметичною метою. Відповідно до іншого варіанту здійснення, система додатково містить другу модифіковану центрифужну пробірку, по суті, такої ж конструкції, що і перша модифікована центрифужна пробірка, при цьому друга модифікована центрифужна пробірка використовується для подальшої обробки перерозчиненої маси з метою досягнення більш високої концентрації стовбурових клітин. Відповідно до іншого переважного варіанту здійснення даного винаходу, запропоновано спосіб підготовки стовбурових клітин жирової тканини, який включає наступні стадії: (а) видалення жирової тканини у людини за допомогою пристрою для екстракції жирової тканини; б) здійснення стерильного переносу ліпоаспірата до модифікованої центрифужної пробірки, що містить сукупність вхідних ліпоаспіратових фітингів, сукупність вхідних фітингів для обробки рідини та сукупність трубок для екстракції маси; (в) обробка ліпоаспірата в модифікованій центрифужній пробірці шляхом додавання однієї або більше рідини за допомогою сукупності фітингів для обробки рідини, обробка, що включає одне або більше очищення та дисоціацію ліпоаспірата; (г) центрифугування в модифікованій центрифужній пробірці, що містить оброблений ліпоаспірат для збору маси зі збагаченою фракцією стовбурових клітин; (д) перерозчинення маси в рідині для отримання суміші клітин, яка значно збагачена стовбуровими клітинами по відношенню до концентрації стовбурових клітин вихідного ліпоаспірата; та (е) введення перерозчиненої суміші клітин до людини з терапевтичною або косметичною метою. Ці та інші задачі, ознаки та переваги даного винаходу будуть очевидні з докладного опису, який наведено нижче. Короткий опис креслень Надані креслення ілюструють кілька варіантів здійснення даного винаходу і разом з описом служать для пояснення принципів винаходу відповідно до варіантів. Фахівцеві у даній галузі 3 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буде зрозуміло, що конкретні варіанти здійснення, проілюстровані на кресленнях, є лише ілюстративними і не обмежують обсяг даного винаходу. На фіг. 1 показана схема, що ілюструє модифіковану центрифужну пробірку для вилучення стовбурових клітин з жирової тканини, відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу. На фіг. 2 показана схема, що ілюструє модифіковану центрифужну пробірку для вилучення стовбурових клітин жирової тканини, що включає нові засоби атомізації, відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу. На фіг. 3 показана схема, що ілюструє систему підготовки мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини для клінічного застосування, відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу. На фіг. 4 показано схему процесу високого рівня підготовки мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини для клінічного застосування, відповідно до варіанту здійснення даного винаходу. На фіг. 5 показано схему детального процесу отримання та використання мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини в клінічних застосуваннях, відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу. Детальний опис Винахідником розроблено і практично реалізовано систему та різні способи підготовки стовбурових клітин жирової тканини, які направлені на задачі і проблеми в рівні техніки, описаному вище. Різні способи будуть тепер описані докладно з посиланнями на кілька прикладів варіантів його здійснення, як показано на доданих кресленнях. У подальшому описі численні конкретні деталі викладені для того, щоб забезпечити повне розуміння одного або більше аспектів та/або ознак, описаних чи згаданих в даному документі. Тим не менш, очевидним для фахівця в даній області техніки є те, що один або більше аспекти та/або ознаки, описані або згадані в даному документі, можуть бути здійснені без деяких або всіх цих конкретних деталей. В інших випадках добре відомі стадії процесу та/або структури не описані надто докладно, щоб не ускладняти сприйняття деяких аспектів та/або ознак, описаних чи згаданих в даному документі. Один або більше різних винаходів можуть бути описані в даній заявці. Крім того, для одного або більше винаходів, описаних в даному документі, можуть бути описані численні альтернативні варіанти здійснення; слід розуміти, що вони наведені тільки в ілюстративних цілях. Описані варіанти здійснення не призначені для обмеження в будь-якому сенсі. Один або більше винаходів можуть широко використовуватись в численних варіантах, як це очевидно з опису. Загалом, варіанти здійснення описані досить детально, дозволяючи фахівцям у даній галузі техніки здійснювати один або більше винаходи, і це слід розуміти, що і інші варіанти здійснення можуть бути використані, а також структурні, логічні, електричні зміни, зміни програмного забезпечення та інші зміни можуть бути здійснені без відхилення від сутності та обсягу конкретних варіантів винаходу. Таким чином, фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що один або більше винаходи може бути здійснено на практиці з різними модифікаціями та змінами. Конкретні ознаки одного або більше винаходів можуть бути описані з посиланням на один або більше конкретних варіантів здійснення або фігури, які є частиною даного опису та на яких показано, як ілюстрацію, конкретні варіанти здійснення одного або більше винаходів. Слід розуміти однак, що такі функції не обмежуються використанням одного або більше конкретних варіантів здійснення або фігур з посиланням, до якого вони належать. Цей опис не є буквальним для всіх варіантів здійснення одного або більше винаходів та не є переліком ознак одного або більше винаходів, які повинні бути присутніми у всіх варіантах. Заголовки розділів, представлених в даній заявці на патент, та назва зазначена у цій заявці, представлені лише для зручності, і не повинні розглядатися як такі, що обмежують будь-яким чином розкриття. Опис варіанту з декількома компонентами, пов'язаних між собою, не передбачає, що всі ці компоненти є необхідними. Навпаки, різні додаткові компоненти можуть бути описані для ілюстрації широкого спектру можливих варіантів здійснення одного або більше винаходів та з метою більш повної ілюстрації одного або кількох аспектів винаходу. Аналогічним чином, навіть якщо етапи процесу, етапи способу, алгоритми і т.