Спосіб контролю кількості сіалової кислоти, спосіб одержання химерного глікопротеїну (варіанти), препарат, що містить химерний глікопротеїн (варіанти), терапевтична композиція

1 Спосіб контролю КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти, що присутня в олігосахаридному бічному ланцюзі глікопротешу, продукованого культурою клітин ссавця, шляхом зміни питомої продуктивності зазначеної культури, який здійснюють наступним чином під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 0,1 мМ до 20 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від 250 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від ЗО до 35°С, і підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротешу 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що для збільшення КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі глікопротешу, продукованого культурою клітин ссавців, зменшують питому продуктивність культури клітин наступним чином під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 0,1 мМ до 6 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від 300 мОсмолей до 450 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від ЗО до 35°С, і підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротешу 3 Спосіб за п 2, який відрізняється тим, що культура клітин ссавців являє собою культуру клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) 4 Спосіб за п 3, який відрізняється тим, що сіль алканової кислоти являє собою бутират натрію 5 Спосіб за п 4, який відрізняється тим, що продукований культурою клітин глікопротеїн являє собою глікопротеїн ссавця 6 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що глікопротеїн являє собою химерний глікопротеїн, що складається з рецептора фактора некрозу пухлини людини і імуноглобуліну Gi 7 Спосіб за п 6, який відрізняється тим, що культура клітин являє собою ЛІНІЮ dpi 2 СНО, трансфектовану вектором, що включає кДНК, кодуючу химерний глікопротеїн, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобуліну Gi (TNFR1igGi) 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що для зменшення КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі глікопротешу, продукованого культурою клітин ссавців, збільшують питому продуктивність культури клітин наступним чином під час перехідної фази додають до культури клітин алканову кислоту з 3-6 атомами вуглецю або її сіль в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 6 мМ до 12 мМ, встановлюють осмоляль О 00 47428 ність клітинної культури в інтервалі значень від приблизно 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від ЗО до 35°С, і підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротешу 9 Спосіб за п 8, який відрізняється тим, що культура клітин ссавців являє собою культуру клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) 10 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що сіль алканової кислоти являє собою бутират натрію 11 Спосіб за п 10, який відрізняється тим, що продукований культурою клітин глікопротеш являє собою глікопротеш ссавця 12 Спосіб за п 11, який відрізняється тим, що глікопротеш являє собою химерний глікопротеш, що складається з рецептора фактора некрозу пухлини людини і імуноглобулшу Gi 13 Спосіб за п 12, який відрізняється тим, що культура клітин являє собою ЛІНІЮ dpi 2 СНО, трансфектовану вектором, що включає кДНК, кодуючу химерний протеїн, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобулшу Gi(TNFR1-lgGi) 14 Спосіб одержання химерного глікопротешу, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобулшу Gi(TNFRI-lgGi) і що має знижену КІЛЬКІСТЬ сіалової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі, який полягає утому, що здійснюють наступні стадії а) культивують клітини СНО, що експресують химерний глікопротеш TNFR1-lgGi при температурі біля 37°С в умовах, що забезпечують максимальне зростання клітин, б) під час перехідної фази додають до культури клітин бутират натрію в інтервалі концентрацій приблизно від 6 мМ до 12 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень приблизно від 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, встановлюють температуру культивування приблизно від ЗО до 35°С, підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротешу і виділяють глікопротеш з культурального середовища та очищають 15 Спосіб одержання химерного глікопротешу, що складається з розчинної форми рецептора фактора некрозу пухлини людини типу 1 і імуноглобулшу Gi(TNFRI-lgGi) і що має підвищену КІЛЬКІСТЬ сіа лової кислоти в олігосахаридному бічному ланцюзі, який полягає у тому, що здійснюють наступні стадії а) культивують клітини ссавців, що експресують химерний глікопротеш TNFR1-lgGi при температурі біля 37°С в умовах, що забезпечують максимальне зростання клітин, б) під час перехідної фази додають до культури клітин бутират натрію в інтервалі концентрацій, що складає приблизно від 1 мМ до 6 мМ, встановлюють осмоляльність клітинної культури в інтервалі значень, що складає приблизно від 300 мОсмолей до 450 мОсмолей, встановлюють температуру культивування, що складає приблизно від ЗО до 35°С, підтримують зазначені параметри на стадії продукування глікопротешу і виділяють глікопротеін з культурального середовища та очищають 16 Спосіб за п 15, який відрізняється тим, що клітини ссавців являють собою клітини СНО 17 Спосіб за п 16, який відрізняється тим, що клітини СНО являють собою ЛІНІЮ dp12 СНО 18 Препарат, що містить химерний глікопротеш TNFR1-lgGi, одержаний ВІДПОВІДНО ДО способу за п 17 19 Терапевтична композиція, що містить химерний глікопротеш TNFRI-lgGi, одержаний ВІДПОВІДНО до способу за п 15, і фармацевтично прийнятний наповнювач 20 Препарат, що містить химерний глікопротеш TNFR1-lgGi, одержаний ВІДПОВІДНО ДО способу за п 14 або 15, причому в молекулі TNFR1-lgGi молярне відношення сіалової кислоти до білка складає приблизно 4-7 21 Препарат, що містить химерний глікопротеш TNFR1-lgGi, одержаний ВІДПОВІДНО ДО способу за п 15, причому в молекулі TNFR1-lgGi міститься приблизно 1-2 моля незахищених залишків Nацетилглюкозамшу на моль білка 22 Препарат, що містить химерний глікопротеш TNFRI-lgGi, одержаний ВІДПОВІДНО ДО способу за п 15, причому в молекулі TNFR1-lgGi молярне відношення сіалової кислоти і Nацетилглюкозамшу складає приблизно від 0,35 до 0,5 23 Препарат за п 22, який відрізняється тим, що молярне відношення сіалової кислоти і Nацетилглюкозамшу складає приблизно від 0,39 до 0,45 Даний винахід відноситься до способів контролю вмісту сіалової кислоти в глікопротеїнух.продукованих в культурі клітин ссавця Винахід відноситься до способів, що дозволяють збільшувати і зменшувати вміст сіалової кислоти в глікопротешух,продукованих в культурі клітин ссавця Крім того, винахід відноситься до способів отримання химер, що складаються з рецептора чинника некрозу nyxnnHH(TNFR) і імуноглобулшу (Ig), a також до нових препаратів на основі TNFR - IgGi і до їхнього застосування для діагностики і лікування різноманітних запальних захворювань і імунних розладів зилювання глікопротешів, отриманих рекомбшантним шляхом, є предметом підвищеного інтересу вчених, оскільки припускається, що отримані рекомбшантні протеїни можуть знайти застосування в медицині для профілактики і терапії хвороб Олігосахаридні бокові ланцюги глікопротешів виявляють вплив на функцію npoTeiHiB[Wittwer А і Howard S С ,(1990) Biochem , 29 4175 - 4180], на внутрішньомолекулярні взаємодії між частинами глікопротешу, що визначають конформацію, і обумовлюють третичну структуру глікопротешу [Hart,(1992) Curr Op Cell Biol , 4 1017 -1023, Goochee і В НИНІШНІЙ час ВІДМІННОСТІ в характерах гліко 47428 ін (1991) Bio/Technology, 9 1347 - 1355, Parekh R B ( 1 9 9 1 ) C u r r Op Struct Biol , 1 7 5 0 - 7 5 4 ] Олігосахариди також можуть служити для орієнтації даного поліпептиду по відношенню до певних структур за допомогою специфічних клітинних вуглеводних рецепторів[ВеуіІасриа М Р і Nelson R М , (1993) J d i n Invest 91 379 - 387, Nelson R M І ін ,(1993) J d m Invest 91 1157 - 1166, Norgard К Е І ін ,(1993) Proc Nail Acad Sci USA, 90 1068 - 1072, Imai Y І ш ,(1993) Nature 361 555 - 557] Кінцевий компонент - сіалова кислота - в олігосахаридному боковому ланцюзі глікопротешу виявляє вплив на абсорбцію, період напіввиведення з сироватки і на кліренс з сироватки, а також на фізичні, ХІМІЧНІ і імуногенні властивості глікопротешу [Parekh R В, див вище, Varki A,(1993) Glycobiotogy, 3 97 - 100, Paulson J ,(1989) TIBS, 14 272 - 276, Goochee і ш,(1991) Biotechnology, 9 1347 - 1355, Kobata A ,(1992) Eur J Biochem,, 209 483 - 501] Отже, важливо підтримувати певний вміст сіалової кислоти в глікопротеїнух, зокрема в таких протеїнух, що призначені для застосування як терапевтичні засоби Велика увага була приділена чинникам, що впливають на глікозилювання в процесі продукування рекомбінантного протеїну, таким, як спосіб вирощування(адгезивний або суспензійний), наявність в складі середовища фетальної бичачої сироватки, ЩІЛЬНІСТЬ середовища, насичення киснем, значення рН, схеми очистки і т п [Wermer R І Noe W (1993) Drug Res , 4 3 1134 - 1249, Hayter і ін ,(1992) Biotech and Bioeng , 39 327 - 335, Borys і IH ,(1994) Biotech and Bioeng , 43 505 - 514, Borys і IH ,(1993) Bio/technology, II 720 - 724, Hearing і I H , , ( 1 9 8 9 ) J Cell BioL, 108 339 - 353, Goochee і IH , в Frontiers in Bioprocessmg II, під ред Todd і IH ,(1992) American Chemical Society, С 199 - 240, патент США 5096816, ChotigeatW ,(1994) Cytotech , 15 217 - 221] Декілька груп ДОСЛІДНИКІВ вивчали вплив параметрів середовища, при культивуванні на якому продукуються рекомбінантні протеїни, і, зокрема, вплив складу середовища на продукування рекомбінантних протешів[Рагк і ш ,(1992) Biotech and Bioeng , 40 686 - 696, Сох і McClure,(1983) In Vitro, 19 1 - 6 , Mizutam і IH ,(1992) Biochem Biophys Res Comm , 187 664 669, Le Gros і IH ,(1985) Lymph R e s , 4(3) 221 227] Відомо, ЩО додання алканових кислот, таких, як олійна кислота, викликає нестійку експресію чужорідної ДНК в рекомбінантніи культурі кліTHH[Prasad і Smha(1976) In Vitro, 12 1 2 5 - 1 3 2 , заявка на патент Японії 62 - 18936, заявка на патент Японії 55 - 150440, Klehr і ш ,(1992) Biochem , 31 3222 - 3229, German і Howard(1983) Nucleic Acid Res , 11 7631 - 7648] Однак бутират натрію по різному діє на експресію гена в залежності від Л І НІЙ КЛІТИН і складів середовища[О'Аппа і ш ,(1980) Biochem, 19 2656 - 2671, Hagopian Н К,(1977) Cell, 12 855 - 860] і на продукування протеїHy[Milhaud(1980) J Cell Physiol 104 163 - 170, заявка на патент Великобританії GB 2122207A], дозволяючи припустити, що бутират може модифікувати[Уиап і ш ,(1985) J Biol Chem , 3778 - 3783] або інгібувати експресію певних генів[Уиап і ш , див вище] В європейській заявці 0239292В1 описаний спосіб підсилення продукування протеїну в присутності алканової кислоти, такий, як олійна кислота або її солі Однак в літературі є невелика КІЛЬКІСТЬ даних про підбір ВІДПОВІДНИХ концентрацій такої добавки, але однак