Спосіб консервування сперми риб

Изобретение относится к воспроизводству ценных пород рыб, а именно к способам консервирования спермы рыб. Известны способы криоконсервирова-ния, предусматривающий охлаждение спермы и смешивание ее с защитным раствором с последующим замораживанием [1]. Общим является то, что в состав защитных растворов входят вещества (криопротекторы), препятствующие разрушению живых клеток. В основном его органические вещества - диметилсульфоксид, манитол, лецитин, этиленгликоль, поливиниловый спирт, кроме того в их составе иодид серебра, в состав ряда сред входят минеральные соли. Применение сред криопротекторов предполагает смешивание о ними спермы рыб, что неминуемо влечет изменение ионной силы раствора, в котором находятся сперматозоиды. Это является причиной, по которой не может быть достигнут необходимый оптимальный эффект при криоконсервации спермы рыб. Задача, на решение которой направлено изобретение заключается в создании способа консервирования спермы рыб за счет внесения в эякулят спермы рыб раствора осмопротектора, который препятствует лизису этих клеток при смешивайии с криопротекторами различной ионной силы и может применяться при работе с любыми видами рыб. При внесении в эякулят спермы рыб раствора осмопротектора становится невозможным осмотический лизис оболочек сперматозоидов, которые абсорбируют на себе одно из предложенных в заявке веществ и обратимо блокируют анионную проницаемость мембран, оказывая антицитологическую осмопротекцию, что увеличивает процент подвижных сперматозоидов после размораживания на 25% и время активного движения сперматозоидов на 10-15%. Сущность изобретения заключается в том, что в способе консервирования спермы рыб, включающего смешивание спермы рыб перед замораживанием со средами криоп-ротекторов, в среду криопротекторов добавляется сперма рыб предварительно выдержанная с осмопротектором, в качестве которого применяются феназепам или нитразепам, или тримекаин с концентрацией в эякуляте от 10-3 Μ до 10-5 М. Известно, что сперматозоиды разных видов рыб сильно отличаются по своей устойчивости к осмотическому шоку. Так, сперматозоиды осетровых рыб устойчивы и сохраняют подвижность как при смешивании с гипертоническими растворами солей, так и при разбавлении спермы растворами низкой ионной силы или дистиллированной водой. Сперматозоиды многих карповых рыб как правило очень чувствительны к воздействию растворов низкой ионной силы. Так, разбавление (особенно при быстром их перемешивании) спермы карпа, белого амура и белого толстолобика криопротектором низкой ионной силы вызывает гибель до 90% клеток. При значительном разбавлении спермы многих карповых рыб растворами низкой ионной силы (лещ, тарань, карп, белый амур, белый и пестрый толстолобик, черный амур) наблюдается полный цитологический эффект. Смесь превращается в гель, состоящий из обводненных дезоксинуклеопротеидов, освободившихся из разрушенных осмотическим шоком половых клеток. С целью избежания осмотического повреждения или воздействия на клетки спермы рыб при помещении их в среды криопротекторов авторами и предложены вещества, препятствующие разрушению сперматозоидов. Вещества эти блокируют анионную проницаемость клеточных мембран и препятствуют ионному обмену между средой и клеткой, что и позволяет предотвратить лизис сперматозоидов в растворах, ионная сила которых отличается от семенной жидкости. В связи с этим для исследования возможности осмопротекции сперматозоидов рыб были использованы феназепам (7 бром-5-)ортохлор-фенил)-1,2-дигидро-3 Н-1,4 бен-здиазепин-ОН), нитразепам (7-нитро-5фенил-1,1 дигидро-3-Н-1,4-бенздиазепин-2-ОН), тримекаин (2,4,6-триметил-N,N-диэтиламиноацетанилид гидрохлорид). Существенные отличия способа применения заключаются в следующем: сперматозоиды разных видов рыб обладают различной устойчивостью к осмотическому шоку. Это предполагает подбор сред криопротекторов с ионной силой раствора наиболее подходящей для каждого вида рыб. В случае работы с редкими и исчезающими видами, т.