Спосіб визначення активності ферменту no-синтази в гомогенатах тканин

Спосіб визначення активності ферменту NOсинтази в гомогенатах тканин, який включає виділення ферменту NO-синтази, проведення оптичного аналізу активності ферменту, який відрізняється тим, що проводять моделювання нікотинамідаденіндинуклеотиду НАДФ(Н)-залежної реакції в інкубаційній суміші, яка містить специфічний субстрат NO-синтази L-аргінін та кофермент НАДФ(Н), про активність ферменту судять по зменшенню концентрації НАДФ(Н). (19) (21) u200509119 (22) 27.09.2005 (24) 15.03.2006 (46) 15.03.2006, Бюл. № 3, 2006 р. (72) Колесник Юрій Михайлович, Бєленічев Ігор Федорович, Абрамов Андрій Володимирович, Ганчева Ольга Вікторівна, Бухтіярова Ніна Вікторівна, Количева Наталія Леонідівна, Павлов Сергій Васильович (73) Запорізький державний медичний університет, Колесник Юрій Михайлович, Бєленічев Ігор Федорович, Абрамов Андрій Володимирович, Ганчева Ольга Вікторівна, Бухтіярова Ніна Вікторівна, Ко 3 13132 4 ваних комплексів, які можуть вицвітати, дозволяє синтази застосовують спектрофотометр. визначати активність синтази оксиду азоту тільки в Спосіб здійснюють таким чином: клітинах крові - тромбоцитах. В інкубаційну суміш, яка містить L-аргінін і В основу корисної моделі поставлено задачу НАДФ(Н) та стабілізовану буфером до рН 7,4 доудосконалення та розширення діапазону дослідають біологічний матеріал при t 37°C. Про активджуваних об'єктів способу визначення активності ність ферменту судять по зменшенню оптичної NO-синтази шляхом використання спектрофотощільності при 340нм на протязі 4 хвилин. метричного методу кінетичних-НАДФ(Н)- залежних Приклад. реакцій, що забезпечить підвищення чутливості, Досліджуваний біологічний матеріал (біоптат якості визначення активності NO-синтази, розшитканини) відмивали ізотонічним розчином (t°-5°С), рення діапазону досліджуваних об'єктів та спропісля чого гомогенізували в рідкому азоті. Точну щення методики. навіску гомогенату розміщували в 50мМ Трис- НС1 Поставлена задача вирішується тим, що у буфері рН 7,4 (який містив 2мМ Трилону Б і 2мМ способі, який включає виділення ферменту NOдитіотрейтолу (тритон-Х)) в співвідношенні 1:7 та синтази із біологічного матеріалу, проведення опцентрифугували при 0-4°С при 15000g протягом 45 тичного аналізу активності ферменту, новим є те, хвилин. Отриману цитозольну фракцію використощо проводять моделювання НАДФ(Н)- залежної вували як джерело NO-синтази. Інкубаційна суміш реакції в інкубаційній суміші, яка містить специфічмістила 25мМ Трис-НСІ, 5мМ MgCl2, 0,1мМ СаСl2, ний субстрат NO-синтази L-аргінін та кофермент 1мМ НАДФ(Н), 1мМ L-аргініну, рН 7,4 (на 1 літр). НАДФ(Н), про активність ферменту судять по зме2,9мл інкубаційної суміші (37°С) розміщували в ншенню концентрації НАДФ(Н). кварцовій кюветі (1см) реакцію запускали доданПричинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ням 0,1мл цитозолю та ретельно перемішували. ознак, що заявляються, та технічним результатом Вимірювали на спектрофотометрі оптичну полягає у такому: щільність відразу та через 4 хвилин, при довжині в якості коферменту застосовують НАДФ(Н); хвилі 340нм. використання способу виключає неспецифічні Активність ферменту NO-синтази (NOC) виреакції з іншими ферментами, які можуть давати значають за допомогою формули: забарвлювальні комплекси із НСТ; 4 E2 E1 1000 NOC , висока специфічність методу (визначаємо ак6,22a тивність тільки ферменту NO-синтази); де Е2 - оптична щільність інкубаційної суміші виконання методики не потребує складного через 4 хвилини; обладнання, швидкий та простий у виконанні; E1 - оптична щільність інкубаційної суміші відспосіб може бути застосований як експресразу після її розміщення у кюветі; метод визначення активності ферменту NOа - вміст білку в досліджуваному матеріалі; синтази; 6,22 - коефіцієнт мілімолярної екстинції спосіб дозволяє визначати активність фермеНАДФ(Н) нту NO-синтази в будь якому біологічному матері1000 - коефіцієнт розведення алі, який містить цій фермент; Результат в нмоль/мг білку/хвилину. для кількісного визначення активності NO Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601