відсутні дані про вплив добавки на глікозилювання протеїну В інших публікаціях описано, що додання низьких концентрацій(0 1,5мМ) бутирату натрію в середовище для культивування клітин з метою збільшення питомої клітинної продуктивності призводить до супутнього збільшення КІЛЬКОСТІ кислих глікоформ(що відповідає збільшенню вмісту сіаловрі кислоти) одержуваного рекомбінантного протеїну [Chotigeat і ш ,(1994) Cytotech 15 217-221] Декілька груп ДОСЛІДНИКІВ вивчали вплив осмоляльності на клітинне зростання і продукування nonmenTHfly[Ozturk і Palsson,(1991) Biotech and Bioeng , 37 989 - 993, Stubblefield і IH ,(1960) Cancer Research, 20 1646 - 1655, Garcia - Perez і I H , ( 1 9 8 9 ) Journal of Biological Chemistry, 264(28) 16815 - 16821, Miner і IH ,(1981) Invasion Metastasis, 1 158 - 174, патент Великобританії 2251249, європейська заявка 481791, патент США 5151359, патент США 4724206, патент США 5122469, і W O 89/04867] Були запропоновані різноманітні діапазони осмоляльності для зростання клітин або для продукування поліпептиду В цілому, осмоляльність середовища для культури клітин збільшують за допомогою додання NaCI або амінокислот Стрес, пов'язаний з навколишнім середовищем, наприклад, збільшення концентрацій солей, в деяких випадках призводить до збільшення продукування клітинного продукту Було висловлене припущення про те, що підвищена експресія в культурах клітин ссавця таких продуктів, як протеїн ссавця, може бути досягнута за допомогою стресу, викликаного розчиненими речовинами, наприклад, шляхом додання в живильне середовище солі, молочної кислоти, аміаку[міжнародна заявка W O 89/04867] Такі стреси звичайно інгібують зростання, але сприяють питомій КЛІТИННІЙ продуктивності Інші дослідники обговорювали вплив концентрації глюкози на зростання клітин і/або продукування поліпептиду в рекомбінантніи культурі клітин див , наприклад, Park і ш ,(1992) Biotechnology and Bioengineenng, 40 686 - 696, Huang і ш ,(1991) Journal of Biotechnology, 18 161 - 162, ЕР 387840, Reuveny і IH ,(1986) Journal of Immunological Methods, 86 53 - 59, Fine і IH ,(1976) In Vitro, 12(10) 693 - 7 0 1 , Dirck і IH ,(1987) Exp Eye Res , 44 951 958, Mizutam і IH ,(1992) Biochemical and Biophysical Research Communications, 187(2) 664 - 669, Sugiura,(1992) Biotechnology and Bioengineenng, 39 953 - 959, W O 88/01643, Graf і ш ,(1989) DECHEMA Biotechnol Conf, 3 615 - 618, заявка на патент Японії JP 1 - 101882, патент США 3926723, W O 87/00195, і Fleischaker J r , Ph D Thesis, Massachusetts Institute of Technology, С 196 229(червень 1982) Однак в попередніх дослідженнях не був вивчений вплив різноманітних параметрів процесу на вміст сіалової кислоти в зрілому протеїні, тобто чинника в продукуванні глікопротешу, що рівноцінний клшичному успіху Даний винахід відноситься до способів конт 47428 ролю вмісту сіалової кислоти в глікопротешах, продукованих в культурі клітин ссавця Стисле викладення суті винаходу Згідно З винаходом було встановлено, що певні параметри процесу при культивуванні клітин ссавця виявляють вплив на питому клітинну продуктивність, а також на ступінь і тип глікозилювання продукованих протеїнів Зокрема, було виявлено, що певні чинники, які посилюють питому клітинну продуктивність, виявляють зворотний вплив на вміст сіалової кислоти в продукованому протеїні Таким чином, згідно з даним винаходом пропонуються різноманітні способи культивування клітин, які сприяють збільшенню певних глікоформ глікопротешів, продукованих в культурі клітин ссавця Отже, винахід відноситься до способу контролю вмісту сіалової кислоти глікопротешу, продукованого культурою клітин ссавця ВІДПОВІДНО ДО цього предмету винаходу зміна швидкості продукування глікопротешу в фазі продукування цього протеїну культурою клітин призводить до змін у ЗМІСТІ сіалової кислоти в зрілому протеїні Зокрема, збільшення питомої клітинної продуктивності під час фази продукування глікопротешу призводить до зменшення вмісту сіалової кислоти в зрілому протеїні і, навпаки, зниження питомої клітинної продуктивності призводить до збільшення вмісту сіалової кислоти в зрілому протеїні Даний винахід відноситься далі до зміни питомої клітинної продуктивності при використанні як клітини - господаря, якою є клітина ссавця, під час фази продукування протеїну в культурі клітин ссавця шляхом контролю за чинниками, що виявляють вплив на питому клітинну продуктивність ВІДПОВІДНО до одного з варіантів контролюють концентрацію чинників, що посилюють транскрипцію ДНК В іншому варіанті виконання контролюють питому клітинну продуктивність, підтримуючи осмоляльність культури клітин в певних межах Згідно З винаходом контролюють будь - які згадані вище параметри - окремо або в комбінації - з метою впливати на вміст сіалової кислоти в зрілому глікопротеші В одному з варіантів виконання даного винаходу чинником, що посилює транскрипцію ДНК, є алканова кислота або її сіль, така, як бутират натрію, в концентрації від приблизно 0,1 мМ до приблизно 20мМ Згідно ще з одним з варіантів осмоляльність культури клітин підтримують приблизно від 250 до 600 мосмолей В іншому варіанті температуру культури клітин підтримують приблизно на рівні ЗО - 37°С Винахід також належить до способу збільшення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеші, продукованому культурою клітин ссавця, який містить підтримання зниженої питомої клітинної продуктивності шляхом контролю будь - якого або всіх зазначених вище параметрів процесу, необов'язково разом з іншими параметрами, відомими в даній галузі техніки Згідно з переважним варіантом клітину - господаря культивують при концентрації алканової кислоти або и солі від приблизно 0,1 мМ до приблизно 6мМ і необов'язково при одночасному підтриманні осмоляльності культури клітин на рівні приблизно 300 - 450 мосмолей, що призводить до отримання протеїну зі збільшеним 8 вмістом сіалової кислоти Винахід далі належить до способу зменшення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеші, що продукується культурою клітин ссавця, який включає збільшення питомої клітинної продуктивності культури клітин У переважному варіанті питому клітинну продуктивність підвищують за допомогою процесу культивування клітин, що містить будь який з наступних способів культивування клітини господаря при концентрації алканової кислоти або и солі від приблизно 6мМ до приблизно 12мМ і підтримання осмоляльності культури клітин на рівні приблизно 450 - бООмосмолей Крім того, ВІДПОВІДНО до винаходу пропонується метод культивування клітин з використанням трьох фаз культури клітин Таким чином, винахід відноситься до способу контролю вмісту глікопротешу, продукованого культурою клітин ссавця, що містить стадії культивування клітини - господаря, експресуючої протеїн у фазі зростання, впродовж такого періоду часу і в таких умовах, щоб забезпечити максимальне зростання клітин ВІДПОВІДНО ДО цього за фазою зростання йде перехідна фаза, під час якої вибирають і встановлюють параметри культивування клітин, необхідні для отримання потрібної КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти у зрілому глікопротеші За перехідною фазою йде фаза продукування протеїну культурою клітин, під час якої підтримують параметри, відібрані в перехідній фазі, одержують і виділяють цільовий продукт у вигляді глікопротешу Зміна питомої клітинної продуктивності під час фази продукування культури клітин шляхом додання під час перехідної фази в культуру клітин алканової кислоти або и солі в концентрації від приблизно 0,1 мМ до приблизно 20мМ і підтримання осмоляльності культури клітин на рівні приблизно 250 - бООмосмолей, необов'язково у сполученні цих параметрів один з одним, призводить до отримання протеїну з різними кількостями сіалової кислоти Винахід також відноситься до способу контролю КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти, що присутня в химерному протеїні, що містить рецептор розчинного чинника некрозу пухлини типу I(TNFR1) і імуноглобулш G-i(lgG-i) [TNFR1 - IgG-i] Згідно з винаходом було встановлено, що за певних умов культивування в фазі продукування можуть бути отримані нові препарати на основі глікоформи TNFR1 IgG-i, які виявляютьпотрібні властивості тривалого кліренсу з крові, зберігаючи при цьому функціональну активність Тривалий період напіввиведення цієї речовини при збереженні його функціональної активності дає можливість використовувати спрощене введення необхідної дози у вигляді болюсу і сприяє ефективності in vivo отриманого глікопротешу, що дозволяє застосовувати більш низькі дозовані форми глікопротешу Згідно З ЦИМ способом отримують молекулу глікопротешу TNFR1 - IgG-i, що містить збільшену КІЛЬКІСТЬ залишків сіалової кислоти Параметри культивування клітин в фазі продукування TNFR1 - IgGi відбирають таким чином, щоб отримати потрібну КІЛЬКІСТЬ сіалової кислоти В переважному варіанті в фазі продукування присутній бутират натрію в концентрації від приблизно 01мМ до приблизно 6мМ, а осмоляльність підтримують на 47428 рівні приблизно 300 - 450мосмолей В більш прийнятному варіанті концентрація бутирату натрію складає приблизно 1мМ, а осмоляльність підтримують на рівні приблизно 350 - 400 мосмолей Даний винахід належить також до препарату на основі глікопротешу TNFRI - IgG-i, отриманого за допомогою способу за даним винаходом Згідно з цим пропонується препарат, що містить TNFR1 IgG-i, причому значення рі препарату перебуває в діапазоні приблизно 5,5 - 7,5 Крім того, пропонується препарат на основі TNFR1 - IgG-i, в якому молярне відношення сіалової кислоти до протеїну складає від приблизно 4 до приблизно 7 і переважно від приблизно 5 до приблизно 6 У винаході пропонується далі препарат на основі TNFR1 IgG-i, що має від приблизно 1 до приблизно 2 молей незахищених залишків N - ацетилглюкозамшу на моль протеїну Ще в одному з варіантів молярне відношення сіалової кислоти до N - ацетилглюкозамшу в препараті складає від приблизно 0,35 до приблизно 0,5, переважно від приблизно 0,4 до приблизно 0,45 Даний винахід також належить до терапевтичної композиції, що містить вищезазначений препарат і придатної для лікування патологічних станів, опосередкованих TNF Опис креслень На фіг 1А і 1Б проілюстрований спосіб, що застосовується для обчислення питомої продуктивності при типовому способі культивування клітин в фазі продукування Питома продуктивність може бути виражена в вигляді функції КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин(штеграл по часу (у днях) від життєздатних клітин), ЯК зображено на фіг 1А, або обсяг клітинної маси(РС\/), як зображено на фіг 1Б Питома швидкість продукування дана з 90% довірительним інтервалом На фіг2А і 2Б показана кореляція поміж питомим продукуванням, визначеним на основі інтеграла по часу(у днях) від життєздатних клітин(фіг 2А) і обсяг клітинної маси(РС\/) (фіг 2Б) під час фази продукування, і вмістом сіалової кислоTH(NANA) В отриманому продукті Надані дані для 9 різних процесів (А - РІ) Крапки на графіку являють собою дані незалежних процесів продукування, що