п. можуть бути описані в послідовному порядку, такі процеси, способи і алгоритми можуть загалом бути налаштовані для роботи в альтернативних послідовностях, якщо спеціально не вказано інше. Іншими словами, будь-яка послідовність або порядок етапів, які можуть бути описані в даній патентній заявці, і як такі, не вказують на необхідність здійснювати етапи у вказаному порядку. Етапи описаних процесів 4 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть на практиці виконуватися в будь-якому порядку. Крім того, деякі етапи можуть бути виконані одночасно, незважаючи на те, що описані як такі, що відбуваються не одночасно (наприклад, через один описаний крок після іншого етапу). Крім того, ілюстрація процесу за його зображенням на кресленні не передбачає, що зображений процес є виключним для інших варіантів і модифікацій до нього, не передбачає, що зображений процес або будь-який з його етапів необхідні для одного або більше винаходу(ів), і не передбачає, що зображений процес є переважним. Крім того, заявка містить етапи, які описані у варіанті як такі, що здійснюються один раз, але це не означає, що вони повинні здійснюватись одноразово, або що вони можуть здійснюватись лише один раз кожного разу, коли процес, спосіб або алгоритм реалізовано або виконано. Деякі етапи можуть бути опущені в деяких варіантах або деяких випадках, або деякі етапи можуть бути виконані більше одного разу в даному варіанті або випадку. Коли описано один пристрій або виріб, цілком очевидно, що можуть бути використані більш ніж один пристрій або виріб замість одного пристрою або виробу. Аналогічним чином, якщо описано більш ніж один пристрій або виріб, очевидно, що один пристрій або виріб можуть бути використані замість більше одного пристрою або виробу. Функціональність або ознаки пристрою можуть бути альтернативно втілені одним або декількома іншими пристроями, які явно не описані як такі, що мають таку функціональність або ознаки. Таким чином, інші варіанти здійснення одного або більше винаходів можуть не включати сам заявлений пристрій. Прийоми та засоби, описані або згадані в даному документі, іноді будуть описані в одиничній формі для ясності. Проте, слід зазначити, що окремі варіанти здійснення включають в себе декілька схожих прийомів або кілька окремих випадків виконання засобу, якщо не вказано інше. Описи процесу або блоки на фігурах слід розуміти як такі, що представляють модулі, сегменти або частини коду, який включає один або більше виконавчих інструкцій для здійснення відповідних логічних функцій або етапів в процесі. Альтернативні реалізації можуть бути включені в обсяг варіантів здійснення даного винаходу, в якому, наприклад, функції можуть бути виконані в порядку, який показано і проілюстровано, в тому числі, головним чином, одночасно або у зворотному порядку, залежно від функціональності, що досягається, та як такі, що будуть зрозумілими звичайним фахівцям у даній галузі техніки. Будь-яка ознака або комбінація ознак, описаних в даному документі, включені в обсяг цього винаходу за умови, що ознаки, включені в будь-яку таку комбінацію, не є взаємно несумісними, як буде очевидно з контексту даного опису, та знань одного з фахівців в даній області. З метою підведення підсумків щодо даного винаходу, певні аспекти, переваги та нові ознаки цього винаходу були описані тут. Звичайно, слід розуміти, що не обов'язково всі ці аспекти, переваги та ознаки будуть втілені в будь-якому окремому варіанті здійснення даного винаходу. Додаткові переваги й аспекти цього винаходу є очевидними із наступного докладного опису і формули винаходу. Кількість публікацій і патентів вказані в даному документі. Кожну із зазначених публікацій та патентів включено в даний опис через посилання у всій їхній повноті. Всі публікації, патенти і патентні заявки, згадані тут, включені в якості посилання у всій своїй повноті в тій же мірі, як якщо б кожна окрема публікація, патент або патентна заявка були конкретно та індивідуально вказані як такі, що включені в якості посилання у всій своїй повноті. Визначення Використане в даному документі визначення "одиниця жирової тканини" відноситься до дискретної або вимірюваної кількості жирової тканини. Одиниця жирової тканини може бути виміряна шляхом визначення маси та/або об'єму одиниці. На основі даних, зазначених вище, одиниця обробленого ліпоаспірата, який видалений з пацієнта, містить клітинний компонент, в якому щонайменше 0,1 % клітинного компонента є стовбурові клітини. Відповідно до розкриття в даному документі, одиниця жирової тканини може відноситися до всієї кількості жирової тканини, видаленої з пацієнта, або до кількості, яка менше кількості жирової тканини, видаленої з пацієнта. Таким чином, одиниця жирової тканини може бути комбінована з іншою одиницею жирової тканини з утворенням одиниці жирової тканини, що має вагу або об'єм, який є сумою окремих одиниць. Використане в даному документі визначення "частина" відноситься до кількості матеріалу, яка менше, ніж сукупна кількість матеріалу. Менша частина відноситься до кількості, яка менше, ніж 50 %, і більша частина відноситься до кількості більшої ніж 50 %. Таким чином, одиниця жирової тканини, що менше, ніж сукупна кількість жирової тканини, видалена з пацієнта, є частиною видаленої жирової тканини. Використане в даному документі визначення "стовбурові клітини" відносяться до мультипотентних клітин з потенціалом до диференціювання в різні типи клітин, які виконують 5 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одну або кілька конкретних функцій і мають здатність до самовідновлення. Деякі зі стовбурових клітин, описаних тут, можуть бути плюрипотентними. Використане в даному документі визначення "оброблений ліпоаспірат" (PLA) відноситься до жирової тканини, яка була оброблена з метою відокремлення активного клітинного компоненту (наприклад, компоненту, який містить стовбурові клітини) від зрілих адипоцитів і сполучної тканини. Як правило, PLA відноситься до маси клітин, отриманих шляхом промивання і виділення клітин з жирової тканини. Клітинну масу зазвичай отримують шляхом центрифугування суспензії клітин таким чином, що клітини з'єднуються в нижній частині центрифужного контейнера. Використаний в даному документі термін "профілактично або терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості клітин даного винаходу, що міститься у фармацевтичній композиції, яка здатна продукувати необхідний терапевтичний ефект. Фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що клітинні кількості (наприклад, дозування) будуть змінюватися в залежності від декількох факторів включно, але не обмежуючись ними, від місця введення, ступеня захворювання та способу введення. Досвід трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (кістковий мозок або стовбурові клітини пуповинної крові були використані для того, щоб регенерувати клітинно-утворюючу активність крові реципієнта) показує, що приживлення залежить від дози клітин з пороговими ефектами. Таким чином, цілком імовірно, що загальний принцип "чим більше, тим краще" буде застосовуватися в межах, встановлених іншими змінними факторами, і де можливий збір буде накопичувати якомога більше тканини, на скільки це можливо. Доза клітин, описаних тут, може бути повторена, залежно від стану і реакції пацієнта, з часовими