Спосіб реєстрації генотипів ячменю

Спосіб реєстрації генотипів ячменю, що включає аналіз компонентів електрофоретичного спектра, який відрізняється тим, що отримані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції IRAPлокуси фіксують у вигляді формули. (19) (21) u200600111 (22) 03.01.2006 (24) 15.06.2006 (46) 15.06.2006, Бюл. № 6, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Календар Руслан Миколаєвич, Стратула Ольга Ромуальдівна 3 15277 4 центрифугувати 5хв. при 14000об./хв. на мікрофузі IRAP-праймерами об'ємом 20мкл містить: 50mM "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чистий KC1, 20mM Тріс-НСІ рН 8.4 (25°С), 3mM MgCl2, епендорф. До водної фази додати 0,5 обсягу 0,01% Tween 20, 5% гліцерін, по 0.15mM кожного (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадиdNTP, 0.2mkM праймера (послідовності наведені в ти ДНК центрифугуванням при 14000об./хв. протятаблиці), 20ng ДНК и 1 одиницю Taq-полімерази. гом 1хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну Для ПЛР застосовувати наступний температурний рідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етанорежим: початкова денатурація - 1,5 хв. при 94°С, лу - центрифугувати при 14000об./хв. Осад розчиденатурація 30сек. при 94°С, відпал - 40сек. при нити у 100мкл ТЕ-буферу. 60°С, елонгація при 94°С - 1хв. при 72°С, заключна 2. Флюорометричне визначення концентрації елонгація 10хв. при 72°С. Кількість циклів ампліфіДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на кації - 35. флюорометрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" 4. Елетрофоретичний розподіл продуктів амп("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері ліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації розділяти в (3М NaCL, 50mM Nа2НРO4) у присутності флюоре2% агарозному гелі. Далі гелі з ПЛР-продуктами сцентного барвника Hoechst 33258. фарбувати бромістим етидієм і фотографувати в 3. Проведення полімеразної ланцюгової реакУФ-світлі на фотоплівку "Мікрат 300". Розміри ції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з фрагментів ДНК визначати за допомогою системи використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКвідеодокументації "Image Master VDS" в п.н. технологія", Росія). Реакційна суміш для ПЛР з Таблиця 1 LTR-праймери для проведення ПЛР № 1 2 3 4 5 7 8 9 10 Назва праймера NIKITA 1-57 92714 Е 0229 С 2430 Е 2082 С 0945 91673 С 0946 Е 1814 Послідовність праймера (5'-3') CGCATTTGTTCAAGC'CTAAACC ATCATTGCCTCTAGGGCATAATTC ACGTCGGCATCGGGCTGTCAC TTGTTCCACCCACCGTCTACTTGC GGGTCGCATATTGGGCGTGAC GCAAGCTTCCGTTTCCGC TGTGACAGCCCGATGCCGACGTTCC TTCCGTTTGGACTCCGTTCC TTCCCATGCGACGTTCCCCAAC Назва ретротранспозона NIKITA BARE1 SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA BARE1 Таблиця 2 Характеристика детектованих IRAP-локусів. Код праймера А В С D Е F G Н І Назва прайме- Кількість ПЛР- Кількість поліморфних ра локусів ПЛР-локусів NIKITA 110 5 57+92714 NIKITA 113 8 57+Е2082 NIKITA 110 4 57+91673 92714+Е2095 12 6 Е 2082 15 11 Е2082+91673 19 9 С 0945 16 11 Е 2095+С 0946 26 17 91673+Е 1814 22 13 Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Реєстрацію ярого сорту ячменю Адапт здійснювали ДНК-типуванням за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів дев'яти IRAP-локусів (таблиця 2). Записали ДНК-спектр у вигляді формули, в якій буква визначає код дослідженого локусу, нижній індекс – розмір отриманого алеля даного локусу (в п. н.): А623А410А364В1232В1126В709В380В353В281С1236С458С416D3 98D264D243Е1754Е1671Е1258Е1035Е958F1028F765F742F642F605 Кількість виявлених генотипів Рівень поліморфізм) (%) 12 50,0 21 61,5 12 40,0 17 24 19 25 27 23 50,0 73,3 47,4 68,8 65,4 59,1 F578F515F386G1097G927G784G703G684G551G484G454G421G3 93Н1538Н1392Н1260Н1193Н493Н470Н327Н312Н293Н265І748І616І 562І479І432І313. Формула сорту Адапт відбиває алельний склад IRAP-локусів та характеризує специфічність даного генотипу. Приклад 2. Реєстрацію озимого сорту ячменю Одеський 167 здійснювали ДНК-типуванням за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів дев'яти IRAP-локусів (таблиця 2). Записали ДНК-спектр у вигляді формули, в якій 5 15277 6 буква визначає код дослідженого локусу, нижній G992G703G551G484G454G421Н1538Н1503Н1392Н1260Н1193 1097 індекс - розмір отриманого алеля даного локусу (в Н470Н251Н228І748І653І616І597І562І432І284І198. п. н.): Формула сорту Одеський 167 відбиває склад А260В709В380В353В281С1236С737С458С416D351Е1754E1278Е1 IRAP-локусів та характеризує специфічність даного генотипу. 258Е1035Е958Е778Е576F1028Е742Е642E605Е578Е515Е386Е273G Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601