Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин із жирової тканини

Реферат: Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин із жирової тканини є імунобіологічним методом виділення цих клітин. Для отримання більшої кількості клітин та більш швидкого методу їх виділення проводять ферментативну обробку жирових клітин 0,3 % розчином колагенази та 0,5 % розчином трипсину протягом 1 години. Далі проводять культивування отриманої клітинної суспензії протягом 3 годин на пластикових чашках Петрі з подальшим розділенням суспензії клітин на ту, що прилипає до пластику (частина суспензії, що містить мезенхімальні стовбурові клітини), та на ту, що не прилипає до пластику, - яку видаляють. UA 78109 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН ІЗ ЖИРОВОЇ ТКАНИНИ UA 78109 U UA 78109 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини (імунології та цитології) і може бути використана для якісного та швидкого отримання збагаченої кількості мезенхімальних стовбурових клітин, придатних для наукових та клінічних досліджень. Сьогодні в світі успішно розробляються та впроваджуються новітні методи діагностичного лікування, основані на досягненнях генетики та клітинно-молекулярної біології. Серед цих нових методів особливе місце займає клітинна терапія, яка здатна відновлювати різні органи та тканини організму, подовжувати життя хворим людям. Велика увага приділяється мезенхімальним стовбуровим клітинам (МСК), які уже інтенсивно та всебічно вивчаються і уже позитивно апробовані при цілому ряді захворювань, таких як інсульти мозку, інфаркти міокарду, паркінсонізм, діабет та інші (1-3). В той же час, поки що відсутні протоколи, як отримання культивування, збагачення клітинної маси та її стандартизації, що є суттєвим гальмом для широкого їх використання. Залишаються ще до кінця не вивченими такі питання, як находження МСК, їх проліферативне та диференціювання активність in vitro, можливості швидкого їх збагачення та отримання в кількості придатних для клінічного використання. Мезенхімальні стовбурові клітини отримують із різних тканин, в першу чергу із кісткового мозку та жирової тканини. Кістково-мозкові МСК були отримані раніше і використовуються досить давно в клітинній терапії, але їх кількість в кістковому мозку мізерна і складає 0,010,005 % від усіх клітин, тоді як із жирової тканини можна отримати до 100000 клітин із 1,0 граму жиру (Sans). В той же час методика отримання суспензії жирових клітин та її відділення МСК в окрему популяцію ще досконало не розроблена. В зв'язку з цим потрібно переглянути методику отримання суспензії жирових клітин та виділення мезенхімальних стовбурових клітин для їх швидкого використання. Найбільш близьким до запровадженого методу отримання стовбурових клітин методика та протоколи Лопатина Т.В. [1], які полягають в отриманні цих клітин із жирової тканини та їх культивування протягом 24-48 годин для розділення суспензії на 2 частини: перша - адгезивні клітини, які прилипають до пластику і які складаються, в основному, з мезенхімальних клітин, та друга - не адсорбовані клітини, які не містять мезенхімальних клітин. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення якості та швидкості отримання клітин із жирової тканини людини чи тварини. Поставлена задача вирішується тим, що для отримання більшої кількості клітин та більш швидкого методу їх виділення проводять ферментативну обробку жирових клітин 0,3 % розчином колагенази та 0,5 % розчином трипсину протягом 1 години, далі проводять культивування отриманої клітинної суспензії протягом 3 годин на пластикових чашках Петрі з подальшим розділенням суспензії клітин на ту, що прилипає до пластику (частина суспензії, що містить мезенхімальні стовбурові клітини), та на ту, що не прилипає до пластику, - яка видаляється. Технічним результатом для застосування корисної моделі є те, що реалізація даної корисної моделі дозволяє збільшити кількість дисоційованих клітин в суспензії після ферментативної обробки, а також є швидке, протягом 3 годин, отримання суспензії мезенхімальних клітин для подальшого вивчення та використання. І етап - отримання суспензії жирових клітин у тварин. Лабораторним тваринам (щурам або мишам) вводили в/м по 0,5 мл тіопенталу натрію, який визивав зупинку дихання та смерть тварини, що рекомендується етичними нормами для робіт з лабораторними тваринами. У тварин стерильно забирали підшкірний жир на животі та переносили його в стерильну чашку Петрі, подрібнювали його ножицями та змішували з розчином 0,5 % трипсину та 0,7 % колагенази в співвідношенні 1,0 грам жиру на 1 грам розчину. Все це витримували при 37 °C 1 годину, а потім фільтрували через капроновий фільтр і доводили об'єм до 1,0 мл середовищем Хенксу. Клітинну суміш 2 рази відмивали шляхом центрифугування середовищем Хенксу при 500 об/хв. Та готували суспензію в 2,0 мл середовища Хенксу. Перераховували кількість клітин загально відомим гематологічним методом з оцтовою кислотою. II етап - культивування на пластикових чашках Петрі. 