інтервалами днів, тижнів або місяців, як це визначається необхідним лікуючим лікарем або іншим працівником сфери охорони здоров'я. Термін "фармацевтично прийнятний носій" відноситься до композиції, затвердженої регулюючим органом федерального уряду або уряду штату, або переліченої у Фармакопеї США або Європейській Фармакопеї або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування на тваринах, включаючи людину. Термін "носій" означає розчинник, ад'ювант, наповнювач або переносник, з якого введені клітини відповідно до даного винаходу, таким чином, носій повинен бути сумісним з клітинами. Фармацевтичні композиції за даним винаходом, при необхідності, можуть також містити, коли це необхідно, добавки для підвищення, управління, або іншого направлення призначеного терапевтичного ефекту клітин, що містять зазначені фармацевтичні композиції та/або допоміжні речовини або їх фармацевтично прийнятні речовини, такі як незначні кількості рН буферних агентів, поверхнево-активних речовин, співрозчинники, консерванти і т.д. Крім того, для стабілізації клітинної суспензії, можна додати метал-хелатуючі агенти (агенти, утворюючі комплексні з'єднання з металом). Стабільність клітин в рідкому середовищі у фармацевтичній композиції даного винаходу може бути покращена шляхом додавання додаткових речовин, таких як, наприклад, амінокислоти, такі як аспарагінова кислота, глутамінова кислота і т.д. Фармацевтично прийнятні речовини, які можуть бути використані у фармацевтичній композиції винаходу, загалом відомі фахівцеві в даній області техніки і зазвичай використовуються у виробництві клітинних композицій. Приклади відповідних фармацевтичних носіїв описані в "Remington Pharmaceutical Sciences" Є.В. Мартіна. Ілюстративні, необмежуючі приклади носіїв для введення клітин, що містяться у фармацевтичній композиції згідно з винаходом, включають, наприклад, стерильний фізіологічний розчин (0,9 % NaCl), PBS, і т.д. Детальний опис варіантів винаходу Розроблено певну сукупність пристроїв для збору і обробки клітин з жирової тканини, але ці пристрої мають одну або декілька проблем, які заважають їх широкому розповсюдженню. Ці проблеми включають в себе труднощі у використанні та вартість пристроїв. Таким чином, існує потреба в альтернативних підходах, в яких популяція активних клітин з підвищеною прибутковістю, консистенцією та/або чистотою може бути підготовлена швидко і надійно, при цьому необхідність в післяекстракційній маніпуляції з клітинами може бути знижена або усунута. Найкращим способом отримання популяції таких клітин є спосіб, який підходить для безпосереднього їх розміщення у реципієнті. Далі буде вказане детальне посилання на переважні на даний час варіанти здійснення винаходу. Скрізь, де це можливо, використовуються одні й ті ж або аналогічні позиції на кресленнях і в описі для посилання на однакові або подібні частини. Слід зазначити, що креслення представлені в спрощеному вигляді, а не в точному масштабі. Посилаючись на розкриття в даному документі, з метою зручності та ясності у відношенні супроводжуючого креслення використовуються лише терміни для визначення напрямку погляду, такі як зверху, 6 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 знизу, ліворуч, праворуч, вгору, вниз, більш, вище, нижче, внизу, задня і передня. Такі терміни не повинні розглядатися як такі, що будь-яким чином обмежують обсяг винаходу. Хоча розкритий тут винахід описаний варіантами, які певним чином ілюстровані, слід розуміти, що ці варіанти наведено для прикладу, а не як обмеження. Метою наведеного нижче докладного опису, враховуючі наведені можливі варіанти, є тлумачення винаходу для того, щоб були охоплені всі модифікації, альтернативні варіанти і еквіваленти варіантів здійснення, які можуть підпадати під сутність і обсяг винаходу, як це визначено формулою винаходу. Даний винахід може бути здійснений в поєднанні з різноманітними клітинними або тканинними способами виділення тканини, які зазвичай використовуються в даній області техніки, головним чином практикуючими етапами способу, включеними в даний документ, які необхідні для забезпечення розуміння цього винаходу. Система для вилучення та обробки жирової тканини Різні варіанти здійснення даного винаходу спрямовані на систему 300 для одержання очищеної фракції отриманих з жирової тканини мезенхімальних стовбурових клітин в клінічних умовах, а також до композицій, способів і систем для використання стовбурових клітин жирової тканини за рахунок введення їх безпосередньо реципієнту разом з добавками, корисними для покращення, виникнення або сприяння терапевтичного, структурного або косметичного ефекту. У різних варіантах здійснення даний винахід сприяє системі 300 для вилучення та обробки жирової тканини у створенні терапевтично ефективної кількості стовбурових клітин жирової тканини для повторного введення в організм пацієнта, при цьому система є простою в експлуатації, недорогою, такою, що підходить для малих і середніх медичних клінік багатопрофільної спеціалізації. У переважному варіанті здійснення винаходу, показаному на фіг. 1, модифікована центрифужна пробірка 100 використовується в поєднанні з різними аксесуарами, відомими в даній області техніки, що складаються в систему або комплект, який допускається для малих практикуючих лікарів, а також для хірургічних центрів, що використовують недорогі способи безпечного вилучення мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) з жирової тканини будь-якого пацієнта або донора для використання безпосередньо в лікуванні або для кріоконсервування (зберігання). Комплект складений з центрифужної пробірки 100 та різних інших компонентів і може бути використаний для проведення безпечних, стерильних і закритих процесів для аспірації невеликих зразків жирової тканини, компонентів для місцевої обробки та очищення фракцій МСК, а також компонентів для якісного аналізу. Комплект, в тому числі центрифужна пробірка 100, як правило, приводиться в дію лаборантом або іншим кваліфікованим фахівцем, відповідно до простих етапів способу, які докладно описані нижче і які можуть викладатися на відповідному тренінгу. Центрифужна пробірка 100 містить закритий стерильний шлях "рідина/тканина", через який отримують зразки жирової тканини, а також вільно забезпечують вихід більш-менш збагачених зразків мезенхімальних стовбурових клітин. Це досягається за рахунок використання комплекту стерильних контейнерів і трубок, що дозволяє забезпечити передачу тканини і елементів рідини по замкнутому шляху. Серія обробки реагентів (наприклад, фізіологічний розчин, ферменти і т.