Композиції для нанесення покриття для контролю за патогенами олійних культур

Реферат: Композицію для покриття для насіння олійної рослини, з якої здатні рости коріння та пагони, де композиція для покриття містить органічний матеріал-носій та один або більше біологічні агенти, які мають активність щодо щонайменше одного або більше патогенів олійної рослини. UA 113848 C2 (12) UA 113848 C2 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Представлений винахід стосується композицій для нанесення покриттів, включаючи органічний компонент та біологічний агент для застосування до насіння олійних рослин, з якого здатні рости коріння та пагони, застосування композицій для нанесення покриттів на насіння олійних рослин, способів отримання таких композицій для нанесення покриття та покриття насіння такими композиціями для нанесення покриття. Зокрема, винахід стосується композицій для нанесення покриття, які містять органічний матеріал-носій та біологічні агенти, вибрані з хімічних речовин та біологічних агентів активних щодо одного або більше з патогенів рослини, вибраних з бактеріальних, грибкових та членистоногих патогенів, які заражають насіння олійних рослин. Втрати урожаю олійного насіння зернових реєструються щорічно, та виникає в результаті зараження рослин паразитами завдяки патогенам, таким як бактерії, гриби та членистоногі, які можуть заражати рослину на різних стадіях розвитку, таких, як на посівний стадії. Агрономічні втрати завдяки зараженням патогенами залишаються високими незважаючи на чисельні захисні заходи, які були розроблені людиною для боротьби з такими зараженнями. Такі захисні заходи включають застосування синтетичних хімічних речовин; застосування генної інженерії рослин; та застосування живих біологічних агентів, які застосовують в формі покриттів, розпилень та промивань до структур олійних рослин, таких як насіння. Пестициди у вигляді хімічних агентів, таких як фунгіциди, бактерициди та артроподициди, як правило, у вигляді інсектицидів та/або акарицидів, можуть бути застосовані до олійних зернових культур у формі просочувань ґрунту, обробок насіння рідиною, тощо. Такі види хімічної обробки мають тенденцію бути змішаними та можуть негативно вплинути на корисні бактерії, грибки та членистоногі, а також патогени рослин, на які такі обробки спрямовані. Коли застосовують традиційні пестициди для обробки насіння, то насіння покривають пестицидом безпосередньо або пестицид застосовують до насіння в присутності неорганічного носія. Такі обробки насіння, як правило, застосовують в рідкій формі, або у вигляді вологої глинистої суспензії, та потім насіння висушують. Такі обробки в основному спрямовані на забезпечення безпосереднього захисту від патогенів, таких як членистоногі та/або, мікроорганізмів, що знаходяться на насінні, та/або мікроорганізмів, що знаходяться на ґрунті, які атакують насіння. Високий рівень хімічних речовин, які зазвичай використовують, вводить хімічне навантаження на довкілля, що може призвести до виникнення екологічних проблем. Однією з проблем при застосуванні біологічного агента, який є хімічною речовиною в традиційних методиках покриття насіння, є те, що хімічну речовину, як правило, застосовують у вигляді глинистої суспензії, і це може призвести до виникнення нерівномірного нанесення покриття у відповідності з чим насіння не є повністю покритим або у відсотках, аж до 20 % насіння, залежно від типу насіння та застосованого способу покриття, не стають повністю покритими. Крім того, покриття насіння не може бути однорідним, та це призводить до виникнення фізичних недоліків у насінної оболонки та покриття може відшаровуватися. Наступна проблема виникає при використанні біологічних агентів, які вибирають з корисних живих бактеріальних і грибкових видів, які можуть бути застосовані умовно до рослинних структур, таких як насіння, наприклад, у вигляді спор у поєднанні з неорганічним носієм у формі порошкових композицій або у формі рідких композицій, які потім можуть бути висушені знову, яка полягає в тому, що біологічні агенти, які застосовують, швидко втрачають життєздатність. Без наміру бути пов'язаною з теорією вважається, що як насіння висушують, мікросередовище змінюється та життєздатність живих біологічних агентів, які застосовують, як може бути видно, різко знижується та майже відразу як висихає композиція, яка застосовується. Втрата життєздатності біологічного агента, як правило, є пов'язаною з розщепленням грибкових або бактеріальних спор, що робить їх нежиттєздатними. На даний момент виявлено, що шляхом використання органічної речовини-носія в поєднанні з біологічним агентом, життєздатність біологічного агента покращується на структурах олійних рослин, таких як насіння, по відношенню до життєздатності біологічних агентів, які традиційно застосовують до такого насіння. Крім того, покриття структури рослини є менш чутливим до відшаровування. Завданням представленого винаходу є забезпечити покращенні покриття для насіння, які містять біологічні агенти для насіння олійних рослин. Крім того, завданням винаходу є забезпечити покриття для насіння, що застосовує менші кількості хімічних речовин для захисту насіння та/або молодих проростків від патогенів, ніж традиційні покриття для насіння. Ці та інші завдання винаходу стануть очевидними з наступного опису та прикладів. Відповідно до представленого винаходу передбачається композиція для покриття насіння олійних культур, де згадана композиція для покриття містить, щонайменше, один органічний матеріал-носій у вигляді частинок, де матеріал-носій є вибраним з восків, що мають 1 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температуру плавлення ≥ 50° за Цельсієм та один або більше біологічних агентів, які мають активність проти одного або більше патогенів олійної рослини. Згідно основної думки представленого винаходу олійним насінням є те, з якого здатні рости коріння та пагони. Посилання на "насінини" та "насіння" використовують в даному документі взаємозамінно та воно означає насінини, як правило, життєздатні насінини, до яких застосовують композиції за винаходом. "Насіння олійних культур", як передбачається в даному документі, означає насіння, яке є здатним до проростання, щонайменше, на традиційних рівнях проростання, характерних для відповідних видів олійних рослин, що розглядаються. "Олійними рослинами" згідно з основною думкою представленого винаходу є ті, які розпізнаються, як такі кваліфікованим фахівцем. Насінини олійних рослин, прийнятні для покриття композиціями за винаходом, включають ті, які вибрані з членів родини хрестоцвітих (каноли (B. campestris) та олійного ріпаку (6. napus), соняшнику, арахісу, сафлору, кунжуту, олійних горіхів, ріжкового дерева, коріандру, гірчиці, винограду, льону, льняного насіння, дикаріону, коноплі, бамії, сосни, маку, рицини, жожоби, тощо. Органічний матеріал-носій вибирають з органічних речовин, які можуть бути застосовані для насіння олійних рослин переважно у вигляді сухого порошку, де частинки порошку мають заздалегідь визначений середній об'ємний діаметр, у вигляді рідини, такої як олієподібна композиція, або у вигляді водної композиції. Як правило, композитні частинки застосування в сухій порошковій композиції за винаходом мають середній об'ємний діаметр певного розміру, як визначено в даному документі. Щоб отримати частинки органічних речовин з середнім об'ємним діаметром, що здатні бути застосованими для використання в даному винаході, органічні матеріали у формі, наприклад, від 1 до 5 кілограмових блоків або таблеток, можуть бути розбиті або подрібнені на дрібні міліметрового розміру шматки (такі як, від 2 мм - 8 мм приблизного діаметру в розмірі, наприклад, від 4 мм до 6 мм) в дробарках. Міліметрового розміру шматки потім можуть бути пропущені через подрібнюючі засоби, такі як стандартний млин, наприклад, подрібнюючий