Антитіло людини, яке специфічно зв’язується з фактором росту нервів (ngf)

Реферат: UA 100382 C2 (12) UA 100382 C2 Винахід належить до виділеного антитіла людини, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервів (NGF) з високою афінністю. Винахід також належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує дане антитіло, вектора експресії, способу одержання антитіла, фармацевтичної композиції. Застосування антитіла при виробництві лікарського препарату, що застосовується для пом'якшення або пригнічення захворювання або патологічного стану в організмі людини, опосередкованих NGF. UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід стосується антитіл людини та антигензв'язувальних фрагментів антитіл людини, які специфічним чином зв'язують фактор росту нервів (NGF) людини, і терапевтичних способів застосування зазначених антитіл. Матеріали, використані при підготовці заявки Фактор росту нервів (NGF) був першим із виявлених нейротрофінів, і його роль у розвитку та виживанні як периферичних нейронів, так і нейронів центральної нервової системи, була добре описана. Було показано, що NGF є найважливішим фактором виживання та збереження функцій при розвитку периферичних симпатичних та ембріональних сенсорних нейронів і базальних холінергічних нейронів переднього мозку (Smeyne et al. (1994) Nature 368:246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76:1001-1011). NGF активізує експресію нейропептидів у сенсорних нейронах (Lindsay et al. (1989) Nature 337:362-364), і його активність опосередкована двома різними інтегрованими в мембрану рецепторами, рецептором TrkA і спільним рецептором нейротрофінів p75. Рівень NGF підвищений у синовіальній рідині пацієнтів, що страждають на ревматоїдний артрит та інші форми артриту. Було показано, що антагоністи NGF попереджують гіперальгезію та алодинію на моделях невропатичного і хронічного запального болю у тварин. Антитіла анти-NGF описані, наприклад, у WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, у публікаціях патентів США 2005/0074821, 2004/0237124 і 2004/0219144. Стислий опис винаходу У першому аспекті даний винахід стосується повнорозмірних антитіл людини та їхніх антигензв'язувальних фрагментів, які специфічним чином зв'язують фактор росту нервів (NGF) людини з KD близько 5 пМ або менше і не вступають у перехресну реакцію з нейротрофіном-3 (NT-3). У переважному варіанті здійснення антитіло анти-NGF або його фрагмент зв'язує NGF людини з KD близько 1,0 пМ або менше. Для даних антитіл характерне зв'язування з NGF із високою афінністю, високою специфічністю та здатність нейтралізувати активність NGF. У переважних варіантах здійснення антитіло або його фрагмент зв'язує NGF людини приблизно в 2-10 разів вище, ніж NGF щура та/або NGF миші. Антитіла можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіла IgG1 або IgG4) або включати лише антигензв'язувальну частину (наприклад, фрагмент Fab, F(ab') 2 або scFv) і можуть бути модифіковані з метою впливати на функціональність, наприклад, видаляти залишкові ефекторні функції (Glu, що видаляє залишкові ефекторні функції (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:19251933)). В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), вибрану з групи SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 104, 108, 112, 116, 132, 136, 140, 156, 160, 176, 180, 184, 200, 204, 208, 224, 228, 232, 236, 240, 256, 260, 264, 280, 284, 288, 304, 308, 312, 328, 332, 336, 352, 356, 360, 376, 380, 384, 400, 404, 420, 424, 440, 456, 460, 464, 480, 484, 488, 504, 508, 512, 528 і 532, або її по суті аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; більш переважно, антитіло або його фрагмент містить HCVR, представлену як SEQ ID NO: 108, 100 або 84; і ще більш переважно, HCVR є амінокислотною послідовністю, представленою як SEQ ID NO: 108. В одному з варіантів здійснення антитіло або його фрагмент, крім того, містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), вибрану з групи SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 102, 106, 110, 114, 124, 134, 138, 148, 158, 168, 178, 182, 192, 202, 206, 216, 226, 230, 234, 238, 248, 258, 262, 272, 282, 286, 296, 306, 310, 320, 330, 334, 344, 354, 358, 368, 378, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 448, 458, 462, 472, 482, 486, 496, 506, 510, 520, 530 і 534, або її суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %. У переважному здійсненні LCVR є SEQ ID NO: 110, 102 або 92; ще більш переважно, LCVR є амінокислотною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 110. У конкретних здійсненнях антитіло або його фрагмент містить пару послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), вибрану з групи SEQ ID NO: 4/12, 20/28, 36/44, 52/60, 68/76, 84/92, 100/102, 104/106, 108/110, 112/114, 116/124, 132/134, 136/138, 140/148, 156/158, 160/168, 176/178, 180/182, 184/192, 200/202, 204/206, 208/216, 224/226, 228/230, 232/234, 236/238, 240/248, 256/258, 260/262, 264/272, 280/282, 284/286, 288/296, 304/306, 308/310, 312/320, 328/330, 332/334, 336/344, 352/354, 356/358, 360/368, 376/378, 380/382, 384/392, 400/402, 404/412, 420/422, 424/432, 440/448, 456/458, 460/462, 464/472, 480/482, 484/486, 488/496, 504/506, 1 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 508/510, 512/520, 528/530 і 532/534. У переважному здійсненні парою HCVR/LCVR є SEQ ID NO: 108/110, 100/102 або 84/92; більш переважно, SEQ ID NO: 108/110. У другому аспекті даний винахід стосується антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла, що містить домен CDR3 (HCDR3) важкого ланцюга, вибраний із SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 122, 146, 166, 190, 214, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 410, 430, 446, 470, 494 і 518, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; і домен CDR3 (LCDR3) легкого ланцюга, вибраний із 18, 34, 50, 66, 82, 98, 130, 154, 174, 198, 222, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 418, 438, 454, 478, 502 і 526, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %. У переважному здійсненні парою HCDR3/LCDR3 є SEQ ID NO: 90 і 98, 214 і 222; 410 і 418; 430 і 438; або 446 і 454; більш переважно, SEQ ID NO: 90 і 98. У подальшому варіанті здійснення даного винаходу наводиться антитіло або його фрагмент, що додатково містить домен CDR1 (HCDR1) важкого ланцюга, вибраний із SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 118, 142, 162, 186, 210, 242, 266, 290, 314, 338, 362, 386, 406, 426, 442, 466, 490 і 514, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; домен CDR2 (HCDR2) важкого ланцюга, вибраний із SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 120, 144, 164, 188, 212, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 408, 428, 444, 468, 492 і 516, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; домен CDR1 (LCDR1) легкого ланцюга, вибраний із SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 126, 150, 170, 194, 218, 250, 274, 298, 322, 346, 370, 394, 414, 434, 450, 474, 498 і 522, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; і домен CDR2 (LCDR2) легкого ланцюга, вибраний із SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 128, 152, 172, 196, 220, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 416, 436, 452, 476, 500 і 524, або його суттєво аналогічну послідовність, яка ідентична зазначеній послідовності на не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %. У переважному здійсненні послідовностями CDR важкого та легкого ланцюгів є SEQ ID NO: 86, 88, 90, 94, 96 і 98; 210, 212, 214, 218, 220 і 222; 406, 408, 410, 414, 416 і 418; 442, 444, 446, 450, 452 і 454; і 426, 428, 430, 434, 436 і 438; ще більш переважно, послідовностями CDR є SEQ ID NO: 86, 88, 90, 94, 96 і 98. У третьому аспекті даного винаходу наводяться молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла анти-NGF або їхні фрагменти. Даний винахід також охоплює рекомбінантні вектори експресії, що несуть нуклеїнові кислоти даного винаходу, і клітини-хазяїни, в які включаються такі вектори, а також способи приготування антитіл шляхом культивування клітин-хазяїнів за умов, що допускають виробництво антитіл та одержання вироблених у такий спосіб антитіл. В одному варіанті здійснення даного винаходу наводиться антитіло або його фрагмент, що містить HCVR, кодовану послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 103, 107, 111, 115, 131, 135, 139, 155, 159, 175, 179, 183, 199, 203, 207, 223, 227, 231, 235, 239, 255, 259, 263, 279, 283, 287, 303, 307, 311, 327, 331, 335, 351, 355, 359, 375, 379, 383, 399, 403, 419, 423, 439, 455, 459, 463, 479, 483, 487, 503, 507, 511, 527 і 531, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; більш переважно, HCVR кодується послідовністю SEQ ID NO: 107 або 99. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент додатково містить LCVR, кодовану послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 101, 105, 109, 113, 123, 133, 137, 147, 157, 167, 177, 181, 191, 201, 205, 215, 225, 229, 233, 237, 247, 257, 261, 271, 281, 285, 295, 305, 309, 319, 329, 333, 343, 353, 357, 367, 377, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 447, 457, 461, 471, 481, 485, 495, 505, 509, 519, 529 і 533, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; переважно, LCVR кодується послідовністю SEQ ID NO: 109 або 101. В одному варіанті здійснення даного винаходу наводиться антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що містить домен HCDR3, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 121, 145, 165, 189, 213, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 409, 429, 445, 469, 493 і 517, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; і домен LCDR3, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 129, 153, 173, 197, 221, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 417, 437, 453, 477, 501 і 525, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не 2 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %. У переважному здійсненні послідовності HCDR3 і LCDR3 кодуються SEQ ID NO: 89 або 97 відповідно. У додатковому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент додатково містить домен HCDR1, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 117, 141, 161, 185, 209, 241, 265, 289, 313, 337, 361, 385, 405, 425, 441, 465, 489 і 513, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; домен HCDR2, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 119, 143, 163, 187, 211, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 407, 427, 443, 467, 491 і 515, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; домен LCDR1, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 125, 149, 169, 193, 217, 249, 273, 297, 321, 345, 369, 393, 413, 433, 449, 473, 497 і 521, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %; і домен LCDR2, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 127, 151, 171, 195, 219, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 415, 435, 451, 475, 499 і 523, або її суттєво аналогічну послідовність із гомологією не менш ніж 90 %, не менш ніж 95 %, не менш ніж 98 % або не менш ніж 99 %. У переважному здійсненні антитіло або його фрагмент містить послідовності CDR важкого ланцюга, кодовані SEQ ID NO: 85, 87 і 89; і послідовності CDR легкого ланцюга, кодовані SEQ ID NO: 93, 95 і 97. У четвертому аспекті даного винаходу наводиться ізольоване антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, який специфічним чином зв'язує NGF людини, що 1 2 3 4 містить HCDR3 і LCDR3, де HCDR3 містить амінокислотну послідовність формули X –X –X –X – 5 6– 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17– 18 1 2 X –X X –X –X –X –X –X –X –X –X –X –X X (SEQ ID NO: 537), де X – Ala або Ser, X – 3 4 5 6 7 Thr або Lys, X – Glu або Ile, X – Phe або Gly, X – Val або Gly, X – Val або Trp, X – Val або 8 9 10 11 12 Phe, X – Thr або Gly, X – Asn або Lys, X – Phe або Leu, X – Asp або Phe, X – Asn або Ser, 13 14 15 16 X – Ser або відсутній, X – Tyr або відсутній, X – Gly або відсутній, X – Met або відсутній, 17 18 X – Asp або відсутній і X – Val або відсутній; і LCDR3 містить амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6– 7 8 9 1 2 3 4 формули X –X –X –X –X –X X –X –X (SEQ ID NO: 540), де X – Gln, X – Gln, X – Tyr, X – Asn, 5 6 7 8 9 X – Arg або Asn, X – Tyr або Trp, X – Pro, X – Tyr або Trp і X – Thr. У більш конкретному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент додатково містить 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 послідовність HCDR1 формули X –X –X –X –X –X –X –X (SEQ ID NO: 535), де X – Gly, X – 3 4 5 6 7 8 Phe, X – Thr або Asn, X – Phe або Leu, X – Thr або Asp, X – Asp або Glu, X – Tyr або Leu і X 1 2 3 4 5 6 7 8 1 – Ser або Ala; послідовність HCDR2 формули X –X –X –X –X –X –X –X (SEQ ID NO: 536), де X 2 3 4 5 6 7 – Ile або Phe, X – Asp або Ser, X – Pro або Trp, X – Glu або Asn, X – Asp або Ser, X – Gly, X – 8 1 2 Thr, Glu або Ser, X – Thr або Ile; HCDR3 містить амінокислотну послідовність формули X –X – 3 4 5 6– 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17– 18 1 X –X –X –X X –X –X –X –X –X –X –X –X –X –X X (SEQ ID NO: 537), де X – Ala або 2 3 4 5 6 7 Ser, X – Thr або Lys, X – Glu або Ile, X – Phe або Gly, X – Val або Gly, X – Val або Trp, X – 8 9 10 11 12 Val або Phe, X – Thr або Gly, X – Asn або Lys, X – Phe або Leu, X – Asp або Phe, X – Asn 13 14 15 16 або Ser, X – Ser або відсутній, X – Tyr або відсутній, X – Gly або відсутній, X – Met або 17 18 1 2 відсутній, X – Asp або відсутній і X – Val або відсутній; послідовність LCDR1 формули X –X – 3 4 5 6 1 2 3 4 X –X –X –X (SEQ ID NO: 538), де X – Gln або Arg, X – Ala, Ser або Thr, X – Val або Ile, X – 5 6 1 2 3 Arg або Thr, X – Asn, Phe або Tyr і X – Asp або Asn; послідовність LCDR2 формули X –X –X 1 2 3 (SEQ ID NO: 539) де X – Gly або Ala, X – Ala і X – Ser або Phe; і LCDR3 містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6– 7 8 9 1 2 3 послідовність формули X –X –X –X –X –X X –X –X (SEQ ID NO: 540), де X – Gln, X – Gln, X 4 5 6 7 8 9 – Tyr, X – Asn, X – Arg або Asn, X – Tyr або Trp, X – Pro, X – Tyr або Trp і X – Thr. У п'ятому аспекті даного винаходу наводиться повністю людське антитіло або фрагмент антитіла, який блокує активність NGF з IC50 менше 10 нМ, відповідно до результатів вимірювання in vitro за допомогою PC12-клітинного аналізу (описано нижче). У переважному здійсненні антитіло винаходу демонструє IC50 близько 500 пМ або менше; ще більш переважно, IC50 близько 100 пМ або менше, близько 50 пМ або менше, або близько 25 пМ або менше. В одному варіанті здійснення даний винахід описує ізольоване антитіло людини або його антигензв'язувальну ділянку, що зв'язує NGF із константою афінності (K D) менш ніж приблизно 500 пМ, переважніше, менш ніж приблизно 300 пМ, ще переважніше, менш ніж приблизно 100 пМ, менш ніж приблизно 50 пМ, менш ніж приблизно 20 пМ, менш ніж приблизно 10 пМ, менш ніж приблизно 5 пМ або менш ніж приблизно 1 пМ, за даними поверхневого плазмонного резонансу (BIACORE™). У переважному здійсненні антитіло анти-NGF людини або фрагмент антитіла даного винаходу зв'язує NGF людини з K D близько 0,5 пМ або менше. У переважних здійсненнях антитіло або його фрагмент зв'язує NGF людини при більш високій афінності – приблизно в 1,5 рази, 2 рази, 3 рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9 разів або 10 разів 3 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вище ніж NGF щура, і приблизно в 1,5 рази, 2 рази, 2,5 рази, 3 рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9 разів або 10 разів вище ніж NGF миші. У переважному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент має високу специфічність щодо NGF людини, наприклад, не вступає у перехресну реакцію з близькоспорідненим нейротрофіном-3 (NT-3). Так, у переважному здійсненні антитіло або його фрагмент із високою афінністю та високою селективністю демонструє KD для NGF людини на рівні 1,0 пМ або менше, інгібує зв'язування NGF із рецепторами TrkA і p75, і не вступає в перехресну реакцію з NT-3 людини, за даними поверхневого плазмонного резонансу. NT-3 відіграє вирішальну роль у таких фізіологічних процесах як, наприклад, м'язова координація за допомогою мотонейронів, і, таким чином, антитіла або фрагменти антитіл, що не вступають у перехресну реакцію з NT-3, забезпечують несподівану клінічну та терапевтичну перевагу в порівнянні з уже відомими антитілами. Було показано, що NT-3 запобігає розвитку термальної гіпералгезії на моделі невропатичного болю по типу хронічної компресії (див., наприклад, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25:758-767). Останнім часом було продемонстровано, що NT-3 суттєво знижує експресію натрієвих каналів, що, як припускають, провокують невропатичний біль (WilsonGerwing & Verge (2006) Neuroscience 141:2075-2085). Ці дані свідчать про сприятливу роль NT-3 у пригніченні невропатичного болю. Даний винахід стосується антитіл анти-NGF із модифікованою структурою глікозилювання. У деяких застосуваннях може виявитися корисним видалити небажані сайти глікозилювання або використовувати антитіло без фукозного фрагмента в олігосахаридному ланцюгу, наприклад, для посилення функції антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В інших застосуваннях може здійснюватися модифікація галактозилювання, для того щоб змінити комплементзалежну цитотоксичність (CDC). У шостому аспекті даний винахід стосується суміші, що включає рекомбінантне антитіло людини або його фрагмент, яке специфічно зв'язує NGF, і прийнятний носій. В аналогічному аспекті даного винаходу наводиться суміш, що являє собою поєднання інгібітора NGF і другого терапевтичного засобу. В одному варіанті здійснення інгібітор NGF є антитілом або його фрагментом. У переважному здійсненні другим терапевтичним засобом є будь-який придатний терапевтичний засіб, який оптимальним чином поєднується з інгібітором NGF. У сьомому аспекті даний винахід стосується способів інгібування NGF людини за допомогою антитіла анти-NGF або антигензв'язувальної ділянки антитіла даного винаходу. Порушенням, що підлягає лікуванню, є будь-яке захворювання або патологічний стан, яке поліпшується, полегшується, пригнічується або попереджається за рахунок усунення, інгібування або зниження активності NGF. Більш конкретно, у винаході пропонується спосіб лікування патологічних станів або захворювань, опосередкованих NGF, наприклад, запального болю, післяопераційного болю шва, комплексного регіонарного больового синдрому, болю при первинному або метастатичному раку кістки, невропатичного болю, болю при переломах, болю при остеопорозних переломах, болю, викликаного опіками, остеопорозом, суглобового болю при подагрі, болю, пов'язаного із загостреннями при серпоподібноклітинній анемії, інших ноцицептивних болів, а також гепатоклітинної карциноми, раку молочної залози та цирозу печінки шляхом введення інгібітора NGF, наприклад, антитіл даного винаходу або їхніх фрагментів як при монотерапії, так і як другого терапевтичного засобу. У переважних варіантах невропатичного болю бажана терапія реперкусійної невралгії трійчастого нерва, постгерпетичної невралгії, фантомного болю в ампутованих кінцівках, фіброміалгії, симпатичної рефлекторної дистрофії та нейрогенних болів. Другим терапевтичним засобом може бути інгібітор інтерлейкіну-1 (IL-1), наприклад, злитий білок, подібний до описаного в патенті США U.S. 6927044; або ж антиепілептичний засіб, наприклад, габапентаїн, прегабалін, топірамат або ж трициклічний антидепресант, наприклад, амітриптилін; целекоксиб; антагоніст цитокінів, наприклад, білок-антагоніст або антитіло проти IL-1, IL-6, IL-6R, IL-18 або IL-18R. В одному варіанті здійснення другим терапевтичним засобом є інший нейротрофін, наприклад, NT-3. У восьмому аспекті даний винахід стосується застосування описаного вище антитіла або антигензв'язувального фрагмента для пом'якшення або інгібування захворювання або патологічного стану в організмі людини, опосередкованого NGF. Опосередкований NGF патологічний стан або хвороба пригнічуються без помітного погіршення моторної координації, і до таких станів належать запальний біль, післяопераційний біль шва, невропатичний біль, біль при переломах, суглобовий біль при подагрі, постгерпетична невралгія, біль, викликаний опіками, біль при раку, біль при остеоартриті або ревматоїдному артриті, ішіасі, біль, пов'язаний із загостреннями при серпоподібноклітинній анемії або постгерпетична невралгія. У пов'язаному аспекті даний винахід також передбачає використання описаного вище антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла при виробництві лікарського препарату, 4 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що застосовується для пом'якшення або інгібування захворювання або патологічного стану в організмі людини, опосередкованого NGF. Інші цілі та переваги стануть очевидними при ознайомленні з наведеним нижче детальним описом. Повний опис винаходу Перш ніж розпочати опис наведеного способу, слід зазначити, що даний винахід не обмежується конкретними способами та викладеними експериментальними умовами, оскільки такі способи та умови можна змінювати. Слід також розуміти, що використовувана в даному документі термінологія призначена виключно для опису конкретних здійснень і не носить обмежувального характеру, оскільки охоплення даного винаходу обмежується лише прикладеною формулою винаходу. Якщо не зазначене інше, всі технічні та наукові терміни, використовувані в даному документі, мають таке ж значення, яке загальновідоме рядовим фахівцям у галузі, до якої належить даний винахід. Хоча на практиці або при перевірці даного винаходу можуть використовуватися будь-які методи та матеріали, аналогічні або ідентичні описаним у даному документі, нижче наводиться опис переважних методів і матеріалів. Визначення Термін "фактор росту нервів людини", або "NGF", використовуваний у даному документі, означає NGF людини з послідовністю нуклеїнової кислоти, представленою в SEQ ID NO: 1, та амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, або його біологічно активний фрагмент. Використовуваний у даному документі термін "антитіло" призначений для позначення молекул імуноглобуліну, складених із чотирьох поліпептидних ланцюгів, при цьому два важкі (Н) ланцюги та два легкі (L) ланцюги зв'язуються один з одним дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (що скорочено називається в даному документі HCVR або VH) і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів: CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (що скорочено називається в даному документі LCVR або VL) і константну ділянку легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену: CL. Ділянки VH і VL можуть далі підрозділятися на ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (CDR), які перемежовуються ділянками з більш високим рівнем консервативності, що називаються остовними ділянками (FR). Кожна ділянка VH і VL утворена трьома CDR і чотирма FR, розташованими від амінотермінального кінця до карбокси-термінального кінця в такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Використовуваний у даному документі термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла (або просто "частина антитіла" або "фрагмент антитіла") позначає один або декілька фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, NGF). Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може здійснюватися фрагментами всієї послідовності антитіла. До прикладів зв'язувальних фрагментів, включених у термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, належать (i) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) фрагмент F(ab') 2, бівалентний фрагмент, що складається з двох фрагментів Fab, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (iii) фрагмент Fd, що складається з доменів VH і CH1; (iv) фрагмент Fv, що складається з доменів VL і VH окремої ділянки антитіла; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), що складається з домену VH; та (vi) окрема ділянка, що визначає комплементарність (CDR). Більше того, незважаючи на те, що два домени у фрагменті Fv, VL і VH кодуються різними генами, їх можна об'єднати, використовуючи рекомбінантні технології, за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє побудувати з них єдиний білковий ланцюжок, в якому ділянки VL і VH зв'язуються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одиничний ланцюг Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883). Такі одноланцюгові антитіла також включаються в сферу охоплення терміна "антигензв'язувальна ділянка" антитіла. Сюди ж входять й інші форми одноланцюгових антитіл, наприклад, діатіла. Діатіла являють собою бівалентні біспецифічні антитіла, в яких домени VH і VL експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але довжина з'єднуючого їх лінкера занадто мала для зв'язування двох доменів на одному й тому ж ланцюзі, що змушує домени одного ланцюга зв'язуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга, створюючи тим самим два сайти зв'язування антигену (див., наприклад, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Далі, антитіло або його антигензв'язувальна ділянка можуть бути частиною більших імуноасоційованих молекул, утворених ковалентною або нековалентною асоціацією антитіла 5 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або частини антитіла та однієї або більше білкової молекули або пептиду. Приклади таких імуноадгезивних молекул включають використання ділянки ядра стрептавідину для одержання тетрамірної молекули scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) і використання залишку цистеїну, маркера-пептиду та C-термінального полігістидинового маркера для одержання бівалентних і біотинільованих молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Частини антитіл, такі як фрагменти Fab і F(ab') 2, можуть бути одержані з цільних антитіл за допомогою стандартних методик, таких як папаїнове та пепсинове розщеплення цільних антитіл відповідно. Крім того, антитіла, частини антитіл та імуноасоційовані молекули можуть бути одержані з використанням стандартних технологій рекомбінантної ДНК, як описано в даному документі. Використовуваний у даному документі термін "антитіло людини" призначений для позначення антитіл з варіабельною та константною ділянками, одержаних з імуноглобулінових послідовностей зародкових ліній людини. Описувані в даному винаході антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані імуноглобуліновими послідовностями зародкових ліній людини (наприклад, мутації, викликані випадковим або сайт-специфічним мутагенезом in vitro або соматичними мутаціями in vivo), наприклад, в ділянках CDR, особливо в ділянці CDR3. Однак використовуваний у даному документі термін "антитіло людини" не має на увазі включення антитіл, в яких у каркасні ділянки послідовності людини вставлені CDR послідовності, одержані із зародкових ліній іншого виду ссавців, наприклад, миші. Використовуваний у даному документі термін "рекомбінантне антитіло людини" має на увазі включення всіх типів антитіл людини, які одержують, експресують, створюють або виділяють із використанням рекомбінантних технологій, у тому числі антитіл, експресованих із використанням рекомбінантного вектора експресії, трансфекованого в клітину-хазяїна (як описано нижче), антитіл, виділених із рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл людини (як описано нижче), антитіл, виділених із тварини (наприклад, миші), трансгенної стосовно генів імуноглобуліну людини (див., наприклад, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), а також антитіл, одержаних, експресованих, створених або виділених із використанням будь-яких інших методів, що використовують сплайсинг послідовностей гена імуноглобуліну людини на інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельну та константну ділянки, одержані з імуноглобулінових послідовностей зародкових ліній людини. У ряді здійснень, однак, такі рекомбінантні антитіла людини піддаються мутагенезу in vitro (або при використанні тварин, трансгенних за імуноглобуліном людини, соматичним мутагенезом in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності ділянок VH і VL рекомбінантних антитіл виявляються послідовностями, які, хоча й одержані з послідовностей VH і VL ділянок зародкових ліній людини та пов'язані з цими послідовностями, можуть бути відсутніми у природно існуючому in vivo наборі послідовностей зародкових ліній людини. Використовуваний у даному документі термін "ізольоване антитіло" призначений для позначення антитіла, суттєво вільного від інших антитіл, що мають іншу антигенну специфічність (наприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує NGF, суттєво вільне від антитіл, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від NGF). Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує NGF, проте, може мати перехресну реактивність до інших антигенів, наприклад, до молекул NGF з інших видів. Більше того, ізольоване антитіло може бути суттєво вільним від інших клітинних матеріалів і/або хімічних реагентів. Використовуваний уданому документі термін "нейтралізуюче антитіло" (або "антитіло, що нейтралізує активність NGF") призначений для позначення антитіла, зв'язування якого з NGF призводить до інгібування біологічної активності NGF. Таке інгібування біологічної активності NGF може оцінюватися за допомогою вимірювання одного або декількох показників біологічної активності NGF, таких як клітинна активація, індукована NGF, і зв'язування NGF з рецептором NGF. Дані показники біологічної активності NGF можуть оцінюватися за допомогою одного або декількох методів аналізу in vitro або in vivo, відомих фахівцям (див. приклади нижче). "CDR", або ділянка, що визначає комплементарність, являє собою ділянку гіперваріабельності, що перемежовується ділянками з більш високим рівнем консервативності, які називаються "остовними ділянками". Групу ділянок CDR можна визначити як узгоджену послідовність амінокислот. Використовуваний у даному документі термін "поверхневий плазмонний резонанс" стосується оптичного явища, яке дозволяє проводити аналіз біоспецифічних взаємодій у реальному часі за рахунок детектування змін концентрацій білка в біосенсорній матриці, наприклад, за допомогою системи BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). 6 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовуваний у даному документі термін "KD" призначений для позначення рівноважної константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Використовуваний у даному документі термін "ізольована молекула нуклеїнової кислоти" стосовно нуклеїнових кислот, що кодують антитіла або частини антитіл (наприклад, VH, VL, CDR3), які зв'язують NGF, призначений для позначення молекули нуклеїнової кислоти, в якій нуклеотидні послідовності, що кодують антитіла або частини антитіл, вільні від інших нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла або частини антитіл, які зв'язують антигени, відмінні від NGF, і такі інші послідовності можуть природно розташовуватися по обох кінцях цієї нуклеїнової кислоти в геномній ДНК людини. Так, наприклад, ізольована нуклеїнова кислота даного винаходу, що кодує ділянку VH антитіла анти-NGF, не містить ніяких інших послідовностей, що кодують інші ділянки VH, які зв'язують антигени, відмінні від NGF людини. Використовуваний у даному документі термін "епітоп" включає будь-який детермінант, переважно поліпептидний детермінант, здатний до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або рецептором Т-клітини. У ряді здійснень епітопні детермінанти включають згруповані на поверхні хімічно активні молекули, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і в ряді здійснень можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні зарядові характеристики. Епітоп являє собою ділянку антигену, яка зв'язується з антитілом. У деяких здійсненнях вважається, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, якщо воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків і (або) макромолекул. У переважних здійсненнях вважається, що антитіло -8 специфічно зв'язується з антигеном, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10 М, -9 більш переважно, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10 М, і найбільш -10 переважно, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10 М. Термін "суттєва ідентичність" або "по суті ідентичні" стосовно нуклеїнової кислоти або її фрагмента означає, що при оптимальному зіставленні з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом) із відповідними додаваннями або делеціями спостерігається ідентичність нуклеотидної послідовності не менш ніж на приблизно 90 % і, більш переважно, не менш ніж на 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % основ нуклеотидів, що вимірюється за допомогою будь-якого відомого алгоритму ідентичності послідовностей, наприклад, FASTA, BLAST або GAP, які обговорюються нижче. Застосовуваний відносно поліпептидів термін "суттєва подібність" або "по суті подібні" означає, що дві пептидні послідовності при їхньому оптимальному зіставленні, наприклад, за допомогою програм GAP або BESTFIT з урахуванням ваги гепів за замовчуванням, демонструють ідентичність послідовностей не менш ніж на 90 %, і ще більш переважно, не менш ніж на 95 %, 98 % або 99 %. Переважно, положення неідентичних залишків відрізняється консервативним заміщенням амінокислот. "Консервативне заміщення амінокислот" – це таке заміщення, при якому один амінокислотний залишок заміщається іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (групу R) з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність).У загальному випадку консервативне заміщення амінокислот не буде призводити до істотних змін функціональних властивостей білка. У випадку, якщо дві або більше амінокислотні послідовності відрізняються одна від одної консервативними заміщеннями, відсоток або ступінь аналогічності може коригуватися у бік збільшення, для того щоб урахувати консервативний характер заміщення. Способи такого коригування добре відомі фахівцям у даній галузі. Див. наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. До прикладів груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з аналогічними хімічними властивостями, належать 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин; 2) аліфатичні гідроксильовані бічні ланцюги: серин і треонін; 3) бічні ланцюги з амідною групою: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) бічні ланцюги із властивостями основи: лізин, аргінін і гістидин; 6) бічні ланцюги із властивостями кислоти: аспартат і глутамат; і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами для консервативного заміщення амінокислот є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізинаргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат та аспарагін-глутамін. В альтернативному варіанті консервативне заміщення являє собою будь-яку зміну, що призводить до позитивного значення в логарифмічній матриці ймовірностей PAM250, описаній в роботі Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. "Помірно консервативним" заміщенням називається будь-яка зміна, що призводить до не негативного значення в логарифмічній матриці правдоподібності PAM250. Подібність послідовностей поліпептидів звичайно визначають за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовності. Програма для аналізу білків зіставляє подібні послідовності з використанням показників аналогічності, що задаються для різних заміщень, делецій та інших модифікацій, у тому числі для консервативного заміщення амінокислот. 7 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, програмне забезпечення GCG містить такі програми як GAP і BESTFIT, які можуть використовуватися з параметрами за замовчуванням для визначення гомології або ідентичності послідовності між близькоспорідненими поліпептидами, наприклад, гомологічними поліпептидами різних видів організмів, або між вихідним білком і його мутантом. Див., наприклад, GCG Версія 6.1. Поліпептидні послідовності можна також зіставляти за допомогою FASTA – програми, включеної в GCG Версія 6.1, – з використанням параметрів за замовчуванням або рекомендованих параметрів. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує зіставлення та визначає відсоток ідентичності послідовностей в ділянках з найбільшим перекриванням між заданою та досліджуваною послідовностями (див. вище Pearson (2000)). Іншим переважним алгоритмом зіставлення послідовності даного винаходу з базою даних, що містить велику кількість послідовностей різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо BLASTP або TBLASTN, яка використовує параметри за замовчуванням. Див., наприклад, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. Одержання антитіл людини До методів одержання антитіл людини належать, наприклад, VELOCIMMUNE™, технологія XENOMOUSE™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21), "мінілокусний" метод і фаговий дисплей. Технологія VELOCIMMUNE™ (US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals) включає метод одержання повністю людських антитіл із високою специфічністю щодо вибраного антигену. Дана технологія припускає одержання трансгенних мишей із геномом, що містить варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюга людини, які функціонально пов'язані з ендогенними локусами константної ділянки миші, так що у відповідь на антигенну стимуляцію миша продукує антитіло, що містить варіабельну ділянку людини та константну ділянку миші. ДНК, що кодує варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюга антитіла, виділяють і функціонально зв'язують із ДНК, що кодує константні важкі та легкі ланцюги людини. Потім ДНК експресується в клітині, яка може експресувати повне антитіло людини. У конкретному здійсненні такою клітиною є клітина СНО. Антитіла можуть використовуватися в терапевтичних цілях для блокування лігандрецепторної взаємодії або інгібування взаємодії рецепторного компонента замість знищення клітин шляхом фіксації комплементу та участі в комплементзалежній цитотоксичності (CDC) або знищення клітин за рахунок антитілозалежної клітинно-обумовленої цитотоксичності (ADCC). Константна ділянка антитіла, таким чином, є важливою для забезпечення здатності антитіла фіксувати комплемент і опосередковувати клітинно-обумовлену цитотоксичність. Тому ізотип антитіла можна вибирати залежно від того, наскільки бажано, щоб антитіло опосередковувало цитотоксичність. Імуноглобуліни людини можуть існувати у двох формах, що пов'язано з гетерогенністю шарнірної ділянки. В одній із форм молекула імуноглобуліну містить стабільну чотириланцюгову конструкцію з масою приблизно 150-160 кДа, в якій димери утримуються дисульфідним містком, що зв'язує важкі ланцюги. У другій формі димери не зв'язані міжланцюговими дисульфідними зв'язками, і утворюється молекула із приблизною масою 75-80 кДа, що включає ковалентно з'єднані легкий та важкий ланцюги (половина антитіла). Ці форми було виключно складно розділити, навіть після афінного очищення. Частота проявів другої форми в різних ізотипах інтактного IgG викликана, крім іншого, структурними відмінностями, пов'язаними з ізотипом шарнірної ділянки антитіла. Заміна однієї амінокислоти в шарнірній ділянці людського IgG4 може суттєво знизити частку другої форми (Angal et al. 1993 Molecular Immunology 30:105) до рівнів, звичайно характерних при використанні шарнірної ділянки людського IgG1. У сферу охоплення даного винаходу входять антитіла, що мають одну або декілька мутацій у шарнірній ділянці, ділянках CH2 або CH3, які можуть бути бажані, наприклад, при продукуванні антитіл для підвищення виходу потрібної форми антитіла. Антитіла даного винаходу переважно одержують із використанням технології VELOCIMMUNE™. Трансгенні миші, в яких варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів ендогенного імуноглобуліну заміняються відповідними варіабельними ділянками людини, стимулюються антигеном, що становить інтерес, і в миші, що експресує антитіла, беруться лімфатичні клітини (наприклад, В-клітини). Лімфатичні клітини можуть зливатися з лінією клітин мієломи для одержання імморталізованих ліній клітин гібридоми, і такі лінії клітин гібридоми проходять скринінг і селекцію для ідентифікації тих ліній клітин гібридоми, які продукують антитіла до антигену, що представляє інтерес. ДНК, що кодує варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюга антитіла, можна виділити та зв'язати з потрібними ізотипічними константними ділянками важкого та легкого ланцюгів. Такий білок антитіла може продукуватися в клітині, 8 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, у клітині СНО. В альтернативному варіанті ДНК, що кодує антигенспецифічні химерні антитіла або варіабельні домени легкого та важкого ланцюгів, можна виділити безпосередньо з антигенспецифічних лімфоцитів. У загальному випадку антитіла даного винаходу мають дуже високу афінність, як правило -9 -12 маючи KD від приблизно 10 до приблизно 10 M або вище, наприклад, не менш ніж приблизно -9 -10 -11 -12 10 M, не менш ніж 10 M, не менш ніж 10 M або не менш ніж 10 M, якщо вимірювати за зв'язуванням з антигеном, іммобілізованим на твердій основі або аналізованим у розчині. Спочатку виділяють химерні антитіла з високою афінністю, що мають варіабельну ділянку людини та константну ділянку миші. Як описано нижче, антитіла характеризують і вибирають за потрібними властивостями, у тому числі за афінністю, селективністю, епітопом та тощо. Константні ділянки миші заміняють бажаними константними ділянками людини, для того щоб одержати повністю людські антитіла, описані в даному винаході, наприклад, вихідний або модифікований IgG1 або IgG4 (наприклад, SEQ ID NO: 541, 542 або 543). Вибрана константна ділянка може змінюватися залежно від конкретного здійснення, а властивості високої афінності антигензв'язування та необхідна специфічність визначаються варіабельною ділянкою. Епітопне картування та пов'язані з ним технології Для скринінгу антитіл, які зв'язуються з конкретним епітопом (наприклад, блокують зв'язування IgE із відповідним рецептором, що має високу афінність), можна проводити стандартний крос-блокінг, подібно до описаного в Harlow and Lane (1990) вище. До інших методів належать мутанти сканування аланіну, пептидний блотинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), і аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можуть використовуватися такі методи, як вирізання епітопу, екстракція епітопу та хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science: 487-496). Використовуваний у даному документі термін "епітоп" стосується сайту антигену, на який реагують B і/або T-клітини. Епітопи B-клітин можуть бути утворені як безперервною послідовністю амінокислот, так і окремими амінокислотами, що опинилися в необхідному взаємному положенні в результаті фолдингу білка в третинну структуру. Епітопи, утворені безперервною послідовністю амінокислот, як правило, зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, що виникли в результаті фолдингу білка в третинну структуру, руйнуються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп, як правило, формується принаймні 3, а звичайно принаймні 5 або 8-10 амінокислотами в цілком конкретній просторовій конформації. Визначення профілю за допомогою модифікації (MAP), також відоме як визначення профілю антитіл на основі структури антигену (ASAP) являє собою метод класифікації великої кількості моноклональних антитіл (mAbs) до того самого антигену відповідно до подібностей профілю зв'язування кожного антитіла з хімічно або ензиматично модифікованими антигенними поверхнями (US 2004/0101920). Кожна категорія може відображати унікальний епітоп, який або чітко відрізняється від епітопу, представленого в будь-якій іншій категорії, або частково перекривається з ним. Подібна технологія дозволяє швидко відокремлювати генетично ідентичні антитіла, так що їхня ідентифікація може бути сконцентрована на антитілах, що генетично відрізняються. У випадку застосування для скринінгу гібридоми, MAP може сприяти ідентифікації рідкісних клонів гібридоми, що утворюють mAbs із потрібними характеристиками. MAP може використовуватися для сортування антитіл анти-NGF даного винаходу в групи антитіл, що зв'язують різні епітопи. Імунокон'югати У галузь даного винаходу входить анти-NGF моноклональне антитіло людини, кон'юговане з терапевтичним засобом ("імунокон'югат"), наприклад, цитотоксином, хіміотерапевтичним препаратом, імунодепресантом або радіоактивним ізотопом. До цитотоксичних засобів належать будь-які речовини, які впливають на клітини. Приклади придатних для застосування цитотоксичних засобів і хіміотерапевтичних засобів для утворення імунокон'югатів відомі фахівцям у галузі, див., наприклад, WO 05/103081. Біспецифічність Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними стосовно різних епітопів одного цільового поліпептиду або можуть містити антигензв'язувальні домени, специфічні стосовно декількох цільових поліпептидів. Див., наприклад, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Анти-NGF антитіла людини можуть бути зв'язані з іншими функціональними молекулами або ж експресуватися одночасно з ними, наприклад, з іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент можуть бути функціонально зв'язані (наприклад, хімічним зв'язком, генетичним злиттям, нековалентною асоціацією або іншим способом) з 9 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однією або декількома молекулярними структурами, наприклад, з іншим антитілом або фрагментом антитіла, з утворенням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з додатковою специфічністю зв'язування. Терапевтичне застосування та суміші препаратів У винаході наводяться терапевтичні препарати, що включають антитіла анти-NGF або їхні антигензв'язувальні фрагменти, що входять у сферу охоплення даного винаходу. Введення терапевтичних препаратів відповідно до даного винаходу буде здійснюватися в придатних носіях, наповнювачах та інших речовинах, які включаються до складу препаратів, щоб забезпечити ефективніше розповсюдження, доставку, переносимість та ін. Безліч придатних сумішей можна знайти у формулярах, відомих всім фахівцям у галузі фармацевтичної хімії: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. До таких препаратів належать, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, олії, ліпіди, ліпід-вмісні (катіонні або аніонні) везикули (наприклад, LIPOFECTIN™), кон'югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії олії у воді та води в олії, емульсії Сarbowax (поліетиленгліколі різної молекулярної маси), напівтверді гелі та напівтверді суміші, що містять Сarbowax. Див. також Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52:238311. Дозу можна змінювати залежно від віку, маси та росту пацієнта, що одержує лікування, захворювання або патологічних станів пацієнта, способу введення та ін. При використанні антитіла даного винаходу для лікування різних патологічних станів і захворювань, пов'язаних із NGF, у тому числі запального болю, невропатичного і/або ноцицептивного болю, гепатоклітинної карциноми, раку молочної залози, цирозу печінки та ін., для дорослих пацієнтів є переважним вводити внутрішньовенно антитіла даного винаходу, як правило, у разовій дозі приблизно від 0,01 до 20 мг на кг маси тіла, більш переважно приблизно від 0,02 до 7 мг, приблизно від 0,03 до 5 мг, або приблизно від 0,05 до 3 мг на кг маси тіла, переважно приблизно від 0,1 до 10 мг накг маси тіла, і ще більш переважно приблизно від 0,1 до 5 мг на кг маси тіла. Залежно від тяжкості стану можна коригувати частоту та тривалість лікування. Відомі різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для введення лікарського препарату даного винаходу, наприклад, інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати мутантні віруси, опосередкований рецепторами ендоцитоз (див., наприклад, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). До методів введення, серед інших, належать черезшкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний і пероральний. Препарат може вводитися будь-яким придатним способом, наприклад, вливанням або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епітеліальні або шкірно-слизові оболонки (наприклад, слизову оболонку ротової порожнини, слизову оболонку прямої кишки та кишечника та ін.) і може застосовуватися разом з іншими біологічно-активними засобами. Введення може бути системним або місцевим. Фармацевтичний препарат може також доставлятися у везикулі, зокрема в ліпосомі (див. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) у Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, сс. 353-365; LopezBerestein, ibid., сс. 317-327; див. у цілому там же. У певних ситуаціях лікарський препарат може доставлятися в системі контрольованого вивільнення. В одному зі здійснень може використовуватися насос (див. Langer; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В іншому здійсненні можуть використовуватися полімерні матеріали (див. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). У ще одному варіанті здійснення систему контрольованого вивільнення можна встановити в безпосередній близькості від цілі препарату, а тому буде потрібна лише мала частка від системної дози (див., наприклад, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984). Інші системи контрольованого вивільнення обговорюються в огляді Langer (1990) Science 249:1527-1533. Ін'єкційних препаратів можуть стосуватися лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, черезшкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, краплинних вливань та ін. Такі ін'єкційні препарати можна приготувати за допомогою відомих методів. Наприклад, ін'єкційні препарати можна приготувати, зокрема, за допомогою розчинення, суспендування або емульгування описаного вище антитіла або його солі в стерильному водному середовищі або в олійному середовищі, які звичайно застосовуються для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій пропонуються, наприклад, фізіологічний розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу та інші допоміжні речовини та ін., які можуть використовуватися в сполученні з відповідним солюбілізувальним засобом, наприклад, спиртом (зокрема етанолом), багатоосновним спиртом (наприклад, пропіленгліколем, поліетиленгліколем), неіоногенною поверхнево-активною 10 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 речовиною [наприклад, полісорбатом 80, НСО-50 (аддуктом поліоксіетилену (50 моль) і гідрогенізованої рицинової олії] та ін. Як олійне середовище використовуються, наприклад, кунжутна олія, соєва олія та ін., які можуть застосовуватися в сполученні зі солюбілізувальним засобом, наприклад, бензилбензоатом, бензиловим спиртом та ін. Приготовлений у такий спосіб препарат для ін'єкцій переважно фасувати у відповідні ампули. Фармацевтичні препарати для перорального або парентерального введення, описані вище, переважно готовити в лікарських формах із разовою дозою, що підбирається відповідно до дозування активних інгредієнтів. До таких лікарських форм із разовою дозою належать, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії та ін. Кількість антитіла, що міститься в разовій дозі, звичайно становить від 5 до 500 мг на лікарську форму; у формі ін'єкції переважно, щоб кількість антитіла, що міститься, становила приблизно від 5 до 100 мг і приблизно від 10 до 250 мг у випадку інших лікарських форм. Монотерапія та комбінаційна терапія. У винаході пропонуються терапевтичні методи, у рамках яких антитіло або фрагмент антитіла даного винаходу застосовується для лікування болю, пов'язаного зі всілякими патологічними станами за участі NGF. Антитіла анти-NGF або їхні фрагменти, описані в даному винаході, особливо ефективні для лікування болю, викликаного будь-яким патологічним станом, який пов'язаний із нейрогенним, невропатичним або ноцицептичним болем. У переважних здійсненнях для невропатичного болю, переважна терапія при реперкусійній невралгії трійчастого нерва, постгерпетичній невралгії, фантомному болі в ампутованихкінцівках, фіброміалгії, симпатичній рефлекторній дистрофії та нейрогенних болях. В інших переважних здійсненнях переважно проводити лікування болю при раку, особливо болю при раку кістки, болю при остеоартриті або ревматоїдному артриті, болю в нижньому відділі спини, болю післяопераційного шва, болю при переломах, болю при остеопорозних переломах, остеопорозі, суглобового болю при подагрі, діабетичній нейропатії, ішіасі, болю, пов'язаного із загостреннями при серпоподібноклітинній анемії, мігрені та інших невропатичних та/або ноцицептивних болях. До інших показань належить, наприклад, лікування раку молочної залози (Adriaenssens et al. (2008) Cancer Res 68:346-51). У конкретних здійсненнях терапевтичних методів даного винаходу пацієнт, що страждає від болю в суглобах, пов'язаного з подагрою, проходив терапію комбінацією антитіла або фрагмента антитіла даного винаходу, у деяких випадках із другим терапевтичним засобом. В одному зі здійснень у ролі другого терапевтичного засобу переважно застосовували антагоніст інтерлейкіну-1 (IL-1), наприклад, рилонасепт ("пастка IL-1", Regeneron). У ролі придатних других терапевтичних засобів може виступати один або декілька засобів, вибраних із групи, в яку входять рилонасепт, анакінра (KINERET®, Amgen), рекомбінантна неглікозильована форма антагоністів рецепторів IL-1 людини (IL1Ra), препарат анти-IL-18, наприклад, IL-18BP або його похідне, пастка IL-18, або антитіло, наприклад, анти-IL18, анти-IL-18R1, анти-IL-18Racp, анти-IL-6 і/або антитіло анти-IL6Ra. До інших форм сумісної терапії, які можна поєднувати з антитілом NGF або його антигензв'язувальним фрагментом у ролі монотерапії або в сполученні з антагоністом IL-1, належать колхіцин у малих дозах, аспірин або інші NSAID, стероїди, наприклад, преднізолон, метотрексат, циклоспорин А в малих дозах, інгібітори TNF, наприклад, ENBREL® або HUMIRA®, інші інгібітори запалення, наприклад, інгібітори каспази-1, p38, IKK1/2, CTLA-4Ig, і т.ін…, і/або сумісної терапії, зокрема з використанням інгібіторів синтезу сечової кислоти для пригнічення накопичення сечової кислоти в організмі, наприклад, алопуринол, стимулятори виведення сечової кислоти для прискорення швидкого виведення сечової кислоти, накопиченої в організмі, такі як пробенецид, сульфінпіразон і/або бензбромарон, є стимуляторами виведення сечової кислоти; кортикостероїди; нестероїдні протизапальні препарати (NSAID), протиепілептичні препарати, наприклад, топірамат, габапентин, прегабаблін; целекоксиб; або ж інший нейротрофін, наприклад, NT-3. ПРИКЛАДИ Наведені нижче приклади призначені для того, щоб дати фахівцям у галузі повну інформацію та опис того, як слід одержувати та використовувати способи та препарати даного винаходу, і не покликані обмежувати сферу охоплення того, що винахідники розглядають як предмет свого винаходу. Вживали спроби домогтися точності стосовно використовуваних показників (наприклад, кількостей, температури та ін.), але необхідно враховувати деякі похибки та відхилення експериментів. Якщо не зазначено інакше, під частинами розуміють масові частини, молекулярною масою називають усереднену молекулярну масу, температура наводиться в градусах Цельсія, а тиск знаходиться на рівні атмосферного або близько до цього рівня. Статистичний аналіз проводили відповідно до змішаного факторіального аналізу ANOVA із застосуванням апостеріорних критеріїв Бонфероні або достовірної значущої різниці Т'юкі. 11 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 1 Імунізація та одержання антитіл Гризуни можуть бути імунізовані за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям у галузі (див., наприклад, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Press, New York; Malik and Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, CAН ДІЄГО). У переважному здійсненні білок NGF людини вводять безпосередньо мишам із локусами ДНК, що кодують варіабельну ділянку важкого ланцюга людського Ig і варіабельну ділянку легкого ланцюга каппа (VELOCIMMUNE™, Regeneron; US 6,596,541), в ад'юванті для стимулювання імунної відповіді. Такий ад'ювант включає повний і неповний ад'ювант Фрейнда, систему ад'юванта MPL+TDM (Sigma) або RIBI (мураміл-дипептид) (див. O'Hagan, Vaccine Adjuvant, Human Press, 2000, Totawa, NJ). Такий ад'ювант може перешкоджати швидкому розведенню поліпептиду, утримуючи антиген у локальному депо, і може містити фактори, які здатні стимулювати імунну відповідь хазяїна. В одному варіанті здійснення NGF вводять непрямим чином у вигляді ДНК-плазміди, що містить ген NGF і експресує NGF за допомогою механізму експресії клітинного білка хазяїна для одержання поліпептиду антигену in vivo. При обох підходах для одержання оптимальних анти-антигенних відповідей мишам уводять бустер-ін'єкції кожні 3~4 тижні, і через 10 днів після кожної ін'єкції відбирають проби сироватки. Імунну відповідь антитіл контролюють із використанням стандартних методів прямого антигензв'язування ELISA. Проби сироватки після стимуляції, розведені у ході 3-кратних послідовних розведень, наносять на планшети, покриті NGF. Титр сироватки визначається як розведення проби сироватки, яка давала при аналізі дворазовий у порівнянні з фоном сигнал. Тварини з оптимальною реакцією у відповідь за 3-4 дні до евтаназії одержують останню бустерін'єкцію внутрішньовенно і внутрішньочеревинно без ад'юванта. Зібрані спленоцити обробляють, як описано нижче, для того щоб одержати антиген-специфічні моноклональні антитіла. Приклад 2 Виділення моноклональних антитіл В одному варіанті здійснення В-клітини, що експресують антитіло, зливають із клітинами мієломи миші, щоб утворилися клітини гібридоми. Гібридні клітини висівають в 96-ямкові планшети із селекцією НАТ і дозволяють рости від 10 до 20 днів. Проводять скринінг кондиціонованого середовища зі зростаючими клітинами гібридоми для перевірки зв'язування антигену та активності блокування рецептора, як описано нижче. Клітини гібридоми, що експресують антитіла, які становлять інтерес, субклоновані з монокультури з використанням проточної цитометрії, і з клональних клітин гібридоми були клоновані та секвеновані гени VH і VL. Із культур антиген-специфічних гібридом також виділяли білки антитіл із використанням збідненого IgG середовища (Invitrogen), та їхні характеристики встановлювали відповідно до описаної нижче процедури. В іншому здійсненні антиген-специфічні антитіла виділяють безпосередньо з антигенпозитивних B-клітин без імморталізації зі специфічними клітинами мієломи, з одержанням клітини-хазяїна СНО, що утворює стабільне рекомбінантне антитіло, як описано в USSN 11/809482 (публікація патенту США No 2007/0280945). Приклад 3 Первинне антигензв'язування та скринінг блокування рецептора Для ідентифікації гібридом, що продукують антиген-специфічні антитіла, кондиціоноване середовище відбирали з 96-ямкових планшетів із клітинними культурами через 10-20 днів після злиття, і антигензв'язувальну специфічність визначали за допомогою високопродуктивного методу прямого зв'язування ELISA. Коротко можна сказати, що кондиціоноване середовище в розведенні 1:10 і 1:100 зв'язувалося з рекомбінантним NGF білком, нанесеним на планшети MAXISORB™ (Nunc) у концентрації 100 нг/ямку. Зв'язані на планшеті антитіла визначали за допомогою специфічного, кон'югованого з пероксидазою хріну поліклонального антитіла козячого антимишачого IgG Fc (Jackson Immuno Lab). Планшети проявляли за допомогою субстратів, що містять тетраметилбензидин (BD Pharmigen), і реєстрували оптичну густину на рівні OD450nm. Паралельно проби з таким же розведенням наносили на оброблені стрептавідином і мічені біотином планшети NGF, і детектували зв'язані із планшетом антитіла. Ямки, що демонструють активність зв'язування для будь-якого із планшетів, відбирали для експансії клітинної культури та зберігали при заморожуванні, а супернатанти, що містять антитіла, використовували для подальшого аналізу з метою одержання характеристик специфічності, афінності та функціональності. Крім скринінгу прямого зв'язування антигену, використовували також функціональний скринінг, для того щоб визначити клони, що продукують антитіла з бажаними властивостями. 