д.) може також бути надана в попередньо упакованій формі для введення в центрифужну пробірку 100, що дозволить забезпечити просте управління в додаванні реагентів, так само як і температуру та час обробки, тим самим спрощуючи процес управління для операторів. У переважному варіанті здійснення вся процедура від екстракції тканини до обробки та розміщення її у реципієнті виконується в одному приміщені (насправді, навіть у межах однієї кімнати, наприклад, переважно у кімнаті пацієнта, що проходить процедуру з застосуванням МСК, отриманих за допомогою винаходу). Пробірка 100 містить основний корпус звичайної конструкції з внутрішнім об'ємом 160, як правило, доступним від 10 мл до 500 мл, і адаптована для використання в стандартних центрифугах, обладнаних для використання трубок зі звичайною геометрією, показаних на фіг. 1 (хоча будь-яка відповідна геометрія центрифужної пробірки, відома в даній області і сумісна з центрифугою, доступною в даній області техніки, відповідно до винаходу, може бути використана). Відповідно до одного з варіантів, комплект або система включає в себе три основних компоненти: (1) постійний комплект обладнання, всі складові якого відомі в цій галузі: аспіраційний насос, шейкер, центрифуга та міні-інкубатор; (2) сукупність матеріалів обладнання для одноразового використання: аспіраційні голки/канюлі, набір пакетів, шприци, фільтри, колби та центрифужні пробірки 100; і (3) різні розчини/реагенти для здійснення способу. Компоненти переважно адаптовані до взаємодії один з одним з метою полегшення видалення і обробки жирової тканини для отримання МСК, при цьому зберігаючи стерильність і спрощуючи цей 7 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процес. Пробірка 100 забезпечена кришкою 150, яка обладнана кількома отворами 115, 120, 121, і 122, і окремим фітингом 110, встановленими переважно у верхній частині пробірки 100 поблизу кришки 150 (повинно бути зрозуміло для звичайного фахівця в даній області техніки, що різні фітинги, одночасно прикріплені до верхньої частини пробірки 100, можуть бути розташовані по-різному, при цьому деякі, всі фітинги проходять або жоден з фітингів не проходить через кришку 150, також кришка 150 в деяких випадках може бути відсутня для уніфікації конструкції пробірки 100, яка може бути утилізована після використання). Через фітинг 120 проходить трубка 129, яка оснащена стерильним фітингом 125 (наприклад, фітингом з наконечником Люера) для введення різних реагентів або інших рідин через трубку 129, не порушуючи при цьому стерильних умов всередині пробірки 100. Як правило, для додавання рідини в пробірку 100 через трубку 129 використовується стерильний шприц. Трубки 130 і 131 входять у кришку 150 за допомогою фітингів 121 і 122, і, відповідно, обладнані стерильними фітингами 126 і 127, в результаті чого клітини або інші матеріали є розміщеними в масі на дні (у вершині зворотного конуса, який формує нижню частину пробірки 100 після центрифугування (утворення гранул речовини з відносно великою питомою вагою під час центрифугування являється добре відомим в даній області техніки). Фітинги 126 і 127 можуть бути будь-якого типу, такого як фітинг з наконечником Люера, відомого в даній області і придатного для створення стерильного з'єднання між трубками 130, 131 та шприцом або іншим пристроєм, який може застосовуватись для всмоктування з метою видалення клітин з маси в нижній частині пробірки 100. Фітинг 115, через який проходить трубка 116, що обладнана стерильним фітингом 117 на її кінці, може бути використаний для всмоктування з верхньої частини пробірки 100 з метою створення вакууму всередині пробірки 100 (наприклад, для сприяння швидкого введення ліпоаспірата в пробірку 100 через фітинг 110). Фітинг 110 з'єднаний за допомогою короткої трубки або кабелю з фітингом 111, який (як і всі інші деталі, що входять усередину пробірки 100) підходить для підтримки стерильних умов в пробірці 100 в будь-яких умовах. Фітинг 110 зазвичай використовується для введення ліпоаспірата в пробірку 100 в якості першого етапу в процесі екстракції та потенційної очистки або концентрації МСК з ліпоаспірата в клітинну масу, що можуть бути виведені за допомогою будь-якої з трубок 130 і 131. В переважному варіанті, обома трубками 130, 131 забезпечується можливість екстракції клітинної маси, навіть якщо одна з трубок засмічується. Фіг. 2 ілюструє модифіковану центрифужну пробірку 200 для вилучення стовбурових клітин з жирової тканини, яка включає нові засоби атомізації, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Фахівцеві, який має звичайну кваліфікацію в даній області техніки, буде зрозуміло, що пробірка 200 переважно схожа на пробірку 100, але має більш ілюстративну деталізацію конструкції фітингів 125-127. Трубка 116 також закінчується вакуумним насосом 220 у захищеному режимі (деталі стерильного з'єднання між трубкою 116 і насосом 220 не показані, але добре відомі в даній області техніки). Вакуумний насос, стерильно підключений до трубки 116, може бути компонентом переносного набору для виділення МСК з ліпоаспірата, або більш широко в разі необхідності він може бути під'єднаний до трубки 116 під час виконання процесу вилучення МСК з ліпоаспірата. Загалом, це являється метою даного винаходу: сприяти швидкому розпаду ліпоаспірата, який входить у пробірку 100, на дрібні краплі таким чином, що руйнування жирової тканини і промивання клітин (без їхнього пошкодження) могло проходити більш ефективно, не вимагаючи спеціального обладнання. Таким чином, в деяких варіантах здійснення, можуть бути передбачені турбіна або екран 210, який включає в себе безліч отворів 211, через які повинен пройти ліпоаспірат при введенні до пробірки 100 через фітинг 110; наявність отворів 211 допомагає позбутись скупчень жирової тканини, які складають щонайменше частину вхідного ліпоаспірата. Слід зазначити, що ліпоаспірат може бути вилучений до пробірки 100 за допомогою вакууму, який забезпечений насосом 220 або іншим засобом вилучення шляхом всмоктування через трубку 116, або безпосереднім уприскуванням ліпоаспірата (наприклад, шприцом плунжерного типу) через фітинг 110. В будь-якому випадку, оскільки ліпоаспірат нагнітається через штуцер 110 і потім отвори 211, він розчіплюється на дрібні краплі або невеликі скупчення клітин і фрагментів тканини, які більш легко промиваються і іншим чином обробляються відповідно до способів, описаних у даному описі (наприклад, з посиланням на фіг. 4). На фіг. 3 показана схема, що ілюструє систему 300 для підготовки мезенхімальних стовбурових клітини з жирової тканини для клінічного застосування, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. У відповідності до варіанту, комплект, що містить різні компоненти, як описано вище, забезпечується для сприяння екстрагування жирової тканини з пацієнта 301 (хоча донор-непацієнт може також забезпечити жировою тканиною, відповідно до варіанту 8 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення, використовуючи