Спосіб визначення концентрації sн-груп у гомогенатах тканин

Спосіб визначення концентрації SH-груп у гомогенатах тканин шляхом проведення реакції з 5,5'-дитюбіс (2-нітробензойною) кислотою в лужному середовищі та наступним спектрофотометричним визначенням концентрації тюнітрофенільного аніона, який відрізняється тим, що для визначення SH-груп використовуються 5% гомогенати тканин внутрішніх органів, приготовлені на 0,05 М Tpic-HCL буфері (рН 7,4-8,0), а концентрацію SH-груп розраховують, виходячи із концентрації SH-rpyn 1 ммоль відновленого глутатюну, і результати виражають в мкмоль/мг тканини Винахід належить до галузі медицини, а саме до біохімії, і може бути використаний для діагностики концентрації сульфгідрильних груп у гомогенатах тканин Сульфгідрильні групи (SH-групи), являючи собою функціональні групи білкових молекул, входять до складу багатьох біологічних сполук білків, пептидів, відновленого глутатюну, цистеїну, ліпоєвоі кислоти, гомоцистешу, тощо, беруть участь в специфічних функціях низки ферментів, гормонів та інших біологічно активних білків, здійснюючи тим самим нормальний перебіг чисельних фізіологічних процесів [Гольдштейн Б И О влиянии сульфгидрильных групп на биологические свойства тканевых белков — Киев, 1955, Гольдштейн Б И В кн Тиоловые соединения в медицине — Киев, 1950 — С 49-52, Торчинский ЮМ Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков — М , 1971] Відомо, ЩО тюл-дисульфідна окисновідновна система є важливим компонентом антиоксидантної системи організму Однак, для повної оцінки функціональної активності антиоксидантної системи окрім визначення вмісту відновленого глутатюну слід досліджувати й вміст сульфгідрильних груп, який вказує на ступінь окисного пошкодження білків тканин тюнітрофенільного аніона, вміст якого прямопропорційний КІЛЬКОСТІ сульфгідрильних груп білків Суть способу-прототипу полягає у тому, що при взаємодії білків з 5,5'-дитюбіс (2-нітробензойною) кислотою (ДТНБК) (Ellman, 1959), яка здійснюється при рН 8,0, відбувається утворення тюнітрофенільного аніона (ТНФА), вміст якого прямопропорційний КІЛЬКОСТІ сульфгідрильних груп білків, що прореагували з ДТНБК Визначення концентрації SH-груп проводять спектрофотометрично з урахуванням коефіцієнта молярної екстинцм тюнітрофенільного аніона, який при 412нм рівний 1,14х104М 1хсм 1 [Мещишен І Ф , Григорьева НП Методи КІЛЬКІСНОГО визначення SH-груп у крові // Букмед вісник — 2 0 0 2 — Т 6, №2 С 190-192] Однак, вказаний спосіб передбачає лише визначення концентрації SH-груп у крові і не адаптований для дослідження їх вмісту у гомогенатах органів, що суттєво обмежує функціональні можливості діагностики Більше того, недоліком даного способу є неможливість визначити приховані та повільнореагуючі SH-групи Найближчим до способу, що заявляється, за технічною сутністю і результатом, є спосіб дослідження концентрації сульфгідрильних груп у плазмі крові шляхом проведення реакції із реактивом Еллмана в лужному середовищі із наступним спектрофотометричним визначенням концентрації В основу винаходу поставлено задачу розробки способу концентрації SH-груп в гомогенатах тканин для розширення можливостей діагностики системи антиоксидантного захисту організму Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення концентрації SH-груп в гомогенатах тканин шляхом проведення реакції з 5,5'дитюбіс (2-нітробензойною) кислотою в лужному середовищі та наступним спекторофотометричним визначенням концентрації тюнітрофенільного ані (О о (О 60670 она, згідно винаходу, для визначення SH-груп використовуються 5% гомогенати тканин внутрішніх органів, приготовлені на 0.05М Tpic-HCL буфері (рН 7,4-8,0), а концентрацію SH-груп розраховують, виходячи із концентрації SH-rpyn 1 ммоль відновленого глутатюну, вміст якого визначають одночасно, і результати виражають в мкмоль/мг тканини Визначення термінів Реактив Еллмана - це 5,5'-дитюбіс (2-нітробензойна) кислота (ДТНБК) N0, соон N0. СООН ТНФА - це тюнітрофенільний аніон N0, СООН Tpic-HCL буфер - це 