Продукт кон’югування цитокіну для використання у протираковій терапії

що несе 5'- або 3'-неперервну послідовність, яка 1. Продукт кон’югування цитокіну, вибраного з кодує пептид, що містить мотив NGR, де вказаний TNF або IFN γ, і пептиду, який містить мотив NGR, пептид є лігандом рецептора CD13. де вказаний пептид є лігандом рецептора CD13. 10. кДНК за п. 9, де вказаний пептид являє собою 2. Продукт кон’югування за п. 1, де вказаним цитопептид за п. 3. кіном є TNFα або TNFβ. 11. кДНК за п. 9, що кодує продукт кон’югування за 3. Продукт кон’югування за п.1 або 2, де вказаний п. 5. пептид вибраний з групи, що складається з 12. Вектор для генної терапії, що місти ть кДНК за CNGRCVSGCAGRC, NGR AHA, GNGRG, цикбудь-яким з пп. 9-11. лоCVLNGRMEC, лінійного або циклічного CNGRC. 13. Фармацевтична композиція, що містить ефек4. Продукт кон’югування за будь-яким з попередніх тивну кількість продукту кон’югування за будьпунктів, де цитокін зв’язаний з пептидом за допояким з пп.1-8, кДНК за будь-яким з пп. 9-11 або могою спейсера. вектора за п. 12 разом з фармацевтично прийнят5. Продукт кон’югування за п. 4, де вказаний пепними носіями та наповнювачами. тид являє собою лінійний або циклічний CNGRC і 14. Композиція за п.13 у формі розчину або суде вказаний пептид зв’язаний з цитокіном за доспензії для ін'єкції або рідини для вливань. помогою спейсерного гліцину. 15. Композиція за п.13 або 14 у формі ліпосом. 6. Продукт кон’югування за будь-яким з попере16. Застосування продукту кон’югування за будьдніх пунктів, де вказаний цитокін дериватизований яким з пп. 1-8, кДНК за будь-яким з пп. 9-11 або поліетиленгліколем або ацильним залишком. вектора за п. 12 для виготовлення лікарських або 7. Продукт кон’югування за будь-яким з попередіагностичних засобів для лікування злоякісної дніх пунктів, де цитокін додатково кон’югований з пухлини. антитілом або з його фрагментом, направленим 17. Застосування продукту кон’югування за п.16 у на пухлинний антиген, пухлинний ангіогенний макомбінації з іншими протипухлинними агентами ркер або компонент позаклітинного матриксу, або або діагностичними пухлиновізуалізуючими сполуз біотином. ками. Даний винахід відноситься до модифікованих цитокінів, які використовуються для лікування злоякісних пухлин. Більш конкретно, даний винахід відноситься до похідних цитокінів, здатних до самонацілювання на клітини пухлинних судин та антигенпрезентуючі клітини (хомінгу). Протипухлинна активність деяких цитокінів добре відома і описана. Деякі цитокіни вже використовуються для терапевтичного лікування людини [29]. Так, наприклад, такі цитокіни, як інтерлейкін-2 (IL-2) та інтерферон a (IFNa) володіють позитивною протипухлинною активністю у пацієнтів з різними типами пухлин, таких як карцинома нирок з метастазами, волохатоклітинний лейкоз, саркома Калоші, меланома, множинна мієлома і т.п. Інші цитокіни, такі як ΙΕΝb, фактор некрозу пухлини (TNF), a, TNF-b, IL-1, 4, 6, 12, 15 та колонієстимулюючі фактори (КСФ), також виявляють деяку протипухлинну активність, направлену на деякі типи пухлин, а тому вони є об'єктами для подальших досліджень. У загальних рисах, терапевтичне використання цитокінів сильно обмежене їх системною токсичністю. Так, наприклад, TNF був спочатку виявле ний за його здатністю індукувати геморагічний некроз деяких пухлин [1] і за його in vitro цитотоксичною дією на різні пухлинні клітинні лінії [2], але згодом було показано, що він володіє сильною прозапальною активністю, яка, у випадку його надпродукування, може представляти небезпеку для людського організму [3]. Оскільки системна токсичність є головною проблемою, пов'язаною з використанням фармакологічно активних кількостей цитокінів у людини, то в даний час ведеться пошук нових похідних і терапевтичних схем, метою якого є зниження токсичної дії біологічних ефекторів цього класу при збереженні їх терапевтичної ефективності. Деякі нові підходи спрямовані на: a) розробку гібридних білків, які можуть доставляти TNF у пухлину і підвищува ти його локальну концентрацію. Так, наприклад, були продуковані гібридні білки, що складаються з TNF і пухлинноспецифічних антитіл [4]: b) розробку TNF-мутантів, які зберігають протипухлинну активність і мають знижену системну токсичність. Відповідно до цього вже були одержані мутанти, які володіють здатністю селективно 5 85365 6 розпізнавати тільки один рецептор (р55 або р75) CD13 являє собою трансмембранний глікопротеїд [5]; масою 150кДа, який є висококонсервативним для c) використання антитіл проти TNF, які здатні деяких видів. Він експресується на нормальних знижувати деякі токсичні ефекти TNF, не впливаклітинах, а також у мієлоїдних пухлинних лініях, в ючи на їх протипухлинну активність. Такі антитіла ангіогенному ендотелії та у деяких епітеліальних вже були описані у літературі [30]; клітинних лініях. CD13-рецептор звичайно ідентиd) використання похідних TNF з більш високим фікується як «NGR»-рецептор, оскільки його пепчасом напівжиття (наприклад, TNF, кон'югованих з тидні ліганди мають спільний амінокислотний мополіетиленгліколем). тив «NGR». Нещодавно повідомлялося про одержання поВідповідно до свого першого аспекту, даний хідних TNF, здатних до селективної доставки у винахід відноситься до продукту кон'югування ципухлинні ділянки. Так, наприклад, був описаний токіну, вибраного з TNF та IFNg, з лігандом рецепгібридний білок, одержаний шляхом приєднання тора CD13. Вказаним лігандом може бути антитіло гена важкого ланцюга mAb проти рецептора або його фрагмент, такий як Fab, Fv, одноланцютрансфертну до гена TNF [4], або гібридний білок, говий Fv, пептид або пептидоміметик, а саме пепутворений TNF з «шарнірною» областю моноклотидоподібна молекула, здатна зв'язуватися з ренального антитіла проти пухлинноасоційованого цептором CD13 і яка необов'язково містить антигену TAG72 (6), або гібридний білок «Fv-TNF» модифіковані неприродні амінокислоти. Вказаний [6]. ліганд переважно являє собою прямий або циклічУ [ЕР 2512494] описана система введення діаний пептид, що включає мотив NGR, такий як гностичного або терапевтичного агента, яка вклюCNGRCVSGCAGRC, NGR AHA, GNGRG, цикчає: антитіло, кон'юговане з авідином або стрепталоCVLNGRMEC або циклоCNGRC або, більш певідином; агент, здатний утворювати комплекс з реважно, пептид CNGRC. Вказаний пептид може кон'югованим антитілом; і сполуку, що складається бути безпосередньо зв'язаний з цитокіном, або він з діагностичного або терапевтичного агента, кон'юможе бути зв'язаний через спейсер, який може гованого з біотином; де вказану систему вводять являти собою одну амінокислоту, амінокислотну послідовно і через адекватні проміжки часу, так, послідовність або органічний залишок, такий як 6щоб таке введення сприяло локалізації терапевтиамінокаприл-N-гідроксисукцинімід. Процедури чного або діагностичного агента, за допомогою скріплення відомі фахівцям і передбачають втівзаємодії біотин-стрептавідин, на клітині-мішені, лення методів генної інженерії або методів хімічяка розпізнається вказаним антитілом. Описані ного синтезу. терапевтичні або діагностичні агенти включають Пептидний ліганд переважно зв'язується з Nхелатні комплекси з металами, а зокрема, хелатні кінцем цитокіну, мінімізуючи, тим самим, будь-який комплекси з радіонуклідами та з низькомолекулявплив на скріплення модифікованого цитокіну з рними протипухлинними агентами, такими як цисйого рецептором. Альтернативно, вказаний пептид платина, доксорубіцин і т.