описані в таблиці 1 Детальний опис винаходу 1 Визначення У контексті даного опису вуглеводневі фрагменти слід розглядати у ВІДПОВІДНОСТІ З номенклатурою, звичайно застосованної для опису олігосахаридів Обсяг по хімії вуглеводів, в якому використована ця номенклатура, опублікован Hubbard і lvatt,(1981) Ann Rev Biochem , 50 555 583 Ця номенклатура містить, наприклад, значення Man для манози, GlcNAc для 2 - N - ацетилглюкозамина, Gal для галактози, і Glc для глюкози Сіалові кислоти описані у ВІДПОВІДНОСТІ ДО абревіатури NcuNAc для 5 - ацетилнейрамшової кислоти і NeuNGe для 5 - гліколілнейрамшової кислот и ^ ВюІ Chem , 1982, 257 3347, J Biol Chem , 1982, 257 3352) Осмоляльність ЯВЛЯЄ собою міру осмотичного тиску часток розчиненої речовини у водному розчині Частки розчиненої речовини включають як іони, так і неюнізирувані молекули Осмоляльність 10 проявляють у вигляді концентрації осмотично активних часток(тобто осмолей), розчинених в 1кг розчина(1мосмоль/кг НгО при 38°С еквівалентний осмотичному тиску 19мм ртст) В протилежність цьому осмолярність означає КІЛЬКІСТЬ часток розчиненої речовини, що розчинений в 1л розчина У контексті цього опису абревіатура мосмолі означає КІЛЬКІСТЬ в міллюмолях/кг розчина В контексті цього опису поняття глікопротеш звичайно відноситься до пептидів і протешум, що містять більш приблизно десяти амінокислот і по крайній мірі одну олісахаридний боковий ланцюг Глікопротеши можуть бути гомологічними КЛІТИНІ господарю, або переважно вони є гетеролопчними, тобто чужорідними по відношенню до використовуючої клітини - господарю, як наприклад, у випадку протеїну людини, що продукується клітиною яічника китайського хом'яка Переважно використовують глікопротеши ссавця(глікопротеши, первісно виділені з організму ссавця), найбільш переважно такі, які безпосередньо виділяються в живильне середовище Приклади глікопротешів ссавця містять такі молекули, як цитокши і їх рецептори, а також химерні протеїни, що містять цитокши або їх рецептори [TNFR-1, ЕР 417563, публікація 20 березня 1991, і TNFR-2, ЕР 417014, публікація 20 березня і991] і їх похідни, ренін, гормон росту, в тому числі гормон росту людини і бичий гормон росту, фактор, що визволяє гормон росту, паратірсоїдний гормон, тиреотропний гормон, ліпопротеши, альфа-1-антитрицеш, А-ланцюг інсуліну, В ланцюг шсулша, прошсулш, фолікулостимуліруючий гормон, кальцитонш, лютешізируючий гормон, глюкагон, чинники звертання крові, такі, як чинник VDC, чинник П, тканевий чинник і чинник фон Віллебрандса, чинники, що перешкоджає звертанню крові, такі, як протеїн С, пересерцевий натріуретичний чинник, поверхнево-активна речовина, що утворює мономолекулярний шар на альвеолярній поверні легень, активатор плазміногену, такий, як урокшаза або активатор плазміногену сечі людини або тканевоспецефічнии активатор плазмшогена(1:-РА), бомбезин, тромбш, гемопоетичний чинник росту, енкефалшаза, RANTES(кoнтpoлюючий активність експресії і серекцм у нормальних Т-клітин), запалювальний протеїн макрофага людини(МІР-і-альфа), сивороточний альбумін, такий, як сивороточний альбумін людини, мулеріан-шпбуюча речовина, А-ланцюг релаксину, прорелаксин, щуровий пептид, що зв'язан з гонадотропшом, мікробний протеїн, такий, як бета-л актам аза, ДНКаза, інпбш, активш, судинний ендотеліальний чинник зростання(\/ЕСР), чинники зростання рецепторів гормонів, штегрш, протеїн А або D, ревматоїдні чинники, нейротропний чинник, такий, як кістковий нейротропний 4HHHHK(BDNF), нейротропні - 3, - 4, - 5 або - 6(NT-3, NT-4, NT-5 або NT-6), або чинник зростання нерву, такий, як NGF-p, тромбоцитарний чинник зростання(РОСР), чинник зростання фібробласта, такий, як aFGF 1 bFGF, епідермальний чинник зростання(ЕСР), чинник, що трансформує зростання(ТСР), такий, як TGF-альфа і TGF-бета, включаючи TGF-p1, TGF-[32, TGF-рЗ, TGF-p4 або TGF-p5, шсулшоподібний чинник зростання-ПіП(ЮР-1 і IGF-11), зв'язувальні протеїни шсулшоподібного чинника зрос 12 11 47428 тання des(1-3)-IGF-1 (IGF-1 мозку), CD-протеши, трансформувалася почки ембріона людини(293такі, як CD-3, CD-4, CD-8 і CD-19, еритропоетин, клітини або 293-клітини, субклонирування для зроостеоіндуктивні чинники, іммунотоксини, морфогестання в суспензійної культурі, Graham і ін , J Gen нетичний протеїн кістки(ВМР), інтерферон, такий, Virol , 36 59 [1977]), клітини почки детениша хом'яяк штерферон-альфа, бета і гама, колонієстимука(ВНК, АТСС CCL 10), клітини Сертоли миши л ю ю ч і 4 H H H H K H ( C S F ) , наприклад, M-CSF, G M - C S F і [ГМ4, Mather, Biol Reprod , 23 243-251 [1980]], G-CSF, штерлейкши(1 L), наприклад, від 1L-1 до клітини почки мавпи(С\/І, АТСС CCL 70), клітини 1L-10, супероксиддисмутаза, рецептори Т-клітин, почки африканської зеленої мартишки(\/ЕРО-76, протеїни поверхні мембрани, прискорюючий розАТТС CRL-1587), клітини цервикальної карциноми клад чинник, вірусний антиген, такий, як, наприлюдини(НЕІ_А, АТСС CCL 2), клітини почки собаклад, фрагмент оболонки вірусу СНІД, транспортні KH(MDCK, АТСС CCL 34), клітини печінки крисипротеїни, 'хомшг'-'рецептори, аддрессіни, регулябуйвола(ВРІ_ ЗА, АТСС CRL 1442), клітини легкої торні протеїни, антитіла, химерні протеїни, такі, як людини(\Л/138, АТСС CCL 75), клітини печінки люіммуноадгезши, і фрагменти будь-яких перераходини(Нер G2, НВ 8065), клітини пухлини молочної ваних вище поліпептидів залози миши(ММТ 060562, АТСС CCL 51), TRIклітини(МаШег і ш Annals N Y Acad ScL, 383 44Поняття "середовище для культури клітин" І 68И982]), MRC 5-клітини, FS4-KAeTKH, і ЛІНІЮ ге"культуральне середовище" належать до поживнопатоми людини(Нер G2) го розчину, що застосовується для росту клітин ссавця Це середовище звичайно містить принаймні один компонент, вибраний з однієї або декількох наступних категорій 1) джерело енергії, звичайно в формі вуглеводу, такого, як глюкоза, 2) всі незамінні амінокислоти і звичайно основний набір з двадцятих амінокислот плюс цистеїн, 3) вітаміни і/або ІНШІ органічні сполуки, необхідні в низьких концентрациях, 4) ВІЛЬНІ жирні кислоти, 5) мікроелементи, причому під поняттям "мікроелементи" розуміють неорганичні сполуки або елементи, що зустрічаються в природніх умовах, які звичайно необхідні в дуже низьких концентраціях, звичайно близьких до мікромолярного рівня Поживний розчин необов'язково може бути доповнений одним або декількома компонентами, обраними з однієї з таких категорій 1) гормони і ІНШІ чинники росту, такі, як, наприклад, інсулін, трансферин і епідермальний чинник росту, 2) солі і буфери, такі, як, наприклад, тіб що включають кальций, магній і фосфат, 3) нуклеозіди і основи, такі, як, наприклад, аденозін, ТІМІДІН і ппоксантш, 4) білкові і тканинні гідролізати Поняття "клітина-хазяїн, що являє собою клітину ссавця", "клітина-хазяїн", "клітина ссавця" і т п належить до ЛІНІЙ КЛІТИН З ссавців, які при умі щенні їх або в моношарову культуру, або в суспензюнну культуру здатні рости і виживати в середовищі, що містить ВІДПОВІДНІ поживні речовини і чинники росту Необхідні чинники росту для конкретної лінії клітин легко виозначає емпіричним шляхом, не проводячи великої КІЛЬКОСТІ експериментів, на основі даних, викладених, наприклад, в Mammalian Cell Culture [ред Mather J P , Plenum Press, N Y [1984], і у Barnes і Sato, (1980) Cell, 22 649] Як правило, клітини здатні експресувати і секретувати великі КІЛЬКОСТІ певного глікопротешу, що становить інтерес, в культуральне середовище Приклади придатних клітин-хазяєв, якими є клітини ссавців, в контексті даного винаходу включають клітини яичника китайського хом'яка/-ВНРК [(СНО, Unaub і Chasm, Proc Natl Acad Sci USA, 77 4216 [1980], клітини лінії dpl2 СНО [ЕР 307247, публікація 15 березня 1989], ЛІНІЮ ПОЧКИ мавпи CVI, SV40 [COS-7, АТСС CRL 1651], ЛІНІЮ ,ЩО Переважні клітини-господарі включають клітини яічника китайського хом'яка/-ВНРР [СНО, Unaub і Chasm, Proc Natl Acad Sci USA, 77 4216 [1980]], клітини лінії dpl2 СНО [ЕР 307247, публікація 15 березня 1989] Під ПОНЯТТЯМ "пептон" в контексті даного винаходу розуміють додаток до середовища, який являє собою сильно пдролізований тваринний протеїн Джерелом цього протеїну можуть бути тваринні відходи зі скотобоен, очищений желатин або рослинний матеріал Протеїн звичайно пдролізують, використовуючи кислоту, нагрівання або різноманітні ферментні препарати Переважними пептонними сумішами є, наприклад, "Pnmatone RL" і "Pnmatone Н3"(обидві є комерційно доступними(фірма Sheffield, Великобританія)) "Питома клітинна продуктивність", "питома швидкість продукування протеїну кліткою" і т п в контексті даного опису означає питому, тобто в перерахунку на клітину або на одиницю клітинної маси або обсягу, швидкість експресії продукту Питому клітинну продуктивність вимірюють, наприклад, в грамах протеїну, що продукується кліткою в день Питому клітинну продуктивність зручно вимірювати в ВІДПОВІДНОСТІ з наступним інтегральним способом dP/dt=qpXa6o P=qPJXdt, де q D означає константу питомої клітинної продуктивності, X означає КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН або ек віваленти обсягу клітин або маси клітин, a dP/dt означає швидкість продукування протеїну Отже, величина q D може бути отримана з графіка залежності концентрації продукту від шнтегралу по часу від жизнеспособних miTHH(JXdt являє собою "інтеграл по часу(в днях) від життєздатних клітин") ВІДПОВІДНО ДО З ЦІЄЮ формулою, якщо побудувати графік залежності КІЛЬКОСТІ виробленого глікопротешового продукту від інтегралу по часу(в днях) від життєздатних клітин, то тангенс куту наклона буде рівний питомої швидкості експресії продукту клітиною Життєздатні клітини можна визначити різноманітними вимірами, наприклад, за допомогою вимірів біомаси, швидкості вбирання Ог, лактатдепдрогенази(ЮН), обсягу клітинної маси або мутности до "Фаза зростання" культури клітин відноситься періоду експоненциального зростання клі 14 13 47428 тин(логарифмічна фаза), під час якої клітини звикислоти є олійна кислота, а відповідна їй сіль явчайно швидко діляться Під час цієї фази клітини ляє собою бутират натрію культивирують впродовж певного періоду часу, II Способи культивування клітин звичайно складає 1 - 4 дня, і в таких умовах, при Згідно винаходу було встановлене, що чиннияких відбувається максимальне клітинне зростанки, що збільшують питому клітинну продуктивність ня Визначення циклу зростання для клітинипід час фази продукування глікопротешу культугосподаря може бути здійснене для конкретної рою клітин ссавця, виявляють зворотний вплив на передбачуваної клітини-господаря без проведення вміст сіалової кислоти в отриманому глікопротеші великої КІЛЬКОСТІ експериментів "Період часу і такі Оскільки експресируючі протеїни, що містять один умови, при яких відбувається максимальне клітинабо декілька залишків сіалової кислоти на один не зростання" і т п відносяться до таких умов складний олігосахаридний фрагмент, характерикультивування, в відношенні яких встановлене, що зуються in vivo більш тривалим часом кліренса, для конкретної лінії клітин вони є