2-амшо-2(пдроксиметил)1,3-пропандюл (C4H11O3N) Спільними ознаками прототипу та винаходу є те, що в обох випадках визначення концентрації SH-груп в бюматеріалі проводиться за участю реактиву Еллмана - 5,5'-дитюбіс (2-нітробензойна) кислота (ДТНБК), і ця реакція здійснюється при рН 8,0 з утворенням тюнітрофенільного аніона (ТНФА), концентрацію якого визначать спектрофотометрично ВІДМІННІСТЬ винаходу від прототипу полягає у тому, що в якості дослідного матеріалу використовують не плазму крові, а 5% гомогенати тканин внутрішніх органів (зокрема, печінки та нирок щурів), приготовлених на 0.05М Tpic-HCL буфері (рН 7,4-8,0),а концентрацію SH-груп розраховують, виходячи із концентрації SH-rpyn 1 ммоль відновленого глутатюну, вміст якого визначають одночасно, і результати виражають в мкмоль/мг тканини Порівняння суттєвих ознак прототипу та винаходу подано в таблиці Таблиця Порівняння ознак винаходу та прототипу Ознака Дослідний матеріал - плазма крові - гомогенат тканини Використання 0,1 М р-ну NaOH Використання фосфатного буфера (рН 8,0) Використання 0.05М Tpic-HCL-буфера (рН 7,4-8,0) Застосування реактиву Еллмана Спектрофотометрія проб при 412нм Вміст SH-груп розраховують, виходячи із концентрації - білка -1 ммоль відновленого глутатюну Концентрацію SH-груп виражали у - мкмоль/г білка - мкмоль/мгтканини Спосіб, що заявляється як винахід, здійснюється наступним чином 0,2мл 5% гомогенату печінки чи нирок, приготовлених на 0.05М Tpic-HCL буфері (рН 7,4-8,0) ставлять в киплячу водяну баню (100°С), залишаючи в кожній пробірці скляну паличку (для створення сприятливих стерильних умов) Через 15хв кип'ятіння проби охолоджують, додають охолоджений 0.05М Tpic-HCL буфер (рН 7,4-8,0) до об'єму 3,9мл і центрифугують протягом 10хв при 3000об/хв До центрифугату додають 0,1мл реактиву Еллмана, ретельно перемішують скляною паличкою і через 10 хв проби спектрофотометрують при 412нм проти холостої проби, в яку вносять лише 3,9мл Tpic-HCL буферу та 0,1 мл реактиву Еллмана (стандартна методика спектрофотометрії) Вміст сульфгідрильних груп в гомогенатах печінки та нирок розраховують, виходячи Винахід Прототип + + + + + + + + + + + + + + із концентрації SH-rpyn 1 ммоль відновленого глутатюну - основного компоненту SH-груп, вміст якого визначили одночасно, - і результати виражають в мкмоль/мгтканини Розрахунки проводять за формулою X (мкмоль/мгтканини) = 0,24 х Е, де Е - оптична густина дослідної проби, 0,24 - коефіцієнт перерахунку в мкмоль на 1мг тканини Таким чином, запропонований спосіб розширює можливості методу визначенням SH-груп, що підтверджує ефективність запропонованого способу діагностики Визначення сульфгідрильних груп в гомогенатах тканин значно розширює можливості діагностики стану оксидантної та антиоксидатної систем ораганізму, оскільки зміни функціональної взаємо 60670 козом проводили евтаназію (шляхом декапітації) дм різник ланок цих систем, спричинене знижентварин Відразу після декапітації щурів наважки ням їх потужності та буферної ємності, відобратканин внутрішніх органів (зокрема, нирок та печіжають рівень метаболічних процесів у бюсубстранки) гомогенізували у 9,5мл 0.05М Tpic-HCL буфетах ру (рН 7,4-8,0) і визначали вміст сульфгідрильних Приклад практичного використання способу груп згідно винаходу Одержані результати навеБуло проведено визначення концентрації SHдені на фіг 1 та фіг 2 груп у гомогенатах тканин нирок та печінки у експериментальних щурів 3 цією метою використано На фіг 1 - вміст SH-груп у тканині печінки, 16 нелінійних щурів, масою тіла 90-100г, які утримкмоль/гтканини, на фіг 2 - вміст SH-груп утканині мувались на стандартному раціоні віварію і були нирок, мкмоль/г тканини розділені на 2 групи І група - контрольні тварини, Отже, рівень SH-груп вказує на зростання акII група - тварини, яким протягом, 10 діб вводили тивності антиоксидантної системи на фоні введенпрепарат ескузан ("Йенафарм", Німеччина) в дозі ня препарату 100мг/кг маси тіла/день Під легким ефірним нар Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119