е при разнообразном видовом составе это значительно затрудняет работу. Применение осмопротекторов в значительной степени снижает вопрос ионной силы раствора криопротектора при взаимодействии со сперматозоидами. Влияние осмотического шока становится несущественным. Сперматозоиды, подвергшие воздействию криопротекторов, не лизируют даже смешанные с большими объемами бидистилля-та и сохраняют подвижность в растворах значительной ионной силы: 0,24 Μ NaCI; 0,28 Μ; 0,56 Μ NaCI, т.е. приобретают заметную осмотическую устойчивость. Способ осуществляется следующим образом. Один из вышерассмотренных осмопротекторов растворяется в 75% диметилсульфоксиде (коммерческое название - димексин), раствор смешивается с семенной жидкостью в соотношении 1.10; что позволяет избежать активации сперматозоидов в эякуляте. Смесь вносится в эякулят в соотношении 1:10. Навеска осмопротектора должна исходить из конечной концентрации его в эякуляте спермы 10 JM. Молекулярные веса: феназепама - 349: нитрозепама -281: тримекаина - 249. Семенную жидкость получают центрифугированием спермы рыб при 3000 об./мин 10 мин. Выход из 1,5 мл спермы 1 мл семенной жидкости Выдерживание не-активировнной спермы рыб с исследуемыми осмопротекторами проводилось от 30 мин до 2,4 ч. Затем сперму смешивали со средой для криопротекции, часть активировали водой и подсчитывали процент подвижных сперматозоидов, а часть замораживали в жидком азоте и подсчет процента подвижных сперматозоидов и времени их активности проводили после размораживания. Данные по эффективности применения веществ-осмопротекторов представлены в таблице. Как видно из данных, представленных в таблице, достоверный эффект осмопротекции отмечен при использовании всей концентрации нитрозепама, феназепама (10-3 М) тримекаина (10-5 М). Наиболее выраженное действие, то есть повышение процента подвижных сперматозоидов по сравнению с контролем отмечено после инкубации сперматозоидов с нитрозепамом 10-4 Μ Представленные данные получены на сперме карпа. Аналогичные результаты применения асмопротекторов получены при замораживании спермы белого амура и белого толстолобика. За счет применения указанных осмопротекторов достоверно возрастает количество подвижных сперматозоидов и время их движения при криоконсервации спермы рыб. Использование осмопротекторов делает сперматозоиды менее чувствительными к перепадам ионной силы раствора при смешивании их со средами криопротекторов и при активации. Применение осмопротекторов особенно целесообразно при криоконсервации спермы исчезающих и редких видов рыб, осмотическая устойчивость сперматозоидов которых не изучена. Все указанные вещества производятся на Украине. Применение способа поясняется следующими примерами. Пример 1. Для осмопротекции спермы рыб при ее криоконсервации необходимо приготовить два исходных раствора нитразепама Для дальнейшей работы. Раствор 1: 34,4 мг нитразепама растворить в 10 мл 75% димексина. Срок хранения раствора 1 месяц при температуре, 18-25°С. Раствор 2: в 9,1 мл семенной жидкости, полученной при центрифугировании 15 мл эякулята при 3000 об./мин в течение 10 мин, добавить 0,9 мл расгвора 1. Срок хранения раствора 2 1,0-1,5 сут при температуре 4°С. В каждые 5 мл эякулята вносят 0,5 мл раствора 2 и смесь инкубируют 45 мин при температуре 4°С. Далее криоконсервируют сперму по общепринятой методике. Конечная концентрация нитразепама в эякуляте составляет 10-4 М. Пример 2. При использовании в качестве осмопротектора для спермы рыб феназепама также готовят два исходных раствора. Раствор I: 426 мг феназепама в 10 мл 75% димексина. Раствор 2: 0,9 мл раствора 1 в 9,1 .мл семенной жидкости. Далее также как в примере 1. Конечная концентрация феназепама в эякуляте 10-3 М. Пример 3. При использовании тримекаина в качестве осмопротектора при криоконсервации спермы следует приготовить два исходных раствора. Раствор 1 : 4,4 мг тримекаина на 10 мл 75% димексина. Раствор 2 : 0,9 мл раствора 1 довести до 10 мл семенной жидкостью. Далее как в примере 1. Конечная концентрация тримекаина в эякуляте 10-5 М.