6 Отриману суспензію клітин наносили в кількості 2-3 × 10 кл/мл в об'ємі 3,0 мл на стерильні чашки Петрі і інкубували 3 години. Надосад з неприлиплими клітинами видаляли із чашки Петрі та промивали 1 раз чашку середовищем Хенкса. До прилиплих клітин добавляли 0,5 % розчин трипсину та 0,25 % ЕДТА на 10 хвилин для зняття клітин із поверхні чашки Петрі. Суспензію мезенхімальних клітин переносили в стерильну пробірку, центрифугували та розчиняли в новому середовищі в об'ємі 1,0 мл. Після перерахунку з оцтовою кислотою кількості отриманих мезенхімальних клітин їх використовували в подальших дослідах. 1 UA 78109 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Прикладом конкретного застосування є результати співставлення 2-х методів отримання мезенхімальних стовбурових клітин. Так, в першому випадку проводили виділення стовбурових клітин без обробки з колагеназою та трипсином, а в другому випадку проводили обробку жирової тканини ферментами (трипсином та колагеназою). Після підрахунку клітин було 6 встановлено, що в першому випадку було отримано 5 × 10 ядроутримуючих клітин на 1 грам 6 жирової тканини, в іншому випадку, по запропонованому методу було отримано 14,2 × 10 клітин на 1 грам жиру. Таким чином, перевага запровадженого нами методу полягає у більшій кількості стовбурових клітин, які можна отримати. В цьому прикладі було отримано клітин в 2,6 разу (14,2 6 6 × 10 :5,4 × 10 =/2,62). Це дозволяє значно більше отримувати клітин, завдяки використання запровадженої методики. Проведена адсорбція цих жирових клітин на чашках Петрі протягом 3 годин при 37 та наступному отриманні прилипаючої фракції було встановлено, що після 3 5 годин адсорбції на чашках Петрі, було отримано 5,6 × 10 клітин, із них було 96 % життєздатних. 5 Тоді як при інкубації протягом 24 годин було отримано 7 × 10 клітин, а життєздатних було лише 73 %. Таким чином, при короткостроковій інкубації виділяється приблизно така ж кількість клітин, але вони мають меншу кількість клітин, які загинули та адсорбувалися до пластику. Крім того, така довга інкубація призводить до зростання бактеріального забруднення клітин, за 24 години дуже сильно може зрости забруднення, яке впливає на клітини. Визначення функціональної активності цих отриманих двома методами стовбурових мезенхімальних клітин, що показали отримані нашим методом клітини гальмували реакцію РТПХ лімфоцитів, ФГА на 52 %, тоді як виділені іншим відомим методом, лише на 23 %, тобто імуносупресивна дія цих клітин, яка є їх спадковою, конституційною властивістю краще проявляється при використанні запропонованого методу. Причиною кращої дії цих клітин на нашу думку було те, що було більше життєздатних та менше було інших домішок, які накопичувались через 24 години. Запропонований нами спосіб має такі переваги: - дає можливість отримувати більшу кількість та більш якісний склад клітинної суспензії. - дає можливість протягом одного дня проводити виділення клітин, завдяки 3 годинній інкубації. - дає можливість отримувати більш життєздатні клітини та менш забруднені мікрофлорою. - дає можливість мати більш якісну по функціональній активності клітини. Джерела інформації: 1. Локатива Т.В., Калинина И.И., Ревищин А.В., Беме А.А. и др. Индукция нейрональной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2008. - Т. III, № 4. - С. 50-54. 2. Соколова И.Б., Федорова О.Р., Гилерович Е.Г. и др. Коррекция ориентовочногоисследовательского дефицита у крыс с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток // Клеточ. трансплант. и тканевая инженерия.-2009. - Т. IV, № 4. - С. 65-70. 3. Rastegar F., Shenag D., Unang J. et al. Mesenchimal stem cells: molemler characteristics and linical application // Wold.J.Stem Cells.-2010. - V. 2. - № 4-P. 67-80. 4. Toda S., Uchihashi K., Poki S. et al. Adipose tissue-organo typic culture system as a promising model for studying adipose tissul geology and regeneration // Organesis.-2009. - v. 5. - № 2. - P. 5052/ 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин із жирової тканини, що є імунобіологічним методом виділення цих клітин, який відрізняється тим, що для отримання більшої кількості клітин та більш швидкого методу їх виділення проводять ферментативну обробку жирових клітин 0,3 % розчином колагенази та 0,5 % розчином трипсину протягом 1 години, далі проводять культивування отриманої клітинної суспензії протягом 3 годин на пластикових чашках Петрі з подальшим розділенням суспензії клітин на ту, що прилипає до пластику (частина суспензії, що містить мезенхімальні стовбурові клітини), та на ту, що не прилипає до пластику, яка видаляється. 2 UA 78109 U Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3