оптимальними той час кліренса продукуємого глікопротешу мождля зростання і ділення клітин Під час фази зросна змінювати в широких межах, варіюючи рівень тання клітини культивирують в живильному сересіалілірування препарату в цілому Даний винахід довищі, що містить необхідні додатки, звичайно відноситься до способів контролю ступеня сіаліліпри температурі ЗО - 40°С в зволоженій контрорування глікопротешу, продукуємого культурою льованій атмосфері, при якій досягається оптимаклітин ссавця По способу, викладеному в даному льне зростання конкретної лінії клітин Клітини описі, можна точно визначити параметри процесу, вирощують в фазі зростання впродовж періоду що забезпечують необхідний вміст сіалової кислочасу приблизно від одного до чотирьох днів, звити в глікопротеші, продукуємом культурою клітин чайно від двох до трьох днів ссавця "Перехідна фаза" культури клітин відноситься до періоду часу, впродовж якого задаються умови культивування для фази продукування Під час перехідної фази чинники навколишнього середовища, такі, як температура культивування клітин, осмоляльність середовища і т п , зсувають від умов, характерних для зростання, до умов, характерних для продукування "Фаза продукування протеїну" культурою клітин відноситься до періоду часу, впродовж якого зростання клітин вийшло на плато Під час фази продукування закінчене логарифмічне зростання клітин, а основним є продукування протеїну Під час цього періоду часу середовище звичайно доповнюють з метою підтримати безперервне продукування протеїну і отримати необхідний продукт у вигляді глікопротешу Поняття "експресія" або "експресирувати" в контексті даного опису відноситься до транскрипції і трансляції, що відбуваються в клітині-господарі Рівень експресії продукту гена в клітині-господарі може бути визначений на основі або КІЛЬКОСТІ ВІДПОВІДНІЙ мРНК, що присутній в КЛІТИНІ, або КІЛЬКІСТЬ протеїну, кодируемого геном, що продукується клітиною Наприклад, мРНК, транскрибируєму виходячи з гену, доцільно КІЛЬКІСНО оцінювати за допомогою нозерн-пбридизацм [див Sambrook і ін , Molecular Cloning A Laboratory Manual, crop 7 3 7 57, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] Протеїн, кодируємий геном, може бути КІЛЬКІСНО оцінений або на основі аналізу біологічної активності протеїну, або з застосуванням способів, що не залежать від такої активності, такими, як вестерн-блотинг або радиоіммуноаналіз з використанням антитіл, здатних вступати в взаємодію з протеїном [див Sambrook і ш , Molecular Cloning A Laboratory Manual, crop 181 - 18 88, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] Під алкановою кислотою або її сіллю розуміють алканову кислоту з прямим або розгалуженим ланцюгом, насичену або ненасичену, або її сіль Алканова кислота звичайно має від одного до десяти атомів вуглецю, більш переважно від трьох до шести атомів вуглецю Прикладом алканової ВІДПОВІДНО ДО даного винаходу клітинугосподаря ссавця культивують для отримання продукту-глікопротешу, що вивільнюється Загальний вміст сіалової кислоти в глікопротеші контролюють, змінюючи параметри культивування клітин, що діють на питому клітинну продуктивність Чинники, що діють на питому клітинну продуктивність, добре ВІДОМІ в даній області техніки і містять, але не обмежені ними, чинники, що справляють вплив на КІЛЬКІСТЬ копій ДНК/РНК, чинники, що справляють вплив на РНК, такі, як чинники, які стабілізують РНК, живильні речовини і ІНШІ добавки до середовища, концентрацію енхансерів транскрипції, осмоляльність культурального середовища, температуру і рН культивування клітин і т п ВІДПОВІДНО до даного винаходу регулювання цих чинників, окремо або в комбінації, для збільшення питомої клітинної продуктивності призводить до отримання протеїну з пониженим вмістом сіалової кислоти Регулювання цих чинників, окремо або в комбінації, для зменшення питомої клітинної продуктивності призводить до отримання зрілого протеїну з підвищеним вмістом сіалової кислоти Нижче винахід описаний з посиланням на різноманітні, в тому числі добре ВІДОМІ, способи і принципи культивування клітин ВІДПОВІДНО ДО даного винаходу клітини ссавця культивують з отриманням цільового глікопротеїнового продукту При виборі клітини-господаря для отримання глікопротешу згідно з винаходом важливо враховувати, що різноманітні клітинигосподарі мають характерні і специфічні механізми трансляційного і пост-трансляційного процесингу і модифікацм(наприклад, глікозилювання, розщіплення) експресованого протеїну 3 метою забезпечити можливість здійснення потрібних посттрансляційних модифікацій мають бути вибрані ВІДПОВІДНІ лінії клітин В альтернативному варіанті клітини-господарі можуть бути модифіковані таким чином, щоб експресувати потрібний генний продукт, необхідний для специфічної посттрансляційної модифікації Зокрема, клітини ссавця, експресируючі необхідний протеїн, повинні також експресирувати фе 16 15 47428 рменти, або ж вони можуть бути видозмінені тами зростання(такими, як інсулін, трансферин або ким чином, щоб експресирувати конкретні фермеепідермальний чинник зростання), солями(такими, нти, що при ВІДПОВІДНИХ умовах, наведених в даяк хлорид натрію, кальцію, магнію і фосфат), Буному описі, можуть здійснювати in vivo відповідну ферами(такими, як HEPES), нуклеозидами(такими, пост-трансляційну модифікацію Ферменти вклюяк аденозин і тимідин), антибютиками(такими, як чають такі, необхідні для доповнення і добудовуліки гентамицин™), мікроелементами(під якими вання N - і О - зв'язаних вуглеводів, таких, як опирозуміють неорганічні сполучення, звичайно присані вище у Hubbard і Ivan для N - зчеплених сутні в кінцевих концентраціях, близьких до мікроолігосахаридів Ферменти необов'язково включамолярного рівня), ліпідами(такими, як лшолеинова ють олігосахарил-трансферазу, альфаабо ІНШІ жирні кислоти) і ВІДПОВІДНИМИ їм носіями, глюкозидазу і, альфа-глюкозидазу II, ER - альфа а також глюкозою або еквівалентним їй джерелом (1 2) манозидазу, Гольджи альфа-манодазу 1, N енергії Можуть бути також включені в ВІДПОВІДНИХ ацетилглюкозамшіл-трансферазу 1, Гольджи альконцентраціях будь-які ІНШІ необхідні додатки, що фа-манодазу 1, N ацетилглюкозамшілВІДОМІ в даній області техніки трансферазу II, альфа(1 6) фукозилтрансферазу і В одному з варіантів здійснення клітинаР (1 4) галактозилтрансферазу Крім того, клітинагосподар, якою є клітина ссавця, являє собою клітгосподар може експресирувати відповідну сіалілтку СНО, більш прийнятну клітку dp12 CHO, а прирансферазу(як частина генома клітини-господаря), датна середа містить основний компонент середи, що, певно, може приєднувати кінцеву сіалову кистакий, як склад на основі DMEM/HAM F - 12[склад лоту в певному положенні і утворювати зв'язок сред DMEM і НАМ F - 12см, наприклад, в розділі Клітка-господар необов'язково може бути сконстпро композиціях культуральних середовищ в руйована таким чином, щоб експресирувати ВІДПОAmerican Type Culture Collection Catalogue of Cell ВІДНІ сіалілтрансферази за допомогою, наприклад, Lines and Hybndomas, 6 - є изд , 1988, crop 346 трансфекцм клітини-господаря ДНК, кодируючої 349] [найбільш придатний склад середовища, описіалілтрансферазу саний в патенті США 5122469], зі зміненими кон Слід очікувати, що описані вище сіалілтрансферази можуть приєднувати залишок кінцевої сіалової кислоти до ВІДПОВІДНОГО олігосахаридному ядра, такого, як Galpl - 4GlcNAc ВІДПОВІДНІ сіалілтрансферази в контексті даного винаходу включають такі сіалілтрансферази, які каталізують комплексне сіаліліровання і розгалуження N - і О зв'язані олігосахаридів, але не обмежені ними Для культивування клітин ссавців, експресируючих необхідний протеїн і здатних додавати необхідні вуглеводи в певному положенні і утворювати зв'язок, можуть використовуватися численні умови культивування, при цьому слід приділяти особливу увага тому, що клітина-господар підлягає культивируванню Придатні умови культивування для клітин ссавця добре ВІДОМІ В даній області техніки^ Immunol Methods (i983), 56 221 - 234] або можуть бути легко визначені фахівцем в даній області техніки [див, наприклад, Animal Cell Culture A Practical Approach, 2-е вид , ред Rickwood D I Hames В D , Oxford University Press, New York (1992)] і варіюються в ВІДПОВІДНОСТІ З конкретною вибраною клітиною- господарем Культуру клітин ссавця за даним винаходом одержують в середовищі, придатному для конкретної клітини, що підлягає культивируванню Прикладами живільних розчинів є комерційно доступні середовища, такі, як середа Хама FIO [НАМ F 10](фірма Sigma), мінімальна середа ,що підтримує([МЕМ], фірма Sigma), RPMI - 1640(фірма Sigma), по способу Дульбекко середа ,що модифікувалася Hma([DMEM], фірма Sigma) Крім того, як культуральне середовище може використовуватися будь-яке з середовищ, описаних у Ham і Wallace,(1979) Meth Enz , 58 44, Barnes i Sato, (1980) Anal Biochem , 102 255, в патентах США 4767704, 4657866, 4927762, 5122469 або 4560655, в WO 90/03430 і WO 87/00195, опис всіх означених публікацій включене в НИНІШНІЙ ОПИС ЯК заслання Будь-яке з цих середовищ при необхідності може бути доповнене гормонами і/або іншими чинника центраціями деяких компонентів, таких, як амінокислоти, солі, цукру і вітаміни, і необов'язково містить гліцин, гіпоксантин і тимідин, рекомбинантний людський інсулін, пдролізований пептон, такий, як Pnmatone HS або Pnmatone RL^ipMa Sheffield, Великобританія) або еквівалентний їм, захисну клітку агент, такий, як Pluromc F68, або еквівалентний плуронієвий полюл, гентаміцин, і мікроелементи Глікопротеши за даним винаходом можуть продуцируватися зростаючими клітинами, що експресують необхідний протеїн в різноманітних умовах культивування клітин Наприклад, для здійснення даного винаходу потенційно придатні спосіби культивування клітин як для крупномасштабного, так і для маломасштабного отримання протеїнів Способи включають, але не обмежені ними, використання бюреактора з псевдоожиженним шаром, бюреактора з системою полих волокон, культивування в роллерфлаконі або ж може застосовуватися бюреакторна система на основі резервуару з мішалкою, причому дві останні системи можуть бути з мікроносіями або без них і їх використають для здійснення винаходи або в періодичному режимі, або в періодичному режимі з підживленням, або в безперервному режимі В найбільш переважному варіанті здійснення культивування клітин за даним винаходом проводять в бюреакторній системі на основі резервуару з мішалкою, використовуючи при цьому періодичний режим з підживленням В найбільш переважному варіанті культивування в такому режимі клітини-господарі, якими є клітини ссавця, і культуральне середовище спочатку вносять в судину для культивування і в процесі культивування в культуру безупинно або дискретними порціями додають додаткові ЖИВІЛЬНІ речовини для культури, здійснюючи(або не здійснюючи) періодичний збір клітин і/або продукту до закінчення культивування Культивирування в режимі з підживленням може включати, наприклад, напівнепреривне куль 17 47428 18 тивування з підживленням, при