млин Apex, та розмелюють або подрібнюють до частинок, що мають приблизний діаметр в діапазоні від 100 мкм - 500 мкм, наприклад від 250 мкм – 300 мкм. Подрібнені частинки мікронного розміру потім можуть бути пропущені через мікронізуючий апарат, такий як AFG мікронізуючий повітряний млин, щоб отримати частинки бажаного діапазону СОД, такого як, від 15 мкм – 20 мкм, які знаходять застосування в представленому винаході. Кваліфікований фахівець оцінить, що такі методики для отримання маленьких частинок є добре відомими в даній галузі з рівня техніки. Переважно, сухі порошкові композиції за винаходом містять композитні частинки, що мають середній об'ємний діаметр ≥ 5 мкм, наприклад, 8 мкм, 9 мкм, 10 мкм, 11 мкм, 12 мкм, 13 мкм, 14 мкм, 15 мкм аж до 40 мкм або будь-яке значення між ними. Як зазначено в даному документі, середній об'ємний діаметр композитних частинок, як правило, становить ≥ 10 мкм або ≥ 12 мкм та може знаходиться в діапазоні від 10 мкм до 200 мкм, та може мати значення, яке знаходиться будь-де серед них, наприклад, від 10 мкм до 100 мкм, або від 10 мкм до 40 мкм, або від ≥ 10 мкм до 30 мкм, або будь-якого бажаного значення середнього об'ємного діаметра в проміжному положенні. Переважно, сухі порошкові композиції за винаходом містять частинки, що мають середній об'ємний діаметр ≥ 8 мкм, наприклад 8 мкм, 9 мкм, 9,7 мкм, 10 мкм, 11 мкм, 12 мкм, 13 мкм, 14 мкм, 15 мкм, тощо аж до будь-якого середнього об'ємного діаметру за вибором, наприклад, до 200 мкм або будь-яким середнім об'ємним діаметром з проміжним значенням, наприклад, 9,7 мкм, 40 мкм або 30 мкм. Вважається, що частинки за винаходом, які мають середній об'ємний діаметр ≥ 10 мкм, є менш торакально небезпечними для людей та не вважаються такими, що є алергенними. У рідких композиціях, частинки попередньо визначеного середнього об'ємного діаметру суспендують в тій в суспензійний композиції та застосовують до насіння, яке потім сушать, застосовуючи традиційні методики сушіння. Коли органічний матеріал-носій застосовують до насіння олійних рослин у формі сухого порошку, частинки органічного матеріалу-носія можуть мати середній об'ємний діаметр будь-якого традиційного розміру, як описано в даному документі. Для таких сухих порошків, хімічні речовини для використання проти членистоногих патогенів, таких як комахи, павукоподібні та якщо доцільно, їх личинок, яєць або лялечок; хімічні речовини для застосування проти бактеріальних патогенів та хімічні речовини для застосування проти грибкових патогенів можуть бути додані перед покриттям олійного насіння. Крім того, корисні живі біологічні агенти, такі як біологічні антагоністи, можуть бути додані до таких сухих порошків для застосування в представленому винаході, живі біологічні агенти будучи здатними до цільових бактеріальних патогенів олійної рослини та/або цільових грибкових патогенів олійної рослини. Спори за вибором корисних живих біологічних агентів, таких як грибна конідія, або гіфа, або міцелії грибів, які не утворюють спор або конідія-подібних структур, можуть бути 2 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 додані до сухих порошків для використання в представленому винаході. Відповідні органічні матеріали-носії для використання у винаході, як правило, складаються з органічних речовин, таких як воски, що мають температуру плавлення ≥ 50 °C, більш переважно ≥ 60 °C, та найбільш переважно складаються з твердих восків, що мають температуру плавлення ≥ 70 °C. Природні воски для застосування в представленому винаході, включають карнаубський віск, бджолиний віск, китайський віск, шелаковий віск, спермацетовий віск, мірицилпальмітат, цетилпальмітат, канделільський віск, гідрогеноване касторове масло, урікуровий віск, ланолін, віск цукрового очерету, рематовий віск, віск рисових висівок, тощо. Синтетичні воски для застосування в представленому винаході, включають прийнятні воски, вибрані з парафінового воску, мікрокристалічного воску, поліетиленових восків, восків ФішераТропша, заміщених амідних восків, полімеризованих α-олефінів, тощо. Мінеральні воски для застосування в винаході включають гірський віск (наприклад, Lumax® Bayer), церезиновий віск, озокерит, віск торф'яний, тощо. Прийнятні органічні частки носія для застосування в представленому винаході можуть бути вибрані з восків, таких як карнаубський віск, бджолиний віск, гірський віск, китайський віск, шелаковий віск, спермацетовий віск, мірицилпальмітат, цетилпальмітат, канделільський віск, гідрогенована касторова олія, урікуровий віск, ланолін, віск цукрового очерету, рематовий віск та віск рисових висівок. Такі воски, як правило, демонструють високу ентальпію енергії ґратки під час розплавлення. Переважно органічний матеріал-носій є карнаубським воском, який може бути застосований в рідкій формі, як правило у формі суспензії, або, переважно, в порошковій формі як дискретні частинки. Як правило, частинки для застосування в винаході мають середнє об'ємне значення, одержене в залежності від кінцевого призначення та очевидної необхідності. Рідкі композиції за винаходом можуть бути сформульовані як водні композиції або як олієподібні композиції в залежності від розробки. Водні композиції можуть включати поверхнево-активні речовини, вибрані з комерційно доступних поверхнево-активних речовин, таких як Libsorb, Silwet L77, Tween 80, Torpedo II, Newmans T80, Fortune, Guard, Rhino, Biopower, тощо. Олієподібні композиції, іншими словами, композиції на основі олії, можуть містити будь-яку олію, прийнятну для застосування в представленому винаході, яка може бути вибраною з мінеральних олій, таких як парафінова олія, та рослинних олій, таких як рапсова олія, соєва олія, соняшникова олія, пальмова олія, тощо. Олієподібні композиції для застосування у винаході містять органічні частинки носія, як описано в даному документі, та вони, в свою чергу, можуть бути змішані з агентами, що підвищують плинність, такими як гідрофільний осаджений діоксид кремнію, наприклад, Sipernat 383 DS, Sipernat 320, EXP 4350 та Sipernat D-17, тощо. Такі агенти для запобігання злежуванності можуть бути дисперговані в оліях, наприклад, з метою запобігання піноутворенню. Кваліфікований спеціаліст прийме до уваги, що там, де може бути використана водна або олійна композиції, щоб застосувати біологічні агенти для застосування у винаході, рідкий елемент повинен бути видалений з покритої структури рослини після того, як покриття досягається, наприклад, шляхом висушування, використовуючи традиційні процеси висушування, залишаючи композицію для покриття насіння, яка знаходиться в формі сухих частинок, де композиція для покриття насіння складається з органічного носія, як описано в даному документі, та, щонайменше, одного біологічного агенту, який також описаний в даному документі. Біологічний агент для цілей представленого винаходу є таким, що може бути застосований для контролю популяції рослинного патогену олійної рослини, та може бути вибраним з хімічних фунгіцидів, артроподицидів, таких як інсектициди та акарициди, бактерицидів, та з живих біологічних агентів, які є здатними контролювати популяцію одного або більше патогенів насіння або несучого шару ґрунту насіння олійних рослин, які дають можливість рости корінню та/або пагонам. Переважно, популяція патогену нанесеного ґрунту на або в безпосередній близькості до насіння олійної рослини зменшують або роблять нездатними до репродукції біологічного агенту відтворення, та/або шляхом їх знищення. Приклади біологічний агентів для застосування в представленому винаході включають хімічні речовини для застосування на насінні олійних рослин, вибраних з артроподицидів, таких як інсектициди та акарициди, фунгіциди та бактерициди, що зазвичай застосовують в даній галузі. Прийнятні приклади, таких хімічних речовин включають нікотиноїдні інсектициди, такі як імідаклоприд [(E)-1-(6-хлор-3піридилметил)-N-нітроімідазолідин-2-іліденамін], метилкарбаматні інсектициди, такі як метіокарб [4-метилтіо-3,5-ксиліл метилкарбамат], оксимкарбаматні інсектициди, такі як тіодикарб [(3E2,12EZ)-3,7,9,13-тетраметил-5,11-діокса-2,8,14-тритіа-4,7,9,12-тетраазапентадека3,12-дієн-6,10-діон] (який застосовують на олійному ріпаку, канолі), та тіазольні інсектициди, такі 3 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як клотіанідин [(Е)-1-(2-хлор-1,3-тіазол-5-ілметил)-3-метил-2-нітрогуанідин] (які застосовують на олійному ріпаку та канолі), тіаметоксам (ЕZ)-3-(2-хлор-1,3-тіазол-5-ілметил)-5-метил-1,3,5оксадіазинан-4-іліден(нітро)амін (який застосовують на соняшнику, окрі, арахісі); фунгіциди для застосування на насінні у відповідності до винаходу включають ті, які вибирають з ациламінокислотних фунгіцидів, таких як мефеноксам [метил N-(метоксиацетил)-N-(2,6-ксиліл)D-аланінат] (який застосовують на соняшнику, окрі, арахісі), стробілуринових фунгіцидів, таких як азоксистробін [метил (2E)-2-{2-[6-(2-ціанофенокси)піримідин-4-ілокси]феніл}-3метоксіакрилат] (який застосовують на соняшнику, канолі), пірольних фунгіцидів, таких як флудіоксиніл [4-(2,2-дифтор-1,3-бензодіоксол-4-іл)-1H-пірол-3-карбонітрил] (який застосовують на соняшнику, насінні бавовни, арахісі, льоні, жодобі, насінні рапсу, сафлорі, арахісі), тіазольних фунгіцидів, таких як тіабендазол [2-(тіазол-4-іл)бензімідазол або 2-(1,3-тіазол-4-іл)бензімідазол], коназольних фунгіцидів, таких як флуквінконазол [3-(2,4-дихлорфеніл)-6-фтор-2-(1Н-1,2,4триазол-1-іл)хіназолін-4(3H)-он] (який застосовують на насінні каноли), дитіокарбаматних фунгіцидів, таких як тірам [тетраметилтіураму дисульфід або біс(диметилтіокарбамоїлу) дисульфід] (який застосовують на окрі), фталимідних фунгіцидів, таких як каптан [N(трихлорметилтіо)циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоксимід] (який застосовують на арахісі), анілідних фунгіцидів, таких як карбоксин [5,6-дигідро-2-метил-1,4-оксатиїн-3-карбоксанілід] (який застосовують на арахісі), дитіокарбаматних фунгіцидів, таких як манеб [етиленбіс(дитіокарбамат) марганцю (полімерний)] (який застосовують на арахісі), та ароматичних фунгіцидів, таких як PCNB [пентахлорнітробензол] (який застосовують на арахісі), тощо. Кваліфікованому спеціалісту буде очевидно, що композиції за винаходом також можуть бути добавлені безпосередньо в ґрунт або середовище для вирощування, в яких олійні культури повинні висаджувати. Такі композиції можуть додавати як порошки та змішувати з ґрунтом або застосовувати як рідкі суспензії, використовуючи традиційні методики. Патогени нанесеного ґрунту для цілей представленого винаходу є такими, що здатні колонізуватися на кутикулі насіння та/або такими, що заселяють ґрунт та які є здатними діяти на олійні культури. Такі патогени нанесеного ґрунту є, як правило, бактеріями та/або грибами. Приклади бактеріальних та грибкових патогенів нанесеного ґрунту, які атакують олійні рослини, включають Aspergillus spp., Rhizoctonia spp. (активні до, наприклад, насіння рапсу, каноли), такі як R. solani активний до S. napus та B. campestris), Peronospora spp., такий як P. parasitica (активний до B. napus та B. campestris), Pythium spp, (активний до, наприклад, каноли та олійного ріпаку, соняшнику), Fusarium spp. (активний до соняшнику), такий як F. оксиsporum (активний до, наприклад, каноли та олійного ріпаку), Phytophthora spp. (активний до, наприклад, каноли та олійного ріпаку, наприклад, P. megasperma), Verticillium spp. (активний до соняшнику), такий як V. longisporum (активний до Brassica spp., такий як 6. napus та 6. campestris), Sclerotium spp. (активний до, наприклад, каноли), Agrobacterium tumefaciens (активний до соняшнику та Brassica spp., наприклад, каноли), Phoma spp.(активний до соняшнику), такий як Phoma lingam (активний до Brassica spp.), Pseudomonas spp. (активний до соняшнику та каноли, наприклад, P. syringae pv maculicola), Altemaria spp. (активний до каноли, соняшнику), Xanthamonas spp., такий як X. campestris (активний до B. napus та B. campestris), тощо. Відповідно до наступного аспекту винаходу передбачається застосування органічних частинок носія воску у виробництві композиції для покриття насіння олійних культур, яка включає біологічний агент, як визначено в даному документі вище. органічні частинки носія вибирають з природних восків, синтетичних восків та мінеральних восків, які мають температуру плавлення від 50 °C, більш переважно від 60 °C, та, найбільш переважно, складаються з твердих восків, що мають температуру плавлення від 70 °C. Прийнятні воски для застосування в даному аспекті винаходу можуть вибирати воски з восків, таких як карнаубський віск, бджолиний віск, гірський віск, китайський віск, шелаковий віск, спермацетовий віск, мірицилпальмітат, цетилпальмітат, канделільський віск, гідрогенована касторова олія, урікуровий віск, ланолін, віск цукрового очерету, рематовий віск, та віск рисових висівок або суміші з них двох або більше. Переважно, покриття для насіння, які застосовують, в даному аспекті винаходу включають карнаубський віск, як органічний носій. Переважно, в даному аспекті винаходу, частинки органічного носія мають середній об'ємний діаметр ≥5 мкм, такий як в діапазоні ≥ 8 мкм до 200 мкм, як описано в даному документі. В третьому аспекті винаходу передбачається застосування воску, як органічного носія в формі частинок в композиції для покриття олійних культур, як описано в даному документі. Частинки органічного носія в даному аспекті винаходу вибирають з природних восків, синтетичних восків та мінеральних восків, що мають температуру плавлення ≥ 50 °C, більш переважно, ≥ 60 °C та, найбільш переважно, та складаються з твердих восків, що мають 4 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температуру плавлення ≥ 70 °C. Прийнятні частинки органічного носія для застосування в даному аспекті винаходу можуть вибирати з карнаубського воску, бджолиного воску, гірського воску, китайського воску, шелакового воску, спермацетового воску, мірицилпальмітату, цетилпальмітату, канделільського воску, гідрогенованої касторової олії, урікурового воску, ланоліну, воску цукрового очерету, рематового воску та воску рисових висівок або суміші з них двох або більше. Переважно, частинки воскового носія для застосування в даному аспекті винаходу включають частинки органічного носія карнаубського воску. Переважно все ж, частинки органічного носія для застосування в даному аспекті винаходу мають середній об'ємний діаметр ≥10 мкм, такий як в діапазоні ≥ 10 мкм до 200 мкм. В четвертому аспекті винаходу передбачається спосіб виробництва композиція для покриття насіння олійних культур, як описано в даному документі, що включає 1) вибір органічного матеріалу-носію, де матеріал-носій вибирають з восків, що мають температуру плавлення ≥ 50° за Цельсієм; 2) подрібнення зазначеного органічного матеріалу-носію до частинок бажаного середнього об'ємного діаметру від 5 мкм, такого як в діапазоні ≥ 8мкм до 200 мкм; та 3) додавання біологічного агенту до частинок продукту зі стадії 2). Біологічний агент для застосування в даному аспекті винаходу вибирають з хімічного агенту, який є артроподицидом, таким як інсектицид, або акарицид, або їх суміші, або хімічного фунгіциду, або виду гриба та/або виду бактерії, або суміші з них одного або більше. Приклади живих біологічних агентів (також відомі як організми біоконтролю або агенти біоконтролю), які є загально названими в даній галузі, як "біологічні антагоністи", які можуть бути застосовані в композиції для покриття за представленим винаходом, включають Pseudomonas spp., Trichoderma spp., такі як T. viride (але не для застосування на цибулях) (при просіюваннях насіння є активними до Rhizoctonia solani, Macrophomina phaseolina та Fusarium spp.), Streptomyces spp., такі як Streptomyces