Штам бактерій васіllus suвтіlіs для одержання препарату проти збудника сірої гнилі суниці

Штамм бактерий Bac illus s ubt llis ЦМҐІМ B-2895 д ля получения препарата против возбуд ителя серой гнили земляники. Наиболее близким к изобретению является способ борьбы с заболеванием земляники, возбу дителем которой являетс я гриб вида B ot rytis cinerea, предус матривающий обработку рас тений земляник и в фазе рос та и бу тонизации (14-22 июня) антагонис том выш еуказанного вид а гриба, в качес тве кото ро го ис п о ль зу ю т од и н и з ш там мо в S t reptomy c es grlsc ovlrides A TC C 39271 39273 [3]. Од нако применение микроорганизмов р Streptomyces в качес тве агентов биологическ ой борьбы с серой гнилью земляник и сопряж ено с ряд ом технологических труд нос тей, а именно" а) д ля наращивания биомассы применяютс я дорогос тоящ ие питательные среды, в т.ч. являющиеся пищ евым сырьем (солодовый экс тракт, казеиновый гидролизат, глюкоза или лактоза); б)трехкратная обработка; в) кроме того, извес тно, что предс тавители указанной группы микроорганизмов стрептомицеты, могу т в отдельных с лучаях служить причиной заболеваний теплок ровных. Г" IV™ 17939 Цель изобретения - получение более тех нологичного ш тамма бактерий B aclHus s ubt ilis для полу чения препарата против возбу д и те ля с ер ой гни ли з емл яник и Bot rytis clnerea. Пос тавленная цель дос тигается следующим образом Штамм рыд елен из почвы Киевской облас ти е 1982 году, ид ентифицирован по "Краткому опред елителю бактерий Берд жи" Штамм депонирован в коллекции куль ту р Ц ентрального Му зея промыш ленных микроорганизмов инс титу та "В НИИ генетика" под номером: ЦМПМ В-2895, в качес тве штамма, облад ающего выс окой антагонистической активнос тью Мор фолого-ку льту ральные признак и Bac illus s ubtilis Ц МПМ В -2895 - ку льту ра спороносная, аэ робная, граммположитель ная. В мазках из колоний, выросших на МПА через 18 ч, обнаруживаются прямые палоч ковидные клетки 1, 9-2,1x 0, 3-0, 4 мкм, рас положенные од иночно, изредка цепочкой. Клетка при спорообразовании не раздувается, пос ле рос та на глюкозном агаре в протоплазме глобу лы не обнаруживаются. На МПБ ку льту ра образу ет пленку. Через 48 ч рос та при +37° на среде Громыко и сусло-агаре ку льтура имеет вид шерох ова тых пл ос к их ту с к лых к олони й с фес тончатым краем, д иаметром 5-8 мм, светло-серого или телесного цвета, пастообразной конс ис тенции, х орош о с нимается петлей с поверхнос ти агара. Через 48 ч роста при +37° на с трептомицетком и картофельном агаре культу ра имеет вид гладк их, плоск их колоний со с легка волнис тым краем, диаметром 3-4 мм, телесного цвета, пас тообразной конс ис тенции, хорош о снимаетс я петлей с поверх нос тью агара. Ми н и ма л ь на я те м пе р а ту ра р ос та Bacillus subtilis Ц МПМ В -2895 к олеблется в пред елах 5-20°; максимальная от +45° д о +55°; оптимальная +28±37°. РН сред ы минимальные 4, максимальные 8, оптимальные 6-7. В качес тве органичес ких ис точник ов азота ш тамм B acillus subtilis ЦМПМ И-2895 может ис пользовать следующие органические с оед инения: пептон, гид ролизат казеина, дрожжевой автолизат; неорганические соед инения: аммонийные соли [ NH2NO3; (NHfl)4S 04 нитраты (ШОз: NaNCb). Штамм х ранится на МПА, среде Громыко {МПА + СА), агаризованной с ред е Гаузе Ns 2 под с лоем с терильного вазелинового мас ла, пересев - 1 раз в год. Маркерный признак ш тамма: ш тамм устойчив в антибиотику - полимикс ину. Харак терной ос обеннос тью ш тамма является его избирательное воздейс твие на возбудителя 5 серой гнили - B ot ryt is c inerea. Физиолого-биох