Спосіб визначення ферменту уреази

Спосіб визначення ферменту уреази, що включає посів у бульйон з сечовиною культури коринебактерій, який відрізняється тим, що змішують 1 частину реактиву А та 19 частин реактиву В, додають повну бактеріальну петлю культури коринебактерій, емульгують протягом 10-15 секунд і через 2-3 хвилини по ЗМІНІ забарвлення середовища визначають наявність ферменту уреази Винахід відноситься до медицини, а саме до лабораторної діагностики і може бути використаний в бактеріологічній діагностиці дифтерійної інфекції Відомо, ЩО при типовій картині дифтерії КЛІНІЧНИЙ діагноз не викликає сумнівів та передує мікробіологічному аналізу Однак, часто перше повідомлення про наявність у хворого дифтерії надходить з мікробіологічної лабораторії Це вказує на значну роль мікробіологічного дослідження, яке повинно мати прості, швидкі та надійні методи При лабораторній діагностиці дифтерії необхідно добиватися отримання точного результату в максимально короткий строк Представники роду Corynebactenum не відзначаються високою ферментативною активністю, але визначення деяких біохімічних властивостей полегшує їх ідентифікацію В повсякденній лабораторній діагностиці для диференціації псевдодифтерійних бактерій (С ulcerans, С pseudotuberculosis, С pseudodiphthenticum) від С diphthenae використовують методику визначення ферменту уреази, який здатний розщеплювати сечовину з утворенням аміаку і вуглекислоти С diphthenae не мають цього ферменту (1) Найближчим аналогом - прототипом до заявленого способу є спосіб визначення уреази шляхом посіву у бульйон з сечовиною у пробірки В пробірку з 2 -Зсм3 стерильного м'ясопептонного бульйону з сечовиною та індикатором крезоловим червоним засівають одну бактеріальну петлю чистої культури коринебактерій та ставлять в термостат Оцінку результатів, по ЗМІНІ забарвлення се редовища, проводять через 1 8 - 2 4 години Проте даний спосіб має ряд недоліків 1 Дослідження затримується на 1 8 - 2 4 години 2 Необхідні стерильні пробірки 3 Витрата середовища складає до Зсм3 на 1 пробірку (дослідження) Беручи до уваги зазначені вище недоліки, ми пропонуємо оригінальний спосіб визначення ферменту уреази Задачі винаходу_ прискорення диференціації С diphthenae від С ulcerans, C pseudotuberculosis, С pseudodiphthenticum за рахунок збільшення концентрації культури в об'ємі середовища та сприяння кращому стиканню культури з середовищем перемішуванням протягом 10-15 секунд Технічний результат що досягався полягає у прискоренні реакції, економії середовища, лабораторного посуду та в простоті виконання Поставлену задачу досягають тим, що на предметне скельце наносять краплю суміші реактивів А (сечовина - 2г, 96° етиловий спирт - 2см 3 , дистильована вода - 4см3) та 19 частин реактиву В (0,2% розчин фенолового червоного - 1см3, однозаміщений фосфат калію - 0,1г, двозаміщений фосфат калію - 0,1г, хлорид натрію - 0,5г дистильована вода - 100см3), потім вносять повну бактеріальну петлю культури коринебактерій і на протязі 10 - 15' змішують і через 2 - 3 хвилини по ЗМІНІ забарвлення середовища визначають наявність ферменту уреази Спосіб здійснюється наступним чином змішують (ex tempore) 1 частину реактиву А (сечовина 2г, 96° етиловий спирт - 2см3 дистильована вода 4см3) та 19 частин реактиву В (0,2% розчин фенолового червоного - 1см3, однозаміщений фосфат О (О 44620 калію (КН2РО4) - 0,1г, двозаміщений фосфат калію Всі культури дали негативний результат (К2НРО4) - 0,1г, хлорид натрію (NaCI) - 0,5г, дисти-1 музейний штам С diphthenae вар belfanti льована вода - 100см Реактив А не стерилізують Результат негативний і зберігають при температурі 6 ± 2°С Реактив В - 18 штамів С ulcerans (1 культура - музейний стерилізують в автоклаві текучою парою штам, 3 - виділені при діагностичних дослідженнях, 15 - при профілактичних дослідженнях) На предметне скельце наносять 2 