систему 300). Жирова тканина, як описано вище, може бути отримана кількома способами, відомими в даній галузі техніки. Відповідно до проілюстрованого варіанту здійснення, як показано на фіг. 3, система 300 містить шприц 302 і стерильний герметичний пакет 303 для використання в процесі отримання жирової тканини від пацієнта 301. Шприц 302 може бути будь-якого звичайного типу, відомого в даній галузі техніки, який підходить для використання у виведенні, за допомогою ручного відсмоктування, різної кількість жирової тканини, як правило, від 1 мл до декількох сотень мл. Різні комплекти відповідно до системи 300 можуть бути забезпечені одним або кількома засобами для дисоціації жирової тканини, такі як ультразвукова камера 305. Жирова тканина може бути поміщена в ультразвукову камеру 305 у тому ж стерильному пакеті 303, або може бути пропущена через ультразвукову камеру 305 за допомогою стерильної пробірки, як показано. Система 300 зазвичай містить, щонайменше, одну середнього розміру (близько 100 мл) модифіковану центрифужну пробірку 310 (таку як ті, що описані вище з посиланням на фіг. 1 і 2). Жирова тканина може бути залучена в пробірку 310 шляхом застосування вакууму 350 до внутрішньої області 340-341 пробірки 310, або за допомогою ін'єкції зі шприца безпосередньо або через стерильну пробірку. Ліпоаспірат повністю прийнято за допомогою турбіни або екрану 210, перфорованого сукупністю отворів 211, які, як описано вище, служать для сприяння в розщепленні зразків вхідної жирової тканини на дрібні краплі, які більш схильні до ефективної обробки всередині пробірки 310. Після того, як зразок ліпоаспірата був поміщений усередину пробірки 310, сукупність миючих засобів 320 або реагентів 321 (наприклад, реагенти, які допомагають у тканинній дисоціації) може бути введена в стерильні контейнери, передбачені як частина комплекту системи 300 через один або більше стерильні фітинги (наприклад, як показано на фіг. 1 і 2, фітинги 125). Як описано вище, пробірка 310 пристосована для зручного використання в центрифузі (яка може бути передбачена як частина комплекту системи 300, або, альтернативно, яка може бути стандартною робочою установкою або іншою центрифугою, притаманною даному місцю, де система 300 має бути використана; центрифуги добре відомі в даній області і, як правило, легко доступні в широкому діапазоні медичних установ), так що ліпоаспірати в пробірці 310 можуть бути легко центрифуговані для того, наприклад, щоб відокремити стовбурові клітини від інших клітин або тканин фракцій. Пробірка 310, як правило, забезпечена одним або більше фітингами 330, 331 для видалення відокремлених стовбурових клітин або інших клітин або матеріалу, що міститься в клітинній масі на вершині конічної секції 340 пробірки 310. Приклади таких фітингів 330, 331 показані на фіг. 1 і 2 (тобто фітинги 126 і 127, які залучають гранульований матеріал з трубок 130 і 131, відповідно). У деяких варіантах здійснення ліпоаспірат, оброблений в пробірці 310 (за допомогою будь-якого промивання, дисоціації та центрифугування), вводять безпосередньо пацієнту 301; в інших варіантах здійснення, система 300 може включати в себе другу, як правило, меншу пробірку 360, яка може бути використана для подальшої обробки ліпоаспірата після його видалення з пробірки 310. Наприклад, частково збагачений ліпоаспірат (тобто оброблений ліпоаспірат з вищою кількістю стовбурових клітин, ніж ліпоаспірат, отриманий від пацієнта або донора 301 на початку) може бути введений (або залучений за допомогою вакууму 350) в пробірку 360, яка може бути, наприклад, об'ємом від 10 до 20 мл (хоча можна використовувати й інші об'єми, у тому числі той же або більший об'єм, що і в пробірці 310; відносні розміри, показані і описані є тільки ілюстративними і не повинні розглядатися як обмежуючі, зокрема, різні протоколи лікування можуть вимагати різних конкретних розмірів пробірки. Таким чином, система 300, показана на фіг. 3 як приклад, демонструє різні пристрої, які можуть бути складені, разом з різними реагентами і миючими засобами в стерильних контейнерах для використання в разі необхідності, у комплект, придатний для використання при одиничному лікуванні, в якому ліпоаспірат вилучають з пацієнта 301, оброблений в портативному, постійно стерильному середовищі, що складається з елементів системи 300, які поставляються у вигляді комплекту, і вводяться без потреби диференціювання або культивування стовбурових клітин до того ж або іншого пацієнта 301. Слід розуміти, що в деяких варіантах здійснення може бути бажаним диференціювання фракції стовбурових клітин, отриманої за допомогою системи 300 з використанням способів, відомих в даній області, наприклад, для отримання та наступного культивування попередників остеоцитів або інших типів клітин-попередників, диференційованих з мезенхімальних стовбурових клітин, отриманих відповідно до винаходу. Способи вилучення та обробки жирової тканини При здійсненні описаних тут способів, клітини (наприклад, мезенхімальні стовбурові клітини), які призначені для введення пацієнтові 301, можуть бути отримані з жирової тканини. Жирова тканина може бути отримана різними способами, відомими фахівцеві в даній галузі техніки. Наприклад, жирова тканина може бути видалена з пацієнта шляхом ліпосакції за 9 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою всмоктування, ліпосакції за допомогою ультразвуку та ексцизійної ліпектомії. Крім того, процедури можуть включати в себе комбінації процедур, таких як комбінація ексцизійної ліпектомії і ліпосакції за допомогою всмоктування. Як тканина або будь-яка її фракція призначена для реплантації пацієнту, так і жирова тканина повинні бути зібрані таким чином, щоб зберігати життєздатність клітинного компонента та зводити до мінімуму вірогідність зараження тканини потенційно інфекційними організмами, такими як бактерії та/або віруси. Таким чином, вилучення тканини переважно повинно бути здійснено стерильним або асептичним чином, щоб звести до мінімуму зараження. Фіг. 4 являє собою схему процесу високого рівня 400 для отримання мезенхімальних стовбурових клітин з жирової тканини для клінічного застосування, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. У відповідності з варіантом, на етапі 401 одноразова система видалення тканини забезпечується в якості компонента стерильного комплекту, призначеного для отримання оброблених збагачених стовбурових клітин ліпоаспірата (наприклад, шприц 302). Потім, на етапі 402, технік, лікар або інший подібний професіонал видаляє жирову тканину з пацієнта (або донора), при цьому жирова тканина має початкову концентрацію стовбурових клітин (зокрема, МСК). Для процедур ліпосакції за допомогою всмоктування жирова тканина може бути зібрана шляхом введення канюлі в або поблизу