lydicus (доступний від Natural Industries Inc., Houston, Texas, USA), Ampelomyces quisqualis ізолят M-10 (доступний від Ecogen Inc, Langhorne, USA), Bacillus spp., такі як Bacillus subtilis GB03, 8. lichenformis, та 8. megaterium (всі доступні від Growth Products, White Plains, USA), Coniothyrium minitans (доступний від Prophyta Biologischer Pflanzenschutz GmbH, Germany), Agrobacterium radiobacter штам 84 (доступний від AgbioChem Inc, Florida, USA), Erwinia amylovora HrpN гарпін протеїн (доступний від Eden Bioscience Corp., Bothell WA, USA), Streptomyces griseoviridis штам K61 (доступний від Kemira Agro Oy, Helsinki, Finland), Agrobacterium radiobacter K1026 (доступний від Bio-care Technology, Australia), Gliocladium catenulatum (доступний від Kemira Agro Oy, Helsinki, Finland), Trichoderma harzianium Rifai штам KRL-AG2 (T-22) (доступний від Bioworks Inc, Geneva, USA) та Gliocladium virens (aka Trichoderma virens) GL-21 (доступний від Certis Inc., Columbia, USA). Прийнятні фунгіциди, які можуть застосовувати для насінної обробки насіння олійних рослин включають ті фунгіциди, які вибирають з ациламінокислотних фунгіцидів, таких як мефеноксам [метил N-(метоксіацетил)-A/-(2,6-ксиліл)-D-аланінат] (який застосовують на соняшнику, окрі, арахісі), стробілуринових фунгіцидів, таких як азоксистробін [метил (2E)-2-{2-[6-(2ціанофенокси)піримідин-4-ілокси]феніл}-3-метоксиакрилат] (який застосовують на соняшнику, канолі), пірольних фунгіцидів, таких як флудіоксиніл [4-(2,2-дифтор-1,3-бензодіоксол-4-іл)-1Hпірол-3-карбонітрил] (який застосовують на соняшнику, арахісі, льоні, жодобі, насінні рапсу, сафлорі, арахісі), флуквінконазол [3-(2,4-дихлорфеніл)-6-фтор-2-(1H-1,2,4-триазол-1іл)хіназолін-4(3H)-он] (який застосовують на насінні каноли), дитіокарбаматних фунгіцидів, таких як тірам [тетраметилтіураму дисульфід або біс(диметилтіокарбамоїл)дисульфід] (який застосовують на окрі). Прийнятні приклади таких хімічних речовин, крім того, включають нікотиноїдні інсектициди, такі як імідаклоприд [(Е)-1-(6-хлор-3-піридилметил)-N-нітроімідазолідин-2-іліденамін], метилкарбаматні інсектициди, такі як метіокарб [4-метилтіо-3,5-ксиліл метилкарбамат], оксимкарбаматні інсектициди, такі як тіодикарб (3EZ, 12ЕZ)-3,7,9,13-тетраметил-5,11-діокса2,8,14-тритіа-4,7,9,12-тетраазапентадека-3,12-дієн-6,10-діон] (всі з яких застосовують на олійному ріпаку, канолі) та тіазольні інсектициди, такі як клотіаніцидин [(Е)-1-(2-хлор-1,3-тіазол5-ілметил)-3-метил-2-нітрогуанідин] (який застосовують на олійному ріпаку та канолі), тіаметоксам (ЕZ)-3-(2-хлор-1,3-тіазол-5-ілметил)-5-метил-1,3,5-оксадіазинан-4-ілiден(нітро)амін (який застосовують на соняшнику, окрі, арахісі), тощо. Органічний матеріал-носій в даному аспекті винаходу можуть вибирати з восків, таких як з тих восків, які описані в даному документі раніше. Прийнятні воски можуть вибирати з восків, таких як карнаубський віск, бджолиний віск, гірський віск, китайський віск, шелаковий віск, спермацетовий віск, мірицилпальмітат, цетилпальмітат, канделільський віск, гідрогенована касторова олія, урікуровий віск, ланолін, віск цукрового очерету, рематовий віск та віск рисових 5 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 висівок або суміші з них двох або більше. Переважно, частинки воскового носія для застосування в даному аспекті винаходу містять сухі частинки карнаубського воску. В наступному аспекті винаходу, передбачається композиція для покриття насіння, така як композиція для покриття насіння, яку отримують за способами, як описано в даному документі. В наступному аспекті винаходу передбачається композиція для покриття олійних культур, як описано в даному документі, для застосування до олійних культур. В наступному аспекті винаходу передбачається спосіб покриття насіння олійної рослини композицією для покриття, яка містить органічний матеріал-носій та біологічний антагоніст до одного або більше грибкових патогенів, бактеріальних патогенів та членистоногих патогенів таким чином, щоб обмежити пошкодження згаданими патогенами зазначеного насіння олійної рослини, спосіб, що включає додавання біологічного антагоністу до органічного матеріалуносію, де органічний матеріал-носій знаходиться в формі сухих частинок, змішування двох компонентів разом та застосування одержаної в результаті композиції в формі сухих частинок до олійних культур. Таким чином, композицію для покриття насіння застосовують до насіння в формі сухих частинок. Безумовно, кваліфікованому спеціалісту буде зрозуміло, що органічний матеріал-носій, крім того, може містити додаткові пігменти, пластифікатори та інші другорядні компоненти, як описано в даному документі. Як альтернатива, покриття для насіння може бути застосоване в рідкій формі, як описано в даному документі, та потім насіння висушують, залишаючи композицію для покриття, яка знаходиться в формі сухих частинок, на насінні. Однак, Переважним є те, що композицію для покриття застосовують в формі сухих частинок для легкого застосування, та вартість виробництва утримують низькою. Органічний матеріал-носій в даному аспекті винаходу можуть вибирати з карнаубського воску, бджолиного воску, гірського воску, китайського воску, шелакового воску, спермацетового воску, мірицилпальмітату, цетилпальмітату, канделільського воску, касторового воску, урікурового воску, ланоліну, воску цукрового очерету, рематового воску та воску рисових висівок або суміші з них двох або більше. Переважно, органічний матеріал-носій є карнаубським воском в формі сухих частинок. Зараз слідують приклади, що іллюструють винахід. Слід розуміти, що приклади не повинні бути тлумачені як такі, що обмежують винахід будь-яким чином. Фігура 1: Спорові навантаження Trichoderma на олійний ріпак Розділ – приклади Контроль за Xanthomonas campestris [United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)] на олійному ріпаку/канолі (Brassica napus) за допомогою обробок насіння. Застосування антагоністів Trichoderma harzianum [United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)], Pseudomonas fluorescens [UKNCC] та Bacillus subtilis [UKNCC] Чорна гниль на капусних (Brassicae) Симптоми Чорна гниль представляє собою васкулярне захворювання, яке передається з насінням. Бактерії можуть проникати в рослину через гідатоди або пошкодження. Основними симптомами є V-подібні хлоротичні, жовті пошкодження по краям листя, з потемнінням жилок; пошкоджені листки можуть передчасно опадати та, крім того, може відбуватись деформація листків, карликовість та смерть рослини. Недоліки традиційної обробки насіння i) Обмежена можливість дози – Кількість пестициду, яка може бути застосована, обмежується кількістю, яка в дійсності буде прилипати до насіння. ii) Обмежена тривалістю захисту – Тривалість часто є короткою завдяки відносно невеликої кількості біологічного агенту (наприклад, хімічного), яку застосовують до насіння, розбавленню біологічного агенту, коли рослина росте, та руйнуванню біологічного агенту. iii) Обмеженого терміну зберігання обробленого насіння – Виробництво надлишку обробленого насіння є небажаним, тому що термін зберігання обробленого насіння може бути обмеженим. Всі три з даних обмежень можна подолати або значно зменшити шляхом включення частинок карнаубського воску, як носія для біологічного агенту, в даному випадку, який не діє на мікроорганізми, які застосовують до насіння. За сприятливих умов, мікроорганізми ростуть та колонізуються на зовнішній поверхні насіння або розсади, що розвивається. Біологічні агенти можуть допомогти у зниженні гниття насіння, захворюванності розсади або кореневої гнилі. Наступні випробування проводять для вивчення можливого впливу включення частинок карнаубського воску. Перша фаза – Виділення культур 1. Підтримання культур 6 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Реєстрації зберігають з кожної виділеної субкультури, які мають присвоєний їм інвентарний номер. Всі планшети та предметні скельця, які стосуються такої субкультури, маркують інвентарним номером. Крім того, постійні встановлені лактофенольні (LP) предметні скельця виконують з кожної з вихідних культур та заносять в файл для контрольних цілей. Не більше, ніж три покоління субкультури проходить перед пасируванням через живого господаря та повторне виділення для того, щоб зберегти пристосованість організму. Субкультури зберігають для майбутнього застосування на картопляному агарі з декстрозою (PDA) при 4 °C. Кожному ізоляту присвоюють інвентарний номер та субкультури маркірують таким номером. ДНК екстрагують для перевірки індивідуальності та зберігають при -20 °C. Еталонний зразок чистої культури зберігають в гліцерині при -20 °C. На завершення повторюють експеримент з ідентифікації ДНК культури, щоб підтвердити, що організм не мутував в процесі роботи. 