Спосіб отримання антипрокоагулянтного препарату з медичних п”явок

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ. Известен способ получения препарата из медицинской пиявки, обладающего антитромботическим, тромболитическим и антиатеросклеротическим действием [1], взятый нами в качестве прототипа. Однако этот способ обладает следующими недостатками: - при ряде заболеваний он может оказать отрицательное действие. Это прежде всего заболевания, связанные с риском тромбообразования (гипотенция, различные оперативные вмешательства, тромбоцитопения и др.); - содержит балластные вещества, ограничивающие растворимость препарата (максимальная растворимость по белку 50мг/мл). В основу изобретения поставлена задача создания способа получения антипрокоагулянтного препарата из медицинских пиявок, обладающего профилактическим противотромботическим действием. Поставленная задача решается тем, что в способе получения антипрокоагулянтного препарата из медицинских пиявок, содержащем замораживание пиявок, лиофилизацию с последующим измельчением, согласно изобретению полученный порошок разбавляют водой, подкисляют до pH 5,8 - 7,0, прогревают на кипящей водяной бане в течение 3 - 15 минут, после чего собирают фильтрат. Способ осуществляется следующим образом. Пиявок промывают, замораживают при температуре не ниже -15 градусов, лиофилизируют, размалывают в порошок. После этого порошок разбавляют водой, подкисляют до значения pH от 5,8 до 7,0, прогревают в кипящей воде в течение 3 - 15 минут, затем собирают надосадочную жидкость. Полученный препарат обладает антитромбиневой активностью, обеспечиваемой гирудином удлиняет время рекальцификации плазмы крови, обусловленной ингибитором каллиюреина плазмы крови, а также блокирует агрегацию и афезию тромбоцитов за счет пиявочных простагландинов, подобных простациклину. Эти свойства препарата определяют его противотромботическое действие, которые больше чем у препарата и прототипа в среднем в 6 раз. Способы определения: 1. Антитромбиновая активность определяется по удлинению времени свертывания фибриногена тромбином. Определяют время образования сгустка в системе состоящей из 0,2мл 0,3% раствора фибриногена и 0,1мл анализируемого препарата после добавления 0,1мл тромбина, содержащего 1 тромбиновую единицу. Активность гирудина выражают в антитромбиновых единицах (АТЕ). 2 Время рекальцификации плазмы крови определяют в системе, содержащей 0,1мл цитратной плазмы крови и 0,1мл анализируемого препарата после добавления 0,1мл 0,025 раствора CaCl2. Отмечают время образования сгустка. Удлинение времени образования сгустка в присутствии АПК выражают в антипрокоагулянтных единицах (АПКЕ), т.е. время рекальцификации в опыте делят на время рекальцификации в контроле (разный объем физиологического раствора). 3. Содержание простагландинов определяют, используя набор реактивов и пропись фирмы (Англия) для радиоиммунологического анализа 6-. 4. Противотромботическое действие АПК определяют на крысах с использованием метода тромбообразования в изолированном участке вены по Бесслеру. Степень блокады тромбообразования оценивали при интервале между введением раствора АПК и активированной стеклом сыворотки крови человека, составляющем 4 часа. Степень блокады тромбообразования выражали в % относительно контроля (введение крысам равного объема физиологического раствора). Примеры. 1. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Тестируют активность этого раствора (см. таблицу). Подкисляют раствор концентрированной муравьиной кислотой до значения pH 6,0. Затем прогревают в кипящей бане в течение 10 минут. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость тестируют (см. таблицу). Как видно из таблицы, полученный АПК обладает высокой антитромбиновой активностью, превышающей исходную в 60 раз; значительно возросла активность ингибитора калликреина (в 60 раз) и возросло содержание простагландинов относительно исходного раствора. Сочетание этих активностей приводит к полному (100%) блокированию тромбообразования в экспериментах на животных. 2. Готовят водный гомогенат (измельчение пиявок в гомогенизаторе, соотношение объемов пиявок и воды 1 : 5). Подкисляют полученный гомогенат 0,1 и HCl до значения pH 6,6. Прогревают гомогенат в кипящей водяной бане в течение 5 минут. Для отделения осадка используют ватно-марлевый фильтр. Надосадочную жидкость тестируют. Как видно из результатов, представленных в таблице, полученный АПК обладает высокой противотромботической активностью. 3. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют его 0,1 и HCl до значения pH 5,4. Выпал осадок, т.е. произошло перераспределение активности между водной фазой и осадком, прогревают 5 минут. По данным таблице видно, что препарат не соответствует целевому продукту. 4. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Снижают значение pH до 7,2 используя 0,1 и HCl. Затем прогревают 5 минут в кипящей бане в течение 5 минут. Осадок не образовался. Значения активностей не превышают исходные (см. таблицу). 5. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют до значения pH 6,0 концентрированной муравьиной кислотой. Затем в течение 2 минут прогревают в кипящей бане. Осадок не образовался. Полученный препарат по активности соответствует исходному (см. таблицу). 6. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Доводят значение pH до 6,0 0,1 и HCl. Прогревают в кипящей бане в течение 18 минут. Из таблицы видно, что в результате продолжительного прогревания произошла денатурация белковых компонентов исходного раствора.