п. може бути зв'язаний з амінокислотними залишкаУ [ЕР 496074] описаний спосіб, який дозволяє ми, які являють собою акцептор амідних або карздійснювати послідовне введення біотинільованобоксильних зв'язків, звичайно присутні на даній го антитіла, авідину або стрептавідину та біотинімолекулі або штучно введені методами генної інльованого діагностичного або терапевтичного агеженерії. Вказаний модифікований цитокін переванта. Хоча цитотоксичні агенти, такі як рицин вже у жно одержують з використанням кДНК, що вклюзагальних рисах описані в літературі, однак, в осчає 5'-безперервну послідовність, яка кодує даний новному, цей опис стосується їх застосування по пептид. відношенню до радіоактивно мічених сполук. Відповідно до переважного варіанту свого втіУ [WO 95/15979] описаний спосіб локалізації лення, даний винахід відноситься до продукту високотоксичних агентів на клітинних мішенях, кон'югування TNF і послідовності CNGRC. Більш який базується на введенні першого кон'югату, що переважно, аміно-кінець TNF зв'язаний з пептидом включає специфічну молекулу-мішень, кон'юговаCNGRC через спейсер G (гліцин). ну з лігандом або з антилігандом, з подальшим На моделях тварин з лімфомою RMA-T було введенням другого кон'югату, що складається з підтверджено, що одержаний продукт (NGF-TNF) є токсичного агента, зв'язаного з антилігандом або з більш активним, ніж TNF. Крім того, у тварин, облігандом. роблених NGR-TNF, спостерігалася здатність до У [WO 99/13329] описаний метод направленої відторгнення додатково введених онкогенних доз доставки молекули у пухлинні ангіогенні судини, клітин RMA-T або RMA. Збільшення протипухлинякий базується на кон'югуванні вказаної молекули ної активності, у порівнянні з нормальним TNF, з лігандами рецепторів NGR. Як можливі кандидамогло спостерігатися у імунокомпетентних тварин, ти пропонувався ряд молекул, але конкретно опиале не у імунодефіцитних тварин. Це вказує на те, саний був тільки доксорубіцин. У вказаній роботі що підвищення протипухлинної активності TNF, не описане використання лігандів NGR-рецепторів кон'югованого з пептидами «NGR», обумовлене як носів для цитокінів з метою індукування імунних посиленням імунної відповіді, а не прямою цитотовідповідей. ксичною активністю вказаного кон'югата. Було несподівано виявлено, що терапевтичБуло також продемонстровано, що in vivoний індекс деяких цитокінів може бути помітно збіімунні ефекти, індуковані NGR-TNF, безпосередльшений, а їх імунотерапевтичні властивості моньо пов'язані з рецептором CD13. Так, наприклад, жуть бути посилені шляхом їх скріплення з спостерігалося, що антитіло проти рецептора лігандом амінопептидаза-N-рецептора (CD13). CD13, а також ліганд GNGRC, конкурують з NGR 7 85365 8 TNF in vi vo, що дає підстави припускати наявність який експресується на пухлинних клітинах або механізму націленої NGR-TNF-доставки до рецепінших компонентах пухлинної строми, наприклад, тора. домен EDB тенасцину або фібронектину. Це приТерапевтичний індекс кон'югатів «TNF/ліганд водить до додаткового поліпшення здатності моCD13» може бути, крім того, поліпшений з викоридифікованого цитокіну до хомінгу у пухлин у та до станням мутантної форми TNF, здатної селективуповільненого вивільнення даного цитокіну у мікно зв'язуватися з одним з двох рецепторів TNF, рооточенні пухлини за допомогою переходів триp75TNFR і p55TNFR. Вказаний мутант TNF може мер-мономер-тример. Дійсно, як показано у попебути одержаний за допомогою сайт-направленого редніх роботах, модифіковані субодиниці мутагенезу [5; 7]. кон'югатів TNF можуть відщеплюватися від комФармакокінетичні властивості модифікованих плексів, що націлюють, і повторно асоціюватися з цитокінів даного винаходу можуть бути поліпшені утворенням немодифікованих тримірних молекул шляхом одержання поліетиленгліколевих похідTNF, які потім дифундують у мікрооточення пухлиних, що дозволяє, тим самим, збільшувати час ни. Було показано, що вивільнення біологічно акнапівжиття самих цитокінів у плазмі. тивного TNF відбувається протягом 24-48 годин В іншому варіанті свого втілення, даний винапісля доставки [21]. хід відноситься до біфункціональних похідних, в Для використання у терапії, модифіковані цияких цитокіни, модифіковані вказаним лігандом токіни даного винаходу можуть бути відповідним CD13, кон'юговані з антитілами або з їх фрагменчином включені до фармацевтичних препаратів тами проти пухлинних антигенів або інших пухлиндля перорального або парентерального введення. Препарати для парентерального введення є перених ангіогенних маркерів, наприклад, avважними, і вони являють собою розчини або суінтегринів, металопротеаз або судинного фактора росту, або з антитілами або з їх фрагментами проспензії для ін'єкцій та рідини для вливань. Для одержання парентеральних форм, ефекти компонентів позаклітинного матриксу, такими як тивна кількість активного інгредієнту може бути антитіла проти тенасцину або домен проти фібророзчинена або суспендована у стерильному носії, нектину EDB. Нещодавно було описане одержання необов'язково з доданням наповнювачів, таких як гібридного продукту, утвореного між TNF і шарнірною областю mAb проти пухлинноасоційованого солюбілізатори, агенти, що надають ізотонічність, консерванти, стабілізатори, емульгатори або дисантигену TAG72, що експресується аденокарципергуючі агенти, після чого одержані розчин або номою шлунка та яєчника [6]. суспензія можуть бути розподілені по герметичних В іншому варіанті втілення винаходу, даний посудинах або ампулах. винахід відноситься до попереднього націлювання на пухлину за допомогою системи біотин/авідин. Одержання препаратів цитокінів у формі ліпосом може поліпшувати їх біологічну активність. Відповідно до цього підходу одержують третинний Дійсно, спостерігалося, що ацилювання аміногруп комплекс на пухлинному антигенному сайті у різTNF індукує збільшення його гідрофобності без них стадіях, де вказаний комплекс утворений 1) втрати біологічної активності in vitro. Крім того, біотинільованим mAb, 2) авідином (або стрептавідином) і 3) двовалентним цитокіном, модифіковаповідомлялося, що TNF, зв'язаний з ліпідами, має незмінені цитотоксичність in vitro, імуномодулюючу ним лігандом CD13 та біотином. Ряд робіт підтведію та знижену токсичність in vivo [12, 13]. рдив, що спосіб попереднього націлювання, у Максимальна гранично допустима болюсна порівнянні зі стандартним способом націлювання з доза TNF для людини становить 218-410мкг/м 2 використанням імунокон'югатів, може фактично збільшувати відношення активних молекул, на[32], що приблизно у 10 разів нижче, ніж ефективна доза для тварин. Виходячи з даних, одержаних правлених на мішень, до вільних активних молена мишачих моделях, очевидно, що для досягненкул, що приводить до зниження токсичності при ня протипухлинних ефектів у людини необхідна, лікуванні [11, 10, 9, 8]. Даний спосіб дає хороші принаймні у 10 разів, більш висока доза [15]. У результати при використанні біотинільованого TNF, який здатний індукувати цитотоксичність in першому клінічному дослідженні на перфузію у гіпертермічно ізольованій кінцівці були одержані vitro та знижувати ріст пухлинних клітин в умовах, високі рівні відповіді з використанням єдиної дози за яких нормальний TNF є неактивним [14, 26]. 