2. Культивування збудника Виділення патогенних бактерій з враженої тканини у чисті культури є одним зі стандартних способів в ідентифікації та в описуванні захворювань. Це є важливим доказом патогенності організмів, які раніше не зустрічались. Способи, як правило, включають: a. Обробка поверхні стерилізацією. b. Покриття (можливо на селективному середовищі) зразків ураженої тканини з відповідними запобіжними заходами. c. Субкультивування, щоб отримати чисті культури. 3. Очистка культур Маленьки дезинфіковані шматочки кореня штучно інокульованої рослини культивують на водному агарі. Бактеріальні колонії, які виникають найбільш часто, є можливим цільовим патогеном. Декілька сапрофітів, крім того, можуть бути присутніми в тканинах інфікованої рослини та вони можуть рости в середовищі з основним патогеном. Звичайна стерилізація поверхні складається з протирання тканини (або занурення в) 0,1 % розчином гіпохлориту натрію (NaOCl – іноді також називають як "NaClO") з наступним промивання стерильною дистильованою водою. Для отримання чистої культури патогену, маленький зразок беруть з краю колонії, що росте, фламбованою петлею або скальпелем та з прожилками на поверхні попередньо відлитого планшету PDA. Включення циклогексиміду (протигрибковий агент здатний пригнічувати ріст сапрофітних грибів) при 30 мг/л знижує ризик бактеріального зараження. Як розвиток смуги на агарі, спори відокремлюють до тих пір, доки одинарні спори не будуть отримані, з яких окремі колонії будуть рости. Дану процедуру повторюють до тих пір, доки чисті культури не будуть отримані. 4. виділення окремої спори Виділення окремих спор є важливим для дослідження патогенної варіабельності. Інокулят спор розміщують в пробірку, що містить 10 мл стерильної води. Дану суспензію спори штрихують вздовж відміченої лінії на поверхні тонкого відгалуження водного агарного середовища, та інкубують при 22 °C. Після 24 годинної інкубації, вибирають пророщені спори, використовуючи стереоскопічний мікроскоп, та переносять одну спору одночасно на інший агаровий планшет. 5. Приготування мікроскопічного препарату для мікроскопічного дослідження та посилання Ідентифікація патогену, переважніше, ніж захворювання, вимагає мікроскопічного дослідження інфікованої тканини. Краплю води поміщають у воскове коло, яке створюють на предметному склі. Використовуючи стерилізовану та охолоджену інокуляційну петлю, отримують дуже маленький зразок бактеріальної колонії. Бактерії акуратно перемішують в краплі води. Регулюють нагрівання бактеріального зразку: щоб вбити бактерії, мазок надійно прикріплюють до предметного скла мікроскопу та дають зразку більш швидко поглинути барвник. Спочатку бактеріальному зразку дають висохнути на повітрі. Потім висушене предметне скло пропускають через полум'я пальника Бунзена (Bunsen) 3 або 4 рази, намазаною стороною вгору. Одноразово предметне скло нагрівають нерухомим, потім його фарбують. X.campestris є грам-негативною бактерією. Рожеве фарбування грам-бактерій завдяки місцерозташуванню пептидоглікану клітинної стінки та зовнішньої LPS мембрани. Клітинні стінки грам-бактерій є більш хімічно складними та тоншими, ніж стінки грам-позитивної клітини. Пептидоглікан становить тільки 5-20 % стінки грам-негативної клітини, та не є самим найближчим зовнішнім шаром, а лежить між плазматичною мембраною та зовнішньою мембраною. Дана зовнішня мембрана є подібною до плазматичної мембрани, але є менш 7 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 проникною та складається з ліпополісахаридів (LPS), шкідлива речовина класифікується як ендотоксин. Процедура грам фарбування проходить наступним чином: 1. предметне скло наповнюють кристалічним фіолетовим (первинне фарбування). 2. Через 1 хвилину предметне скло промивають водою. 3. предметне скло наповнюють йодом (йод є протравою, яка зв'язує кристалічний фіолетовий з грамом + стінкою клітини.) 4. Через 1 хвилину предметне скло промивають водою. 5. предметне скло наповнюють ацетоном зі спиртом. (Спирт є обезбарвлювачем, який буде видаляти забарвлення з грам-негативних клітин.) 6. Через 10 або 15 секунд, предметне скло промивають водою. (Не залишають обезбарвлювач на занадто догий час, тому що він може видалити барвник з грам-позитивних клітин, як стінки.) 7. Предметне скло наповнюють сафраніном (контрасне забарвлення). 8. Через 1 хвилину предметне скло промивають водою. 9. предметне скло акуратно промокують насухо. В даний момент є готовими, щоб розглядати під олійною імерсією (1000x TM) мікроскопом з яскравим полем сполуки. У грам-клітин буде з'являтися рожеве забарвлення, яке має зберігатися контрасним після первинного фарбування, яке видаляється обезбарвлювачем. 10. Ріст та середовища Субкультури оцінюють для росту та проростання в діапазоні температур 15 °C, 20 °C та 25 °C. Ряд середовищ досліджують на прийнятність. В той час як PDA є, як правило, прийнятним для більшості видів грибів, виявлено, що застосування низько поживного агару, такого як агар з водопровідною водою, знижує продуктивний ріст та може стимулювати утворення спор. Тому PDA, агар з водопровідною водою, та селективні середовища з літератури, модифіковані середовищем Tween B (McGuire, R.G. 1986 Plant Disease 70: 887) є включеними в межі оціночних випробувань. Диск діаметром 5 мм ріжуть з краю культури, яка активно росте, застосовуючи прокалене в полум'ї свердло для пробок. Його розташовують перевернутими вверх дном в центрі чашок з попередньо налитими середовищами. П'ять відтворювань роблять для кожного типу середовищ та температури (всого 45 планшетів). До чашок в кожному інкубаторі застосовують повну рандомізацію. За чашками спостерігають доки одній культурі вдається повністю покрити чашку в будь-якому одному з середовищ. На даний момент здійснюють наступні вимірювання: діаметр колонії, колір та край. Крім того, реєструють рівень споруляції. П'ять дисків діаметром 5 мм вирізають з кожної чашки, використовуючи прокалене в полум'ї свердло для пробок, та суспендують в 20 мл дистильованої води (+0,05 % Tween 20®). Потім зразок піддають дії ультразвуку протягом 2 хвилин, щоб вивільнити спори та потім струшують, щоб допомогти утворенню однорідної суспензії спор. Зразки оцінюють на концентрацію спор, використовуючи гемоцитометр, вдосконалений Нейбауером (Neubauer), використовуючи стандартну методологію підрахунку. Середнє для кожного типу середовища розраховують, та ANOVA застосовують, щоб дослідити результати для значних відмінностей. Фаза два – дослідження іn vitro: 1. Скрінінг мікроорганізмів та карнаубський віск, щоб визначити взаємодії Для того, щоб пояснити ефекти, які спостерігають, мікроорганізми, патогени та антагоністи будуть скринінговані тільки щодо ефекту карнаубського воску для ідентифікації будь-якого носія. Це дає можливість визначити ефект від обробки, а також будь-який синергетичний ефект, що виникає в результаті використання, застосовуючи антагоніст з частинками