якому всю культувміст сіалової кислоти ру(включаючи клітини і середу) періодично вилуДля підвищення вмісту сіалової кислоти в зрічають і замінюють свіжим середовищем Культилому глікопротеші звичайно використають більш вування в режимі з підживленням відрізняється від низькі концентрації енхансера транскрипції Більш культивування в періодичному режимі, при якому низькі концентрації призводять до підсилення всі компоненти для культивування клітранскрипції, але забезпечують більш низьку питин(включаючи клітини і живильні речовини культому клітинну продуктивність, підтримуючи однак тури) вносять в судину для культивування напочажиттєздатність культури клітини-господаря Звитку процесу культивування Крім того, чайно використані концентрації енхансера транскультивування в режимі з підживленням відрізнякрипції, такого, як бутират натрію, складають від ється від культивування спосібом перфузм тим, що приблизно 0,1 мМ до приблизно 8мМ В найбільш супернатант не вилучають з судини для культивупереважному варіанті концентрації складають від вання під час процесу(при культивуванні способом приблизно ЮмМ до приблизно бОмМ Згідно з ще перфузм клітини імобілізують в культурі, наприодним варіантом здійснення використають конценклад, шляхом фільтрації, шкапсулірування, зв'язутрацію бутирата натрію приблизно 6мМ В іншому вання з мікроносіями тощо, а культуральне сереваріанті здійснення використають концентрацію довище беззупинно або періодично вводять і бутирата натрію приблизно 1мМ вилучають з судини для культивування) Ще в одному варіанті здійснення одержують глікопротеш з пониженим рівнем сіалової кислоти Крім того, клітини культури можуть бути розВІДПОВІДНО ДО З ЦИМ варіантом клітини ссавця множені в ВІДПОВІДНОСТІ з будь-якою схемою або культивують в умовах, при яких зростає питома спосібом, що можуть бути придатні для конкретної клітинна продуктивність Концентрацію алканової клітини-господаря і конкретного передбачуваного кислоти або іншого ВІДПОВІДНОГО енхансера трансплану отримання продукту Отже, НИНІШНІЙ винахід крипції вибирають далі таким чином, щоб завдяки припускає використання одностадійного або багазбільшеної питомій КЛІТИННІЙ продуктивності одертостадійного процесу культивування При одножувати протеїн з необхідним профілем сиалових стадійному культивуванні клітини-господарі внокислот В найбільш переважному варіанті конценсять в середовище для культивування, а обробку трація алканової кислоти або солі складає приза данним винаходом здійснюють під час єдиної близно від 5 до 20мМ і найбільш переважно прифази продукування продукту культурою клітин В близно від 6мМ до 12мМ В другм варіанті альтернативному варіанті припускається багатоконцентрація бутирата натрію складає приблизно стадійне культивування При багатостадійному 1 2мМ культивуванні клітини можна культивувати з використанням декількох стадій або фаз Наприклад, Визначення відповідної концентрації енхансеклітини можуть бути вирощені на першій стадії або ра транскрипції, такого, як алканова кислота або и в фазі зростання, коли клітини, можливо отримансіль, може бути здійснене в ВІДПОВІДНОСТІ з фіг 2, а ня з банку, вносять в середу, придатну для стимутакож з таблицею 1, наведеної нижче в прикладі 1 лювання зростання і високої життездібності КлітиВІДПОВІДНО ДО З НИНІШНІМ винаходом більш низькі ни можна підтримувати в фазі зростання впродовж концентрації бутирата натрію звичайно призводять необхідного періоду часу, додаючи свіже середодо пониженої питомої клітинної продуктивності вище до культури клітини-господаря ВІДПОВІДНО ДО З винаходом концентрації бутирата ВІДПОВІДНО ДО З переважним варіантом для підсилення зростання клітин ссавця в фазі зростання культури клітин запропоновані умови культивування в режимі з підживленням або в безперервному режимі В фазі алканова кислота може являти собою будь-яку з алканових кислот з прямим або розгалуженим ланцюгом, що посилює транскрипцію протеїнів ссавця В переважному варіанті здійснення алканова кислота являє собою олійну кислоту, а її сіллю переважно є бутират натрію ВІДПОВІДНО ДО З НИНІШНІМ винаходом контро люють концентрацію бутирата натрію з метою контролювати питому клітинну продуктивність Використають концентрації бутирата натрію від 0,1 до 20мМ і змінюють їх в залежності від конкретної культивируючої клітини-господаря і необхідного вмісту сіалової кислоти в одержуваному глікопротеїні Для отримання протеїну з необхідним вмістом сіалової кислоти вибирають таку концентрацію бутирата натрію, що забезпечує найбільш високу питому клітинну продуктивність з найбільш переважним профілем сіалових кислот Таким чином, в ВІДПОВІДНОСТІ з НИНІШНІМ винаходом концентрації енхансера транскрипції, такого, як бутират натрію, вибирають таким чином, щоб отримати необхідний натрію вибирають, зважаючи на ІНШІ параметри процесу, такі, як осмоляльність в фазі продукування Як описане більш докладно нижче, осмоляльність може впливати на питому клітинну продуктивність Концентрації бутирата вибирають з урахуванням конкретної осмоляльності, що повинна підтримуватися під час фази продукування В альтернативному варіанті для інших клітингосподарів, якими є клітини ссавця, і інших гликопротешов можуть бути отримані невеликі тесткультури, для яких може бути визначена швидкість продукування глікопротешового продукту, тобто питома клітинна продуктивність, і кінцевий вміст сіалової кислоти, що може бути використаний для отримання аналогічних таблиці і графіка, ВІДПОВІДНИХ конкретній культивируемой клітці-господарю, зважаючи на, що зменшення питомої клітинної продуктивності призводить до збільшення вмісту сіалової кислоти в одержуваному глікопротеші Алкановую кислоту або и сіль, таку, як бутират натрію, або інший ВІДПОВІДНИЙ енхансер Транскрипції додають в культуру клітини-господаря під час або приблизно під час, коли починається фаза продукування продукту клітинною культурою Звичайно в процесі культивування до фази продукування застосовують перехідну фазу, під час якої 19 47428 умови культивування клітин, як описане вище, задають таким чином, щоб досягнути необхідної питомої клітинної продуктивності і, отже, необхідного профіля глікоформ Алканову кислоту або її сіль додають по способам, добре відомим в даній області техніки В переважному варіанті бутират натрію додають в вигляді порцм-дози до системи для культивування в напівнеперервному режимі з підживленням разом або без інших ВІДПОВІДНИХ живильних речовин, як це вказане в нинішньому описі або відомо фахівцям в області культур клітин ссавця ВІДПОВІДНО З винаходом в доповнення до зазначених вище чинників здійснюють контроль за осмоляльністью навколишньої середи культури клітини з тієї метою, щоб регулювати ступінь сіалілірування зрілого глікопротешу В одному з варіантів здійснення осмоляльність контролюють з тієї метою, щоб контролювати вміст сіалової кислоти в зрілому протеїні незалежно від інших чинників, що впливають на питому клітинну продуктивність В іншому варіанті осмоляльність контролюють в доповнення до контролю за іншими чинниками, що виявляють вплив на питому клітинну продуктивність В переважному варіанті здійснення контролюють як осмоляльність, так і концентрацію алканової кислоти Осмоляльність навколишньої середи культури клітини контролюють з метою отримати необхідний баланс між питомою клітинної продуктивністю і профілем сіалових кислот утвореного протеїну В цілому, питома клітинна продуктивність зростає з збільшенням осмоляльності Осмоляльність, при якій продукується протеїн з необхідним вмістом сіалової кислоти, вибирають з урахуванням того, що збільшення осмоляльності звичайно призводить до збільшення швидкості продукування конкретного протеїну Для зниження швидкості продукування і підвищення вмісту сіалової кислоти в зрілому глікопротеші осмоляльність звичайно підтримують на більш низькому рівні для конкретного типу культури, що підлягає культивуванню Для культури клітин ссавця осмоляльність культурального середовища звичайно складає приблизно 290 - ЗЗОмосмолей Однак збільшення осмоляльності звичайно призводить до збільшення швидкості продукування протеїнів Осмоляльність вибирають таким чином, щоб швидкість продукування відповідала необхідному профілю продукту Для збільшення КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти понижают швидкість продукування, а осмоляльність звичайно підтримують в більш низьких межах, зважаючи на конкретну клітку, що підлягає культивуванню-господаря Осмоляльність в діапазоні від приблизно 250мосмолей до приблизно 450мосмолей придатна для отримання підвищеного вмісту сіалової кислоти Найбільш переважну осмоляльність підтримують в діапазоні приблизно від 300 до 450мосмолей, ще найпереважно від 350 до 400мосмолей і найбільш переважно на рівні приблизно 400мосмолей Для зменшення вмісту сіалової кислоти вибирають таку осмоляльність, що призводить до підвищення швидкості продукування Згідно даному варіанту осмоляльність підтримують приблизно на рівні 350 - бООмосмолей, більш прийняти на рівні 20 приблизно 450 - 550мосмолей Для фахівця-практика в даній області техніки очевидно, що осмоляльність середовища залежить від концентрації осмотично активних часток в культуральній рідині і що на осмоляльність впливає велика КІЛЬКІСТЬ змінних складових, що входять в складне культуральне середовище для клітини ссавця Початкову осмоляльність культурального середовища визначають по складу культурального середовища Осмоляльність може бути зміряна за допомогою осмометра, наприклад, такого, як що поставляється фірмою Fisher Scientific, Pittsburg, Pennsylvania під маркою OSMETTE(a6o модель Osmette 2007, що поставляється фірмою Precision Systems, Inc , Natick MA) Для отримання осмоляльності в необхідному діапазоні можна регулювати концентрацію різноманітних складових культурального середовища Розчинені речовини, що можуть бути додані в культуральне середовище для підвищення її осмоляльності, включають протеїни, пептиди, амінокислоти, пдролизованние тваринні протеїни, такі, як пептони, неметаболизированние полімери, вітаміни, іони, солі, цукру, метаболіти, органічні кислоти, ЛІПІДИ і т п В одному з варіантів осмоляльність контролюють шляхом додання пептона в культуру клітини разом з іншими компонентами культурального середовища при культивуванні в періодичному режимі з підживленням ВІДПОВІДНО З НИНІШНІМ винаходом осмоляль ність підтримують або доводять до необхідного діапазону шляхом додання, наприклад, основного складу середовища, включаючого в доповнення до пептону амінокислоти і різноманітні солі(наприклад, NaCI) В переважному варіанті здійснення культуральне середовище доповнюють, наприклад, основним культуральним середовищем, що містить надлишок амінокислот [див, наприклад, середовище "Super" в патенті США 5122469], глюкозу і пептон Однак очевидно, що концентрацію (ї) інших складових культурального середовища можна змінювати з метою отримати зазначений вище діапазон осмоляльності Контролюючи або періодичні, або постійно концентрацію, наприклад, глюкози(первинного