Спосіб диференціації та ідентифікації генотипів сортів ячменю

Спосіб диференціації та ідентифікації генотипів сортів ячменю, що включає молекулярногенетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що як праймери використовують LTR-послідовності ретротранспозонів ячменю. (19) (21) u200600095 (22) 03.01.2006 (24) 15.06.2006 (46) 15.06.2006, Бюл. №6, 2006р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Календар Руслан Миколаєвич, Стратула Ольга Ромуальдівна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 15273 4 гом 1хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКрідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етанотехнологія", Росія). Реакційна суміш для ПЛР лу - центрифугувати при 14000об./хв. Осад розчиоб'ємом 20мкл містить: 50mM KCІ, 20mM Тріс-НСІ нити у 100мкл ТЕ-буферу. рН 8.4 (25°С), 3mM MgCli, 0,01% Tween 20, 5% 2. Флюорометричне визначення концентрації гліцерин, по 0.15mM кожного dNTP, 0.2mkM прайДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на мера (послідовності наведені в таблиці), 20ng ДНК флюорометрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" і 1 одиницю Taq-полімерази. Для ПЛР застосову("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері вати наступний температурний режим: початкова (3М NaCL, 50mM Nа2НРО4) у присутності флюореденатурація - 1,5хв. при 94°С, денатурація 30сек. сцентного барвника Hoechst 33258. при 94°С, відпал - 40сек. при 60°С, елонгація при 3. Проведення полімеразної ланцюгової реак94°С - 1хв. при 72°С, заключна елонгація 10хв. при ції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з 72°С. Кількість циклів ампліфікації - 35. Таблиця LTR-праймери для проведення ПЛР. № 1 2 3 4 5 7 8 9 10 Назва праймера NIKITA 1-57 92714 Е 0229 С 2430 Е 2082 С 0945 91673 С 0946 Е 1814 Послідовність праймера (5'-3') CGCATTTGTTCAAGCCTAAACC ATCATTGCCTCTAGGGCATAATTC ACGTCGGCATCGGGCTGTCAC TTGTTCCACCCACCGTCTACTTGC GGGTCGCATATTGGGCGTGAC GCAAGCTTCCGTTTCCGC TGTGACAGCCCGATGCCGACGTTCC TTCCGTTTGGACTCCGTTCC TTCCCATGCGACGTTCCCCAAC 4. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації розділяти в 2% агарозному гелі. Далі гелі з ПЛР-продуктами фарбувати бромістим етидієм і фотографувати в УФ-світлі на фотоплівку "Мікрат 300". Розміри фрагментів ДНК визначати за допомогою системи відеодокументації "Image Master VDS" в п. н. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Диференціація сорту Гетьман за допомогою IRAP-методу. Для дослідження поліморфізму використовували ПЛР-метод IRAP з двома парами праймерів. Перша пара - 91673 + Е 1814. При використанні цих праймерів кількість поліморфних локусів складала 2 (розмір фрагментів - 484 і 432 п.н.). Кількість детектованих генотипів в межах сорту - 4. Друга пара праймерів - NIKITA 1-57 + 92714. При використанні цих праймерів поліморфний локус був 1 (розмір фрагменту - 260 п.н.), а кількість де Комп’ютерна верстка Л. Купенко Назва ретротранспозона NIKITA BARE1 SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA BARE1 тектованих генотипів в межах сорту складала 2. Встановлено внутрішньосортовий поліморфізм сорту Гетьман. Проаналізований сорт є неоднорідним за 3 локусами. Приклад 2. Диференціація сорту Одеський 115 за допомогою IRAP-методу. Для дослідження поліморфізму використовували ПЛР-метод IRAP з парою праймерів: Е 2095 + С 0946. При використанні цих праймерів кількість поліморфних локусів складала 2 (розмір фрагментів - 293 і 265 п.н.). Кількість детектованих генотипів в межах сорту - 4. Також використовували одиничний праймер Е 2082. При цьому поліморфний локус був 1 (розмір фрагменту - 958 п.н.). Кількість детектованих генотипів в межах сорту складала 2. Встановлено внутрішньо сортовий поліморфізм сорту Одеський 115. Аналізований сорт є гетерогенним за 3 локусами. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601