карнаубського воску. a. Чашки з відповідними середовищами застосовують, ґрунтуючись на одержаних даних з експерименту зазначеного вище. Подрібнений на повітрі карнаубський віск стерилізують, використовуючи автоклав, та потім перемелюють, використовуючи млин з подвійним лезом, одержуючи частинки з приблизним СОД 130 мкм. Стерилізовані середовища потім охолоджують до 50 °C (стадія плавлення). Карнаубський віск потім вводять в середовища. Карнаубський віск потім вводять в стерилізовані середовища при приблизно 50 °C (стадія плавлення). Досліджують дві концентрації карнаубського воску; 1 г/л та 10 г/л. Диск діаметром 5 мм відрізають від краю культури, що активно росте, використовуючи прокалене в полум'ї свердло для пробок. Його розташовують перевернутими вверх дном в центрі чашок з попередньо налитими середовищами/карнаубським воском. П'ять відтворювань роблять для кожної концентрації та інкубують при оптимальній температурі для росту/споруляції (як визначено в 8 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 попередньому експерименті). Швидкості росту та характеристики порівнюють з контролями, використовуючи дані з експерименту "Ріст та середовища" вище. Відмінності аналізують, використовуючи ANOVA. b. Диски патогену та антагоністів посипають різними протравлюваннями карнаубського воску та розміщують у відповідних середовищах. Необхідно, щоб частинки карнаубського воску були вільними від мікроорганізмів, щоб бути здатними приймати участь в даному експерименті. Порівнюють ріст оброблених та необроблених організмів. 2. Дослідження дії антагоніста щодо патогенів i. Вплив антагоністів на життєздатність X.campestris (in vitro аналіз I) Всі антагоністичні ізоляти досліджують в подвійному аналізі культури щодо патогенних бактерій на PDA або альтернативних попередньо визначених середовищах. Агарні пробки X.campestris та ізолят антагоністу, які випробовували, упорядковують на 7 см по окремості на 9 см агарових чашках. Зони інгібування та зони перекриття будуть оцінювати через 7 днів інкубації при 13,5 °C, 18 °C та 22,58 °C. Коли антагоніст переростає X.campestris, зону взаємодії між обома досліджують мікроскопічно (100x). Більш того, життєздатність X.campestris в області взаємодії досліджують шляхом переносу вегетативних дисків на водно-агарові чашки через 5 днів після першого контакту. Кожен експеримент повторюють тричі з трьома зразками на відтворювання. ii. Вплив антагоністів на проростання X.campestris, одержаного in vitro (in vitro аналіз II) Спори X.campestris однакового розміру розташовують на 6 день старої культури (PDA, 20 °C) антагоністу. Після інкубації протягом 14, 28 та 35 днів при 20 °C, вісім спор на відтворювання (три відтворювання на антагоніст) переносять з агарної чашкина водний агар. Ріст з даних спор оцінюють під світловим мікроскопом (100x). 3. Підтвердження патогенності Стадії, щоб виконати постулати Коха (Koch) (Кох 1890, критерії спрямовані на встановлення причинно-наслідкового зв'язку між хвороботворним мікроорганізмом та захворюванням) a) Описують виражені симптоми захворілих злакових культур. b) Виділяють підозрюваний патоген - ті ж самі культури повинні бути виділеними з рослин з подібними симптомами. c) Одержують чисту культуру та застосовують її для інокуляції здорового рослинного матеріалу. d) Спостерігають симптоми, виражені для інокульованих рослин - симптоми повинні бути такими самими як ті, що спостерігають спочатку у злакових культур. e) Знову ізолюють патоген з заново захворілого матеріалу. Культура повинна бути такою ж, що й вихідна очищена культура. i. Непряме застосування – рослина Використовуючи здорові рослини – в ґрунт можуть вносити, безпосередньо використовуючи суспензію спор, виготовлену з чистої агарової культури або з культури, що росте в колбах. Грибкові спори або бактеріальну суспензію можуть додавати після появи сходів, таким чином, щоб кореневу систему змочити суспензією. Потім за рослинами спостерігають протягом 7 днів та реєструють симптоми. Постулати Коха застосовують для того, щоб підтвердити, що симптоми стосуються інокульованого патогену. ii. Пряме застосування – насіння Посівні культури для одержання суспензій спор вирощують на водному агарі, що містить стерильні насіння. Грибні спори та гіфи або бактеріальну спору та вегетативний ріст зіскоблюють з колонії та переносять у стерильну воду. Дану суспензію спор потім застосовують до насіння та змішують, щоб забезпечити рівномірний розподіл. Насіння потім: • розміщують на вологому фільтрувальному папері та інкубують при оптимальній температурі росту протягом 5 днів. • висівають в теплий стерилізований заливний компост та інкубують в культиваторі при оптимальній температурі росту протягом 7 днів. Проявлення симптомів та проростання реєструють для обох наборів експериментів та застосованих постулатів Коха. 4. Аналіз спільного розташування карнаубського воску/антагоністу Сухий порошкоподібний препарат спор виробляють, використовуючи сепаратор спор. Вміст вологи в препараті знижують до нижче 5 %, використовуючи вологопоглинач та кульки діоксиду кремнію. Концентрацію спор визначають, використовуючи гемоцітометр Нейбауера та стандартизовану методологію підрахунку. Стадії перемелювання з повітрям в процесі мікронізації за Бойсом (Boyes) (для частинок карнаубського воску з СОД приблизно 10 мкм) 9 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. 2 кг блоків карнаубського воску спочатку потрібнюють до частинок від приблизно 4 до 6 мм в подрібнювачі KT Handling Ltd Model 04 (серійний номер 729/C), слідуючи інструкціям виробника. 2. Подрібнені частинки потім пропускають через подрібнюючий млин Apex Construction Ltd Model 314.2 (серійний номер A21306) та далі зменшують розмір в діапазоні від 250 до 300 мкм. 3. Подрібнені частинки потім пропускають через струменевий млин Hosokawa Micron Ltd Alpine 100AFG (серійний номер 168092), слідуючи інструкціям виробника, параметри млина за прийнятної швидкості (на швидкості 8000 обертів на хвилину для частинок, що мають СОД 15 мкм або на швидкості 2500 обертів на хвилину для частинок, що мають СОД 75 мкм), з позитивним тиском в системі 0,03 бар. 4. Розмелювання з повітрям повинне підтримувати до 6 бар, система промивання повітряного потоку та класифікування зазору коліс промиваючого повітря є обома, для яких повинні бути встановлені на мінімумі 0,5 бар та не більше ніж 0,75 бар, при очищенні повітряного фільтра слід фіксувати дельту не більшу, ніж 5 бар, щоб досягати кінцевий розмір частинки з СОД 15 мкм або 75 мкм, як вимагається. Ентостат комбінували з олійними культурами при трьох навантаженнях (дивись нижче). Два розміри частинки карнаубського воску, що мають СОД 15 мкм та 75 мкм, відповідно, досліджують в комбінації з композицією спори при двох різних співвідношеннях (1:3, 2:2). Зразки суміші карнаубського воску/спори аналізують, використовуючи електронну фотомікроскопію, щоб визначити ефект спільного розміщення. Реєструють будь-яку зміну, що спостерігається. Крім того, обидва розміри карнаубського воску, про який йде мова, змішують з гомогенізованим зразком міцелію та досліджують, як описано вище. 5. Навантаження частинки карнаубського воску Адгезію частинок карнаубського воску до насіння апроксимують шляхом застосування фотомікроскопії (якісний аналіз) та флуорометричного аналізу (кількісний аналіз). Застосовують два розміри частинок карнаубського воску (з 1 % globrite), що мають СОД 15 мкм та 75мкм, відповідно. Чотири комбінації: два співвідношення композиції карнаубський віск/спора, разом з одним міцелієм та контрольним носієм (тільки карнаубський віск), становить загалом вісім обробок. Обробки застосовують до 10 г насіння та повторюють тричі. Три субзразки беруть з кожного повторення, та середнє значення застосовують в аналізі. Для флуорометричного аналізу до трьох зразків по 1 г кожний додають по 5 мл етанолу