Штам бактерій васіllus роlyмyха вндісгм в-324 д для виробництва стимулятора росту цукрового буряка

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности сахарной свеклы и состоит в получении нового штамма фосформобилизующих микроорганизмов для производства бакпрепарата. Известно использование эндомикоризного везикулярного-арбускулярного гриба Glomus для улучшения фосфорного питания растений [Авт.св. СССР № 1145503]. Однако, пока не разработана эффективная технология его применения. Так, инокулянт накапливают на вегетирующих растениях, доза препарата большая (3т/га), что экономически не выгодно при использовании. Известно бактериальное удобрение фосфоробактерин, которое приготавливалось на основе микроорганизма, разлагающего органофосфаты - Bacillus megaterium, var. phosphaticum (Труды института микробиологии. В.XI, 1961). Однако оно снято с производства в 1968 году как недостаточно эффективное. Известен также штамм Bacillus megaterium, АР-1 (А.с. №633897) растворяющий железофосфаты (прототип). Однако в связи с последним, он рекомендуется для применения лишь на почвах, богатых фосфа тами железа (дерново-подзолистые и торфоболотные) под овощные культуры. Предлагаемый нами штамм активно развивается в лесостепных и степных почвах, растворяя в них фосфаты кальция, приживается в ризосфере сахарной свеклы. Известны также попытки использовать под сахарную свеклу флавобактерин, который приготавливается на основе азотфиксирующих бактерий. Однако, предлагаемый нами штамм фосформобилизующей бактерии более эффективен. В основу изобретения поставлена задача создания эффективного штамма фосформобилизующих бактерий для обеспечения доступности труднорастворимых трикальцийфосфатов растениям сахарной свеклы и за счет этого увеличить урожай и сахаристость корнеплодов этой культуры. Поставленная задача решается тем, что штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д для производства стимулятора роста сахарной свеклы, которым обрабатываются семена этой культуры перед посевом, активно мобилизует фосфор из почвенных резервов, растворяя труднодоступные растениям трикальцийфосфаты, позволяет покрыть дефицит в удобрениях, является экологически чистым, естественным и эффективным способом стимулирования роста, повышения урожайности и сахаристости корнеплодов этой культуры. Новый штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В324 Д выделен из темно-серой окультуренной почвы (пояс выщелоченных черноземов северной лесостепи Украины) на картофельной среде №3. Идентифицирован в соответствии с "Кратким определителем бактерий Берги". Штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д депонирован во Всероссийском научноисследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (г.С.Петербург) под регистрационным номером ВНИИСХМ В-324 Д в гр уппе фосформобилизующих микроорганизмов как фосфа трастворяющий микроорганизм. Данный штамм имеется и в коллекции культур музея лаборатории почвенной микробиологии института сельскохозяйственной микробиологии УААН (г.Чернигов). Штамм имеет следующую характеристику. Морфологические и культуральные признаки: Клетки - прямые палочки 3,0 - 5,0 ´ 1,1 - 1,3м, одиночные, в парах и коротких цепочках, грамположительные, подвижные. При спорообразовании клетки раздуваются лимоновидно, с некоторой клостридиальностью (веретенообразностью). Споры крупные, овальные (эллиптические). При анаэробном культивировании через несколько пересевов теряют способность к спорообразованию, палочки приобретают зернистость. На крахмальных средах клетки накапливают гранулезу. Колонии на питательных средах: Мясо-пептонный агар (МПА). Колонии на МПА на 2 - 3 - е сутки роста округлые, плоские, тусклые, с беловатым плотным центром и бесцветной периферией (2 - 3 концентрических круга), край зазубренный, диаметр колоний - 3 - 4мм. Картофельная среда №3: 200г горячего варенного (очищенного) картофеля растирают в растворе минеральной основы среды (МО) следующего состава, г/л: калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5: калий фосфорнокислый двухзамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,5, натрий хлористый - 0,5, железо сернокислое - 0,01, марганец сернокислый - 0,01, смесь микроэлементов - 1,0мл дистиллированная вода 1000мл). Приготовленную смесь питательных веществ доводят до 1000мл водопроводной водой. В приготовленную кашицу вносят 10г и 20г агар-агара. Разливают кашицу в колбы, стерилизуют при контролируют pH - 7,4 - 7,5. Колонии на картофельном агаре состоят из двух концентрированных кругов - беловатого сопкообразного центра и плоской полупрозрачной периферии, край зазубренный, 3 - 4мм в диаметре при 3 - х суточном культивировании в термостате при температуре 28°C. Глюкозо-аспарагиновая среда (среда Муромцева), г/л: глюкоза - 10,0; аспарагин - 1,0; 20,0; вода водопроводная стерилизуют при до агар-агар 1л. Среду в течение 20мин. В стерильную среду вносят 5г/л Колонии на среде