Спосіб зберігання тіней еритроцитів

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано в научно-исследовательских и клинических лабораториях при исследовании свойств эритроцитов. Жизнедеятельность эритроцитов осуществляется с участием ионтранспортных систем мембраны, поэтому сохранение структурнофункциональных свойств плазматических мембран эритроцитов в процессе консервирования клеток является актуальной проблемой. Известны способы хранения эритроцитов под защитой различных криопротекторов полиэтиленоксида (А.с. СССР №560613, кл. A61K35/18, 1977), этиленгликоля (А.с. СССР №596202, кл. A01N1/02, 1978), 1,2-пропандиола (Патент РФ №888896, кл. A01N1/02, 1980). Однако недостатком этих способов является то, что после переноса эритроцитов из криоконсервирующего раствора в физиологический, активность транспортных мембранных систем нарушается и их дальнейшее использование для исследования активного транспорта становится невозможным. Идеальным препаратом мембран для изучения катионного транспорта являются тени эритроцитов. Поэтому актуальной проблемой является создание способов хранения теней эритроцитов. Наиболее близким к заявляемому является способ хранения теней эритроцитов при 4°C (Лишко В.К. Тени эритроцитов как модель изучения активного транспорта Na+ и K+. - Транспортные аденозинтрифосфатазы. - М.: МГУ, 1977. - С.141 145). Согласно этому способу эритроциты, отмытые от плазмы и других форменных элементов крови, помещают в гипотонический раствор соли при 4°C. Соотношение клетки : раствор 1 : 4. Полученные таким образом тени эритроцитов реставрируют путем доведения концентрации солевого раствора до изотонической. Затем удаляют гемоглобин из внеклеточного пространства и помещают на хранение в изотоническом солевом растворе при 4°C. Недостатком способа является то, что он позволяет хранить тени без существенного изменения проницаемости мембран только в течение 2 - 3 суток. В случае же использования теней для изучения активного транспорта их можно хранить в таких усло виях только 6 - 12 часов, т.к. при более длительном сроке хранения происходит, гидролиз внутриклеточной АТФ. Задачей изобретения является создание такого способа хранения теней эритроцитов, в котором изменение температуры и среды хранения позволило бы стабилизировать мембраны, сохранить ионотранспортные ферменты и таким образом обеспечить увеличение сроков сохранения транспортных свойств мембран теней эритроцитов. Поставленная задача решается тем, что в способе хранения теней эритроцитов путем помещения их на холод в солевой среде, гени помещают в жидкий азот в среде, содержащей эндогенный гемоглобин. Способ осуществляют следующим образом. Отмытые от плазмы и други х форменных элементов крови эритроциты лизируют при 4°C в гипотоническом растворе, содержащем 10мМ трис HCl (pH 7,4) и 4мМ MgCl2 при соотношении клетки : раствор 1 : 4. Затем тени концентрируют центрифугированием при 10000q в течение 10мин и непосредственно в этой среде, содержащей эндогенный гемоглобин в полиэтиленовых пробирках помещают в жидкий азот (-196°C). Перед использованием тени отогревают при 40°C в водяной бане и реставрируют 3М KCl, доводя тоничность до 150мМ. Гемоглобин удаляют путем центрифугирования при 10000q в течение 10мин. Способ поясняется следующими примерами. Пример 1. Тени эритроцитов получали путем гемолиза эритроцитов в гипотоническом растворе, содержащем 10мМ трис-HCl, pH 7,4 и 4мМ MgCl2 при отношении эритроциты : гипотонический раствор 1 : 4. Затем половину проб центрифугировали, удаляли надосадок, содержащий гемоглобин. Осадок теней эритроцитов суспендировали в гипотоническом растворе. Все пробы, содержащие гемоглобин и без гемоглобина, погружали в жидкий азот и хранили при -196°C в течение 1 недели, 1 месяца, 1 года. Размораживали в водяной бане при 42°C. После этого тени реставрировали, добавляли к ним 3М KCl до изотонической концентрации 150мМ. После удаления гемоглобина исследовали транспорт 86Rb в реставрированных тенях эритроцитов (Гулевский А.К. и др. Транспорт одновалентных катионов в эритроцитах при инкубации в защитных средах // Криобиология. 1985. - №3. - С.24 - 28). Результаты представлены в табл.1. Данные представлены в мМ Rb+/л эритроцитов за 1 час инкубации при 37°C. Из табл.1 видно, что- хранение теней эритроцитов в среде эндогенного гемоглобина при -196°C является более благоприятным по сравнению с хранением при -196°C без гемоглобина, т.к. общий и АТФ - зависимый транспорт в тени эритроцитов незначительно отличается от контроля. Пример 2. Тени эритроцитов получали как в примере 1, хранили при 4°C с гемоглобином и без гемоглобина в течение 6 часов, 3 суток и 7 суток. После гипотермического хранения, реставрации и удаления гемоглобина в половине проб 86 исследовали транспорт Rb. Результаты представлены в табл.2. Из табл.2 видно, что способ хранения теней эритроцитов при 4°C как в присутствии гемоглобина, так и без него приводит уже на 3 - е сутки хранения к потере мембранами теней эритроцитов нативных свойств, которые еще более усугубляются к 7 - м суткам хранения. Пример 3. Тени эритроцитов получали, как описано в примере 1. Одну половину образцов хранили при -196°C в присутствии гемоглобина, а другую отмывали от гемоглобина и хранили при +4°C в холодильнике. Образцы которые хранились при -196°C, размораживали, реставрировали, отмывали от гемоглобина и исследовали в них состояние транспорта 86Rb, как описано в примере 1. Аналогично исследовали тени эритроцитов, хранившиеся при +4°C. Результаты представлены в табл.3. Из табл.3 видно, что при хранении теней эритроцитов при -196°C в присутствии гемоглобина общий транспорт Rb в клетки остается на уровне контроля, незначительно повышается пассивная проницаемость Rb, активный вход Rb, который осуществляет Na+ - K+ АТФаза, повреждается в незначительной степени при все сроках хранения, что свидетельствует о сохранении структурно-функциональных свойств мембраны, в частности Na+ - насоса. При хранении теней эритроцитов известным способом уже через 1 неделю хранения активный перенос Rb+ полностью отсутствуе т, существенно повреждается общий транспорт Rb+ и пассивная проницаемость мембран для катиона. Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют о том, что заявляемый способ хранения теней эритроцитов обеспечивает длительное их хранение без потери мембранами структурно-функциональных свойств.