имичес кме свойс тва. Ф ермен тиру е т глюкозу , араб инозу , маннит, кс илозу с образованием кис лоты без газа. Дает положительную реакцию Фо10 гес-Проскауэра, гид ролизует крахмал, желатину , рас тет при 7% NaCI, у тилизиру ет цитрат, пропионат не использует. Ку льту ра не рас тет в анаэробных условиях и при 10% NaCI, не образу ет газ из N03 в анаэробных 15 ус ловиях, не облад ает э ргининд игид ролазой, лецитиназой. В протоплазме клетки не обнару живаютс я включения поли-^-ок с имас ляной кис лоты. Штамм не патогенен для теплокровных 20 животных. Дан ны е о не па тоге нн ос ти ш там ма Bac illus subt ilis Ц МПМ В -2895. Сус пензии штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895, выращенного в течение 24 ч на мяс о-пептон25 ном агаре (МПА) при + 30°С. Ф ильтра та ку льту ральн ой жид кос ти штамма Bacillus subtllis ЦМПМ В -2895, выращенного в течение 15 сут на жидкой среде Гаузе № 2 при +30°С. 30 П ро ве рку па тог ен н ос ти ос у щ ес тв л я л и иа белых мишах вес ом 18-20 г. Животным ввод или суспензии и фильтраты в желуд ок через зонд и в инъекциях. Резу льтаты исс лед ования токсичнос ти 35 фильтрата ку льту ры B acillus subt ilis ЦМПМ В-2895 после роста на среде Гаузе № 2 представлены в табл. ?. Резу льтаты исс ледования виру лентнос ти су спензии ку льту ры B aciUus s ubt ilis 40 Ц МПМ В -2895, выращенной в течение 24 ч при +37°С на МПА предс тавлены в табл. 2. Наблюд ения за животными провод или ежед невно на протяж ении 15 д ней пос ле окончания инъекции или перорального вве45 д ения. В период наблюд ения вс е животные были активны, хорошо поед али пищ евые рационы, физиологические отравления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерс т50 н ог о п окр о ва н е о тм еч а лос ь . В с е под опытные мыши пос ле окончания срока наблюд ения были умерщвлены, вскрыты и их органы под вергну ты макроскопич ескому изучению. 55 Резу льтаты вскрытия показали: Серд це - обычной формы и величины. Л егкие - в объеме не у величены, доли легко отд еляю тся д руг от дру га, поверхности гладкие, спаек не отмечается. 12939 Желудок, петли тонкого и толстого кишечника - внешне представляются обычным и, п р и вск р ыти и п р осв е та р ису н ок слизистой не изменен. Печень - темно-красного цвета, среднего кровонаполнения, не увеличена, Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие. Почки - обычных размеров и формы. Поверхности гладкие, на разрезе четкий рисунок коркового и мозгового вещества. Селезенка ~ не увеличена, плотной консистенции, На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета. Таким образом, введение суспензии 24часовой культуры Bacillus subtiHs ЦМПМ В28 95 п ер ор а льн о в дозах 1- 5 м лрд микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 микробных клеток на одну мышь не вызывало у мышей каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявило у них патологических изменений, регистрируемых макроскопически. Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма Bacillus subtills ЦМПМ В-2895) на жидкой среде Га узе № 2 не вызывало у животных патологическ о го п р о цесс а , р ег ис тр и ру е м ог о клинически или при макроскопическом изу чении внутренних органов животных. Приведенные данные дают основание считать, что штамм Bacillus subtllis ЦМПМ В-2895 не вирулентен и не токсичен, т.е. не патогенен для теплокровных животных. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении возбудителя серой гнили земляники - Botrutis cinerea, a также к фитопатогенным бактериям и грибам, патогенным и условно патогенным микроорганизмам (табл.). Антагонистическая активность штамма Bacillus subtills ЦМПМ В-2895 представлена в табл. 3. Получение препарата против возбудителя гнили земляники Botrytls cinerea на основе штамма бактерий Bacillus subtllis ЦМПМ В-2895. Основные этапы изготовления препарата: подготовка штамма - засев на косячки с сусло-агаром, инкубирование при +37°С а течение 18-24 ч, Пересев на бактериологические матри цы с твердой средой - сусло-агар, стоимость 1 л которого составляет 14 коп, в то время как д ля в ыр ащ и ва н и я ш та м м ов Streptomyces grlseovlrfdes ATCC 3927139273 используются дорогостоящие питательные среды. Инкубирование при +37°С в течение 7 сутдля получения спор. Срок культивирования Streptomyces griseovirldes ATCC 39271 39273 составляет 12 дней (5 дней со встряхиванием и 7 дней без встряхивания). Контроль спорообразования штамма Bacillus subtilis ЦМЛМ В-2895 проводим мик-роско-5 пически. С агаризованной среды культуру смываем физиологическим раствором . Полученную суспензию клеток доводим до 60 и 100 млрд спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). 10 Биологическую активность полученной суспензии спор (которую квали фи цируем как препарат) определяют по антагонистической активности бактериальной культуры в отношении Botrytls cinerea - возбудителя 15 серой гнили земляники методом радиальных штрихов. 18-часовая культура высевается в центр чашки Петри с сусло-агаром на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 сут инкубирования при +28°С 20 подсевают по радиальным штрихам тест культуру Botrytls cinerea из бактриальной 8 суспензии 5-10 кл/мл. Зоны отсутствия роста учитывают через 18-24 ч инкубирования. 25 Проверка опытных серий культуры Bacillus subtitis ЦМПМ В-2895. выращ енной при 37°С на среде сусло-агар, содержащей 100 млрд КОЕ в 1 мл представлена в табл. 4. 30 Наличие зон отсутствия роста Botrytls cinerea - 19-21 мм свидетельствует о высокой антагонистической активности штамма Bacillus subtiHs ЦМПМ В-2895. Для длительного хранения препарата в 35 полученную суспензию клеток вносят наполнитель ~ сахарозо-желатиновую среду (4% и 1 % соответственно) к общему объему и разливают в лотки из нержавеющей стали. Помещают в морозильную камеру при тем40 пературе не выше -20°С на 48 ч. Затем провод я т лио филиз а цию в в акуум н ых сушильных камерах в течение 36 ч при температуре от -20° до +36°С. Контроль бактериальной чистоты препарата проводят 45 методом рассева на агаризованные пита тельные среды (МПА, Гаузе № 2, Громыко, карто фельный агар, стрептомицетный агар). Антагонистическую активность пол50 ученного препара та на основе штамма Bacillus s ubtilis ЦМПМ В-2895 по отношению к тесткультуре Botrytls cinerea определяют методом радиальных штрихов. Антагонистическая активность опыт55 ных серий препарата на основе штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 (после лиофильной сушки) представлена в табл. 5. П р и м е р . Препарат против возбудителя серой гнили земляники получают наращиванием штамма Bacillus su btllis ЦМПМ 12939 В -2895 на тверд ой с ред е су с ло-агар при П + 37 С в течение 7-10 су т для получения спор. Ку льтуру смывают физиологическим рас твором. Готовят рабочу ю суспензию с гитром 60 и 100 млрд спор в 1 мл из расчета 1 л/га. Р асх од рабочей жидкос ти 600-800 л/ га. В полевых условиях д ейс твие препарата проверяю т на ус тойчивом к возбудителю серой гнили B otrytls clnerea с орте земляники - Ясна, Опыты провод ят на с орте ЗенгаЗенг ана, являющимс я вос приимчивым к возбуд ителю B ot rytis clnerea, что не д ает возможнос ти делать вывод о его более высокой э ффективнос ти. Насажд