відкладень жирової тканини, наявних у пацієнта 301, з наступним відсмоктуванням жирової тканини пристроєм всмоктування. В одному варіанті виконання, невелика канюля може бути з'єднана з шприцом 302, і жирова тканина може бути вилучена вручну. За допомогою шприца 302 або іншого подібного пристрою переважним може бути збирання відносно невеликої помірної кількості жирової тканини (наприклад, від 0,1 мл до декількох сотень мл жирової тканини). Ліпосакція за допомогою всмоктування може бути переважною при видаленні жирової тканини з пацієнта 301, так як вона забезпечує мінімально інвазивний спосіб збору тканини з відповідним мінімальним потенціалом пошкодження стовбурових клітин. Крім того, широке використання процедур ліпосакції в цій області зумовило розвиток добре відомих і безпечних способів видалення значних кількостей жирової тканини з донорів або пацієнтів. У кращому варіанті здійснення, система включає в себе одноразову систему аспірації, що дозволяє витягувати жирову тканину у стерильній закритій упаковці для подальшої обробки. Переважно, система використовує порівняно невеликий пристрій, такий як невеликий шприц 302, із додатковою перевагою в тому, що ліпоаспірація може бути виконана лише за допомогою локальної (або навіть без неї) анестезії, на відміну від загальної анестезії. Жирова тканина, видалена з пацієнта, може бути зібрана в стерильний контейнер (такий як стерильний герметичний пакет 303) для подальшої обробки. Як зазначено в даному описі, в одному з варіантів винаходу, пристрій призначений для і має на меті збір тканини для виробництва обробленої популяції клітин жирової тканини, що включає в себе стовбурові клітини та/або ендотеліальні клітини-попередники. У переважному варіанті здійснення, пристрій являє собою систему аспірації одноразового використання, що висмоктує жирову тканину з пацієнта в стерильний герметичний пакет 303. В альтернативних варіантах здійснення, пристрій може бути будь-яким звичайним пристроєм, який зазвичай використовується для збору тканини лікарями, які виконують процедуру екстракції. Оскільки, як правило, необхідною є лише невелика кількість жирової тканини, корисність цього винаходу не обмежується приватними особами з великою кількістю жирової тканини. Частина тканини повинна бути зібрана в залежності від числа змінних параметрів, включаючи, але не обмежуючись цим, індекс маси тіла донора, наявність доступних ділянок збору жирової тканини, супутніх і попередньо існуючих препаратів і умов (наприклад, антикоагулянтної терапії), і клінічних цілей, для яких жирова тканина збирається. Крім того, концентрації стовбурових клітин, присутні в ліпоаспіратах, широко варіюють від індивідуума до індивідуума, так що, коли певна кількість стовбурових клітин є необхідною, більший або менший об'єм жирової тканини може знадобитися для отримання конкретної необхідної кількості. Наприклад, концентрація стовбурових клітин в тканині, виділеної з худої людини, як правило, буде більшою, ніж виділена з донора, що страждає на ожиріння (це відображає типовий розбавляючий ефект збільшення вмісту жиру в жировій тканині у огрядних осіб). Переважним способом отримання жирової тканини людини є процедури видалення або ліпосакції, добре відомі в даній галузі техніки. Плюрипотентні клітин за винаходом присутні з самого початку у вирізаній або витягнутій жировій тканині, незалежно від способу, за допомогою якого жирову тканину отримано. Жирова тканина може бути потім оброблена для полегшення поділу/концентрації стовбурових клітин. Наприклад, плюрипотентні клітини можуть бути отримані шляхом промивання зібраної жирової тканини фізіологічно-сумісним розчином, таким як натрій-фосфатний буферний розчин (PBS). Як правило, етап промивання складається з 10 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 промивки зразка жирової тканини у PBS, перемішування зразка і забезпечення знаходження тканини в зразку до прийняття рішення. Додатково до промивання, жирова тканини може бути піддана дисоціації. Дисоціація може відбуватися за рахунок ферменту деградації (наприклад, лікування трипсином). В якості альтернативи або в поєднанні з такою ферментативною обробкою можуть бути використані інші способи дисоціації, такі як механічне перемішування, звукова або ультразвукова енергія або теплова енергія. Клітини потім можуть бути піддані центрифугуванню, і отримана в результаті маса (яка містить плюрипотентні клітини) може бути піддана додатковій обробці після перерозчинення у відповідному розчині (наприклад, PBS). На етапі 403 щонайменше частина жирової тканини, отримана на етапі 402, обробляється (як описано вище, наприклад) для отримання підвищеної концентрації стовбурових клітин, і на етапі 404 оброблені стовбурові клітини вводять пацієнту 301 із стерильного контейнера, що може бути наданий в комплекті системи 300 або може бути доступний в медичній установі. Плюрипотентні клітини в перерозчиненій масі можуть бути відділені від інших клітин перерозчиненої маси способами, які включають, але не обмежуються ними: сортуванням клітин, фракціонуванням, грануляційно, за щільністю, молекулярно, морфологічно і імуно-гістологічно (наприклад, розділення методом пеннінга, використовуючи магнітні кульки, флуоресцентноактивоване сортування клітин/FACS, магнітно-активоване сортування клітин/MACS, або афінна хроматографія). В деяких імунологічно основаних способах виділення клітин плюрипотентні клітин можуть бути отримані шляхом позитивної селекції, за допомогою використання антитіла або іншого специфічного зв'язуючого білка, який зв'язується з епітопом на поверхні клітини. У таких способах відновлення клітин з антитіл, до яких вони приєдналися, може бути виконане за допомогою одної або декількох промивок з підходящими буферами, які відомі фахівцеві в даній галузі техніки. Крім того, плюрипотентні клітини можуть бути виділені шляхом негативноїселекції. У відповідності з різними варіантами здійснення даного винаходу, комплекти збору стовбурових клітин можуть містити стерильні контейнери та/або реагенти для полегшення відділення або концентрації стовбурових клітин у зразку ліпоаспірата. Наявність плюрипотентних клітин переважно визначена попередньо до повторного введення, використовуючи, наприклад, маркери поверхонь специфічних клітин та/або враховуючи способи, відомі в даній галузі техніки. Плюрипотентні клітини, отримані за допомогою системи 300 відповідно до даного винаходу, як правило, будуть введені (або повторно введені) пацієнту без росту або диференціації. Тим не менш, в деяких варіантах здійснення, плюрипотентні клітини можуть бути вирощені та/або диференційовані in vitro. Тобто, після виділення плюрипотентні клітини можуть бути збережені і допущені до розмноження в середовищі культивування. Плюрипотентні клітини можуть бути