краплі виготовленої суміші В одну краплю вносять одну поВсі культури дали негативний результат вну бактеріальну петлю досліджуваної культури і - З штами С pseudotuberculosis (1 культура змішують на протязі 10-15 секунд Оцінку резульмузейний штам, 2 - виділені при діагностичних татів проводять через 2 - 3 хвилини по ЗМІНІ забадослідженнях) рвлення Всі культури дали позитивний результат С ulcerans, С pseudodiphthenticum, - 20 штамів С pseudodiphthenticum (1 культурамузейний штам, 2 - виділені при діагностичних С pseudotuberculosis, змінюють забарвлення на дослідженнях, 17 - при профілактичних досліяскраво-рожеве дженнях) С diphthenae не викликають зміни забарвлення Всі культури дали позитивний результат Приклади лабораторного застосування методу Паралельно проводилось дослідження цих 49 культур класичним методом (посівом в бульДослідження 1 йон) Результати досліджень співпали Проводилось у бактеріологічній лабораторії Київської обласної санепідстанцм Було досліДослідження З джено Проводились у бактеріологічній лабораторії Інституту педіатри, акушерства та гінекологи Було - 6 штамів С diphthenae Bap gravis (1 культура досліджено - музейний штам, 2 культури виділені від хворих 3 культури виділені при дослідженнях з - 2 штами С diphthenae Bap gravis (1 культура профілактичною метою) - музейний штам, 1 - при профілактичному дослідженні) Всі 6 культур дали негативний результат - 7 штамів С diphthenae вар mitis (1 культура Всі культури дали негативні результати музейний штам, 2 культури виділені при дослі- 2 штами С diphthenae вар mitis (1 - музейний дженнях з діагностичною метою, 4-з профілакштам, 1 - виділений при профілактичному дослітичною метою) дженні) Всі 7 культур дали негативний результат Результати негативні - 4 штами С diphthenae вар belfanti (1 культура -16 штамів С ulcerans (1 культура - музейний штам, 15 - виділені при профілактичних дослі- музейний штам, 3 культури виділені при дженнях) Результати позитивні 1 музейний штам профілактичних дослідженнях) С pseudotuberculosis Всі 4 культури дали негативний результат - 12 штамів С ulcerans (1 культура - музейний Результат позитивний штам, 11 - отримані при профілактичних до- 24 штами С pseudodiphthenticum (1- музейслідженнях) ний штам, 23 - виділені при профілактичних дослідженнях) Всі 12 культур дали позитивний результат - 11 штамів С pseudotuberculosis (1 культура Результати позитивні музейний штам, 10 - отримані при профілактиПаралельно проводилось дослідження цих 45 чних дослідженнях) культур класичним методом (посівом в бульйон) Результати досліджень співпали Всі 11 культур дали позитивний результат Паралельно проводилось дослідження цих 50 Спосіб визначення ферменту уреази був закультур класичним методом (посівом в бульйон) стосований при 144 дослідженнях коринебактерій, Результати досліджень співпали виділених при діагностичних, профілактичних дослідженнях та при дослідженнях музейних штамів Дослідження 2 Проводились у бактеріологічній лабораторії Результат полягав у прискоренні ідентифікації санепідстанцм Броварського району Київської обС diphthenae від С ulcerans, ласті С pseudodiphthenticum, С pseudotuberculosis через визначення ферменту уреази, економії поживних Було досліджено середовищ та реактивів, лабораторного посуду та - З штами С diphthenae Bap gravis (1 культура простоті виконання музейний штам ] - виділена при діагностичному дослідженні, 1 - при профілактичному досліЛітература дженні) 1 Р Брукс Дифтерия Руководство по лабораВсі культури дали негативний результат торной диагностике дифтерии Лаборатория здравоохранения Свэнси Великобритания 1981 - 4 штами С diphthenae вар mitis (1 - музейний штам, 1 - виділений при діагностичному дослі2 Руководство ВОЗ по лабораторной диагносдженні, 2 - при профілактичному дослідженні) тике дифтерии 1993 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 44620