Муромцева круглые, до 1мм в диаметре (на 2 - е сутки), бесцветные с беловатым приподнятым центром и полупрозрачной периферией, край зазубренный. Крахмало-пептонная среда. Состав среды, г/л: крахмал - 10,0; пептон - 10,0; - 2,0; агарагар - 20,0; вода водопроводная - до 1л. Колонии крупные (6 - 7мм на 2 - 3 - е сутки), с беловатым приподнятым центром и бесцветной неровной по плотности периферией (шириной 1,0 1,5мм), пастообразные, край зазубренный. Физиологические и биохимические признаки. Факультативный аэроб, восстанавливает нитраты, сероводород не образует. Желатину гидролизует. Ассимилирует (сбраживает) крахмал, мальтозу, маннозу, лактозу, глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу. Пои этом образует кислоты молочную, уксусн ую, а также этиловый спирт, бутиленгликоль, сильно газит. Дульцит не усиливает. Фиксирует атмосферный азот. Подкисляет среду до pH 4,2. Маркерных признаков штамм не имеет. Признаки штамма устойчивы. Санитарно-гигиенические свойства: Украинским научно-исследовательским институтом экогигиены и токсикологии химических веществ (УкрНИИГИНТОКС) в опытах на животных (белые мыши, белые крысы) при различных способах введения изучены вирулентность, токсигенность, инфективность и дисбиотическое действие активного фосфатрастворяющего почвенного микроорганизма Bacillus polymyxa ВНИИСХМВ-324Д. Исследованиями установлено, что клетки Bacillus polymyxa авирулентны для теплокровных организмов и не токсигенны. Они не обладают способностью преодолевать естественные клеточные и гуморальные защитные барьеры, размножаться во внутренних органах теплокровных животных и вызывать инфекционный процесс. Микроорганизмы Bacillus polymyxa не оказывают дисбиотического действия при однократном пероральном поступлении в организм теплокровных животных. Таким образом, штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д, как непатогенный для теплокровных организмов может быть рекомендован для использования его в микробиологической промышленности при производстве бактериального препарата. Способы размножения, условия хранения штамма. Выращивают на картофельной среде высоким столбиком при температуре 28°C в течение 7 суток. Состав среды: 200г горячего картофеля растирают в водном растворе солей: добавляют 1мл раствора микроэлементов по Федорову, доводят до объема 1000мл. В приготовленную картофельную кашицу вносят 10г и нагревают при 1,5атм в течение 10 15мин, затем перемешивают, разливают по пробиркам и стерилизуют при 120°C в течение 30мин, pH среды - 7,4 - 7,5. Хранится на картофельном агаре при комнатной температуре под вазелиновым маслом. Можно сохранять и на средах без масла. В течение года делают 4 пересева. Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. В качестве адсорбента используется почва, мелкозернистый песок. Стерильный адсорбент, помещенный в ампулы или пенициллиновые флаконы смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают, флаконы закрывают. Штамм устойчив к антибиотикам. Активно размножается в присутствии стрептомицин сульфата в концентрации 10мг/мл. Положительные свойства штамма. Пример 1. Активность растворения Штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д культивировали на картофельной среде с внесением 0,5% Штамм сравнения (стандартный) Bacillus megaterium АР-1 культивировали на глюкозо-аспарагиновой среде (глюкоза 10г; аспарагин 1г; с внесением фосфата железа. Полученные данные представлены в табл.1. Штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д накапливает на десятые сутки 25мг/100мл подвижного фосфора. Известный наиболее активный в этом отношении штамм Bacillus megaterium АР-1 - 13,7мг и лишь на 25 - е сутки 44,6мг. Пример 2. Продуцирование стимуляторов роста растений - гибберелловых веществ и bиндолилуксусной кислоты (ИУК) изучали в жидкой картофельной среде №3 (состав смотри выше). Среду разливали в колбы Эрленмейера на 250мл. В колбы для определения ИУК добавляли триптофан (исходный продукт для синтеза ИУК) из расчета 0,05%. Культуру выращивали в термостате при температуре 28°C в течение 5 суток. Гиббереллины определялись фотоколориметрически по методу Г.С. Муромцева и др. Метод основан на реакции гибберелловой кислоты с реактивом Фолина - Чиокальто (фосфорновольфрамовомолибденовый комплекс). При опрыскивании этим реактивом, гибберелловая кислота проявляется на бумаге в виде синеватого пятна. Количество b-индолилуксусной кислоты определяли фотоколориметрически с помощью реактива Сальковского. Полученные данные представлены в табл.2. Результаты свидетельствуют, что штамм Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д является одним из активнейших продуцентов стимуляторов роста растений. Пример 3. Эффективность бактеризации семян сахарной свеклы. Исследование проведено в полевом опыте на черноземе выщелоченном. Обеспеченность почвы питательными веществами - выше среднего уровня. Площадь опытной делянки - 50м 2, учетной - 25м 