Спосіб паспортизації генотипів ячменю

Спосіб паспортизації генотипів ячменю включає аналіз компонентів електрофоретичного спектра, який відрізняється тим, що отримані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції REMAPлокуси фіксують у вигляді формули, в якій відображена наявність чи відсутність ПЛР-локусу. (19) (21) u200601814 (22) 20.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Календар Руслан Миколаєвич, Стратула Ольга Ромуальдівна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 16082 4 4 С 2430 TTGTTCCACCCACCGTCTACTTGC SABRINA "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чистий 5 E 2082 GGGTCGCATATTGGGCGTGAC SUKKULA епендорф. До водної фази додати 0,5 обсягу 7 С 0945 GCAAGCTTCCGTTTCCGC SABRINA (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осади8 91673 TGTGACAGCCCGATGCCGACGTTCC SUKKULA ти ДНК центрифугуванням при 14000об./хв. протя9 С 0946 TTCCGTTTGGACTCCGTTCC SABRINA гом 1хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Надосадну 10 E 1814 TTCCCATGCGACGTTCCCCAAC BARE l рідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етаноТаблиця 3 лу - центрифугувати при 14000об./хв. Осад розчинити у 100мкл ТЕ-буферу. Характеристика детектованих REMAP-локусів 2. Флюорометричне визначення концентрації Рівень ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на Кількість Кількість Кількість Код поліфлюорометрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" Назва праймера ПЛР- поліморфних виявлених прайморлокусів ПЛР-локусів генотипів ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері мера фізму(%) (3M NaCL, 50mM Na2HPO4) у присутності флюореА NIKITA 1-57+R2 20 15 23 75,0 В С 2430+R2 14 12 21 85,7 сцентного барвника Hoechst 33258. С 91673+R2 24 17 25 70,8 3. Проведення полімеразної ланцюгової реакD NIKITA 1-57+R8 15 10 25 66,7 ції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з E E 0229+R8 21 15 23 71,4 використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКF С 0945+R8 12 7 16 58,3 технологія", Росія). Реакційна суміш для ПЛР з G 92714+R9 16 7 21 43,8 H E 0229+R9 18 11 25 61,1 IRAP-праймерами об'ємом 20мкл містить: 50mM I 91673+R9 16 11 25 68,8 KC1, 20mM Tpic-HCl pH 8,4 (25°С), 3mM MgCl2, 0,01% Tween 20,5% гліцерін, по 0,15mM кожного Приклади конкретного використання запропоdNTP, 0,2mkM праймера (послідовності наведені в нованого способу. Приклад 1. Паспортизацію яротаблицях 1 і 2), 20ng ДНК и 1 одиницю Taqго сорту ячменю Незалежний здійснювали ДНКполімерази. Для ПЛР застосовувати наступний типуванням за даними електрофоретичного розтемпературний режим: початкова денатурація поділу ампліфікованих алелів дев'яти REMAP1,5хв. при 940°С, денатурація 30сек. при 94 С, локусів (таблиця 3). Записали ДНК-спектр у виглявідпал - 40сек. при 60 С, елонгація при 94 С - 1хв. ді формули, в якій буква визначає код дослідженопри 72 С, заключна елонгація 10хв. при 72°С. Кіго локусу, нижній індекс - розмір отриманого алеля лькість циклів ампліфікації - 35. даного локусу (в п. н.): 4. Елетрофоретичний розподіл продуктів ампліфіА797В1023В899В798В714В622В586В473В330С649С403С259D741 кації. Продукти ПЛР-ампліфікації розділяти в 2% D488D347D330Е1182E1045Е1009Е857Е703Е644Е611E555Е486Е4 агарозному гелі. Далі гелі з ПЛР-продуктами фар07Е348Е139F1058F924F594 бувати бромістим етидієм і фотографувати в УФF418F249G396G341Н1329H1300Н869Н826Н678Н625Н282І1207I11 світлі на фотоплівку "Мікрат 300". Розміри фраг30I1042І857І465І428І401I250 ментів ДНК визначати за допомогою системи відеФормула сорту Незалежний відбиває алельодокументації "Image Master VDS" в п. н. ний склад REMAP-локусів та характеризує специфічність даного генотипу. Таблиця 1 Приклад 2. Паспортизацію озимого сорту ячISSR-праймери для проведення ПЛР меню Тамань здійснювали ДНК-типуванням за даними електрофоретичного розподілу ампліфіко№ Назва праймера Послідовність праймера ваних алелів дев'яти REMAP-локусів (таблиця 3). 1 R2 (GA)9C Записали ДНК-спектр у вигляді формули, в якій 2 R8 (АGС)6G буква визначає код дослідженого локусу, нижній 3 R9 (AG)9C індекс - розмір отриманого алеля даного локусу (в п. н.): Таблиця 2 А260В709В380В353В281С1236С737С458С416D351Е1754Е1278 Е1258Е1035Е958Е778Е576F1028Е742Е642Е605Е578Е515Е386Е27 LTR-праймери для проведення ПЛР 3G1097G992G703G551G484 Назва Назва ретротран-G454G421Н1538Н1503Н1392Н1260Н1193Н470Н251Н228І748І653І6 № Послідовність праймера (5'-3') праймера спозона 16І597І562І432І284І198. NIKITA 1Формула сорту Тамань відбиває склад 1 CGCATTTGTTCAAGCCTAAACC NIKITA 57 REMAP-локусів та характеризує специфічність 2 92714 ATCATTGCCTCTAGGGCATAATTC BARE l даного генотипу. 3 E 0229 ACGTCGGCATCGGGCTGTCAC SUKKULA Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601