та піддають дії ультразвуку, щоб допомогти вивільненню частинок карнаубського воску з насіння. Зразки аналізували, використовуючи Perkin Elmer L55 флуориметр (Perkin Elmer, Ma, USA). Статистичний аналіз варіації між обробками виконують, використовуючи ANOVA. Розмір насінини та архітектура варіюють, в значній мірі, між видами зернових культур та це впливає на норму внесення добрив та спосіб. Гомогенна суміш досягається шляхом перевертання циліндру з композицією насіння та карнаубського воску, адаптованою для отримання латерального змішування/перевертання за допомогою включення кутових внутрішніх лопаток, розташованих на ролику Wheaton протягом 5 хвилин. Фаза три – In vivo: X.campesfris, разом з найбільш успішною моделлю антагоністу застосовують в серіях експериментів in vivo. Основна конструкція є експериментом з розщепленими ділянками з температурою, яка є основним фактором ділянки (15 °C, 20 °C та 25 °C) та співвідношення карнаубського воску/антагоністу (2 обробки: 2 x спора), яка є під-ділянкою. Чотири гомогенних суміші з кожної обробки одержують, використовуючи спосіб, описаний вище та дані відображають повторення. Обробки: 6 -1 1) Пропорція застосування 1 – 7,5 × 10 конідії кг 8 -1 2) Пропорція застосування 2 – 7,5 × 10 конідії кг 3) Контроль 1 – контрольний носій (тільки карнаубський віск) 4) Контроль 2 – без обробки суміші (істинні повторення): A, B, C, D Суб-зразки з кожної суміші: α, β Суміші та обробки систематизували відповідно до рандомізованої блочної конструкції. Дослідження в горщиках Кожна температура (камера росту) містить 60 горщиків з рослинами. Оброблене насіння сіють відповідно до рекомендацій постачальника. Ґрунт/компост (1:1 Джона Іннеса № 2 та торф'яний компост) стерилізують нагріванням перед інокуляцією 10 мл суспензії спор X. campestris та ретельно перемішують перед посівом. 10 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослини розташовують в камерах росту на період протягом 21 дня зі спостереженнями за проявами симптомів, які роблять кожні 48 годин після появлення. Воду подають через капілярні підстилки двічі на день. Через 21 рослини видаляють зі своїх горщиків та далі проводять оціночні вимірювання: • % проростання • % змочуваність перед проростанням • % змочуваність після проростання • маса кореню • маса паростку Крім того, прояви симптомів оцінюють на основі шкали ушкоджень (FAO 1971). Середні значення вимірювань, взяті з під-зразків α, β, γ порівнюють для кожної обробки, використовуючи ANOVA. Зразки беруть з 5 рослин, які демонструють симптоми, та застосовують постулати Коха, щоб підтвердити спричиняючий організм (шляхом порівняння з еталонним предметним склом культури-господаря). Експеримент повторюють. Другий приклад Контроль Plasmodiophora brasscae [доступний від United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)] на олійному ріпаку (Brassica napus), використовуючи способи обробки насіння, використовуючи металаксил. Експериментальна розробка – як в дослідженні в горщечках, описаному вище. Карнаубський віск плавлять, використовуючи мідні ванночки. Під час охолодження додають металаксил в кількості 1 % від маси карнаубського воску. Даній суміші дають затвердіти перед подрібненням та обробляють за допомогою млина, як описано вище, з параметрами швидкості перемелювання 6000 обертів на хвилину, щоб отримати частинки з СОД 25 мкм. Обробка для дослідження в горщечку – контроль 1 – контрольний носій (тільки карнаубський віск) контроль 2 – без обробки. Обробка 1 – 1 % металаксильний карнаубський віск 17 г на кг насіння. Обробка 2 – 1 % металаксильний карнаубський віск 5 г на кг насіння. Оцінювання та аналіз як в попередньому дослідженні в горщечку. Третій приклад Відповідно до: Контроль Cabbage stem flea beetle (Psylliodes chrysocephala) на олійному ріпаку (Brassica napus), використовуючи способи обробки насіння, використовуючи тіаметоксам. Експериментальна розробка – як в дослідженні в горщечках, описаному вище. Карнаубський віск плавлять, використовуючи мідні ванночки. Під час охолодження додають тіаметоксам в кількості 1 % від маси карнаубського воску. Даній суміші дають затвердіти перед подрібненням та обробляють за допомогою млина, щоб отримати частинки з СОД 25 мкм. Обробка для дослідження в горщечку – контроль 1 – контрольний носій (тільки карнаубський віск), контроль 2 – без обробки. Обробка 1 – 1 % тіаметоксамальний карнаубський віск 4,2 г на кг насіння. Порожні горщики вистилають скрінінговим матеріалом нейлонової сітки перед наповненням ґрунтом для горщиків. Конструюють каркас із проволоки та нейлон з комірками зв'язують над рамкою таким чином, щоб забезпечити закрите експериментальне поле, розроблене таким чином, що комаха не може уникнути оброблених ділянок. Насінню дають прорости протягом трьох днів перед додаванням личинки вікової стадії п'ять іх 3 до поверхні ґрунту кожного горщика перед повторним закриттям клітки з комірками. Спостереження проводять понад 21 день. Рослини оцінюють щодо: • % проростання • пошкодження • маси кореня • маси паростка. Процедурам, деталізованим в прикладі один, наведеному вище, слідують, щоб дослідити антагоністичний ефект Trichoderma harzianum [United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)], Pseudomonas fluorescens [UKNCC] та Bacillus subtilis [UKNCC] на Verticillium longisporum, грибковому патогені соняшника (Helianthus annuus). Процедурам, деталізованим в прикладі два, слідують, щоб дослідити ефект прохлоразу (Nпропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфеноксі)етил]імідазол-1-карбоксаміду) на Phoma sp., грибковому патогені олійного ріпаку (Brassica napus). 11 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Процедурам, деталізованим в прикладі два, слідують, щоб дослідити ефект прохлоразу (Nпропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфеноксі)етил]імідазол-1-карбоксаміду) на Phoma sp., грибковому патогені соняшника (Helianthus annuus). Процедурам, деталізованим в прикладі три, слідують, щоб дослідити ефект імідаклоприду/пцифлутрину на блошиному жуку стовбуру капусти (Psylliodes sp.), комасі-шкіднику олійного ріпаку (Brassica napus). Процедурам, деталізованим в прикладі три, слідують, щоб дослідити ефект імідаклоприду/пцифлутрину ([(R)-ціано-[4-фтор-3-(фенокси)феніл]метил](1 R, 3R)-3-(2,2-дихлоретеніл)-2,2диметилциклопропан-1-карбоксилату) на блошиному жуку стовбуру капусти (Psylliodes sp.), комасі-шкіднику соняшнику (Helianthus annuus). Пригнічення агентів, що спричиняють грибкове захворювання в олійного ріпаку (Brassica napus), використовуючи покриття насіння Trichoderma sp. та частинками карнаубського воску Потенціал Trichoderma sp. (Ascomycota), як біологічного агенту в захисті проти рослинних патогенів, є відомим. Гіфи Trichoderma є здатними проникати в гіфи інших грибів та екстрагувати поживні речовини з середини, одержуючи в результаті пригнічення та можливу смерть господаря. Trichoderma демонструє швидкий ріст міцелію та є здатним до зовнішнього конкурування з іншими грибами за поживні речовини. Існує декілька комерційно доступних композицій Trichoderma, які продаються як засоби захисту зернових продуктів. Їх зазвичай поставляють у вигляді порошкової композиції, що змочується, та застосовують до ділянок культивування у вигляді зрошування. Недоліком даної форми застосування є те, що існує необхідність обробляти всю ділянку культивування, тоді як потребує обробки тільки область безпосередньо навколо насінини або рослини. Чим більше число конідій, доставлених в дану область, тим більший рівень контролю вони здатні передавати. В наслідок цього система цільового застосування, здатна доставляти достатню кількість конідії до необхідної області, пропонує явну перевагу в застосуванні Trichoderma в порівнянні з традиційними застосуваннями. Мета експерименту: оцінити потенційне застосування ентостату, як технології покриття насіння для доставки корисних мікробів Способи Стадії перемелювання з повітрям в процесі мікронізації за Бойсом (для частинок карнаубського воску з СОД приблизно 10 мкм) 1. 