4мг TNF у комбінації з мелфаланом та інтерфероСпосіб попереднього націлювання може бути також здійснений шляхом проведення двофазової ном g [16]. В інших роботах було показано, що інпроцедури з використанням біспецифічного антитерферон g може бути відсутнім, і що для індукутіла, яке одночасно зв'язується з пухлинним антивання терапевтичної відповіді можуть виявитися геном і з модифікованим цитокіном. Нещодавно достатніми навіть більш низькі дози TNF [17,18]. було описане використання біспецифічного антиОскільки два цитокіна здійснюють синергічну дію тіла проти карциноембріонального антитіла та на ендотеліальні клітини, і їх об'єднане селективне TNF як спосіб для попередньої доставки TNF у націлювання на ці клітини приводять, ймовірно, до пухлину [31]. більш сильної протипухлинної активності, то таким Відповідно до іншого варіанту свого втілення, чином можна вирішити проблеми, пов'язані з сисданий винахід відноситься до молекули TNF, кон'темною токсичністю, які звичайно виникають при югованої як з лігандом CD13, так і з антитілом, або лікуванні злоякісних пухлин з використанням тих з його фрагментом (безпосередньо або опосередже цитокінів, взятих у комбінації один з одним. ковано зв'язаним через біотин-авідиновий місток) Крім того, відомо, що TNF може знижувати бар'єрна різних субодиницях TNF, де вказане антитіло ну функцію судин з ендотеліальною вистилкою, що або його фрагменти направлені проти антигену, приводить до збільшення їх проникності для мак 9 85365 10 ромолекул. Враховуючи більш низьку токсичність Фігура:3: Вплив обмеженого трипсинового гідмодифікованих молекул TNF даного винаходу, що ролізу NGR-TNF і TNF на їх масу (а) та протипухвикористовуються для лікування, та їх самонацілинну активність (b) люючих власти востей по відношенню до пухлинТрипсин-агарозу одержують шляхом взаємодії них судин, то вони можуть мати альтернативне 1мг трипсину з 1мл активованої СН-сефарози застосування у терапії або у діагностиці, яке базу(Pharmacia-Upjohn) відповідно до інструкцій вироється на збільшенні проникності пухлинних судин бників. NGR-TNF і TNF (170мкг кожного у 300мкл для інших сполук. Так, наприклад, модифікований 0,15М хлориду натрію, 0,05М фосфату натрію, рН TNF може бути використаний для збільшення по7,3) змішують з 15мкл суспензії смоли (1:4) або глинання пухлиною радіоактивно мічених антитіл тільки з буфером, і перемішують шля хом безпереабо гормонів (сполук, що візуалізують пухлину) рвного обертання при 37°С протягом певного часу. при радіоімуносцинтиграфії або радіоімунотерапії Чотири продукти фільтрують через фільтруючий пухлин. Альтернативно, може бути також збільшепристрій Spin-X 0,22мкм (Costar, Cambridge, MA) і не поглинання хіміотерапевтичних лікарських зазберігають при -20°С аж до їх використання, (а) собів, імунотоксинів, ліпосом, що несуть лікарські Mac-спектрометричний аналіз шляхом електроназасоби або гени, або інших протиракових лікарсьпилення. Величини молекулярних мас і відповідні ких засобів, так, щоб їх протипухлинна дія посипродукти (N-кінцеві послідовності) вказані на кожлювалася. ному піку. Стрілки на послідовностях означають Відповідно до цього, цитокіни даного винаходу сайт розщеплення. (b) Дія 1 або 3мкг NGR-TNF і можуть бути використані у комбінованих препараTNF, інкубованих без трипсину (верхні панелі) або тах, окремих препаратах або препаратах, які ввоз трипсином (нижні панелі), на ріст пухлин RMA-T і дяться послідовно, а також разом з іншими діагновагу тварин (середнє±середня квадратична похибстичними або терапевтичними речовинами для ка для груп, оброблених дозами 1 і 3мкг). Тварин лікування або діагностики злоякісних пухлин. обробляють на 13-й день після імплантації пухлиВ останньому своєму аспекті, даний винахід ни (n=5 тварин/групи). відноситься до кДНК, що кодує описані тут кон'юФігура 4: Електрофорез у ΠΑΑΓ з ДСН та проговані цитокіни, які можуть бути одержані з кДНК типухлинна активність людського NGR-TNF до і цитокінів шляхом додання 5'- або 3'-безперервної після денатурації/повторного укладання ДНК-послідовності, що кодує ліганд CD13, а переЕлектрофорез у ПААГ з ДСН в умовах, що неважно, вищеописані пептиди, відповідальні за хоредукують, (А) людського TNF (a), NGR-TNF до (b) мінг. Комбінована кДНК може бути використана і після (с) процесу денатурації/повторного уклабезпосередньо або після введення у вектори, які дання описаний у Прикладі V. застосовуються у генній терапії. Одержання і теВплив TNF і NGR-TNF, не підданого повторрапевтичне застосування відповідних векторів ному укладанню, на ріст лімфом RMA-T (В) і на описане у роботі [19], яка вводиться у даний опис масу тіла (С). Дія людського TNF (D) та повторно за допомогою посилання. укладеного NGR-TNF (що складається з >95% Фігура 1: Вплив TNF і NGR-TNF на ріст лімфом тримерів з дисульфідами всередині ланцюга) (Е) RMA-T (а і b) та на масу тварини (с i d) на ріст пухлини. Тварин (15 або 5 мишей/групу як 5 тварин на групу обробляли разовою дозою показано у кожній панелі) обробляли і.р. однією TNF або NGR-TNF (і.р.) через 10 днів після імдозою TNF або NGR-TNF через 10 днів після імплантації пухлини. Площу п ухлини оцінювали на плантації пухлини. 14-й день в залежності від дози (b), а втрату маси Даний винахід більш детально проілюстровапісля лікування (середнє у дні 11 і 12) (d) інтерпоний нижченаведеними прикладами. лювали, виходячи з логарифмічних кривих. ПротиПриклад l пухлинна дія, індукована введенням 1мкг або 9мкг Одержання мишачих TNF і NGR-TNF NGR-TNF на 14-й день, перевищувала дію, індукоМишачий рекомбінантний TNF і Cys-Asn-Glyвану порівнянними кількостями TNF (Р=0,024 і Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) продукували шляхом Р=0,032, відповідно), при цьому, втрата маси після експресії цитоплазматичної кДНК у Е.coli. кДНК, вказаної обробки була аналогічною. Стрілками що кодує мишачий Met-TNF1-156 [20], одержували вказані екстрапольовані дози TNF і NGR-TNF, які за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі індукують порівнянну дію. зворотною транскриптазою (ОТ-ПЛР) на мРНК, що Фігура 2: Дія mAb R3-63 і CNGRC на протипухвиділена з стимульованих ліпополісахаридом милинну активність NGR-TNF (a) i TNF (b). шачих моноцитарних-макрофагальних клітин mAb R3-63 або CNGRC змішують з NGR-TNF RAW-264.7 з використанням 5'або TNF і вводять тваринам з пухлиною RMA-T на CTGGATCCTCAC AGAGCAATGACTCCAAAG-3' і 5'12-й день після імплантації пухлини (n=5 тваTGCCTCAC ATATGCTCAGATC ATCTTCTC-3' як 3'- і рин/групу). В окремому експерименті (с), TNF і 5'- 14 праймерів. NGR-TNF спільно вводять з CNGRC або CARAC Ампліфікований фрагмент гідролізували фер(контрольний пептид) тваринам з 11-денними пухментами Ndel та ВатНІ (New England Biolabs, линами (n=5). Протипухлинна дія 1мкг NGR-TNF Beverley, MA) і клонували у вектор pET-11b була сильнішою за протипухлинну дію 9мкг TNF (Novagen, Madison, WI), заздалегідь гідролізований (Р=0,009, т-критерій, день 20) і ця дія значною мітими ж ферментами (pTNF). рою інгібувалася CNGRC (P=0,035) та mAb R3-63 кДНК, що кодує C ys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1(P=0,011). 