12 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Планшети Maxisorb витримували протягом ночі при 4 °C для покриття рекомбінантним TrkA-hFc людини в концентрації 100 нг/ямку. Кондиціоноване середовище при розведенні 1:2 і 1:10 зв'язували з розчином 2 нг/мл біотин-NGF протягом 1 години до перенесення на покриті TrkAhFc планшети для вимірювання зв'язаного із планшетом біотину-NGF. Зв'язані на планшеті біотин-NGF визначали за допомогою кон'югованого з пероксидазою хріну стрептавідину (Pierce) і проявляли за допомогою субстратів, що містять тетраметилбензидин (BD Pharmigen), при реєстрації оптичної густини. Гібридоми, в яких культуральне середовище перешкоджало зв'язуванню біотину-NGF із TrkA-hFc, відносили до потенційних блокаторів і досліджували додатково. Аналогічні процедури скринінгу in vitro проводили з 96-ямковим кондиціонованим середовищем клітин CHO, трансфектованих повністю людським IgG, що містить V-гени, одержаним безпосередньо з антиген-позитивних В-клітин. Крім того, проводили скринінг зразків для виявлення активності зв'язування NGF із використанням покритих антигеном гранул LUMINEX™, антиген-специфічне антитіло до яких детектували за допомогою Fc-специфічних поліклональних антитіл кози антилюдського IgG. Для антигензв'язувальних антитіл проводили вимірювання афінності з використанням BIACORE™. Коротко можна сказати, що антитіла із супернатантів неочищеної культури фіксували на поверхні амінозв'язаного специфічного поліклонального антитіла hFc. Відслідковували зв'язування антигену при фіксованій концентрації. Для припасування сенсограми зв'язування використовували модель бімолекулярної взаємодії 1:1, для того, щоб визначити антигензв'язувальну афінність (K D) за допомогою кінетичних констант швидкостей ka і kd для взаємодії кожного з антитіл за ідентичних умов. Зокрема, Fc-специфічні поліклональні антитіла кози антилюдського IgG ковалентно фіксували на поверхні чипа CM-5, і супернатанти CHO, що містять антитіла, вводили зі швидкістю 1 мкл/хв протягом 5 хвилин, після чого проводили промивання буфером. NGF людини (25 нМ) вводили протягом 3 хвилин, щоб забезпечити зв'язування NGF із поверхнею іммобілізованих людських антитіл. Відразу ж після введення NGF на поверхню наносили буфер зі швидкістю 100 мкл/хв протягом приблизно 10 хвилин і реєстрували спад сигналу RU. Поверхню регенерували для видалення зв'язаних антитіл і NGF і повторювали цикл із наступним зразком супернатанту СНО. Приклад 4 Визначення антигензв'язувальної афінності Антигензв'язувальні афінності антитіл для NGF людини визначали з поверхневої кінетики методом поверхневого плазмонного резонансу біосенсора в реальному часі (BIACORE™). Антитіла утримували на поверхні поліклонального антитіла козячого, антилюдського або антимишачого IgG, утвореної за допомогою прямого амінного зв'язування утриманого антитіла із чипом BIACORE™. На поверхні захоплених антитіл вводили різні концентрації NGF людини, і зв'язування антигену з антитілом і дисоціацію зв'язаного комплексу контролювали в реальному часі. Розрахунок рівноважної константи дисоціації (K D) і константи швидкості дисоціації здійснювали за допомогою кінетичного аналізу, причому константу швидкості дисоціації використовували для розрахунку напівперіоду дисоціації комплексу антиген/антитіло (t 1/2) (таблиця 1). Гуманізоване антилюдське моноклональне антитіло NGF E3 ("RN624") (танезумаб; CAS Registry No. 880266-57-9; публікація патенту США 2004/0237124) використовували як контрольне антитіло. 13 UA 100382 C2 Таблиця 1 Антитіло 301272-1D07-B10 301272-1H07-G9 301272-1H08-G8 301272-3D08-C11 301272-3F12-D7 301272-3G11-C1 301272-3H10-A10 301272-3H11-A3 301272-6E07-D10 301272-6G10-D7 301272-7A10-D7 301272-7C05-G1 301272-7E05-F6 301272-7F11-A8 301272-7G09-E4 301272-7G10-E1 301272-7G11-F6 301272-7H05-D4 301272-7H07-C12 VAT 8C10-8 VAT 13F5-5 VAT 12A10-13 VAT 2C2-1 Контроль (RN624) 5 10 KD (пМ) 0,5 60,1 0,2 0,7 190,0 1,1 0,1 23,8 13,0 7,7 75,0 162,0 0,4 5,8 17,0 292,0 4,9 77,6 9,8 102,0 156,0 109,0 959,0 1,3 t1/2 34,6 годин 32,8 хв 55,6 годин 6,9 годин 13,2 хв 14,6 годин 25,2 годин 4,3 годин 4,5 годин 44,3 хв 11,6 хв 10,1 хв 40,0 годин 5,3 годин 4,3 годин 10,1 хв 2,9 годин 1,0 годин 6,0 годин 14,7 хв 13,7 хв 9,4 хв 9,0 хв 35,0 годин Антигензв'язувальні афінності деяких очищених антитіл для NGF також визначали з поверхневої кінетики методом поверхневого плазмонного резонансу біосенсора в реальному часі (BIACORE™), як описано вище. Для зручності користування антитіло 301272-3H10-A10 перейменували в "REGN261" (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 84/92 і hIgG1 SEQ ID NO: 541); 3012726E07-D10 перейменували в "REGN263" (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 208/216 і hIgG1 SEQ ID NO: 541). Протестовані похідні антитіла включали REGN472 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 100/102 і hIgG1 SEQ ID NO: 541), REGN474 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 100/102 і мутант hIgG4 SEQ ID NO: 543), REGN475 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 108/110 і мутант hIgG4 SEQ ID NO: 543), REGN476 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 224/226 і мутант hIgG4 SEQ ID NO: 543), і REGN477 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 232/234 і мутант hIgG4 SEQ ID NO: 543). Таблиця 2 Антитіло REGN472 REGN474 REGN475 REGN476 REGN477 Контроль (RN624) 15 20 KD (пМ) 0,41 0,41 0,18 8,91 7,98 1,25 t1/2 (години) 30 31 57 4 4 35 Приклад 5 Перехресна реакційна здатність нейротрофіну-3 (NT-3) NGF і NT-3 належать до сімейства факторів росту нервів і належать до основних невеликих секреторних білків, які забезпечують виживання конкретних популяцій нейронів. Незважаючи на певні амінокислотні подібності цих двох нейротрофінів, їхні біологічні функції можуть різнитися (Barde et al. 1990 Prog Growth Factor Res 2(4):237-48). Вивчали перехресну реакційну здатність зв'язування антитіл анти-NGF і людського NT-3. Коротко можна сказати, що поліклональне антитіло кози антилюдського IgG хімічно зв'язувалося із чипом CM5. Моноклональні антитіла анти-NGF вводили таким чином, щоб 14 UA 100382 C2 5 утворилася поверхня із приблизно від 50 до 900 RU іммобілізованих антитіл за допомогою взаємодії зі зв'язаними з чипом поліклональними антитілами. На поверхню наносили білок NGF або NT-3 у концентрації 20 нМ із наступним промиванням буфером, щоб дати можливість дисоціювати зв'язаним лігандам. Контролювали фазу асоціації та дисоціації та проводили аналіз даних. Результати наведені в таблиці 3 (NB = активність зв'язування не спостерігалася). На відміну від контрольного антитіла (RN624), всі тестовані антитіла не проявляли зв'язування, що піддається вимірюванню, із NT-3, що вказує на вищий ступінь антиген-специфічності стосовно контрольного антитіла. Таблиця 3 Антитіло 301272-1D07-B10 301272-1H07-G9 301272-1H08-G8 301272-3D08-C11 301272-3F12-D7 301272-3G11-C1 301272-3H10-A10 301272-3H11-A3 301272-6E07-D10 301272-6G10-D7 301272-7A10-D7 301272-7C05-G1 301272-7E05-F6 301272-7F11-A8 301272-7G09-E4 301272-7G10-E1 301272-7G11-F6 301272-7H05-D4 301272-7H07-C12 Контроль (RN624) KD NGF (пМ) 0,5 60,1 0,2 0,7 190,0 1,1 0,1 23,8 4,3 7,7 75,0 162,0 0,1 7,5 5,5 292,0 4,9 77,6 9,8 1,3 10 15 20 25 TM KD NT-3 (нМ) NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB NB 1,1 Конкурентний аналіз у розчині на основі OCTET також використовували для вимірювання здатності REGN475 і RN624 конкурувати в розчині за зв'язування з NT-3, NGF або з нейротрофічним фактором із мозку людини (hBDNF). Коротко можна сказати, що зразки антитіло-антиген готовили преінкубуванням контрольного антитіла RN624 (2,5 мкг/мл) або REGN475 (2,5 мкг/мл) із різними концентраціями NT-3 (від 0 до 4 мкМ), hBDNF (від 0 до 4 мкМ) або NGF (від 0 до 0,2 мкМ) протягом 1 години при 30C. Стрептавідинові сенсори FA із високим рівнем зв'язування (HBS, ForteBio, Inc., Каліфорнія) інкубували з біотином-NGF при 2 мкг/мл протягом 10 хвилин при 30C. Зв'язані з біотин-NGF сенсори потім інкубували із преінкубованими зразками антитіло-антиген протягом 10 хвилин при 30C. Зміну в'язкості біологічного шару виміряли після інкубації. Величину зв'язування нормували у відсотках від зв'язування стосовно зв'язування антитіла за відсутності конкурента. Як показано в таблиці 4, зв'язування між NGF і RN624 блокувалося NT-3 залежним від дози чином, тоді як зв'язування між REGN475 і NGF не блокувалося NT-3. Присутність hBDNF не перешкоджала зв'язуванню як RN624, так і REGN475 із NGF, тоді як присутність розчинного NGF практично повністю блокувала зв'язування та RN624, і REGN475 із іммобілізованим NGF. 15 UA 100382 C2 Таблиця 4 Конкурент NT-3 (4 мкМ) NT-3 (2 мкМ) NT-3 (1 мкМ) NT-3 (0,5 мкМ) NT-3 (0,25 мкМ) NT-3 (0 мкМ) BDNF (4 мкМ) BDNF (2 мкМ) BDNF (1 мкМ) BDNF (0 мкМ) NGF (0,2 мкМ) NGF (0,1 мкМ) NGF (0,05 мкМ) NGF (0 мкМ) 5 10 15 % зв'язування RN624 17 26 38 52 72 100 103 104 104 100 1 -1 0 100 % зв'язування REGN475 102 102 98 93 101 100 116 115 106 100 3 2 1 100 Зв'язування між вибірковими очищеними людськими анти-NGF антитілами REGN472, REGN474, REGN475, REGN476, REGN477 або контрольним антитілом RN624 і NT-3 також TM оцінювали з використанням аналізу BIACORE із концентраціями NT-3 у діапазоні від 1,25 нМ до 40 нМ. У той час як контрольне антитіло (RN624) зв'язувалося з NT-3 з KD 1,1 нМ, жодне з досліджуваних антитіл не проявляло афінності до NT-3, що піддавалася вимірюванню. Приклад 6 Перехресна реакційна здатність стосовно NGF мишей і щурів NGF людини (NGF) має високу гомологічність за амінокислотною послідовністю NGF миші (mNGF) і NGF щура (rNGF) із рівнем ідентичності приблизно 90 %. Афінність зв'язування антитіл із mNGF і rNGF визначали за описаною вище методикою. Всі антитіла демонстрували перехресну реакційну здатність до mNGF і rNGF. Одна група антитіл міцно зв'язувала NGF всіх видів зі значенням KD менше 10 пМ; друга група переважно зв'язувала NGF і демонструвала KDs > ~ 100 пМ для mNGF і rNGF (контроль = RN624) (таблиця 5). Таблиця 5 Антитіло 301272-1D07-B10 301272-1H07-G9 301272-1H08-G8 301272-3D08-C11 301272-3F12-D7 301272-3G11-C1 301272-3H10-A10 301272-3H11-A3 301272-6E07-D10 301272-6G10-D7 301272-7A10-D7 301272-7C05-G1 301272-7E05-F6 301272-7F11-A8 301272-7G09-E4 301272-7G10-E1 301272-7G11-F6 301272-7H05-D4 301272-7H07-C12 Контроль (RN624) KD NGF людини (пМ) 0,5 60,1 0,2 0,7 190,0 1,1 0,1 23,8 13,0 7,7 75,0 162,0 0,4 5,8 16,8 292,0 4,9 77,6 9,8 1,25 KD mNGF (пМ) 3,0 2280,0 1,7 5,0 3130,0 6,1 0,2 619,0 362,0 94,7 2630,0 2000,0 4,1 320,0 379,0 7090,0 157,0 5520,0 1200,0 1,4 KD rNGF (пМ) 6,6 6330,0 0,7 8,5 8710,0 5,9 0,6 800,0 360,0 157,0 4900,0 1790,0 1,6 459,0 425,0 11800,0 160,0 7090,0 473,0 1,5 Також визначали афінність зв'язування деяких очищених антитіл анти-NGF із mNGF і rNGF (таблиця 6). 16 UA 100382 C2 Таблиця 6 Антитіло REGN472 REGN474 REGN475 REGN476 REGN477 Контроль (RN624) 5 10 15 KD NGF (пМ) 0,41 0,41 0,18 8,91 7,98 1,25 KD mNGF (пМ) 0,61 0,43 0,36 115 133 1,4 KD rNGF (пМ) 3,96 3,42 0,93 155 164 1,51 Приклад 7 Інгібування зв'язування NGF із рецепторами TrkA/hFc і p75/hFc Для ідентифікації блокувальних антитіл, розробляли метод аналізу блокування рецепторів за допомогою приладу BIACORE™ 3000. Рекомбінантні людські білки TrkA-hFc і p75-hFc фіксували амінним зв'язком на чипі CM5 до густини приблизно 5000-6000 RU. NGF людини (від 10 нМ до 25 нМ) зв'язували з поверхнею TrkA і p75 для визначення максимального значення RU для зв'язування NGF. Потім проводили регенерацію поверхні, і NGF у концентрації від 10 нМ до 25 нМ змішували з надлишковими молярними концентраціями індивідуальних антитіл або розчинних білків рецепторів, а розчин наносили на поверхню регенерованого чипа, щоб зафіксувати зв'язувальні сигнали залишкового вільного NGF. У таблиці 7 наводиться відсоткова частка вільного NGF, закріпленого на TrkA і p75, у присутності антитіла або білка рецептора. Максимальній величині RU для зв'язування людського NGF під час відсутності антитіла надавали значення 100 %. Як позитивний контроль використовували RN624, TrkA-hFc і p75-hFc у розчині, а як негативний контроль зв'язування використовували контроль IgG1 (AVASTIN®; Genentech, Каліфорнія). 