джерела енергії) в культуральному середовищі в процесі культивування, можна підтримувати осмоляльність середи в необхідному конкретному діапазоні Контроль за концентрацією глюкози сприяє забезпеченню клітин адекватним джерелом вуглецю і водночас контролює продукцію молочною кислоти клітинамигосподарями Перевагою в цьому випадку є те, що при цьому обмежується зменшення значення рН в культурального середовища, що вимагає додання нейтралізаторів(наприклад, підстави, такого, як ЫагСОз або NaOH), що призводить до збільшення осмоляльності Для підтримання осмомоляльності в необхідному інтервалі середовище може бути доповнене в відомих межах в ВІДПОВІДНОСТІ З будь-якою схемою, що застосовується для підтримання культури клітин В переважному варіанті система для культивування являє собою систему культивування в періодичному режимі з підживленням і середу доповнюють підживлючою порцією-дозою під час 21 47428 фази продукування продукту культурою клітин Крім того, середовище може бути доповнене під час фази продукування, як описане нижче В альтернативному варіанті може бути здійснений паралельний порційний відбір зразків культурального середовища Після цього при необхідності осмоляльність культурального середовища може бути модифікована шляхом модуляції підживлюючого розчину Для фахівця в даній області техніки очевидно, що способи культивування клітини за данним винаходом вибирають таким чином, щоб досягнути необхідного рівня сіалілірування одержуваного протеїну В доповнення до наведених в нинішньому описі параметри процесу, що виявляють вплив на ступінь сіалілірування, включають рівень кисня і рівень глюкози На сіалілірування також впливають ЩІЛЬНІСТЬ культури, час і умови зберігання, такі, як температура Мається на увазі, що НИНІШНІЙ винахід включає такі додаткові параметри процесу, що найбільш важливі для збільшення сіалілірування III Відновлення глікопротешу Після фази продукування поліпептиду становлячий інтерес поліпептид виділяють з культурального середовища за допомогою способів, узвичаєних в даній області техніки Цей поліпептид виділяють з культурального середовища в вигляді секретованого поліпептиду, хоча він також може бути виділений з лізатів клітини-господаря На першій стадії культуральне середовище або лізат центрифугують для вилучення часток клітинного дебрису Після ЦЬОГО поліпептид очищують від забруднювачей - розчинених протеїнів і поліпептидів - в ВІДПОВІДНОСТІ з способами, прикладами яких є наступні способи очистки фракціонування за допомогою іммуноафінної хроматографії або на іонообмінних колонках, осадження етанолом, ЖХВР з звернутою фазою, хроматографія на силікагеле або на катюнобмінній смолі, такий, як DEAE, хроматофокусирування, електрофорез в ПААГ-ДСН, осадження сульфатом амонію, гель-фільтрація з використанням, наприклад, Sephadex G-75, і протеїн А-сефарозніколонки для вилучення таких забруднювачей, як IgG Для інгібування протеолітичного розкладу в процесі очистки може бути також доцільним використання протеазного інгібітору, такого, як фенілметилсульфонілфторид(ФМСФ) Для фахівця в даній області техніки очевидно, що може зажадатися модифікація способів очистки поліпептида за рахунок змін характеристик поліпептида при експресії в рекомбінантній культурі клітин Особливо переважними в контексті даного винаходу є способи очистки і процеси, підібрані для вуглеводів по винаходу Необхідні глікоформи за данним винаходом можуть бути збагачені у відношенні молекул, що містять сіалову кислоту, наприклад, шляхом іонообмінної м'якої гельхроматографм або ЖХВР з використанням катюно - або анюнобмінних смол, при яких одержують більш кислі фракції IV Аналіз глікопротешу Комплексну вуглеводну частину глікопротешу, отриманого за допомогою способів за данним ви 22 находом, при необхідності можна легко проаналізувати звичайними способами аналізу вуглеводів Так, наприклад, такі способи, як лектин-блотинг, добре відомий у даній галузі техніки, дозволяє виявити пропорції кінцевої манози або інших цукрів, таких, як галактоза Наявність кінцевих залишків сіалових кислот у олігосахариді з однією, двома, трьома або чотирма боковими гілками може бути підтверджена вивільненням цукрів з протеїну з використанням безводного гідразину або ферментативних способів і фракціонування олігосахаридів іонообмінної хроматографією або гельфільтрацією або за допомогою інших способів, добре відомих у даній галузі техніки Значення рі глікопротешу також можна виміряти до та після обробки нейрамшідазою для вилучення сіалових кислот Збільшення значення рі після обробки нейрамшідазою свідчить про присутність сіалових кислот в глікопротеші Вуглеводні структури за данним винаходом, що входять до складу протеїну, експресувалися у вигляді N - або О-зв'язаних вуглеводів N - і Озв'язані вуглеводні фрагменти в основному відрізняються за будівлею їх ядра N-зв'язане глікозилювання означає приєднання вуглеводневого фрагменту до аспарагінового залишку в пептидному ланцюзі через GlcNAc Усі N-зв'язані вуглеводи мають загальну структуру ядра Мап1 -6(Мап 1 - 3) Мап[31 - 4GlcNAc[31 - 4GlcNAcp - R При цьому в означеній структурі ядра R означає аспарагіновий залишок продукуємого протеїну ПОСЛІДОВНІСТЬ пептидів виробленого протеїну повинна містити аспарапн-Х-серин, аспарапн-Х-треонш і аспарагшХ-цистеш, де X означає будь-яку амінокислоту, за винятком проліну На противагу цьому О-зв'язані вуглеводи характеризуються загальною будівлею ядра, де GalNAc приєднаний до гідроксильної групи треоншу або серину З N- та О-зв'язаних вуглеводів найбільш важливими є складні N - та Озв'язані вуглеводи Такі складні вуглеводи повинні містити структури, які складаються з декількох гілок Для додавання кінцевих сіалових кислот важливі ЗОВНІШНІ моно -, бі -, три- або чотирирозгалудженні структури Такі ЗОВНІШНІ ланцюгові структури забезпечують додаткові місця для приєднання конкретних цукрів та утворення зв'язків, їх містять вуглеводи за данним винаходом Вуглеводи, що утворилися, можуть бути проаналізовані будь-яким способом, який відомий у даній галузі техніки, включаючи способи, що наведені в данному описі Для аналізу глікозилювання відомо декілька методів, які можуть застосовуватися згідно до винаходу Такі методи дозволяють отримати інформацію стосовно ідентичності та складу приєднаного до пептиду олігосахариду Методи аналізу вуглеводів для застосування за данним винаходом включають, але не обмежені ними, лектин-хроматографію, HPAEC-PAD, в якому для розподілу олігосахаридів на основі їх заряду використовується анюнобмшна хроматографія при високому значенні рН, ЯМР, масспектрометрія, ЖХВР, гель-проникаюча хроматографія(ГПХ), аналіз складу моносахаридів, послідовний ферментативний розклад Крім того, ВІДОМІ методи для вивільняння олігосахаридів Ці методи включають 1) фермента 23 47428 тивне вивільнення, яке звичайно проводять з використанням пептид-м-глюкозидази F/ендо-ргалактозидази, 2) р-елімшацію з використанням жорстких лужних умов для вивільнення головним чином О-зв'язаних структур, і 3) ХІМІЧНІ методи, що базуються на використанні безводного гідразину для вивільнення як N -, так і О-зв'язаних олігосахаридів Аналіз може бути здійснений з використанням наступних стадій 1 Діаліз зразка відносно деюнізованої води для вилучення всіх буферних солей з наступною люфілізацією 2 Вивільняння інтактних ланцюгів олігосахариду за допомогою безводного гідразину 3 Обробка інтактних ланцюгів олігосахариду безводним метанольним розчином НСІ для видалення індивідуальних моносахаридів у вигляді Ометильних похідних 4 N-ацетилювання будь - яких первинних аміногруп 5 Утворення похідних з отриманням пер - О триметилсилілметильних ГЛІКОЗИДІВ 6 Розподіл ЦИХ ПОХІДНИХ за допомогою капілярной газо-рідинної хроматографм(ГЖХ) на колонці TnnyCP-SIL8 7 Ідентифікація індивідуальних глікозидних похідних за часом утримання при ГЖХ і масспектрометри у порівнянні з відомими стандартами 8 Кількісна оцінка індивідуальних похідних за допомогою FID за внутрішнім стандартом(13-Ометил-О-глюкозидом) Нейтральні цукри і аміносахари можуть бути визначені за допомогою аніонообмінної хроматографії високого дозволу, об'єднаної з імпульсним амперометричним визначенням(НРАЕ-РАО Carbohydrate System фірми Dionex Corp) Наприклад, цукри можуть бути вивільнені за допомогою гідролізу 20%-ною(за об'ємом) трифтороцтовою кислотою при 100° С Speed - \/ас(фірма Savant Instruments) Після ЦЬОГО залишки розчиняють у 1%-ному розчині трипдрату ацетату натрію та аналізують на колонці для ЖХВР типу HPLC-AS6, як описано в Anumula та ш [Anal Biochem 195 269 -280(1991)] Сіалова кислота може бути визначена окремо прямим колориметричним методом Уаота ш [Anal Biochem 179 332 - 335 (1989)] з використанням трьох зразків У варіанті, якому надається перевага, застосовують тюбарбитурову кислоту(ТБК) у ВІДПОВІДНОСТІ з мтодом Warren L, J ВюІ Chem ,238(8)(1959) В альтернативному варіанті може бути здійснений аналіз вуглеводів за допомогою імуноблотинга У ВІДПОВІДНОСТІ з цим способом вуглеводи, пов'язані з протеїном, визначають з використанням комерційної системи визначення глікану(фірма Boehrmger), яка базуєтьсяна методі окиснювального імуноблотинга, який описано в Haselbeck і Hosel [Haselbeck та інш , Glycoconjugate J 7 63(1990)] При цьому притримуються протоколу фарбування, який рекомендується виробником, за вийнятком того, що протеїн преносять на мембрану з полівшілідендифориду, а не на нітроцелюлозну мембрану та блокуючий буфер містить 5% бичачого сироваткового альбу 24 міну в ЮмМ трис-буфері з рН 7,4 з 0,9% хлориду натрію Виявлення здійснюють з використанням антитіл проти дигоксигеніду, пов'язаних з коньюгантом лужного фосфату(Воепппдег) при розведенні 1 1000 у фізіологічному розчині, який забуферений трисом , з використанням таких субстратів для фосфатази, як хлорид 4-нітроблакитного тетразолію(0,03ваг/звер %) у ЮОмМ трис-буфері, рН 9,5, який містить ЮОмМ хлорид натрію та 50мМ хлорид магнію Протеїнові смуги, що містять вуглевод , найчастіше проявляють пртягом приблизно 10 15 хвилин Вуглевод звичано також може бути проаналізований розкладенням пептид-ІЧ-глюкозидазой Е У ВІДПОВІДНОСТІ з цим способом залишок суспендують у 14мкл буфері, який містить 0,18% ДСН, 18мМ бета-меркаптоетанол, 90мМ фосфат, 3,6мМ ЕТДК при рН 8,6, та витримують при температурі 100°С протягом Зхвилин Після охолодження до кімнатної температури зразок поділяють на дві рівні частини Одну аліквоту більше не піддають обробці, і вона є контролем Іншу фракцію доводять до приблизно 1% детергентом NP-40, а потім піддають обробці 0,2 одиницями пептид-Мглюкозидази Р(фірма Boehrmger) Обидва зразки витримують при 37°С протягом 2годин та потім аналізують за допомогою електрофореза в поліакриламідному гелі у присутності ДСН V Химери рецептор фактора некроза опухолі - імуноглобулін У варіанті, якому надається первага, способи за данним винаходом використовують для отримування химери, яка складається з рецептора фактора некроза nyxnnHH(TNFR) та імуноглобуліна(Ід) Особливу перевагу з цього класу