2 кг блоків карнаубського воску спочатку подрібнюють до частинок від приблизно 4 до 6 мм в подрібнювачі KT Handling Ltd Model 04 (серійний номер 729/C), слідуючи інструкціям виробника. 2. Подрібнені частинки потім пропускають через подрібнюючий млин Apex Construction Ltd Model 314.2 (серійний номер A21306) та далі зменшують розмір в діапазоні від 250 до 300 мкм. 3. Подрібнені частинки потім пропускають через струменевий млин Hosokawa Micron Ltd Alpine 100AFG (серійний номер 168092), слідуючи інструкціям виробника, параметри млина зі швидкістю 12500 обертів на хвилину, з позитивним тиском в системі 0,03 бар. 4. Розмелювання з повітрям повинне підтримувати до 6 бар, система промивання повітряного потоку та класифікування зазору коліс промиваючого повітря є обома, для яких повинні бути встановлені на мінімумі 0,5 бар та не більше ніж 0,75 бар, при очищенні повітряного фільтра слід фіксувати дельту не більшу, ніж 5 бар, щоб досягати кінцевий розмір частинки з СОД 9,7 мкм. Ентостат комбінували з олійними культурами при трьох навантаженнях (дивись нижче), олійну культуру поставляв місцевий фермер. 1. Дані базисної лінії: способи покриття насіння 9 1.1. Покриття насіння. Trichoderma harzianum (який містить 7,75 × 10 колонії утворюючих . -1 одиниць г Sylvan Bio, Loches, France) з відсотком проростання 95 % застосовували до олійного ріпаку (різноманітний кунжут, LS Plant Breeding, UK), використовуючи частинки карнаубського 5 воску з СОД 9,7 мкм. Цільове навантаження становило 10 конідій на насінину. Частинки карнаубського воску змішували з порошком сухої конідії при різних співвідношеннях та 0,05 г (1 % за масою) застосовували безпосередньо до сухого насіння, 5 г насіння на концентрацію. Для кожної концентрації, чотирі серії з 10 насінин використовували для оцінки навантаження конідії. Використаними співвідношеннями конідії до корнаубського воску були: 100 % конідії, 50 % конідії, 25 % конідії та 9 % конідії із залишком в кожному випадку, що становить частинки карнаубського воску. 12 UA 113848 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1.2. Підрахунок. Безпосередній підрахунок, щоб визначити навантаження конідії на насіння, роблять шляхом застосування гемоцитометру (Improved Neubauer, Hawksley, Lancing, UK). Посівна культура: Приготування суспензії. Пагони, як правило, формулюють у водному носію, незважаючи на те, що вони з гідрофобними клітинними стінками (такі як Trichoderma) не суспендуються легко у воді. Для однорідного суспендування гідрофобних пагонів у воді є необхідним піддати дії ультразвуку та/або застосувати способи механічного суспендування. Крім того, поверхнево-активна речовина може сприяти суспендуванню пагонів (Tween 20 при 0,05 %). Щоб суспендувати гідрофобну конідію, зібрані конідії поміщають в 1,5 мл мікроцентрифужну пробірку, в пробірку додають 0,5 мл стерильної води, мікропестик вставляють в пробірку, та конидіальну масу обережно перемішують вручну, використовуючи мікропестик. Потім мікропестик приєднують до двигуна (наприклад, Kontes, Argos двигун з кульковим пестиком) та суспензію енергійно перемішували, в той же час двигаючи пестик вверх та вниз, та переміщуючи з боку в бік, приблизно 30 сукенд. Так як гемоцитометричний спосіб не робить різниці між життєздатними та нежиттєздатними пагонами, існує необхідність визначити життєздатність спор таким чином, що дози можуть бути одержані на основі життєздатних пагонів. Насіння миється та підрахунок Trichoderma навантаження виконували на 4 серіях насіння на обробку. Посівну культуру промивали від насіння шляхом додавання в 1 мл стерильного 0,05 % Tween 20 в пробірку еппендорфа (Eppendorf) та струшуючи протягом 30 секунд, щоб видалити конідію з поверхні насіння. Потім зразки піддавали дії ультразвуку протягом двох хвилин, щоб зруйнувати будь-які агрегати конідії. Одержані підрахунки застосовували для обчислення середнього навантаження конідії на насіння, покрите різними обробками. Одержані результати, використовуючи 100 % порошок конідії, застосовували як еталонний тест, та комбінацію порошків конідії/карнаубського воску порівнювали з нею, як визначення ефективності навантаження. Підтвердження життєздатності конідії досягали шляхом нанесення розбавлення на конкретні середовища Trichoderma (TSM) (дивись нижче). Серії розбавлення готували та дублікати чашок інокулювали з серій. Підрахунки колонії утворюючих одиниць (КУО) виконували через 7 днів, що дає кількісно визначити рівні посівної культури на насінні. Крім того, свіжі, невикористані конідії клали, щоб забезпечити порівняння перед та після застосування насіння. Крім того, вимірювали відсоток проростання. Одержували задовільну щільність конідії, використовуючи поширенність 6 приблизно 10 конідій в 100 мкл середовища в 9 см чашці петрі. Конідію інкубували в темноті C при 25 C протягом п'яти днів, та, щоб спостерігати площу, потім фіксували, використовуючи лактофенол. Фаза контрастної мікроскопії, використовуючи інвертований складний мікроскоп, що дає можливість достатного контролювання конідії. Конідії вважалися життєздатними, якщо довжини зародкової трубки була подвоєним діаметром пагону, що розглядається. Підраховували кількості пророслих та непророслих конідій в довільно вибраних ділянках зображення або в паралельних трансектах, визначених за допомогою окулярного мікрометра. Нарахували мінімум 300 конідій, щоб забезпечити точну оцінку. Бажаним є визначити життєздатність пагонів на культурах відтворювання та в різних положеннях на одному й тому ж планшеті. Це дозволяли калібрування способів покриття насіння, щоб одержати подібні рівні навантажень Trichoderma на насіння для кожного способу покриття. 1.3. Проростання насіння. Одну серію (5 насінин) насіння з кожної обробки розміщували на папері тестування насіння (Ватман 181) в 9 см чашці петрі. Чашки герметично закривали плівкою Parafilm та витримували при 20 °C протягом 7-10 днів та визначали швидкість проростання. Це повторювали з необробленим насінням. Вибрані середовища Trichoderma (адаптовані з Williams, Clarkson et al 2003) одержували наступним чином: Інгредієнти основного поживного середовища: 0,2 г MgSO4 0,9 г K2HPO4 0,15 г KCl 1,0 г NH4NO3 3,0 г глюкози 0,15 г бенгальської рози 20 г агару 950 мл дистильованої води Процес приготування основного поживного середовища 13 UA 113848 C2 5 10 15 20 Змішують рідкі інгредієнти зі всіма твердими інгредієнтами, за виключенням агару, в 1 л колбі Ерленмейера. Додають 20 г агару та струшують або перемішують. Закривають пробкою з вовняної вати та накривають фольгою. Автоклавують. Біоцидне середовище (на літр) 0,25 г кристалізованого хлорамфеніколу 0,2 г хінтозину 0,2 г каптану 1,2 мл пропамокарбу (Previcur) 50 мл стерильної дистильованої води. Маса насіння Використовували як міру гомогенності серії насіння. Вісім повторень з 25 насінин зважують та реєструють коефіцієнт варіації (Cv). Даний коефіцієнт не повинен перевищувати значення 5. Якщо це виконується, потім процедуру повторюють та середнє з всіх 16 зразків використовували для обчислення кількості насінин на грам. Результати Прямий підрахунок кількостей з використанням гемоцитометру Вихідна щильність спор Trichoderma harzianum сухого препарату спори (при 5 % вмісту 9 . -1 7 вологи), визначена, використовуючи гемоцитометр, становила 7,75 × 10 спори г (n=4±2,6 × 10 95 %CL). Підрахунок спор з помитого насіння Мінливий Кількість спор 25 35 n 4 4 4 4 середнє 200750 422750 730250 905250 Se середнє 18158 13640 31876 56629 Дивись Фігуру 1. Існували чіткі та статистично значні відмінності між середніми кількостями спор на насінину, досягнутими різними обробками, як визначено одностороннім ANOVA (F(3,12)= 83,28, p= 5 -1