17 UA 100382 C2 Таблиця 7 Антитіло Лише NGF 301272-1D07-B10 301272-1H07-G9 301272-1H08-G8 301272-3D08-C11 301272-3F12-D7 301272-3G11-C1 301272-3H10-A10 301272-3H11-A3 301272-6E07-D10 301272-6G10-D7 301272-7A10-D7 301272-7C05-G1 301272-7E05-F6 301272-7F11-A8 301272-7G09-E4 301272-7G10-E1 301272-7G11-F6 301272-7H05-D4 301272-7H07-C12 VAT 8C10-8 VAT 13F5-5 VAT 12A10-13 VAT 2C2-1 REGN472 REGN474 REGN475 REGN476 REGN477 Контроль mAb (RN624) Контроль (TrkA-hFc) Контроль (p75-hFc) Контроль IgG1 5 10 15 20 % зв'язування TrkA-hFc 100 2 20 1 1 25 1 1 18 4 2 31 1 1 4 8 62 1 14 42 4 4 11 11 4 6 6 6 9 10 10 3 116 % зв'язування p75-hFc 100 4 25 3 2 23 1 2 20 6 2 26 1 1 3 16 62 1 20 81 395 5 539 360 7 9 10 13 13 16 15 5 116 Здатність деяких досліджуваних антитіл REGN472, REGN474, REGN475, REGN476 і REGN477, а також контрольного антитіла RN624 блокувати зв'язування людського NGF із рецепторами людини TrkA і p75 також кількісно вимірювали за допомогою конкурентного сендвічевого аналізу ELISA, у ході якого присутність антитіла з фіксованою концентрацією NGF у розчині не дозволяла NGF зв'язуватися з TrkA-hFc або p75-hFc, нанесеними на планшет для мікротитрування. NGF людини, використаний у ході аналізу, являв собою рекомбінантний білок, продукований в E. coli, а людські білки TrkA-hFc і p75-hFc були димерними злитими білками, що складаються із двох позаклітинних доменів відповідних рецепторів, злитих послідовно з Fcчастиною людського IgG1. Мічений біотином білок NGF із фіксованою концентрацією 50 пМ титрували різними кількостями антитіла з концентрацією від 1,5 пМ до 1,5 нМ у розчині протягом однієї години при кімнатній температурі. Кількість незв'язаного вільного біотину-NGF у сумішах розчинів потім визначали за допомогою фіксації біотину-NGF на планшетах для мікротитрування, покритих hTrkA-hFc або hp75-hFc, після чого зв'язаний із планшетом біотинільований NGF детектували за допомогою системи стрептавідин-пероксидаза із хріну. Зокрема, планшети для мікротитрування готували за допомогою нанесення на них розчинів 0,5 мкг/мл hTrkA-hFc або 1 мкг/мл hp75-hFc у PBS-буфері протягом ночі при 4C із наступним блокуванням планшетів 0,5 % BSA перед використанням. Для вимірювання незв'язаного біотинNGF преінкубоване антитіло та розчини біотин-NGF переносили на покриті рецептором планшети з наступною інкубацією протягом 1 години при кімнатній температурі. Зв'язаний із планшетом біотин-NGF визначали за допомогою кон'югованого з пероксидазою хріну стрептавідину та проявляли за допомогою колориметричного субстрату ТМВ із реєстрацією 18 UA 100382 C2 5 OD450 нм. Залежність значень OD450 нм від концентрацій REGN475 у розчинах перед зв'язуванням TM аналізували на основі сигмоїдної моделі відповіді на дозу, що постачається PRISM (Graph Pad, Каліфорнія). Прогнозоване значення IC50, яке визначається як концентрація антитіла, необхідна для блокування 50 % зв'язування 50 пМ біотинільованого NGF із покритими рецептором планшетами, використовували як індикатор здатності антитіла блокувати зв'язування NGF із hTrkA-hFc або hp75-hFc. У таблиці 8 наводяться значення IC50 кожного антитіла, що проходило тестування стосовно hTrkA-hFc і hp75-hFc. Контроль mAb=RN624. Таблиця 8 REGN472 REGN474 REGN475 REGN476 REGN477 Контроль (RN624) 10 15 20 IC50 (пМ) блокування TrkA-hFc 12 8,1 20 65 65 48 IC50 (пМ) блокування p75-hFc 12 6,3 22 61 62 72 Приклад 8 Інгібування зв'язування NT-3 із рецепторами TrkA-, TrkB-, TrkC- і p75/hFc Також тестували зв'язування 20 нМ людського NT-3 із поверхнею TrkA-, TrkB-, TrkC- і p75hFc людини, відповідно, у присутності 500 нМ REGN475, RN624 і AVASTIN® (контроль IgG1). TrkA-hFc людини (9300 RU), TrkB-hFc(6000 RU) людини, TrkC-hFc (9100 RU) людини та p75-hFc (7500 RU) людини ковалентно зв'язували з поверхнею чипа BIACORE® CM5 за допомогою амінного поєднання. 20 нМ людського NT-3 змішували з 500 нМ контролю (контроль IgG1 AVASTIN®), REGN475, RN624, hTrkA-hFc, TrkB-hFc, TrkC-hFc або p75-hFc у розчині. Суміш для зв'язування спочатку інкубували при кімнатній температурі до рівноважного стану (приблизно 1 година), а потім вводили на поверхні TrkA-hFc, TrkB-hFc, TrkC-hFc і p75-hFc. Вимірювали рівень зв'язування людського NT-3 у кожному зразку. RU зв'язування в кожному зразку нормували відповідно до величини RU для негативного контрольного зразка (тобто 20 нМ людського NT-3 з 500 нМ AVASTIN®) і виражали в % зв'язування з поверхнями Trk (таблиця 9). REGN475 не демонстрував практично ніякої конкуренції зі зв'язуванням NT-3 із рецепторами, тоді як інші зразки в значній мірі блокували зв'язування NT-3 із рецепторами. 25 Таблиця 9 Антитіло Контроль IgG1 RN624 REGN475 TrkA-hFc TrkB-hFc TrkC-hFc P75-hFc 30 35 40 TrkA-hFc 100 7 90 21 6 11 14 TrkB-hFc 100 8 99 5 0 0 2 TrkC-hFc 100 8 101 3 0 0 2 p75-hFc 100 19 103 7 0 0 4 Приклад 9 Нейтралізація біологічного ефекту NGF In Vitro Здатність антитіл NGF блокувати активність росту клітин, залежну від NGF і опосередковану рецептором TrkA, оцінювали з використанням клітин MG87, стабільно трансфектованих плазмідою, що кодує людський рецептор TrkA. Коротко говорячи, трансфектовані клітини 5 обробляли трипсином і ресуспендували в концентрації приблизно 2,510 клітин у мл, а потім висівали по 5000 клітин на ямку в 96-ямковий планшет для культур тканин. Очищені білки антитіл піддавали послідовному розведенню в зазначеному середовищі плюс 0,1 % BSA і додавали до клітин на планшеті в концентраціях від 0 до 500 нМ. NGF людини додавали в ямки до кінцевої концентрації 373 пМ. Відповідь вимірювали після інкубації клітин протягом 3 днів при 37 °C у вологому інкубаторі з 5 % CO2. Активність росту клітин визначали за допомогою набору CCK8 (Dojindo) і реєстрували OD450 нм. Залежність сигналів від концентрацій антитіла аналізували із зазначенням значень IC50 (таблиця 10, колонка 2). Здатність антитіл NGF блокувати сигнал NGF для активності, опосередкованої рецепторами p75 і TrkA, також вимірювали in vitro із використанням лінії хромафінних клітин щурів PC12, які 19 UA 100382 C2 5 10 забезпечують ендогенну експресію обох рецепторів (Urdiales et al. 1998 J. Neuroscience 18(17):6767-6775). Коротко можна сказати, що PC12 клітини стабільно трансфектувалися репортерною плазмідою, що містить елемент відповіді сироватки (SRE), зв'язаний із геном 5 люциферази. Трансфектовані клітини ресуспендували в концентрації приблизно 2,510 клітин у мл, а потім висівали по 50000 клітин на ямку в 96-ямковий планшет для культур тканин, витримуючи в середовищі Opti-MEM протягом ночі. Очищені білки антитіл піддавали послідовному розведенню в середовищі (DMEM плюс 0,1 % BSA) і додавали до клітин на планшеті в концентраціях від 0 до 100 нМ. NGF людини додавали в ямки до кінцевої концентрації 12,5 пМ. Активність люциферази вимірювали після інкубації клітин протягом 6 годин при 37 °C у вологому інкубаторі з 7,5 % CO2 із використанням системи аналізу люциферази BRIGHT GLOW™ (Promega). Значення IC50 визначали відповідно до опису вище та указували в стовпці 3 таблиці 10. Контроль mAb=RN624. Таблиця 10 Антитіло 301272-1D07-B10 301272-1H07-G9 301272-1H08-G8 301272-3D08-C11 301272-3F12-D7 301272-3G11-C1 301272-3H10-A10 301272-3H11-A3 301272-6E07-D10 301272-6G10-D7 301272-7A10-D7 301272-7C05-G1 301272-7E05-F6 301272-7F11-A8 301272-7G09-E4 301272-7G10-E1 301272-7G11-F6 301272-7H05-D4 301272-7H07-C12 VAT2C2-1 VAT8C10-8 VAT12A10-13 VAT13F5-5 Контроль (RN624) 15 IC50 MG87 (нМ) < 0,186 2,000 < 0,186 0,576 < 0,186 < 0,186 < 0,186 16,000 0,293 106,000 15,000 < 0,186 < 0,186 0,428 3,000 < 0,186 9,000 3,000 0,383 532,000 41,000 41,000 5,000 < 0,186 IC50 PC12 (нМ) 0,011 0,261 0,006 0,005 --0,019 0,009 0,842 0,726 0,087 --0,035 0,018 0,071 --0,088 -0,183 ----0,021 Здатність деяких очищених антитіл анти-NGF, REGN472, REGN474 і REGN475, а також контролю mAb RN624 блокувати сигнали NGF через опосередковану рецепторами p75 і TrkA активність у лінії клітин PC12 також оцінювали за допомогою описаного вище люциферазного методу аналізу (таблиця 11). Таблиця 11 Антитіло IC50 (пМ) 4,5 6,6 9,6 4,9 REGN472 REGN474 REGN475 Контроль (RN624) 20 Здатність антитіл анти-NGF, REGN475 і контрольного антитіла блокувати сигнали NT-3 через опосередковану рецепторами p75 і TrkA активність у лінії клітин PC12 оцінювали за допомогою описаного вище люциферазного методу аналізу, модифікованого за рахунок заміни 12,5 пМ NGF на 75 нМ NT-3. Результати показали, що контроль mAb RN624 блокував сигнали 20 UA 100382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 NT-3 з IC50 приблизно 104,8 нМ, тоді як у даних експериментальних умовах REGN475 не впливав на сигнал NT-3. Крім того, був розроблений метод біологічної проби для визначення здатності антитіл антиNGF, REGN475 і RN624 нейтралізувати опосередковану NT-3 клітинну функцію за рахунок TrkC in vitro. Генно-інженерну лінію клітин HEK293, що експресує TrkC, трансфектували репортерною плазмідою SRE-люциферази. NT-3 регулює експресію люциферази в 6-годинній пробі. Здатність REGN475 і RN624 блокувати сигнал NT-3 за рахунок активності, опосередкованої рецептором TrkC у цій генно-інженерній клітинній лінії, оцінювали за люциферазним методом аналізу. Генно-інженерну лінію клітин HEK293 висівали на 96-ямкові планшети в концентрації 4 110 клітин/ямку в безсироваткове середовище та інкубували протягом ночі при 37ºC, 5 % CO2. REGN475 і RN624 у концентраціях від 1,6 мкМ до 28 пМ преінкубували з 15 пМ NT-3 протягом 1 години, і суміш додавали до клітин. Клітини потім інкубували при температурі 37ºC в атмосфері 5 % CO2 протягом 6 годин. Активність люциферази визначали при додаванні у відповідних об'єму ямки кількостях BRIGHT GLOW™ (Promega). Результати показали, що RN624 інгібував опосередковану NT-3 активність люциферази з IC50 приблизно 150-200 нМ у присутності постійної концентрації 15 пМ NGF, тоді як REGN475 не інгібував опосередковану NT-3 активність люциферази. Приклад 10 Нейтралізація біологічної активності NGF In Vivo Тест на запальний біль із повним ад'ювантом Фрейнда (ПАФ). Для того щоб встановити, чи в стані антитіла анти-NGF купірувати біль у моделі хронічного периферичного запального болю мишей, повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ) вводили підшкірно (п/ш) у задню лапу самців мишей лінії C57BL/6, викликаючи термічну гіперальгезію, що оцінювали за тестом Харгрейвса (Torres et al. (2007) Pain130:267-278). Контрольні миші одержували чистий носій (тобто PBS). Після адаптації мишей в апараті Харгрейвса (модель 336, IITC Life Science) протягом 2-3 годин у день протягом 3 днів вони проходили тестування в апараті при активних установках інтенсивності, що дорівнюють 17 %. Щоб уникнути ушкодження тканин використовували час відсічення 25 сек. Для кожної з мишей відлік показань робили тричі протягом періоду 30 хвилин щодня, і для аналізу використовували медіанну латентність. Після одержання базисних значень в апараті Харгрейвса за 1 годину до введення 50 % розчину ПАФ (10 мг/20 мкл) у підошву задньої лапи в дозі 10 мг/кг або 25 мг/кг п/ш вводили тестовані антитіла анти-NGF, 301272-7E05-F6 (REGN268) і 301272-7G09-E4 (REGN270), а також гуманізоване антитіло анти-NGF (RN624) у ролі позитивного контролю. Тест Харгрейвса повторювали щодня протягом до 4 днів після ін'єкції ПАФ і розраховували % зниження в порівнянні з базисними показниками латентності відсмикування лапи (таблиці 12 і 13, середній % зміни ± СОС). Значне зменшення термічної гіперальгезії спостерігалося принаймні в один із днів аналізу для кожного з тестованих антитіл у порівнянні з контрольними мишами, які одержували лише носій (p < 0,001-0,05). Не реєструвалося статистичного розходження між тестованими антитілами та контрольним антитілом. Таблиця 12: n=7 для кожної групи; всі групи 10 мг/кг. Таблиця 13: носій: n=5; контроль RN624: n=5, 10 мг/кг; обоє REGN269: n=9). Таблиця 12 Час після ін'єкції ПАФ Вихідний рівень День 1 День 2 День 3 Носій Контроль (RN624) REGN268 REGN270 0,0±0,0 -73,8±1,8 -67,9±2,1 -54,4±2,8 0,0±0,0 -58,3±5,5 -30,9±5,2 -20,7±6,3 0,0±0,0 -68,3±3,0 -44,7±9,5 -28,9±11,3 0,0±0,0 -55,8±9,2 -36,6±9,9 -38,1±5,6 Таблиця 13 Час після ін'єкції ПАФ Вихідний рівень День 1 День 2 День 3 День 4 Носій Контроль (RN624) 0,0±0,0 -82,6±1,6 -76,7±3,6 -60,8±5,5 -40,3±5,0 0,0±0,0 -61,7±9,7 -33,1±17,9 -9,6±15,4 -0,4±18,5 21 REGN269 10 мг/кг 0,0±0,0 -79,8±1,8 -57,0±8,2 -23,9±12,4 -25,3±6,6 REGN269 25 мг/кг 0,0±0,0 -80,4±2,2 -54,0±5,2 -41,1±8,9 -16,9±12,6 UA 100382 C2 5 10 Модель болю післяопераційного шва. Модель болю післяопераційного шва в гризунів, при якому розріз підошви задньої лапи викликає підвищену чутливість до дотиків, захисну поведінку та термічну гіперальгезію, використовували для вивчення ефективності терапії антитілами антиNGF. При операції розтину підошви в мишей C57BL/6 під ізофлураном проводили розріз через шкіру, фасцію, після чого ізолювали м'яз згинача, що лежить нижче, яку розсікали вертикально. Після накладення шва та загоєння, мишей протягом 5 днів перевіряли на термічну аналгезію в ході тесту Харгрейвса та на захисну поведінку в тесті навантаження на лапу (модель 600, IITC Life Science). Разову п/ш ін'єкцію носія (n=7), mAb REGN268 (n=7) або контролю mAb RN624 (n=7) у дозі 10 мг/кг проводили за 1 годину до розтину (таблиця 14, середня відсоткова зміна від базисного значення Харгрейвса ± СОС). У таблиці 15 наводяться результати тесту навантаження на лапу (середній відсоток розподілу ваги на ушкоджену кінцівку ± СОС) (n=7 для кожної групи, контроль RN624 і REGN268, по 10 мг/кг кожен). В обох тестах попередня обробка досліджуваними антитілами або контрольним антитілом значно знижувала післяопераційний біль у порівнянні з контрольними мишами, які одержували лише носій (p < 0,001-0,05). 