2, повторность четырехкратная. Бактеризация семян штаммом Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д проведена заблаговременно до посева 13.02.90г. из расчета около 250тыс. клеток на семя. Культура выращивалась на жидкой картофельной среде №3 (состав среды на с.3). Доза препарата составляла 20мл/кг семян. В день посева на одном семени находилось около 160тыс. клеток. Бактеризованные семена до посева хранились в кладовой при температуре не ниже 0°C. Обработка семян флавобактерином и штаммом Bacillus megaterium, var. phosphaticum проведена в день посева (согласно соответствующей для них инструкции). Полученные данные представлены в табл.3. Из табл.3 видно, что инокуляция семян сахарной свеклы штаммом Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д улучшила фосфорное питание растений. Содержание фосфора в корнеплодах увеличилось с 0,35 до 0,54%. Урожай возрос на 15% - значительно больше, чем под влиянием стандартных микроорганизмов. Важно отметить, что обработку семян штаммом Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д, как свидетельствуют результаты опыта, можно проводить заблаговременно, что имеет большое значение для производства. Клетки и их споры сохраняют жизнеспособность на семенах длительное время - не менее двух месяцев. Пример 4. Влияние бактеризации на заболеваемость проростков сахарной свеклы "корнеедом". Полевые опыты проведены на вышеуказанной почве. Бактеризация семян проведена заблаговременно - за 1,5 месяца до посева из расчета 20мл культуральной среды на 1кг семян. Титр культуральной среды - 2млрд. клеток/мл. При этом обрабатывались как чистые, не протравленные семена, так и семена, обработанные фунгицидом ТМТД - наиболее эффективным веществом, которое применяется на производстве против "корнееда". Результаты представлены в табл.4 Полученные данные свидетельствуют, что ядохимикат ТМТД ли шь частично предупреждает заболеваемость проростков. Обработка семян сахарной свеклы штаммом Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д снижает пораженность проростков даже по фону ТМТД, более чем в 3 раза. Эффективность заблаговременной бактеризации семян сахарной свеклы штаммом Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д (влияние на фосфорное питание, урожай, пораженность "кореедом") изучена в восьми полевых опытах, в том числе при совмещении с применением фунгицида ТМТД и инсектицида адифура. Во всех опытах получены положительные результаты. Пример 5. Эффективность бактеризации семян сахарной свеклы в производственных посевах. Испытание проведено в колхозе им. Димитрова Томашпольского района, Винницкой области. Семена пробактеризованы на Винницком семенном заводе 1 февраля 1990г. совместно с обработкой инсектицидом адифуром, фунгицидом ТМТД и прилипателем СМАН-20 из расчета 20мл культуральной среды (титр 2,2млрд. клеток в 1мл) на 1кг семян. Культура выращивалась на жидкой картофельной среде №3 (смотри выше). Посев осуществлен 26 марта 1990г. в двух полях. В поле №7 (чернозем оподзоленный) бактеризованные семена высеяны на площади 80га, контрольные (не бактеризованные) - на 10га (в средине поля). В поле №8 (темносерая лесная почва) бактеризованные семена высеяны на площади 45га, контрольные - на 5га. Учет урожая проведен сплошной уборкой всех массивов. Полученные данные представлены в табл.5. Из табл.5 видно, что заблаговременная заводская бактеризация обеспечила увеличение урожайности сахарной свеклы на 14 - 17%. Пример 6. Влияние на сахаристость. Исследования проводили в полевых опытах (под Черниговом и в Носовке) и производственных посевах (Томашполь). Бактеризация семян проводилась заблаговременно на Винницком семенном заводе при подготовке семян (калибровка, инкрустация). Доза препарата - 20мл на 1кг семян при титре 2,0 - 2,2млрд. клеток в 1мл. Сахаристость корнеплодов определялась заводскими лабораториями на Носовском и Томашпольском сахарных заводах. Результаты представлены в табл.6. Из таблицы видно, что бактеризация семян способствует увеличению сахаристости корнеплодов сахарной свеклы на 0,3 - 0,6%. Совмещение бактеризации с обработкой семян фунгицидом ТМТД и инсектицидом адифуром не снимает положительного действия препарата. Пример 7. Получение препарата на основе штамма Bacillus polymyxa ВНИИСХМ В-324 Д. Для получения препарата штамм Bacillus polymyxa В324 Д выращивают на жидкой картофельной среде №3. Посевной материал вносят в стерильнуо среду в количестве 3-5% от объема. Культуру выращивают в матрах при температуре 28°C в течение пяти суток. При этом титр препарата - не менее 2млрд. клеток в 1мл. Таким образом, инокуляция семян сахарной свеклы штаммом фосформобилизующих бактерий Bacillus polymyxa улучшает фосфорное питание растений, стимулирует их рост, снижает заболеваемость проростков "корнеедом", увеличивает са харистость и урожай корнеплодов, что дает основание рекомендовать данный штамм для производства биопрепарата под сахарную свеклу.