156 , ампліфікували за допомогою ПЛР на pTNF, з використанням 5'GCAGATCATATGTGC AACGGCCGTTGCGGCCTC 11 85365 12 AGATCATCTTCTC-3' як 5'-праймера та вищезгаодному мл кожна) інтенсивно промивали стерильданого 3'-праймера. Ампліфікований фрагмент ними розчинами, які не містять ендотоксинів, загідролізували та клонували у pET-11b, як описано вантажували очищений TNF або NGR-TNF у PBS і вище, і використовували для трансформації клітин десорбували шляхом градієнтного елюювання BL21(DE3) E.coli (Novagen). Експресію TNF і NGR(1год., буфер A: PBS; буфер В: 0,5М хлорид натрію, 0,2Μ гліцин-НСl). Фракції, які містять TNFTNF індукували ізопропіл-b-D-тіогалактозидом відантиген, нейтралізували та діалізували проти степовідно до інструкцій виробників рЕТ11b. Розчинний TNF і NGR-TNF виділяли з дволітрових кульрильного фізіологічного розчину. Для запобігання адсорбції білка на мембранах, перед діалізом дотур шля хом обробки бактерій ультразвуком у 2мМ давали альбумін сироватки людини, що не містить етилендіамінотетраоцтовій кислоті, 20мМ Трисендотоксину (0,5мг/мл). Вміст TNF у кожній фракції НСl, рН 8,0, з подальшим центрифугуванням вимірювали за допомогою ELISA та аналізу на (15000´g, 20хв., 4°С). Обидва екстракти змішували цитоліз. з сульфатом амонію (25% насичення), залишали Електрофорез TNF у нередукуючому П ААГ з на 1год. при 4°С, а потім центрифугували, як опиДСН виявив одну смугу 17-18кДа, очікувану для сано вище. Потім сульфат амонію у супернатантах мономерного TNF (не показано). На відміну від доводили до 65%-ного насичення, залишали при цього, електрофорез NGR-TNF у нередукуючому 4°С на 24год., після чого центрифугували. Кожний ПААГ з ДСН і вестерн-блот-аналіз NGR-TNF виосад розчиняли у 200мл 1M сульфату амонію, явили різні імунореактивні форми 18, 36 і 50кДа, 50мМ Трис-НСІ, рН 8,0, і очищали за допомогою ймовірно відповідні мономерам, димерам і тримегідрофобної хроматографії на фенілсефарозі 6 рам. У редукуючи х умовах, більшість з 50- і 36кДаFast Flow (Pharmacia-Upjohn) (градієнтне елююсмуг були перетворені у 18кДа-форму, що вказування, буфер А: 50мМ фосфат натрію, рН 8,0, що вало на присутність молекул NGR-TNF з дисульмістить 1M сульфат амонію; буфер В: 20% гліцефідними містками всередині ланцюга. 18кДа-смуга рин, 5% метанол, 50мМ фосфат натрію, рН 8,0). становила, за оцінками, приблизно 2/3 від всього Фракції, які містять TNF-імунореактивний матеріал матеріалу, тоді як 36кДа-смуга становила більшу (Вестерн-блотінг), об'єднували, діалізували проти частину решти матеріалу. Ці електрофоретичні 2мМ етилендіамін-тетраоцтової кислоти, 20мМ картини дають підставу припустити, що NGR-TNF Трис-НСІ, рН 8,0, а потім очищали іонообмінною являє собою суміш тримерів, яка складається з хроматографією на DEAE-сефарозі 6 Fast Flow трьох мономерних субодиниць з «правильними» (Pharmacia-Upjohn) (градієнтне елюювання, буфер дисульфідами всередині ланцюга (принаймні, А: 50мМ Трис-НСІ, рН 8,0; буфер В: 1мМ хлорид 50%), а інша частина, в основному, складається з натрію, 20мМ Трис-НСІ, рН 8,0). Фракції, які містримерів з одним або декількома дисульфідами, тять TNF-імунореактивний матеріал, об'єднували і розташованими між ланцюгами. Наявність 36кДаочищали гель-хроматографією на сефакрилі-S-300 смуги, що ще спостерігається за допомогою елекHR (Pharmacia-Upjohn), заздалегідь зрівноважуватрофорезу у редукуючому П ААГ з ДСН, дозволяє ли та елюювали 150мМ хлоридом натрію, 50мМ припустити, що NGR-TNF містить також необоротфосфа тно-натрієвим буфером, рН 7,3 (PBS). Франо денатурований димер (приблизно 10% від загакції, які відповідають продуктам з відносною молельної кількості). кулярною масою (Mr) 40000-50000, об'єднували, Молекулярна маса мономерів TNF і NGR-TNF розділяли на аліквоти та зберігали у замороженоскладала 17386,1±2,0Да і 17843,7±2,5Да, відповідму вигляді при -20°С. Усі розчини, що використоно, як було визначено за допомогою масвуються у хроматографічних стадіях, одержували спектрометрії шляхом електронапилення. Ці зназ використанням стерильної води, яка не містить чення дуже добре відповідають масі, очікуваній ендотоксинів (Salf, Bergamo, Italy). Кінцеві виходи для Met-TNF1-156 (17386,7Да) та для CNGRCGскладали 45мг TNF і 34,5мг NGR-TNF. TNF1-156 (17844,2Да). Молекулярну масу очищеного TNF і NGR-TNF Приклад ll вимірювали за допомогою мас-спектрометрії шляIn vitro-цитотоксична активність мишачих TNF і хом електронапилення. Вміст білка вимірювали з NGR-TNF використанням комерційно доступного набору для Біологічну активність TNF і NGR-TNF оцінювааналізу білків (Pierce, Rockford, IL). Вміст ендотокли за допомогою стандартного аналізу на цитоліз, сину у NGR-TNF і TNF становив 0,75одиниць/мкг проведеного на мишачих фібробластах L-M (АТСС та 1,38одиниць/мкг, відповідно, як було визначено CCL1.2), як описано у роботі (23). Цитолітичну акза допомогою кількісної хромогенної проби з лізативність TNF і NGR-TNF на клітинах RMA-T тестутом амебоцитів (лімулюс-тест) (BioWhittaker). вали у присутності 30нг/мл актиноміцину D. КожЕлектрофорез у поліакриламідному гелі з доний зразок аналізували у дублікатах при трьох децилсульфатом натрію (ДСН-ПААГ) та вестернрізних розведеннях. Результати виражені як сереблот-аналіз здійснювали з використанням 12,5 або днє±сер.кв.пох. для двох-трьох незалежних аналі15% поліакриламідного гелю у відповідності зі стазів. ндартними процедурами. In vitro-цитотоксична активність TNF і NGRНевелику кількість TNF і NGR-TNF додатково TNF складала (1,2±0,14)´108одиниць/мг і очищали афінною хроматографією на розчинному p55-TNF-рецепторi (sTNF-R1)-сефарозі, як описа(1,8±0,7)´108одиниць/мг, відповідно, як було вино нижче: 5мг рекомбінантного sTNF-R1 одержузначено за допомогою стандартного аналізу на вали, як описано у роботі [22], і зв'язували з 2мл цитоліз з використанням клітин L-M. Ці результати активованої СН-сефарози (Pharmacia) відповідно показали, що група CNGRCC у молекулі NGR-TNF до інструкцій виробників. Дві окремі колонки (по 13 85365 14 не запобігає укладанню, олігомеризації та скріпальбуміну бичачої сироватки, як носія, до розчинів ленню з TNF-рецепторами. TNF або NGT-TNF. Кожний експеримент проводиУ попередній стадії, авторами було виявлено, ли з використанням 5 мишей на групу. За ростом що клітини RMA-T можуть бути лізовані TNF у припухлини щодня спостерігали шляхом вимірювання сутності 30нг/мл актиноміцину D, тоді як у відсутрозміру пухлини за допомогою штангенциркуля. ності інгібіторів транскрипції, ці клітини є резистенПлощу пухлини оцінювали шляхом обчислення тними до TNF навіть після інкубування протягом r1´r2 , а об'єм п ухлини оцінювали шляхом обчисдекількох днів. In vitro цитотоксичність NGT-TNF на лення r1´r2´r 3´4/3, де r1 і r2 означають подовжній і клітинах RMA-T у присутності актиноміцину D поперечний радіуси, а r 3 означає товщин у п ухлискладала (1,4±0,8)´108одиниць/мг, як було виміряни, яка виступає над поверхнею нормальної шкіри. но з використанням TNF При досягненні пухлиною діаметра 1,0-1,3см, тва((1,2±0,14)´108одиниць/мг) як стандарт. Таким чирин умертвляли. Розміри пухлин виражали як сеном, цитотоксичні активності NGT-TNF і TNF були редню величину± сер.кв.