індуковані до диференціювання (або фенотипічних змін) в потрібний тип клітин з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Фахівцеві в даній області техніки відомо як модифікувати або модулювати концентрації середовища та/або середовища добавок, які необхідні для клітин, що використовуються. В іншому варіанті здійснення, плюрипотентні клітини даного винаходу можуть бути вирощені в середовищі культивування певного складу, в якому сироватка замінена комбінацією сироваткового альбуміну, сироваткового трансферину, селену та рекомбінантних білків, включаючи, але не обмежуючись ними: інсулін, тромбоцитарний фактор росту (PDGF) і основний фактор росту фібробластів (bFGF), відомих в даній галузі техніки. Умови експлуатації плюрипотентних клітинних популяції(ій) за винаходом можуть також містити один або більше клітинних факторів, які дозволяють зберігати клітини в недиференційованому вигляді. Якщо є бажаною диференціація плюрипотентних клітин, одна або більше додаткових речовин може бути додана до культури, щоб викликати специфічну бажану фенотипічну зміну. Такі речовини можуть містити один або більше активаторів внутрішньоклітинних сигнальних шляхів (наприклад, мітоген-активована протеїнкіназа і SMAD), активаторів факторів транскрипції (наприклад, Sox9, L-Sox5 і L-sox6), активаторів виробництва та взаємодії з позаклітинними матричними білками (наприклад, колаген II, аггрекан і олігомерний матричний білок хряща), факторів росту, цитокінів, хемокінів, гормонів, а також екологічних факторів (наприклад, кисневого тиску). Фіг. 5 являє собою схему деталізованого процесу 500 для одержання і використання мезенхімальних стовбурових клітин з жирової тканини при клінічних застосуваннях, відповідно до переважного варіанту здійснення даного винаходу. У відповідності до варіанту здійснення, на етапі 501 жирова тканина видалена у донора або пацієнта 301. На етапі 502 ліпоаспірат введено або залучено за допомогою вакууму 350 в модифіковану центрифужну пробірку 310. Додатково на етапі 503 виділений ліпоаспірат може бути промитий з використанням миючих 11 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 засобів, відомих в даній галузі техніки, таких як PBS. На етапі 504 ліпоаспірат додатково може бути дисоційований до розщеплення жирової тканини і клітинних скупчень з метою полегшення подальшої обробки. На етапі 505 клітини або ліпоаспірат може бути центрифуговані для відокремлення клітинних і тканинних фракцій з різними питомими вагами. Наприклад, у відповідним чином підготовленого ліпоаспірата, МСК може бути сформована в клітинну масу у вершині конічного об'єму 340 пробірки 310 і, таким чином, може бути виділена в значній мірі від більш легких клітин або фрагментів тканини. У багатьох випадках, клітинна маса, отримана в результаті етапу 505, може мати в незначній кількості збагачену концентрацію стовбурових клітин (по відношенню до концентрації стовбурових клітин, присутніх в ліпоаспіраті, взятого з донора або пацієнта на етапі 501), і подальше збагачення може бути необхідним. На етапі 506 збагачена маса стовбурових клітин може бути перерозчинена у відповідному розчині для подальшої обробки (у тому числі потенційне повторення етапів від 502 до 505). На етапі 507 стовбурові клітини можуть бути додатково окремо відокремлені від інших фракцій клітин з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Плюрипотентні клітини в перерозчиненій масі можуть бути відділені від інших клітин перерозчиненої маси методами, які включають, але не обмежуються ними: сортуванням клітин, фракціонуванням, грануляційно, за щільністю, молекулярно, морфологічно і імуно-гістологічно (наприклад, розділення методом пеннінга, використовуючи магнітні кульки, флуоресцентно-активоване сортування клітин/FACS, магнітно-активоване сортування клітин/MACS, або афінна хроматографія). В деяких імунологічно основаних способах виділення клітин плюрипотентні клітин можуть бути отримані шляхом позитивної селекції за допомогою використання антитіла або іншого специфічного зв'язуючого білка, який зв'язується з епітопом на поверхні клітини. У таких способах відновлення клітин з антитіл, до яких вони приєдналися, може бути виконане за допомогою однієї або декількох промивок з підходящими буферами, які відомі фахівцеві в даній галузі техніки. Крім того, плюрипотентні клітини можуть бути виділені шляхом негативної селекції. На етапі 508 концентрація стовбурових клітин в обробленому зразку ліпоаспірата може бути визначена з використанням будь-яких засобів, відомих в даній галузі техніки. Наявність плюрипотентних клітин переважно визначена попередньо до повторного введення, використовуючи, наприклад, маркери поверхонь специфічних клітин та/або враховуючи способи, відомі в даній галузі техніки. На етапі 509 визначення може бути виконано на основі, щонайменше, частини концентрації, визначеної на етапі 508, при умові подальшої обробки ліпоаспірата для додаткового концентрування (тобто для створення вищої концентрації стовбурових клітин), і якщо так, такі подальші обробки можуть бути проведені за допомогою повторення одного або більше етапів від 502 до 508. На етапі 510 стовбурові клітини можуть бути додатково культивовані для отримання більшої кількості стовбурових клітин, за допомогою методик, розроблених та добре відомих в даній області. Аналогічним чином, на етапі 511 (який може бути виконаний або до, або після того як, або навіть одночасно з етапом 510) плюрипотентні стовбурові клітини можуть бути диференційовані в один або більше типи клітинпопередників з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Нарешті, на етапі 512 стовбурові клітини або клітини-попередники, екстраговані та оброблені як описано вище з посиланням на етапи від 501 до 511, можуть бути введені одному або більше пацієнтам 301, або зберігатися для подальшого використання в терапевтичних, косметичних або інших цілях. Засоби для повторного введення стовбурових клітин жирової тканини Комплекти відповідно до системи 300 винаходу можуть бути використані для створення фармацевтичної композиції, яка містить профілактично або терапевтично ефективну кількість мезенхімальних стовбурових клітин відповідно до винаходу, переважно, головним чином в очищеній формі, разом з прийнятним носієм у відповідних кількостях для того, щоб забезпечити форму стовбурових клітин, придатну для безпечного і ефективного введення пацієнту. Пацієнти, що проходять лікування у відповідності з різними варіантами здійснення даного винаходу, можуть отримувати різні концентрації стовбурових клітин, ніж при інших лікуваннях, що використовують жирову тканину або стовбурові клітини, отримані з жирової тканини. Таким чином, жирова тканина, яка виділена з пацієнта може бути оброблена з метою зміни концентрації стовбурових клітин, які вводять пацієнтові. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, пацієнти отримують вищу концентрацію стовбурових клітин, ніж концентрації стовбурових клітин, як правило, що присутні в трансплантаті жирової тканини та інших подібних видах стовбурових клітин на основі лікування. Концентровані стовбурові клітини можуть бути введені в композицію, що містить стовбурові клітини жирової тканини та/або ендотеліальні клітини-попередники, головним чином, вільні від зрілих адипоцитів і сполучної тканини, або, в якості іншого прикладу, концентровані стовбурові клітини можуть бути введені в композиції, що містить скупчення жирової тканини із збільшеною кількістю стовбурових клітин. 12 UA 114815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтична композиція даного винаходу може бути сформульована відповідно до спеціально обраної лікарської форми. Наприклад, фармацевтична композиція може бути підготовлена у формі рідкої дози, наприклад, у вигляді суспензії, яку буде введено в суб'єкт, що потребує лікування. Демонстраційні (не обмежуючі) зразки включають формування фармацевтичної композиції відповідно до винаходу у вигляді стерильної суспензії з фармацевтично прийнятним носієм, таким як фізіологічний розчин, натрій-фосфатний буферний розчин (PBS), або будь-який інший відповідний фармацевтично прийнятний носій для введення суб'єкту, наприклад, людині, переважно внутрішньовенно, внутрішньочеревно, підшкірно і т.д., хоча інші способи введення також можуть бути можливими. Введення фармацевтичної композиції суб'єкту, який потребує цього, може бути здійснене за допомогою звичайних засобів, відповідно до винаходу. У конкретному варіанті здійснення фармацевтична композиція може бути введена суб'єкту, який потребує внутрішньовенного введення з використанням пристроїв, таких як шприци, катетери, троакари, канюлі і т.д. У будьякому випадку, фармацевтична композиція за даним винаходом може вводитись за допомогою будь-якого відповідного обладнання, апаратури та пристроїв, відомих фахівцям в даній області. У переважних варіантах, пристрій для введення фармацевтичної композиції надається як частина комплекту, описаного вище, або адаптований для використання з комплектом, описаним вище, для полегшення передачі фармацевтичної композиції суб'єкту без зараження. Наведений вище опис переважних варіантів здійснення даного винаходу було надано з метою ілюстрації та опису. Він не є вичерпним або обмежуючим винахід точно розкритими формами. Багато варіантів здійснення було обрано і описано для того, щоб краще пояснити принципи винаходу і його практичне застосування, тим самим дозволяючи іншим фахівцям у даній галузі техніки зрозуміти винахід для різних варіантів здійснення і з різними модифікаціями, які підходять для індивідуального передбачуваного використання. Передбачається, що обсяг винаходу визначається формулою винаходу і її еквівалентами. Фахівцеві в даній області буде відомо про діапазон можливих модифікацій різних варіантів здійснення, описаних вище. Відповідно, даний винахід визначається формулою винаходу і її еквівалентами. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Система для вилучення та обробки жирової тканини у стерильних умовах для генерування терапевтично ефективної кількості стовбурових клітин жирової тканини, причому система містить пристрій для вилучення жирової тканини, який містить першу модифіковану центрифужну пробірку (100, 200), що містить стерильні вхідні ліпоаспіратові фітинги (110, 111), щонайменше один із стерильних вхідних фітингів для обробки рідини (120, 125, 129), стерильний всмоктуючий фітинг (115, 116, 117) та щонайменше один стерильний екстракційний фітинг (121, 122, 126, 127), функціонально сполучений з трубкою для вилучення маси (130, 131), та екран (210), який включає в себе сукупність отворів (211), розташованих у межах згаданої першої модифікованої центрифужної пробірки, розділюючи таким чином внутрішній об'єм згаданої пробірки на верхню частину та нижню частину, яка відрізняється тим, що екран придатний для дисоціації жирової тканини та отримання суміші клітин, яка збагачена стовбуровими клітинами, у зазначеній нижній частині; при цьому пристрій для вилучення жирової тканини придатний для вилучення порції жирової тканини людини; при цьому ліпоаспірат переміщений до першої модифікованої центрифужної пробірки за допомогою стерильного переносу, етапи обробки виконані через щонайменше один стерильний фітинг (125) для очищення і відокремлення ліпоаспірата, причому клітинна маса, що містить збагачену фракцію стовбурових клітин, отримана за допомогою центрифугування в модифікованій центрифужній пробірці та виділена через щонайменше один із зазначених стерильних екстракційних фітингів (126, 127), при цьому клітинну масу перерозчинено в рідині і введено пацієнту-людині в терапевтичних або косметичних цілях. 2. Система за п. 1, яка відрізняється тим, що додатково містить другу модифіковану центрифужну пробірку (310), по суті, такої ж конструкції, що і перша модифікована центрифужна пробірка, причому друга модифікована центрифужна пробірка має двостороннє сполучення за допомогою власного вхідного фітинга зі щонайменше одним зі стерильних вхідних фітингів (126, 127) першої модифікованої центрифужної пробірки, при цьому друга модифікована центрифужна пробірка придатна для подальшої обробки перерозчиненої маси з метою досягнення підвищеної концентрації стовбурових клітин. 3. Система за п. 1, яка відрізняється тим, що перша модифікована центрифужна пробірка додатково містить верхню внутрішню область (340) та вершину конічної секції (341), де 13 UA 114815 C2 5 10 стерильний вхідний ліпоаспіратовий фітинг (111), щонайменше один стерильний вхідний фітинг для обробки рідини (125), стерильний всмоктувальний фітинг (116, 117) та щонайменше один стерильний екстракційний фітинг (126, 127) сполучені з верхньою внутрішньою областю першої модифікованої центрифужної пробірки. 4. Система за п. 1, яка відрізняється тим, що екстракційна трубка (130, 131) виконана придатною для подовження від стерильного екстракційного фітинга (121, 122) у напрямку вершини конічної секції (341) першої модифікованої центрифужної пробірки. 5. Система за п. 3, яка відрізняється тим, що щонайменше один стерильний вхідний фітинг для обробки рідини (120, 125, 129), стерильний всмоктувальний фітинг (115, 116, 117) та щонайменше один стерильний екстракційний фітинг (121, 122, 126, 127) розташовані у кришці (150), закріпленій на верхній частині першої модифікованої центрифужної пробірки з можливістю її відкривання. 6. Система за п. 1, яка відрізняється тим, що додатково містить вакуумний насос (220), сполучений зі всмоктувальним фітингом (116). 14 UA 114815 C2 15 UA 114815 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16