химерних протеїнів надають химері, яка складається з растворимого TNFR типу 1 та IgGi Отримані химери TNFRI-lgGi можуть застосовуватися при лікуванні або діагностиці багатьох опоередкованних TNF або пов'язаних з TNF хвороб і розладів Поняття "лікування" в даному контексті включає як профілактику(запобігання), приглушення(наприклад, симптомів), так і лікування існуючого патологічного стану Патологічні стани, пов'язані з TNF, включають, але не необмежені ними, бактеремм, зумовлені грамнегативними і грампозитивними бактеріями, ендотоксичний шок, явище відторгнення трансплантату, ревматоїдні артрити, системну червону волчанку, хворобу Крона та ІНШІ аутоімунні та запальні захворювання, пов'язані з TNF Препарати за данним винаходом на основі TNFR1-lgGi звичайно придатні для застосування при таких показаннях, при яких раніше використовувались моноклональні антитіла до TNF Наприклад, при використанні тварин як моделей виявлено, що моноклональні антитіла до TNF-альфа виявляють захисну дію при застосуванні в профілактичних цілях [Тгасеу К J та ш , (1987) Nature, 330 662] [ Як описано у Exiey A R та ш , (1990) Lancet, 335 1275], у фазі 1 кліничного експерименту встановлено, що мишине моноклональне антитіло до рекомбинантному TNF-альфа людини безпечно для уведення пациентам з серйозним септичним шоком Химери TNFR1-lgGi придатні для лікування ревматоїдних артритів, а також септичного шока 25 47428 У способі лікування захворювання або розладу, пов'язаного з TNF, терапевтичне активна КІЛЬКІСТЬ препарату TNFR1-lgGi уводять суб'єкту, який необхідно таке лікування Переважним суб'єктом є людина Ефективна доза препарату на основі глікоформи TNFR1-lgGi за винаходом для лікування захворювання або розладу складає 0,01 - ЮОмг для одного пацієнта, перевага надається 1 - 75мг, але краще від приблизно 10 до приблизно 50мг Для уведення препарат TNFR1-lgGi повинен бути виготовлений у вигляді відповідної фармацевтичної або терапевтичної композиції Така композиція звичайно містить терапевтично ефективну КІЛЬКІСТЬ преперата TNFR1 -IgGi та фармацевтичне прийнятний наповнювач або носій, такий, як фізіологічний розчин, забуферований фізіологічний розчин, декстроза, або вода Композиції також можуть містити певні стабілізатори, такі як цукри, включаючи манозу та маніт, і місцеві анестетики для композицій, включаючи, наприклад, лідокаш(5) препарати TNFR1-lgGi, в яких молярне відношення сіалової кислоти до N-ацетилглюкозамшу складає від приблизно 0 35 до приблизно 0 5 і найбільш переважно від приблизно 0 4 до приблизно 0 45 Шляхи вступу індивідуальних або комбінованих терапевтичних композицій за данним винаходом включають стандартні шляхи, такі, як, наприклад, внутрішньовенна інфузія або швидкий внутрішньовенний вступ більших обсягів рідини Також пропонується застосування препарату TNFR1-lgGi по винаходу при виготовленні ЛІКІВ для лікування людини або тварини Нижче винахід більш докладно поясняется на прикладах, що уявлені тільки з ілюстративною метою і, якщо не вказаний інше, не направлені на обмеження обсягу даного винаходу Приклади БІОЛОГІЧНІ ВПЛИВИ TNF-альфа і TNF-бета здійснюються через певні рецептори [Dembic і ш , (1990) Cytokmes, 2 231]) Молекулярне клонування показало існування двох різноманітних типів TNF-peцeптoplв(TNFR) з передбачуваними молекулярними масами 55кДа(тип 1) [Shall і ш , (1990) Cell, 61 361] і 75кДа(тип 2) [Smith і ш , (І990) Science, 248 1019], кожний з яких в природних умовах зв'язується як з TNF-альфа, так і з TNFбета [Loetscher і ш , (1990) Cell, 61 351 .Schall і ін , (1990) Cell, 61 3 6 1 , Kohno і ш , (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87 8331] Встановлено, що позаклітинні частини обох рецепторів в природних умовах є розчиненими, TNF-зв'язуючими протеїнами(Коїіпо і ш , див вище) Були створені агоністи TNF, що блокують шкідливий вплив TNF при різноманітних імунних і запальних захворюваннях [РерреІ і ш , (1991) J Exp Med , 174 1483 - 1489, Uuch (1993) Am J Path , 142 1335 - 1338, Howard О M Z (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 2 3 3 5 2339, Wooley P H , (1993) J Immunol , 151 6602 6607] Один такий агоніст [Werner і ш , (1991) J Cell Biochem , Тези 20-го щорічного з'їзду, crop 1 15] об'єднує позаклітинний домен людського TNFR типу 1 з молекулярною масою 55кДа з частиною шарнірної області і Fc-області важкого ланцюга імуноглобуліна d людини 26 В цьому прикладі культивували клітини ссавця, трансфектовані вектором, що містить кДНК, кодуючу химеру TNFR1-lgGi Методи А ЛІНІЯ КЛІТИН Як ЛІНІЮ клітини-господаря, якою є ЛІНІЯ КЛІТИН ссавця, використали ЛІНІЮ КЛІТИНИ яєчника китайського хом'яка(СНО), отриману з СНО-К1[АТСС №ССІ_61 СНО-К1] Мутантну ЛІНІЮ клітини СНО-К1 з дефіцитом дигlдpoфoлaтpeдyктaзи(DHFR), позначену як СНО-К1 DUX-B11(DHFR) [отриману від Dr L Chasm з Колумбійского університету, Simonsen С С і Levmson A D (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80 2495 - 2499, Urlaub G і Chasm L (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77 4216 - 4220], після цього використали для отримання лінії клітини з пониженим споживанням інсуліну шляхом трансфекцм вектором, що містить кДНК для препроінсуліну [Sures і ін , (1980) Science, 208 57 59] Відібраний клон, позначений як dpl2 CHO, потребував для зростання гліцину, гіпоксантину і тимідину, підтверджуючи цим самим свій DHFRгенотип Б Конструювання химери, що складається з розчинного TNFR типу 1 та I g d Химеру розчинний TNFR типу 1-lgGi конструювали шляхом генного злиття позаклітинного домену людського TNFR типу 1 з шарнірною ділянкою і Сн2 - і СнЗ-доменами важкого ланцюга ІдСі(позначену далі як TNFR1-lgGi) ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК, яка кодує людський розчинний TNFR типу 1 [див Loetscher і ш , див вище], одержували з плазміди pRK-TNF-R [Schall і ш , Cell, 61 361 (1990)] Для конструювання цієї вихідної плазміди клон плацентарної кДНК довжиною 2 1 т п н (Schall і ін , див вище) вбудовували у вектор, який забезпечує експресію в клітинах ссавця pRK5, конструкція якого описана в ЕР 307247, публікація 15 березня 1989 Ця кДНК починається з нуклеотиду в положенні 64 ПОСЛІДОВНОСТІ, описаної Loetscher і ш , з ІНІЦІЮЮЧИМ метіоніном на відстані 118 пар основ нижче(по ходу транскрипції) по відношенню до початкового нуклеотиду Джерелом ПОСЛІДОВНОСТІ, кодуючої lgG-і, служила плазміда pRKCD42F c i, експресуюча CD4-lgG [Capon D J і ін , Nature, 337 525 (1989), Byrn і ш , Nature, 344 668 (1990)], що складається з ПОСЛІДОВНОСТІ кДНК, кодуючої гібридний поліпептид, який містить 1-180 залишків зрілого людського протеїну СО4(два N-кшцевих варіабельних домену CD4), злитих з послідовностями людського IgGi, які розпочинаються з аспарагінової кислоти в 216 положенні(якщо вважати амінокислоту в 114 положенні як перший залишок константної ділянки важкого ланцюга [Rabat і ш , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4-е вид (1987)], яка є першим залишком шарніра IgGi після залишку цистеїну, що бере участь у зв'язуванні важкого і легкого ланцюга), і закінчуються залишком в 441 положенні для приєднання Сн2- і СнЗ-доменів Fcділянки IgGi TNFR1-lgGi конструювали, одержуючи рестрикційні фрагменти плазмід pRK-TNF-R і pRKCD42F c i і лігуючи їх з використанням делеційного мутагенезу таким чином, щоб залишок треоніну в положенні 171 зрілих TNFR співпадав з за 27 лишком аспарагінової кислоти в положенні 216 важкого ланцюга I g d [Rabat і ш , див вище] Утворена плазміда pRKTNFR-IgG містила повнорозмірну ПОСЛІДОВНІСТЬ, кодуючу TNFR1-lgGi В Культура клітин Ген, що кодуює розчинний TNFR типу 1-lgG-i, вводили в клітини лінії dpl2 СНО шляхом трансфекцм Це уведення здійснювали за допомогою методу на основі фосфату кальцію для інтродукції ДНК в клітини ссавця Через два дні після трансфекцм клітини обробляли трипсином і пересівали в селективне середовище(середовище НАМ F-12 без гліцину-ппоксантину і тимідину/DMEM.I 1 за об'ємом 2% підданої діалізу сироватки) Отримані ізоляти піддавали скринінгу на здатність секретувати TNFRrlgGi Клони, експресуючі TNFR1-lgGi, ампліфікували в метотрексаті, одержуючи клони, що мають високу експресію, і їх послідовно адаптували до безсироваткового середовища Ці клітини перебували під безперервним селективним тиском до перенесення у невибірне середовище для зростання і експансм(розмноження) шокуляту Для отримання культур клітин, продукуючих TNFR1-lgGi, описану вище популяцію клітин з середовища, що містить метотрексат, розмножували шляхом серійних пересівів в судини більшого об'єму в середовище для зростання, що не містить метотрексату На цих стадіях процесу неселективне середовище для зростання являло собою композицію на основі DMEM/HAM F-12 [див, наприклад, патент США 5122469] зі зміненими концентраціями деяких компонентів, таких як глюкоза, амінокислоти, солі, цукор, вітаміни, гліцин, гіпоксантин і тимідин, рекомбінантний людський інсулін, пдролізований nenTOH(Pnmatone HS або Pnmatone RL), захищаючий клітину агент, такий, як Pluromc Р68(плуронієвий полюл) або його еквівалент, гентаміцин, ЛІПІДИ і мікроелементи Культури містили при контрольованому зна 47428 28 ченні рН 7 2 + 0,4, використовуючи газоподібний СО2(кислота) і/або ЫагСОзОэснова) Температуру під час періоду зростання підтримували біля 37°С Вміст розчиненого кисню підтримували на рівні вище 5% від насичення повітрям за допомогою прямого продування повітрям і/або газоподібним киснем Осмоляльність протягом фази розмноження шокуляту підтримували в діапазоні приблизно від 250 до 350мосмолей Для кожної культури за фазою зростання йшла друга фаза або перехідна фаза, в якій умови культивування змінювали від умов, оптимальних для зростання, до умов, ВІДПОВІДНИХ фазі продукування Під час цієї перехідної фази температуру системи для культивування знижували звичайно приблизно до 30-35°С Додавали бутират і осмоляльність підтримували в певному діапазоні Продукт, що накопичувався під час цієї фази продукування, аналізували на вміст сіалової кислоти За звичайної схеми продукування приблизно 1 2x106 клітин, отриманих в результаті розмноження шокуляту після стадії селекції, вирощували в фазі зростання з вихідною осмоляльністю ЗООмосмолей Середовище для зростання доповнювали мікроелементами, рекомбшантним людським інсуліном і пдролізованим пептоном В цих умовах клітини вирощували протягом 2днів На початку третього дня культивування клітин температуру знижували Водночас або після зміни температури в культуру клітин додавали бутират натрію і підтримували необхідну для продукування осмоляльність, додаючи різноманітні компоненти середовища Клітини вирощували в цих умовах з підживленням впродовж 9-Юднів При необхідності клітини підживлювали різноманітними компонентами середовища В таблиці 1 подані умови для різних способів здійснення процесу продукування Таблиця 1 Варіант процесу А Б В Г Д Е Ж 3 І Питома продуктиКонц бу- Осмоляльність В Зміст сіалової кислоти в вність КЛІТИНИ МІЖ ти рату фазі продукування TMPK1-lgGi на 10 день 5-10 