ения земляники были инфицированы конид иями B otrytls clnerea. Ф оновая нагру зка сос тавляет 2-10 конид ий в 1 мл. Ч ерез од ни су тки д елянки од нократн о опр ыс кива лис ь пр епа ра том на ос н ов е штамма B acillus subtllls ЦМПМ В-2895 с титром 60 и 100 млрд спор в 1 мл в фазу рос та и начало созревания плодов, поскольку возбудитель наход ится на рас тительных остатках, черешках, чаш елис тиках. До фазы цветения и пос ле сбора урожая рекомендуется применять химические с редс тва защ иты (против серой гнили - байлетон 25% с.п. Количес тво мышей в опыте 10 10 10 8 с нормой расх ода 0,24 кг/га, который испытан нами как э талон). В фазы после цветения, рос та и созревания плод ов применять химические с редс тва защиты категорически запрещено. В благоприятные д ля развития болезни годы (дожд ливая, туманная погод а) пог ибает практически весь урожай. Применение в э тот период препарата на ос нове B acillus s ubt llls ЦМПМ 8-2895 позволт значительно сох ранить у рожай. 10 Эффективнос ть B acillus s ubt llls против серой гнили земляники в сравнении с фу нгицидом ОПХ УНИИС "Новоселки" (фаза роста и с озревания плодов) предс тавлена в табл. 6. Опрыс кивание рас тений препаратом на ос нове ш тамма B ac illus s ubtllls Ц МПМ В-2895 с нижает поврежд еннос ть ягод серой гнилью на 8, 6-10, 6% по с равнению с контролем, и на 6, 3% по с равнению с э талоном, развитие болезни - на 46, 24-57%. Предлагаем ый с пос об борьб ы с с ерой гнилью земляники позволяет получить прибавку у рожая 1, 6-2,2 ц/га (при средней у рож а й н ос ти п л а н та ц и и 5 0 ц / r a ), ч то сос тавляет 228-294 ру б/ га. 15 20 25 30 Курс введения Доза, мл Путь введения 0,5 0,5 0,5 Вну трибрюш инно Подк ож но Подк ож но 1 5 1 Т а б л иц а 1 Заболело Пало Выжило 0 0 0 0 0 0 10 10 10 Т а б ли ц а 2 КоличестДоза во мы(количес тшей в во микроопыте бных клеток) 10 1 млрд 10 3 млрд 10 5 млрд 10 1 млрд 10 3 млрд 10 5 млрд 10 10 млрд Путь введения Курс введения Заболело Пало Выжило Перорально _-_ ________ и _ Вну трибрющинно -"_"_ ________ 5 5 0 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10 10 10 11 _ 5 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Т а б л иц а 3 Тес т-культуры Bot rytls clnerea Monilla fructlgena P hlzopus nlgrlcans Xantomonas malvacearum Зоны лизис а тес т-ку льту ры, мм 20-21 12-16 13-15 15-17 12939 10 Продолжение табл 3 Тест-культуры Зоны лизиса тест-культуры, Penicillium expansum claviforme Fuzarium Oxysporum Verticllllum dalie Thllavlopsls basicola Salmonella stenley 5266 stenley Proteus vulgarls Fi vulgarls 72 retlgerl Staphylococcus aureus 209 Candida albicans troplcales Ervlnla euratovors Asperglllus nlger fumlgatum 1 fumfgatum flavum 282 -"- fumlgatum 507 14-16 15-17 10-13 15-17 15-18 32-33 40-31 75-27 40-42 30-32 20-23 40-31 10-13 40-43 15-17 мм 5-7 12-14 20-22 25-27 Таблица 4 Серия Зоны лизиса Botrytls clnerea, мм 19 20 18 21 19 1 2 3 4 5 Т аб ли ца 5 Серия Зоны лизиса Botrytis cinerea, мм 21 20 19 21 19 1 2 3 4 5 Т аб ли ца б Развитие болезни, % — Пораженность ягод, % 18,6 100 Урожай, ц/га 48,0 0,04% 12,3 66,12 48,9 Варианты опыта Рабочая концентрация Контроль (вода) Байлетон, 25 % с. п. норма расхода 0,24 кг/га (эталон) 12939 11 12 Продолжение табл. 6 Варианты опыта Штамм Bacillus subtills ЦМПМ В-2895 Упорядник Замовлення 4090 Рабочая концентрация Пораженность ягод, % 10 60 млрд спор/мл 8.0 100 млрд спор/мл Техред М.Моргентал Развитие болезни. % Урожай, ц/га 53.76 49.6 43.0 50.2 Коректор М. Куль Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53. Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101