пох. (5-10 тварин на груаналогічні як на клітинах L-M, так і на клітинах пу, як вказано в описі графічного матеріалу) і RMA-T. порівнювали із застосуванням т-критерію. Приклад lll Протипухлинну активність і токсичність NGTХарактеризація терапевтичної і токсичної акTNF порівнювали з відповідною активністю і токситивності мишачих TNF і NGT-TNF чністю TNF з використанням моделей лімфоми Індуковану вірусом Раушера лімфому RMA, RMA-T і меланоми B16F1 на мишах C57BL6. Оскіщо походить від C57BL/6, витримували in vitro у льки модель RMA-T була раніше охарактеризовасередовищі RPMI 1640, яке містить 5% фетальну на і використана для дослідження протипухлинної бичачу сироватку (FBS), 100од/мл пеніциліну, активності TNF у різних схемах його направленої 100мкг/мл стрептаміцину, 0,25мкг/мл амфотеридоставки [26], то автори даного винаходу вирішили цину В, 2мМ глутаміну та 50мкМ 2використати цю модель також і у даному дослімеркаптоетанолу. R MA-T одержували з клітинної дженні. лінії RMA шляхом трансфекції конструкцією, що Мишачий TNF, що вводиться тваринам, які некодує алель Thy 1.1, та культивували, як описано у суть вже розвинені підшкірні пухлини RMA-T, роботі [14]. спричиняв через 24 години зниження маси пухлиКлітини меланоми B16F1 культивували у сени та геморагічного некрозу в центральній частині редовищі RPMI 1640, що містить 5% FBS, пухлини з подальшим значним сповільненням рос100од/мл пеніциліну, 100мкг/мл стрептаміцину, ту пухлини протягом декількох днів [26]. Разова 0,25мкг/мл амфотерицину В, 2мМ глутаміну, 1% TNF-обробка не індукувала повну регресію цієї MEM із замінною амінокислотою (BioWhittaker пухлини навіть при дозах, близьких до LD50, і при Europe, Venders, Belgium). цьому, живі клітини, які залишилися навколо некДослідження in vivo на моделях тварин були ротичної зони починали знову рости через декільсхвалені Комітетом з етики при Науковока днів після обробки. дослідному інституті у Рафаелі (Ethical Committee У першій серії експериментів, авторами даного of the San Raffaele Η Scientific Institute) і проводивинаходу були проведені дослідження дії різних лися відповідно до інструкцій. Мишам C57BL/6 доз (і.р.) TNF або NGT-TNF на виживання тварин. (Charles River Laboratories, Calco, Italy) (16-18г) у Щоб не завдавати тваринам зайвих страждань, їх умертвляли, коли діаметр пухлини досягав більше лівий бік підшкірно (s.c.) ін'єктували 5´104 живих клітин RMA-T або B16F1, відповідно. Через де1-1,3см. Летальні ефекти TNF і NGT-TNF через 3 дні після обробки були аналогічні (LD50, 60мкг і сять-дванадцять днів після імплантації пухлини, 45мкг, відповідно), тоді як їх протипухлинна активмишей обробляли, і.р., 250мкл розчинами TNF або ність помітно відрізнялася (таблиця 1). NGT-TNF, розведеними 0,9% хлоридом натрію, що не містить ендотоксин. Попередні експерименти показали, що протипухлинна активність не змінювалася при доданні Таблиця 1 Виживання мишей з лімфомою RMA-T, оброблених мишачим TNF aбo NGT-TNF Обробка None TNF Тварини Доза (n) (мкг) 18 4 9 9 14 9 9 0 1 3 9 27 54 108 День 3 100 100 100 100 100 55 0 Виживання (%)а після обробки День 38 День 62 День 7 День 14 День 21 День 30 (2-а стим.)b) (3-a стим.)b) День 92 0 20 0 55 0 55 22 11 0 57 14 7 0 55 0 15 85365 16 Продовження таблиці 1 1 NGRTNF 2 10 10 9 13 9 9 3 1 3 9 27 54 108 4 100 100 100 100 33 0 5 70 80 88 85 33 6 10 20 55 30 0 7 10 20 22 23 8 10 20 11 15 9 0 0 11 15 10 11 15 11 11 15 a) Тварин з пухлиною обробляли TNF або NGT-TNF (і.р.) через 10 днів після імплантації пухлини. Тварин умертвляли, коли діаметр пухлини перевищував 1-1,3см. b) Тваринам, які вижили, повторно вводили 50000 клітин RMA-T (друга стимуляція) або 50000 RMA (третя стимуляція) у вказаний час. При цьому, кожний раз у вказаний час проводили моніторинг онкогенності ін'єктованих клітин з використанням для порівняння 5 нормальних тварин. У всі х контрольних тварин розвивалася пухлина протягом 10 днів (дані не наводяться). Так, наприклад, введення 1 або 3мкг NGT-TNF приводило до сповільнення росту пухлини більш ефективно, ніж 27мкг TNF, що вказувало на те, що NGT-TNF, принаймні, на один порядок величини був більш активним. Цікаво зазначити, що деякі тварини виліковувалися дозами NGT-TNF, які були нижчими за LD50, в той час як жодна з тварин не виліковувалася TNF. У вилікуваних тварин спостерігалося відторгнення клітин RMA-T або клітин RMA дикого типу, введених при подальших ін'єкціях онкогенних доз, що дає підставу припускати, що обробка лише одним NGT-TNF здатна індукувати протективний імунітет. Заслуговує уваги той факт, що збільшення дози TNF або NGT-TNF вище за 927мкг приводить до помітного збільшення токсичності та до зниження терапевтичної активності або до її відсутності. Втрата маси після TNF-обробки є добре відомою ознакою системної токсичності [26]. Так, наприклад, для подальшого порівняння співвідношення ефективність/токсичність TNF і NGT-TNF, авторами був проведений моніторинг росту пухлини та маси тварин після обробки. Дія 1мкг NGTTNF на ріст пухлини була аналогічною або перевищувала дію 9мкг TNF (Фіг.1а), а втрата маси за один-два дні після обробки була порівнянною з втратою маси після обробки 1мкг TNF (Фіг.1с). Після інтерполяції даних по логарифмічній кривій на графіку «доза-відповідь», авторами було виявлено, що терапевтичний ефект, який одержується при введенні 9мкг TNF на 14-й день, може бути досягнутий, принаймні, при введенні 0,6мкг NGTTNF (Фіг.1b). На противагу цьому, для індукування порівнянної токсичної дії необхідно 8,5мкг (Фіг.1d). Таким чином, обчислене співвідношення ефективність/токсичність NGT-TNF за цих умов у 14 разів вище, ніж це співвідношення для TNF. Аналогічні результати були одержані на моделі меланоми B16F1. Обробка 1мкг NGT-TNF на день 11 і на день 17 індукувала протипухлинну відповідь на день 19, яка перевищувала відповідь, одержану з використанням 4мкг TNF та була аналогічною відповіді, одержаній з використанням 12мкг TNF (дані не наводяться). На противагу цьому, втрата маси, викликана введенням 1мкг NGT-TNF, була помітно нижчою, ніж втрата маси, викликана введенням 4 і 12мкг TNF. Обробка 12мкг NGT-TNF давала навіть більш сильний протипухлинний ефект, а токсична дія була аналогічна токсичній дії, що спостерігається з використанням 12мкг TNF. При введенні третьої ін'єкції на день 19, деякі тварини гинули через 1-2 дні у всі х групах (2 з 5 у групі, обробленій фізіологічним розчином і 12мкг NGT-TNF, і 1 з 5 в інших група х). Слід зазначити, що у однієї тварини, обробленої 12мкг NGT-TNF, спостерігалося повне відторгнення пухлини. При введенні цій тварині другої онкогенної дози клітин В16F1, через 18 днів розвивалася пухлина, що пальпується, а у контрольних тварин пухлина розвивалася за 6-7 днів. Загалом, ці результати дають підставу припустити, що е фективність NGT-TNF відносно інгібування росту пухлини у 10-15 раз вище, ніж ефективність TNF, тоді як їх токсичності є аналогічними. Крім того, NGT-TNF може індукувати протективні імунні відповіді більш ефективно, ніж TNF. Приклад IV Ме ханізм дії NGT-TNF mAb проти мишачих CD13, R3-63, виділяли з асцитичних рідин за допомогою хроматографії на комплексі «білок G - сефароза» (PharmaciaUpjohn, Uppsala, Sweden), та діалізували проти 0,9% хлориду натрію. Кролячу поліклональну сироватку одержували від Primm srl (Milan, Italy) та очи щали за допомогою афінної хроматографії на комплексі «білок А сефароза» (Pharmacia-Upjohn). Пептиди CNGRC і CARAC одержували, як описано раніше [28]. Для підтвердження того факту, що підвищена активність NGT-TNF залежить від його доставки в пухлину за допомогою частини NGR, авторами були проведені дослідження для того, щоб визначити, чи може in νινο-активність NGT-TNF частково конкурувати з CNGRC. Для цього, мишам з пухлиною RMA-T вводили NGT-TNF (1мкг) разом з молярним надлишком CNGRC або без нього. Паралельно, інших тварин обробляли TNF (3 або 9мкг), і знову разом з CNGRC або без нього. Як і очікувалося, введення CNGRC приводило до значного зменшення протипухлинної активності NGT-TNF (Фіг.2а), але не TNF (Фіг.2b). На відміну від CNGRC, контрольний пептид (CARAC) був нездатний спричиняти значне зниження NGT-TNF 17 85365 18 активності (Фіг.2с). Ці результати дозволяють приhTNF-кодуючу послідовність [33] з використанням пустити, що CNGRC конкурує з NGT-TNF за скріпнаступних праймерів: лення з рецептором CNGRC, підтверджують гіпоNGR-hTNF/1 (смисловий): 5' А ТАТ CAT ATG тезу про механізм доставки, який сприяє TGC AAC GGC GGT TGC GGC GTC AGA TCA збільшенню активності. Слід зазначити, що TCdT TCT CG 3'; CNGRC не здатний до зниження in vitro цитотоксиNGR-hTNF/2 (антисмисловий): 5' TCA GGA чної активності NGT-TNF (дані не наводяться). ТСС TCA CAG GGC AAT GAT ССС ААА GTA GAC Оскільки нещодавно повідомлялося, що амі3'. нопептидаза N(CD13) є рецептором для пептидів Ампліфікований фрагмент гідролізували та CNGRC, то авторами було проведене дослідження клонували у рЕТ11b (NdeI/ВаmHI) і використовудля того, щоб визначити, який внесок вносить давали для трансформації клітин Е.coli BL21(DE3) ний рецептор у механізм доставки NGT-TNF. З (Novagen). Експресію NGT-hTNF індукували ізоцією метою, автори досліджували дію анти-CD13 пропіл-b-D-тіогалактозидом відповідно до інструкантитіла (mAb) (R3-63) на протипухлинну активцій виробників рЕТ11b. Розчинний NGT-TNF видіність NGT-TNF і TNF. mAb R3-63 значно інгібувало ляли з дволітрових культур шля хом обробки протипухлинну активність NGT-TNF (Фіг.2а), але бактерій ультразвуком у 2мМ етилендіамінтетраоне TNF (Фіг.2b), що вказувало на те, що CD13 дійцтовій кислоті, 20мМ Трис-НСІ, рН 8,0, з подальсно грає вирішальну роль у протипухлинній актившим центрифугуванням (15000´g, 20хв., 4°С). ності NGT-TNF. При проведенні FACS-аналізу Екстракт змішували з сульфатом амонію (35% культивованих клітин з використанням mAb R3-63, насичення), залишали на 1год. при 4°С, а потім ніякої експресії CD13 на поверхні клітин RMA-T не центрифугували як описано вище. Сульфат амоспостерігалося (дані не наводяться), що дозволяє нію у супернатантах доводили до 65%-ного насиприпустити, що in vivo це антитіло розпізнавало чення, залишали на 24год. при 4°С, а потім інші клітини. центрифугували. Кожний осад розчиняли в 1M Хоча ці дані вказують на те, що CD13 є важлисульфаті амонію, 50мМ Трис-НСІ, рН 8,0, і очищавим рецептором для NGT-TNF, автори даного вили гідрофобною хроматографією на фенілнаходу не могли повністю виключити той факт, що сефарозі 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (градієнтпевний внесок у механізм доставки також вносить, не елюювання, буфер А: 100мМ фосфат натрію, хоч і в меншій мірі, скріплення з іншими ще не ідерН 8,0, що містить 1M суль фат амонію; буфер В: нтифікованими NGR-рецепторами. 70% етиленгліколь, 5% метанол, 100мМ фосфат Попередні експерименти за частковим протенатрію, рН 8,0). Фракції, що містять hTNFолізом показали, що зв'язок Arg-Ser у N-кінцевому імунореактивний матеріал (як було визначено за сегменті TNF (залишки 2-3) дуже чутливий до тридопомогою ELISA), об'єднували, діалізували проти псину, тоді як інша частина молекули є значно 20мМ Трис-НСІ, рН 8,0, а потім очищали іонооббільш резистентною. Таким чином, для одержання мінною хроматографією на DEAE-сефарозі Fast додаткового підтвердження того факту, що підвиFlow (Pharmacia-Upjohn) (градієнтне елюювання, щена активність NGT-TNF асоційована з його часбуфер А: 20мМ Трис-НСІ, рН 8,0; буфер В: 1M тиною NGR, авторами даного винаходу були хлорид натрію, 20мМ Трис-НСІ, рН 8,0). Усі розчизроблені спроби відщепити домен NGR від Nни, що використовуються у хроматографічних стакінцевої області мутеїн у шляхом часткового гідродіях, одержували з використанням стерильної волізу іммобілізованим трипсином. Ця обробка приди, яка не містить ендотоксинів (Salf, Bergamo, водила до перетворення NGT-TNF і TNF у молекуItaly). лу, яка відповідає фрагменту TNF3-156 (очікувана На цій стадії, з дволітрових культур виділяли мас 16986,2Да; див. Фіг.3а для виміряної маси і 30мг TNF і 32мг NGT-TNF. Електрофорез у нерепередбачуваних послідовностей). дукуючому ПААГ з ДСН виявив смуги, які відповіХоча гідроліз не приводив до зниження in vitro дають мономерам, димерам і тримерам, що дало цитолітичної активності NGT-TNF на клітинах L-M підставу припустити, що людський NGT-TNF також (2,3±1,4)´108од/мл), однак, його протипухлинна являє собою суміш тримерів з "правильними" диактивність in vivo знижувалася до рівня TNF сульфідами всередині ланцюга і тримерів з одним (Фіг.3b). Слід зазначити, що токсичність NGT-TNF і або декількома дисульфідними містками між ланTNF була аналогічною як до, так і після гідролізу, цюгами (Фіг.4А, доріжка b), як це спостерігалося як було оцінено за втратою маси тваринами через для мишачого NGT-TNF. один день після обробки (Фіг.3b, права панель), Тримери з «правильними» дисульфідними міщо дозволяє припустити, що механізм NCRстками всередині ланцюга були виділені з цієї сузалежної доставки не впливає на токсичність. міші чотирьохстадійним способом денатураціїПриклад V повторного укладання, проведеним таким чином: Одержання і характеризація людського TNF і очищений людський NGT-TNF денатурували 7М NGT-TNF сечовиною і піддавали гель-фільтрації на колонці з Людський рекомбінантний TNF і NGT-TNF (що сефакрилом S-300 HR (1025мл) (Pharmacia), заскладається з людського TNF1-157, приєднаного здалегідь урівноваженої 7М сечовиною, 100мМ до С-кінця CNGRCG) одержували методами рекоТрис-НСІ, рН 8,0. Фракції, які відповідають мономбінантних ДНК та очищали, в основному, як опимерному TNF, об'єднували, піддавали ультрафільсано вище для мишачого TNF і NGT-TNF. кДНК, трації через 10кДа-мембрану YM MWCO (Amicon) і що кодує NGT-TNF людини, одержували за допопіддавали повторному укладанню шляхом діалізу могою ПЛР на плазміді pET11b/hTNF, що містить проти 33 об'ємів 2,33Μ сечовини, 100мМ Трис-НСІ, рН 8, при 4°С (140хв), а потім проти 1,55Μ сечови 19 85365 20 ни, 100мМ Трис-НСІ, рН 8 (140хв) і 1Μ сечовини, BL21(DE3) (Novagen). Експресію білка індукували 100мМ Трис-НСІ, рН 8 (140хв). І нарешті, продукт ізопропіл-b-D-тіогалактозидом відповідно до індіалізували проти 80 об'ємів 100мМ Трис-НСІ струкцій виробників рЕТ11b. Продукт очищали з (16год.), центрифугували при 13000´g (30хв), фіекстрактів Е.coli імуноафінною хроматографією з льтрували через 0,45мкм-мембрану SFCA використанням антитіла mAb проти мишачих IFNg (Nalgene) і піддавали гель-фільтрації на колонці з (AN 18), іммобілізованого на агарозі у відповідноссефакрилом S-300 HR (1020мл), заздалегідь урівті до стандартних процедур. Електрофорез кінценоваженої 0,15Μ хлориду натрію, 0,05Μ фосфату вого продукту у