дня(ммоль/л) (мосмоль/кг) (моль/моль) ми(пг/день) 1 360-420 0 6-1 5 6 4-7 2 1 480-510 1 7-2 2 6 0-6 3 6 460 48 47 6 370-420 2 4-2 8 5 5-5 6 6 350-370 1 4-2 3 5 4-6 3 12 390 40 53 12 490-510 2 9-5 2 4 0-5 2 12 400-430 2 0-2 8 5 8-6 0 12 370-380 2 0-2 2 5 5-5 9 N= N= N= N= N= N= N= N= N= 4 3 1 3 3 1 4 3 3 29 47428 Г Виділення TNFR-IgG Химеру TNFR1-lgGi очищували до гомогенності більше 95% за допомогою афінної хроматографії на імобілізованому протеїні A Staphylococcus aureus, як описано у Capon і ш , див вище Д Аналіз вуглеводу Вміст сіалової кислоти аналізували способом Warren L , (1959) J Biol Chem , 234 1971 -1975 Результати Будували графік залежності питомої клітинної продуктивності для кожної з продукуючих культур, наведених в таблиці 1, від вмісту сіалової кислоти отриманого продукту Результати наведені на фіг 1 Найбільш високий вміст сіалової кислоти спостерігали, коли параметри процесу в фазі продукування підтримували на наступному рівні осмоляльність приблизно 360 - 420 мосмолей, а концентрація бутирату приблизно 1мМ Вміст сіалової кислоти може контролюватися в широкому діапазоні значень шляхом регулювання параметрів процесу Приклад • Визначали в плазмі фармакокшетичні параметри, такі, як час напівжиття і/або швидкість кліренсу для різноманітних препаратів Препарати, що мають більш високий вміст сіалової кислоти, звичайно мали більший період напіввиведення з плазми і/або меншу загальну швидкість кліренсу у порівнянні з препаратами, що мають більш низький вміст сіалової кислоти Методи Сімнадцять самців щурів лінії Sprague-Dawley вагою 272 - 315г випадковим чином розподіляли за трьома групами(ІЧ = 5 або 6 особин в групі), які піддавали обробці злитим протеїном TNFR1-lgGi Тваринам внутрішньовенно через канюлю в стегновій вені вводили номінальну дозу 5мг/кг тестованого матеріалу Відібрані тестовані матеріали містили два препарати TNFR1-lgGi, отримані в результаті процесу, в якому концентрація бутирату під час фази продукування складала 6мМ і осмоляльність під час фази продукування підтримували на рівні приблизно 400мосмолей(процес 1), а третій препарат TNFR1 -IgGi був отриманий в результаті процесу, в якому концентрація бутирату складала 12мМ і осмоляльність під час фази продукування складала приблизно 500мосмолей(процес II) Зразки крові об'ємом 2мл перед обробкою і через 5хв , 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 і 120годин після обробки вносили в 8 5%-ну ЕДТК Зразки крові центрифугували, збирали плазму і зразки аналізували на вміст злитого протеїну TNFR1 -IgGi Для кількісної оцінки вмісту TNFR1-lgGi у плазмі щура застосовували імуноферментнии аналіз з використанням біологічного зв'язування(ЕІ_ІВА) Цей аналіз заснований на спроможності TNFальфа, з'єднаного з пероксидазою з xpoHy(TNFальфа-HRP), який зв'язувався з рецепторною ділянкою злитого протеїну TNFR1-IgGi В цьому аналізі покриття лунок планшетів для мікротитрування Fab-фрагментами козиного антилюдинного IgGF використовували для імобілізацм TNFR1 -IgGi шляхом взаємодії з Fc-частиною молекули В лунки додавали ТІЧР-альфа-Ь^Р і давали зв'язувати ЗО ся з рецепторною ділянкою імобілізованого TNFR1-lgGi Кількісну оцінку здійснювали шляхом виміру забарвлення, отриманого в результаті реакції пероксидази з перекисом і ортофенілендіаміновим(СЮР) субстратом Діапазон аналізованих значень складав від 0 003 до 0 02мг/мл Встановлено, що присутність ЕДТК в зразках плазми не чинить вплив на якість аналізу Дози усереднювали таким чином, щоб врахувати ВІДМІННОСТІ в концентраціях розчинів, що застосовуються для обробки Всі обчислення були зроблені на основі графіків залежності концентрації від часу аж до кінцевої точки відрахунку 120год Усічену площину під кривою(АІІСо - i2oA/V) обчислювали з використанням правила трапеції, а усереднене по вазі значення усіченого кліренсу(СІ_о i2oA/V) обчислювали за формулою доза/AUCo -120 Результати Швидкості кліренсу варіювали в залежності від використаного варіанта процесу(пор процес 1 з процесом •) і від КІЛЬКОСТІ сіалової кислоти, присутньої в продукті Швидкості кліренсу, отримані для окремих тварин, і відповідне середнє значення і стандартні відхилення, отримані в цьому дослідженні, наведені нижче в таблиці • При використанні процесу 1 отримано більш низьку і більш прийнятну швидкість кліренсу Таблиця Кліренс 0 - 120(мл/г/кг) Процес 1 212 2 03 1 63 Процес 1 1 89 1 85 1 91 0 02 Процес 1 2 08 2 31 20 Процес 1 2 22 1 99 1 66 2 08 0 23 Процес • 2 144 2 99 2 61 Процес 11 3 27 2 82 3 42 2 88 0 45 середнє значення 1 91 станд відхилення 0 02 Приклад • Склад моносахаридів TNFR1-lgGi Визначення складу олігосахаридів вуглеводю і побудови химери TNFR1-lgGi, отриманої згідно з прикладом 1, показало, що вміст сіалової кислоти при різноманітних варіантах процесу змінюється Швидкий кліренс з плазми пов'язаний з високим рівнем незахищеного GlcNAc, пониженим рівнем сіалової кислоти в ланцюгах олігосахариду і(припустимо) доступністю протеїну для рецепторів манози або галактози Повільний кліренс з плазми пов'язаний з більшою КІЛЬКІСТЮ кінцевих залишків сіалової кислоти А Джерела тестованого матеріалу TNFR1-lgGi одержували ВІДПОВІДНО ДО методів, викладених вище в прикладі 1 Матеріал для процесу 1 одержували з культури клітин, використовуючи під час фази продукування 6мМ бутират і осмоляльність приблизно 400мосмолей Матеріал 31 47428 32 для процесу • одержували з культури клітин, випри 120°С протягом 1 год користовуючи під час фази продукування 12мМ 4 Після КИСЛОТНОГО гідролізу TNFR1 -IgGi і конбутират і осмоляльність приблизно 500мосмолей трольні зразки охолоджували і випарювали їх досуха Б Методи Вивільняння інтактних нейтральних цукрів і 5 Відновлювали зразки водою до кінцевої аміноцукрів визначали за допомогою аніонообмінконцентрації приблизно 0 бмг/мл ної хроматографії з високим значенням рН, об'єд6 Проводили розподіл моносахаридів при тенаної з імпульсним амперометричним визначенмпературі навколишнього середовища за допомоням Аналіз проводили ВІДПОВІДНО ДО наступних гою анюнообменної хроматографії з високим знастадій ченням рН, об'єднаної з імпульсним амперометричним визначенням, використовуючи 1 Проводили заміну буферу в препаратах з колонку типу Dionex CarboPac РАІ(4х250мм) (фірTNFR1-lgGi(npn6nH3HO 50мкг/мл) і у ВІДПОВІДНИХ ма Dionex Corp , Sunny vale, CA) контрольних зразках таким чином, щоб кінцевий зразок перебував в 1%-ной оцтовій кислоті 7 Проводили кількісну оцінку індивідуальних моносахаридів шляхом порівняння з моносахари2 Заморожували приблизно 90мкг TNFR1дами в контрольних зразках IgG-i, а також зразки з контрольними матеріалами в бані з сухим льодом і спиртом, а заморожений 8 Результати зразок люфілізували протягом ночі Відносний молярний вміст кожного моносахариду в двох препаратах наведений в таблиці • 3 Відновлювали висушені замороженням зранижче зки в 500мкл трифтороцтової кислоти і шкубували Таблиця • Відносний молярний вміст моносахаридів в двох препаратах TNFRI-lgGt Моносахарид Фукоза Галактоза Маноза N - ацетилглюкозамш Сіалова кислота N-ацетилгалактозамш Відношення сіалова кислота/GlcNAc Процес • 44 47 125 143 37±0,3 03 0 26 Процес 1 4 3 + 0,2 65±0,0 12 2 ±0,6 14 1 ±0,6 4 9 + 0,3 0 5 + 0,1 0 35 Наведені вище результати показують, що параметри процесу, вибрані для фази продукування глікопротешу, чинять вплив на склад вуглеводнів зрілого глікопротешу Препарати з більш високим вмістом сіалової кислоти звичайно мають пролонгований період напіввиведення з сироватки В наведених нижче таблицях IV і V показаний вуглеводний склад бокових ланцюгів олігосахариду в препаратах на основі химери TNFR1-tgGi, отриманих в умовах, ВІДПОВІДНИХ процесу І і процесу • В таблиці V наведені дані для вуглеводів в рецепторній ДІЛЯНЦІ химерної молекули за винятком сайта глікозування Fc Таблиця IV Сіалова кислота Фукоза GalNAc GlcNAc Gal Man Відношення сіалова кислота/GlcNAc Пр 1 58 40 03 129 74 120 0 45 Пр 1 58 40 02 150 76 120 0 39 Пр 1 57 36 02 148 71 100 0 39 Пр • 37 44 03 143 47 125 0 26 Пр 1 58 41 04 143 70 120 0 41 Пр • 35 43 04 144 41 11 9 0 24 Таблиця V Кіл-сть молей незахищеного GlcNAc на моль Кіл-сть молей незахищеного Gal на моль Гілки Gal КІЛЬКІСТЬ сіалової кислоти на моль Дані, наведені в таблицях IV і V, показують, що склад TNFR1-lgGi характерний для комплексних олігосахаридів з однією, двома і трьома гілками, що закінчуються сіаловою кислотою Можна зро 318 Пр • 32 0 97 4 47 35 Пр • 1 11 -0 08 4 72 48 ПрІ ПрІ 1 32 1 45 6 45 5 00 -0 26 6 24 65 бити висновок про те, що TNFR1-lgGi, отриманий ВІДПОВІДНО до процесу І, має істотно більший вміст сіалової кислоти і істотно менший вміст незахищеного GlcNAc КІЛЬКІСТЬ сіалової кислоти на моль 33 47428 протеїну свідчить про те, що цей матеріал має більш низьку ізоелектричну точку у порівнянні з матеріалом, отриманим ВІДПОВІДНО ДО процесу II При співставленні з результатами, наведеними в таблиці II, ці дані також показують, що більш повільний кліренс з плазми матеріалу, отриманого ВІДПОВІДНО до процесу 1, корелює з більш низьким вмістом незахищеного CIcNAc і звичайно з більш високим вмістом сіалової кислоти В таблицях IV і V наведені дані про препарати TNFR1-lgGi, що містять комплексний олігосахарид, який закінчується одним або декількома залишками сіалової кислоти Більш прийнятні препарати TNFR1-lgGi містять молекули TNFR1-lgGi, що мають приблизно 1 - 2 моля незахищених залишків N-ацетилглюкозамшу на моль протеїну Молярне відношення сіалової кислоти до протеїну складає приблизно 4 - 7 Препарати TNFR1 -IgGi мають молярне відношення сіалової кислоти до Nацетилглюкозамшу приблизно від 0 4 до приблизно 0 45 Приклад • Значення рі дуже сіалілованого препарату нижче, ніж значення рі слабко сіалілованого препарату Методи Для різноманітних препаратів, описаних в прикладі II, проводили ізоелектричне фокусування 34 Ізоелектрично фокусуючі гелі поділяють глікопротеїни препарату ВІДПОВІДНО З їх ізоелектричною точкою(рі) при використанні градієнту рН, створюваного за допомогою амфолітів з різним значенням рН В цьому дослідженні аналіз препаратів проводили, використовуючи градієнт рН від 10 до 4 Результати Препарати TNFR1-igGi мають ізоелектричні точки в діапазоні від приблизно 5 5 до приблизно 7 5, як встановлено методом хроматофокусування, в якому рі чутлива до обробки неирамінідазою Усі зазначені вище документи внесені в даний опис як незалежно від того, використані вони конкретно чині Хоча даний винахід описаний на прикладах його конкретних варіантів здійснення, очевидно, що можливі й ІНШІ модифікації Передбачається, що даний опис містить будь-які варіації, застосування або модифікації винаходу, що випливають в цілому з основної ідеї винаходу, і такі відхилення від опису даного опису, які можуть бути зроблені на основі відомої або звичайної практики в даній галузі техніки, до якої відноситься винахід і які можуть бути застосовані до істотних ознак викладеного вище винаходу, описаних в пунктах формули винаходу, що додаються Інтеграл у часі від PCV 35 47428 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 36