15 Таблиця 14 Час після операції Вихідний рівень День 1 День 2 День 3 День 4 День 5 Носій 0,00±0,0 -72,4±4,4 -72,7±3,5 -63,8±7,4 -52,1±7,8 -32,7±10,0 Контроль (RN624) 0,00±0,0 -62,5±10,6 -55,2±9,4 -5,3±12,1 -6,4±8,7 -5,3±5,6 REGN268 0,00±0,0 -59,9±8,9 -34,4±21,3 -19,8±18,8 6,9±4,4 6,8±7,8 Таблиця 15 Час після операції День 0 День 1 День 2 День 3 День 4 День 5 20 25 30 35 Носій 49,7±0,9 35,3±1,5 34,3±1,9 34,1±2,5 42,2±0,8 48,6±1,3 Контроль (RN624) 49,0±0,5 44,8±1,9 42,7±1,8 48,7±1,9 47,2±1,2 49,7±0,7 REGN268 50,3±0,7 39,5±3,4 40,7±2,0 42,0±3,3 44,8±1,0 48,8±0,8 Для того щоб установити, чи можуть антитіла анти-NGF знижувати сталий біль у моделі болю післяопераційного шва, REGN475 (25 мг/кг, n=7), RN624 (25 мг/кг, n=7) і контрольне антитіло IgG1 (25 мг/кг, n=7) вводили внутрішньочеревинно (в/ч) у день 1 післяопераційного періоду після проведення поведінкових досліджень. Термічну гіперальгезію досліджували в ході тесту Харгрейвса, а механічну алодинію вивчали в тесті фон Фрея. В останньому тесті випробування на мишах проходили після їхньої акліматизації протягом 2-3 годин протягом 4 днів в апараті із дротяною сіткою замість підлоги. Тест проводили за допомогою прикладання в порядку наростання послідовності ниток фон Фрея через дротяну сітку до поверхні підошви задньої лапи зі швом. Відповідь вважали позитивною, якщо у відповідь на дотик нитки лапу відривали від платформи. Починаючи із самої тонкої нитки, кожну нитку фон Фрея прикладали до п'яти разів, доти поки не спостерігалася відповідь. Результати тесту Харгрейвса (таблиця 16) показали, що введення антитіла REGN475 призводило до помітного повернення термічної гіперальгезії до вихідних показників після закінчення 72 годин після операції (p < 0,001-0,01). Таке повернення до вихідного рівня не спостерігалося в групі мишей, що одержували RN624, які поводилися так само, як і група, що одержувала контрольний IgG. У тесті фон Фрея (поріг відсмикування лапи) (g) (таблиця 17) обидва антитіла анти-NGF викликали аналогічне купірування механічної алодинії (p < 0,001-0,05) (IgG1 контроль=AVASTIN®, 25 мг/кг, n=7; RN624, 25 мг/кг, n=7; REGN475, 25 мг/кг, n=7). 22 UA 100382 C2 Таблиця16 Час після лікування анти-NGF Вихідний рівень День 1 6 годин 23 годин 47 годин 72 годин Контроль IgG1 0,0±0,0 -66,5±9,0 -79,8±3,8 -77,6±3,6 -61,2±6,6 -57,0±7,9 RN624 0,0±0,0 -74,7±4,3 -68,1±5,2 -40,5±8,9 -37,6±7,2 -47,2±8,0 REGN475 0,0±0,0 -72,6±5,4 -59,3±9,6 -37,0±15,0 -30,5±10,8 2,1±17,3 Таблиця17 Час після лікування анти-NGF Вихідний рівень День 1 5 годин 22 годин 45 годин 70 годин 5 10 Контроль IgG1 1,314±0,137 0,011±0,002 0,011±0,002 0,029±0,004 0,190±0,135 0,194±0,034 RN624 1,314±0,137 0,010±0,002 0,083±0,053 0,610±0,123 0,909±0,216 1,143±0,189 REGN475 1,286±0,074 0,010±0,002 0,034±0,009 0,714±0,074 1,086±0,184 1,571±0,437 За станом на день 4 після завершення тестів поведінки в рамках моделі болю післяопераційного шва сироватку мишей збирали та аналізували для визначення циркулюючих рівнів нейтрофіну-3 (NT-3) із застосуванням сендвічевого методу ELISA. Для з'ясування відповіді концентраційної кривої рівня детектування (~40 пг/мл) установлювали таким, що дорівнює двом стандартним відхиленням (2) від фону, що визначають мінімум за п'ятьма стандартами NT-3. Рівні NT-3 у мишей, що одержували RN624 (середнє  ст. відх. пг/мл, таблиця 18), демонстрували значний ріст (172  114 пг/мл, n=7) у порівнянні із тими, що одержували REGN475 (не виявлені = ND, n=7) або контроль IgG (AVASTIN®; ND, n=7). Таблиця18 Група Сироватка NT-3 172  114 ND ND RN624 REGN475 Контроль IgG1 15 20 Для порівняння, інтактні миші C57BL/6 під ізофлураном одержували разову п/ш ін'єкцію (50 мг/кг) REGN475, RN624 або контролю IgG1 mAb (AVASTIN®), та їхню сироватку аналізували через 1, 7 і 14 днів після введення для визначення рівнів NT-3 із використанням сендвічевого методу ELISA. Для з'ясування відповіді концентраційної кривої рівень детектування (~40 пг/мл) установлювали таким, що дорівнював двом стандартним відхиленням (2) від фону, обумовленого мінімум за п'ятьма стандартами NT-3. Рівні NT-3 (таблиця 19) у мишей, що одержували RN624 (131-199 пк/мл, n=6), підвищувалися в порівнянні з REGN475 (ND, n=6) або контролем IgG (ND, n=6), як було показано за допомогою описаної вище моделі болю післяопераційного шва. 23 UA 100382 C2 Таблиця19 Група Сироватка NT-3 День 1 RN624 REGN475 Контроль IgG1 День 7 RN624 REGN475 Контроль IgG1 День 14 RN624 REGN475 Контроль IgG1 5 10 131  41 ND ND 199  15 ND ND 196  35 ND ND Модель гострого суглобового болю при подагрі. Модель суглобового болю в мишей, викликаного ін'єкцією кристалів мононатрію урату (MSU) у гомілковостопний суглоб, використовували для дослідження ефективності антитіл даного винаходу для лікування суглобового болю при подагрі. Вільні від ендотоксинів кристали MSU (0,5 мг/20 мкл) вводили внутрішньосуглобово в гомілковостопний суглоб мишей C57BL/6, після чого їх тестували на наявність п'яткового термічного болю в ході тесту Харгрейвса протягом до 3 днів після ін'єкції кристалів MSU. Параметри адаптації та характеристики апарата для тесту Харгрейвса описані вище. Досліджувані mAb 7E05-F6 (REGN268; n=7), 6E07-D10 (REGN263; n=7), контрольні гуманізовані mAb (RN624; n=7) або носій (n=7) вводили п/ш у дозі 10 мг/кг за 1 годину до ін'єкції кристалів MSU у гомілковостопний суглоб. Як видно з таблиць 20 і 21, досліджувані антитіла значно знижували суглобовий біль у порівнянні з контрольними мишами, які одержували лише носій (p < 0,001-0,05). 15 Таблиця 20 Час після ін'єкції кристалів MSU у гомілковостопний суглоб Вихідний рівень День 1 День 2 День 3 День 4 Контроль (RN624) 0,0±0,0 -33,3±5,2 -4,5±11,2 -3,2±12,0 28,3±18,7 Носій 0,0±0,0 -62,4±3,1 -44,2±3,5 -24,9±7,9 -11,6±10,5 REGN268 REGN263 0,0±0,0 -28,1±7,8 29±19,3 12,1±15,5 19,9±16,5 0,0±0,0 -36,3±3,8 16,8±22,3 4,5±15,5 -9,0±5,5 Таблиця 21 Час після ін'єкції кристалів MSU у гомілковостопний суглоб Вихідний рівень День 1 День 2 День 3 20 25 Контроль (RN624) 0,0±0,0 -36,0±6,8 -11,8±9,8 -5,3±8,2 Носій 0,0±0,0 -62,6±2,7 -54,8±2,7 -31,8±3,4 REGN268 REGN263 0,0±0,0 -46,7±4,2 -28,5±8,4 -12,6±9,0 0,0±0,0 -53,9±4,0 -35,3±8,5 -28,5±8,6 Здатність антитіл анти-NGF знижувати сталий біль у моделі гострої подагри детальніше вивчали на мишах, що одержували ін'єкцію антагоніста IL-1 (пастка IL-1 (rinolacept), Economides et al. (2003) Nature 9:47-52) або колхіцину. Через день після ін'єкції кристалів MSU у гомілковостопний суглоб мишам вводили пастку mIL-1 (35 мг/кг; n=7), колхіцин (1 мг/кг; n=7), контроль mAb RN624 (10 мг/кг; n=7) або носій (n=7) і перевіряли наявність термічної гіперальгезії відповідно до описаної вище процедури. Крім того, інша група мишей (n=3) одержувала комбіноване лікування з пасткою mIL-1 і контролем RN624. Комбінаційна терапія антитілами анти-NGF і антагоністом IL-1 на день 2 після лікування значною мірою купірувала сталу термічну гіперальгезію в порівнянні з лікуванням одним носієм (p < 0,001-0,05), 24 UA 100382 C2 монотерапією антитілом анти-NGF (p < 0,001) або монотерапією антагоністом IL-1 (p < 0,001) (таблиця 22). Таблиця 22 0,0±0,0 Контроль (RN624) 0,0±0,0 Пастка mIL-1 + RN624 0,0±0,1 -52,9±2,6 -52,8±2,1 -51,9±2,4 -46,6±4,3 -54,8±2,0 -50,6±1,8 -33,1±4,9 -53,2±3,0 -43,3±4,4 -46,8±2,1 -31,9±6,2 -23,1±7,1 -32,0±10,6 -3,7±11,0 -37,3±3,6 -9,1±9,4 -23,0±7,6 -27,6±8,3 40,0±29,1 -26,9±4,4 -12,4±10,4 -14,3±9,8 -9,1±10,9 21,9±19,9 Час 10 15 20 Пастка mIL-1 Колхіцин Вихідний рівень День 1 після ін'єкції MSU 7 годин після введення День 1 після введення День 2 після введення День 3 після введення 5 Носій 0,0±0,0 0,0±0,0 -51,9±3,0 Невропатичний біль. Модель Зельтцера невропатичного болю в мишей (Malmberg et al. (1998) Pain 76:215-222) використовували для самців мишей C57BL/6, в яких формувалося часткове ушкодження нерва за рахунок накладення твердої лігатури шовковою шовною ниткою 7-0 навколо приблизно від 1/3 до 1/2 діаметра сідничного нерва на одному зі стегон у кожної миші. Після операції мишам дали відновитися протягом принаймні двох днів, а потім їх вивчали декілька тижнів після втручання для виявлення термічної гіперальгезії в тесті Харгрейвса. Як контроль використовували мишей із симульованою операцією, у ході якої відкривався доступ до сідничного нерва, але його перев'язку не проводили. Після операції миші проходили випробування в день 4 і день 7 після втручання для підтвердження розвитку термічної гіперальгезії. У день 7 після хірургії мишам вводили п/ш mAb REGN268 (100 мг/кг), контроль IgG1 (AVASTIN® 100 мг/кг) і носій. REGN268 у значному ступені купірували сталу термічну гіперальгезію в рамках даної моделі ушкодження нерва (таблиця 23; p < 0,05). Таке купірування болю не відзначалося в мишей із симульованою операцією. Результати представлені у формі середньої відсоткової зміни в порівнянні з вихідним рівнем Харгрейвса  СОС (симуляція-носій, n=3; симуляція-100 мг/кг контролю IgG1 (AVASTIN®), n=4; симуляція-100 мг/кг REGN268, n=5; Зельтцер-носій, n=5; Зельтцер-100 мг/кг контроль IgG1 (AVASTIN®), n=5; Зельтцер-100 мг/кг REGN268, n=8). Таблиця 23 Днів після операції 0 4 7 8 11 13 16 18 20 24 28 31 25 Симуляція- СимуляціяСимуляціяносій контроль IgG1 REGN268 0,0±0,0 8,5±3,9 4,5±1,3 10,3±1,7 5,0±2,3 15,4±2,6 4,2±4,0 10,2±7,8 7,8±6,0 7,6±5,6 11,1±6,0 11,7±6,6 0,0±0,0 -7,2±3,7 8,7±13,2 -9,4±4,1 14,7±11,4 -6,9±3,3 2,3±3,0 0,2±2,8 3,6±2,4 1,5±2,9 0,7±2,5 1,1±2,3 0,0±0,0 12,0±4,0 8,7±7,7 3,0±5,1 1,5±5,7 28,7±13,8 9,0±1,4 6,3±4,8 5,0±4,5 11,1±3,2 10,9±5,0 5,1±1,8 Зельтцерносій 0,0±0,0 -42,5±3,0 -45,7±1,5 -53,2±3,2 -61,5±4,2 -61,4±3,8 -52,2±5,3 -54,9±4,4 -53,8±4,5 -56,4±3,0 -53,9±2,1 -49,6±4,1 Зельтцерконтроль IgG1 0,0±0,0 -46,9±6,5 -55,3±6,4 -55,6±4,3 -57,3±5,1 -59,7±6,5 -51,2±4,0 -57,7±4,6 -53,2±4,9 -54,9±4,1 -51,81±4,1 -49,7±2,5 ЗельтцерREGN268 0,0±0,0 -46,4±3,7 -46,5±2,7 -2,4±6,8 4,2±11,2 1,2±5,7 2,1±12,1 2,2±10,0 -20,8±8,1 -26,4±6,8 -5,4±15,0 -23,3±11,7 У другому експерименті, для того щоб установити, чи може введення анти-NGF купірувати термічну гіперальгезію через 7 днів після операції, анти-NGF REGN268 (100 мг/кг) вводили п/ш у день 7, 14 або 21 після втручання. Помітне купірування болю реєструвалося для всіх трьох точок за часом у порівнянні з контролем IgG1 (AVASTIN® 100 мг/кг; p < 0,05) (таблиця 24, 25 UA 100382 C2 середня відсоткова зміна в порівнянні з вихідним рівнем Харгрейвса  СОС; 100 мг/кг контроль IgG1, n=6; 100 мг/кг REGN268, n=7). Таблиця 24 Днів після операції Вихідний рівень День 5 День 7 День 8 День 10 День 14 День 15 День 17 День 21 День 22 День 24 День 28 День 32 День 35 День 39 День 42 5 10 День 7 Контроль REGN268 IgG1 День 14 Контроль IgG1 REGN268 День 21 Контроль REGN268 IgG1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 -53,5±5,9 -55,4±4,4 -56,7±3,8 -64,3±2,6 -66,9±5,1 -60,6±4,0 -58,9±3,5 -54,1±9,6 -56,3±4,9 -55,6±5,1 -54,1±3,5 -41,9±8,3 -43,9±6,8 -42,5±6,9 -35,0±6,6 -51,4±5,6 -50,0±6,6 17,3±13,5 -6,4±7,7 -4,9±3,4 -1,7±10,5 -0,8±10,5 0,9±9,9 -1,0±10,0 -1,0±10,3 -9,0±9,6 -29,1±7,1 -32,6±7,4 -29,0±7,9 -26,1±7,6 -60,0±4,8 -54,4±6,4 -55,3±6,1 -52,8±7,2 -62,1±5,7 -63,0±5,8 -58,6±5,7 -57,1±4,4 -55,4±5,1 -49,5±6,6 -53,6±5,4 -40,9±13,1 -42,9±10,3 -39,0±11,4 -38,1±12,5 -54,2±5,2 -47,9±3,6 -47,2±3,2 -62,9±5,2 -59,7±2,1 -38,5±7,3 25,5±17,0 2,1±14,8 -6,4±7,1 -2,1±11,4 -1,8±8,5 -10,2±8,7 -11,8±7,9 -11,7±6,7 -8,9±8,6 -55,5±5,0 -47,2±4,8 -47,9±4,7 -55,0±6,7 -63,8±4,6 -54,5±5,0 -52,4±5,3 -55,8±3,6 -50,6±5,3 -44,7±5,7 -46,0±7,6 -32,8±4,8 -39,8±4,5 -34,6±10,0 -33,9±9,9 -55,5±6,0 -40,7±8,5 41,2±7,3 -45,9±6,9 -61,2±3,4 -47,1±4,4 -48,4±4,5 -48,1±5,0 -34,0±6,4 -3,2±10,8 13,9±12,0 8,0±12,9 12,2±12,4 12,3±10,8 -13,5±11,5 У третьому експерименті на моделі Зельтцера випробовували характеристики іншого антитіла анти-NGF REGN475. Після операції по Зельтцеру миші проходили випробування в день 5 і день 7 після втручання для підтвердження розвитку термічної гіперальгезії. Потім у день 7 після хірургії мишам вводили п/ш або в/ч REGN475 (50 мг/кг), контроль mAb RN624 (50 мг/кг) або контроль IgG1 (AVASTIN® 50 мг/кг). Помітне купірування болю спостерігалося для обох антитіл анти-NGF в обох групах мишей, як після п/ш (таблиця 25), так і після в/ч (таблиця 26) введення, тоді як контроль IgG1 не демонстрував ніяких ефектів (p