редук уючому та у нередукуючому натрію (PBS). Було виділено приблизно 23мг проПААГ з ДСН виявив одну см угу 16кДа. Масдукту з повторним укладанням. спектрометрія шляхом електронапилення виявила Після проведення електрофорезу у нередукумолекулярну масу 16223+3,6Да (передбачувана ючому ПААГ з ДСН (Фіг.4а, доріжка с), кінцевий маса 1625,5Да), що відповідає мишачому Metпродукт був, в основному, мономерним, мав гідроIFNg1-134(C134S)CNGRC(NGT-IFNg). динамічний об'єм, аналогічний об'єму тримерного Здатність NGT-IFNg і NGT-TNF конкурува ти з людського TNF, як було визначено за допомогою антитілом проти CD13 за скріплення з пухлинноааналітичної гель-ВЕРХ на колонці з супердексом соційованими судинами досліджували імуногісто75 HR (дані не наводяться) і мав молекулярну махімічним методом. су 17937,8+1,8Да (очікувану для CNGRCG-TNF1Свіжі хірургічні зразки карциноми клітин нирок 157, 17939,4Да), як було визначено за допомогою людини одержували з Відділення гістопатології мас-спектрометрії шляхом електронапилення. ЦиНауково-дослідного інституту у Ра фаелі. Одержутолітичні активності in vitro не підданого і піддановали зрізи (товщиною 5-6мкм) фіксованих буїном го повторному укладанню NGT-TNF на мишачих (4-6год.) і залитих у парафін зразків та адсорбуваклітинах L-M становили (6,11´107)+4,9 і ли на предметних скельцях, покритих полілізином. (5,09´107)+0,3одиниць/мг, відповідно, тоді як актиАнтигенний CD13 детектували методом з викорисвність очищеного людського TNF становила танням комплексу «авідин-біотин», як описано (5,45´107)+3,1одиниць/мг. Ці результати дають нижче: тканинні зрізи регідратували з використанпідставу припустити, що процес денатураціїням ксиліту і серії високосортних спиртів відповідповторного укладання не впливає на взаємодію но до стандартних процедур. Тканинні зрізи вмілюдського NGT-TNF з мишачим рецептором р55. щували у посудин у, яка містить 1мМ EDTA, і Протипухлинна in νiνo-активність 1мкг людськип'ятили протягом 7 хвилин у мікрохвильовій печі кого NGT-TNF (без повторного укладання) була (1000Ват). Потім посудину повторно заповнювали більшою, ніж активність 10мкг TNF (Фіг.4В), тоді як 1мМ EDTA і знову кип'ятили протягом п'яти хвитоксичність, оцінена за втратою маси тварини, лин. Тканинні зрізи залишали для охолодження та була значно нижчою (Фіг.4С). Після повторного інкубували у PBS, що містить 0,3% пероксид водукладання, 0,3мкг NGT-TNF було досить для індуню протягом 15 хвилин для нейтралізації ендогенкування більш сильного протипухлинного ефекту, ної пероксидази. Потім зразки промивали PBS та ніж це досягалося з використанням 10мкг TNF інкубували з 100-200мкл PBS-BSA (1год. при кім(Фіг.4В, 4Е). натній температурі), а потім з mAb W15 (проти Ці результати показали, що протипухлинна акhCD13), взятим окремо або в суміші з різними контивність людського NGT-TNF перевищує активкуруючими агентами (див. таблицю 2) у PBS-BSA ність людського TNF. (протягом ночі при 4°С). Предметні скельця проКрім того, автори спостерігали, що повторно мивали три рази PBS (3 хвилини кожне) та інкубуукладений людський і мишачий NGT-TNF можуть вали з PBS-BSA, що містить 2% нормальну кінську індукувати значні протипухлинні ефекти у мишей, сироватку (PBS-BSA-NHS) (Vector Laboratories, які несуть RMA-T, навіть при дуже низьких дозах Burlingame, СА) протягом 5 хвилин. Потім розчин (1-10нг/миша) при відсутності токсичної дії, тоді як замінювали 3мкг/мл біотинільованого кінського TNF не здатний індукувати значні ефекти при вкаантитіла проти мишачих IgG (H+L) (Vector заних дозах (дані не наводяться). Laboratories, Burlingame, CA) у PBS-BSA-NHS і Приклад VI знову інкубували протягом 1 години при кімнатній Одержання і характеризація мишей з NGTтемпературі. Предметні скельця знову промивали та інкубували протягом 30 хвилин з реагентом IFNg Vectastatin Elite (Vector Laboratories, Burlingame, Рекомбінантний мишачий інтерферон (IFN)g, CA), розведеним 1:100 у PBS. Потім таблетку 3,3'злитий з CNGRCG (NGT-IFNg), одержували методіаміно-бензидин-тетрагідрохлориду (Merck, дами рекомбінантних ДНК, в основному, як описаDarmstadt, Germany) розчиняли у 10мл деіонізовано для NGT-TNF. Домен CNGRC був приєднаний ної води, яка містить 0,03% пероксиду водню, фідо С-кінця IFNg. Крім того, цистеїн у положенні 134 льтрували через 0,2мкм-мембрану, та наносили на був замінений серином, а метіонін був введений у тканинні зрізи протягом 5-10хв. Предметні скельця положення -1 для експресії у клітинах Е.coli. Для промивали як описано вище та піддавали контраспродукування кДНК NGT-IFNy використовували тному фарбуванню гематоксиліном Харріса. ПухПЛР-праймери: 5' А ТАТ СТА CAT ATG C AC GGC линноасоційовані судини були ідентифіковані за АС А GTC ATT GAA FGC С (значеннєвий) і 5' ТС фарбуванням зрізів тканини анти-СD31 антитілом GGA ТСС ТС А GC A ACG GCC GTT GC A GCC mAb (mab JC/70A, антитіло проти людських CD13, GGA GCG ACT ССТ ТТТ CCG СТТ ССТ GAG GC. IgGl від DAKO, Copenhagen, Denmark). кДНК клонували у рЕТ-11b (Ndel/BamHI) і викорисРезультати систематизовані у Таблиці 2. Як товували для трансформації клітин Е.coli показано у таблиці, скріплення WM15 з пухлинно 21 85365 22 асоційованими судинами інгібувалось надлишком Авторами даного винаходу був зроблений виNGT-TNF, NGT-IFNg і CNGRC, але не іншими консновок, що NGR-частина NGT-IFNg і NGT-TNF мотрольними реагентами, в яких був відсутній мотив же взаємодіяти з формою CD13, яка розпізнається NGR. Це дає підставу припускати, що сайт скріпmAb WM15 на пухлинноасоційованих судинах. лення NGR на CD13 стерично перекривається з Крім того, ці результати показали, що мотив епітопом WM15. На противагу цьому, NGT-TNF CNGRC є функціональним при його приєднанні як був нездатний конкурувати з 13С03 за скріплення до N-кінця, так і до С-кінця цитокіну. з епітеліальними клітинами. Таблиця 2 Скріплення WM15 зі зрізами раку нирок у присутності різних конкурентів Конкурент відсутній NGT-TNF (25мкг/мл) NGT-IFNg (50мкг/мл) CNGRC (100мкг/мл) TNF (25мкг/мл) Альбумін людської сироватки (25мкг/мл) Синтетичний CgA (60-68) (100мкг/мл) Скріплення WM15 з пухлинноасоційованими судинами + + + + A Конкурент, у PBS, що містить 2% BSA, додавали на стадії блокування і змішували з «першим» антитілом. b mAb WM15 (проти люд. CD13, IgGl) одержували від Pharmingen (San Diego, CA); Синтетичний пептид CgA (60-68) відповідає фрагменту 60-68 хромограніну А. Приклад VII Направлена доставка біотинільованого NGTTNF до пухлин з використанням антипухлинних антитіл та авідину (попередня доставка) У нижченаведеному прикладі проілюстрована можливість «подвійної» доставки TNF, яка базується на комбінації антипухлинного антитіла, що самонацілюється, та пептиду CNGRC. Кон'югат «біотин-NGR-TNF» одержували шляхом змішування NGT-TNP з Nгідроксисукцинімідоефіром D-біотиніл-6амінокапронової кислоти (Societa Prodotti Antibiotici S.pA, Milan, Italy) у 1 M натрій-карбонатному буфері, рН 6,8 (3год. при кімнатній температурі) [21]. Реакцію блокували 1M Трис-НСІ, рН 7,5. Кон'югат характеризували за допомогою масспектрометрії і було виявлено, що він містив 1 біотин/тример (в середньому). Потім мишам C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Italy) у лівий бік підшкірно (s.c.) ін'єктували 5´104 живих клітин RMA-T. Коли площа пухлини досягала 40мм 2, мишам послідовно вводили ін'єкції біотинільованого антитіла, авідину та біотин-TNF відповідно до «триденного» протоколу, описаного раніше [26]. Було ін'єктовано: 40мкг біотин-mАb19Е12 (і.р., стадія І); 60мкг авідину та 60мкг стрептавідину через 18 і 19год., відповідно (і.р., стадія II); і 3мкг біотинNGT-TNF, через 24год. (і.р., стадія III). Кожну сполуку розводили стерильним 0,9%-ним розчином хлориду натрію. У контрольному експерименті, авідин та стрептавідин не використовували. Кожний експеримент здійснювали з використанням 5 мишей на групу. Моніторинг пухлини проводили щодня шляхом вимірювання розміру пухлини за допомогою штангенциркуля. У групі, обробленій mAb 19Е12-біотин/авідин/стрептавідин/біотинNGT-TNF (5 тварин, середнє+сер.кв.пох.), площі пухлин за 10 днів до обробки і через 10 днів після обробки становили 39+4мм 2 та 8±5мм 2, відповідно. У контрольній групі (обробленій mAb тільки 19Е12біотин/біотин-NGT-TNF), площі пухлин за 10 днів до обробки і через 10 днів після обробки становили 40±4мм 2 та 20±6мм 2, відповідно, що вказувало на те, що попередня доставка з використанням антипухлинного антитіла, що самонацілюється, та авідину приводила до збільшення активності NGTTNF. Бібліографія 1. Carswell, Ε. Α., et al., An endotoxin-induced seram factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975.72:3666-70. 2. Helson, L., et al., Effect of tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nature 1975. 258:731-732. 3. Tracey, K. J., and A. Cerami. Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Ann. Rev. Cell Biol, 1993. 9:317-43. 4. Hoogenboom, H. R., et al., Construction and expression of antibodytumor necrosis factor fusion proteins. Mol. Immunol. 1991. 28:1027-37. 5. Loetscher, H., et al., Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75kDa TNF receptors. J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-7. 6. Yang, J., et al., A genetically engineered singlechain FV/TNF molecule possesses the anti-tumor immunoreactivity of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81. 7. Van Ostade, X., et al., Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor. Nature 1993. 361:266-9. 8. Paganelli, G., et al.. Three-step monoclonal antibody tumor targeting in carcinoembryonic antigenpositive patients. Cancer Res. 1991. 51:59606. 23 85365 24 9. Paganelli, G., et al., Clinical application of the relationships and mechanism of action on avidin avidin-biotin system for tumor targeting. In D. pretargeted tumor cells. Cancer Res. 1998. 58:3866Goldenberg (Ed. Cancer therapy with radiolabeled 3872. antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995. P. 23922. Corti, Α., et al., Up-regulation of p75 Tumor 253. Necrosis Factor alpha receptor in Mycobacterium 10. Modorati, G., et al., Immunoscintigraphy with avium-infected mice. Infect. Immun. 1999, 67:5762three step monoclonal pretargeting technique in 5767. diagnosis of uveal melanoma: preliminary results. Br. 23. Corti, Α., et al., Tumor necrosis factor (TNF) alpha J. Ophtalm. 1994. 78:19-23. guantification by ELISA and bioassay: effects of TNF 11. Colombo, P., et al., Immunoscintigraphy with antialpha-soluble TNF receptor (p55) complex chromogranin A antibodies in patients with dissociation during assay incubations. J. Immunol. endocrine/neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. Meth. 1994. 177:191-198. 1993. 16:841-3. 24. Ljunggren, H. G., and K. Karre. Host resistance 12. Debs, R. J., et al., Liposome-associated tumor directed selectively against H-2-deficient lymphoma necrosis factor retains bioactivity in the presence of variants. Analysis of the mechanism. J. Exp. Med. neutralizing anti-tumor necrosis factor antibodies. J. 1985. 162:1745-59. Immunol. 1989. 143:1192-7. 25. Celik, C, et al., Demonstration of immunogenicity 13. Debs, R. J., et al., olmmunomodulatory and toxic with the poorly immunogenic B16 melanoma. Cancer effects of free and liposome-encapsulated tumor Res. 1983.43:3507-10. necrosis factor alpha in rats. Cancer Res. 1990. 26. Gasparri, Α., et al., Tumor pretargeting with avidin 50:375-80. improves the therapeutic index of biotinylated tumor 14. Моrо, М., et al, Tumor cell targeting with antibodynecrosis factor alpha in mouse models. Cancer Res. avidin complexes and biotinylated tumor necrosis 1999. 59:2917-23. factor alpha. Cancer Res. 1997. 57:1922-8. 27. Palladino, Μ. Α., Jr., et al., Characterization of the 15. Schraffordt Koops, et al., Hyperthermic isolated antitumor activities of human tumor necrosis factorlimb perfusion with tumour necrosis factor and alpha and the comparison with other cytokines: melphalan as treatment of locally advanced or induction of tumor-specific immunity. J. Immunol. recurrent soft tissue sarcomas of the extremities. 1987. 138:4023-32. Radiothepray & Oncology 1998.48:1-4. 28. Arap, W., et al., Cancer treatment by targeted 16. Lienard, D., et al., In transit metastases of drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. malignant melanoma treated by high dose rTNF alpha Science 1998. 279:377-80. in combination with interferon-gamma and melphalan 29. Fiers, W. Biologic therapy with TNF: preclinical in isolation perfusion. World Journal of Surgery studies. In V. De Vita, S. Hellman, and S. Rosenberg 1992.16:234-40. Eds). Biologic therapy of cancer: principles and 17. Hill, S., et al., Low-dose tumour necrosis factor practice. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, alpha and melphalan in hyperthermic isolated limb 1995. P. 295-327. perfusion. Br. J. Sugr. 1993. 80:995-7. 30. Rathjen, D. Α., et al., 1992. Selective 18. Eggermont, A. M., et al., Isolated limb perfusion enhancement of the tumour necrotic activity o f TNF with tumor necrosis factor and melphalan for limb alpha with monoclonal antibody. Brit. J. Cancer salvage in 186 patients with locally advanced soft 65:852. tissue extremity sarcomas. The cumulative 31. Robert, В., et al., 1996. Cytokine targeting in multicenter European experience. Ann. Surg. 1996. tumors using a bispecific antibody directed against 224:756-65. carcinoembryonic antigen and tumor necrosis factor 19. Mizuguchi, H., et al., Tumor necrosis factor alphaalpha. Cancer Res. 56:4758. mediated tumor regression by the in vivo transfer of 32. Fraker, D.L., Ale xander, H.R. & Pass, H.I., 1995. genes into the artery that leads to tumor. Cancer Res. Biologic therapy with TNP: systemic administration 1998. 58:5725-30. and isolation-perfusion. In Biologic therapy of cancer: 20. Pennica, D., et al., Cloning and expression in principles and practice, De Vita, V., Hellman, S. & Escherichia coli of the cDNA for murine tumor Rosenberg, S. (eds) pp. 329-345. J.B. Lippincott necrosis factor. Proc. Natl Acad.Sci. USA Company: Philadelphia. 1985.82:6060-4. 33. Pennica, D., et al., 1984. Human tumor necrosis 21. Corti, Α., et al., Tumor targeting with biotinylated factor: precursor, structure, expression and homology tumor necrosis factor alpha: Structure activity to lymphotoxin. Nature, 321, 724-729. 25 85365 26 27 85365 28 29 85365 30 31 85365 32 33 85365 34 35 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 85365 Підписне 36 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601