Спосіб вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого ( gentiana punctata l.)

Корисна модель відноситься до галузі біотехнології і може бути застосована для отримання клітинної біомаси цінних лікарських видів рослин роду Gentiana L., а більш конкретно, до способу вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого [Gentiana punctata L.]. Вирощують культуру ізольованих клітин і тканин рослин двома методами: на поверхні сахарозо-мінеральних агаризованих середовищ або в рідких живильних середовищах. При використанні рідких живильних середовищ скорочується цикл вирощування завдяки полегшеному доступу поживних речовин до клітин; вдається запобігти впливу компонентів, що містяться у агар-агарі, на ріст популяції клітин, окрім того з'являється можливість використання продуктів клітинного метаболізму, що виділяються у середовище. Однак, у зв'язку із необхідністю постійного перемішування суспензійних культур, а також продування стерильного повітря потрібна спеціальна апаратура (шейкери, качалки, аератори тощо), що, звичайно, ускладнює, процес отримання біомаси [1]. Більш технологічними є способи культивування in vitro з використанням рідкого живильного середовища і підтримуючих субстратів-підкладок, на поверхні яких вирощується клітинна маса [2]. Застосування такого підходу актуальне для тирличу крапчастого Gentiana punctata L. - цінної лікарської рослини Українських Карпат, що інтенсивно використовується в медицині для регуляції діяльності травної, дихальної, видільної систем, поліпшення обміну речовин в організмі тощо. Крім того, тирлич крапчастий знаходиться під загрозою зникнення і занесений до Червоної книги України (1996), тому природна сировина для отримання ліків відсутня. Найбільш близьким до пропонованого за кількістю суттєвих ознак є спосіб вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого [Gentiana punctata L.], який включає експлантацію та вирощування калюсу на живильному середовищі на основі Мурасіге-Скуга (МС) з половинним вмістом макро- і мікросолей (МС/2), яке доповнюють 6бензиламінопурином і 2,4-дихлорфеноксіоцтовою кислотою [3]. У відповідності до згаданого способу у живильному середовищі в якості підтримуючого субстрату використовують агар. Недоліками цього способу є необхідність використання дорогого компоненту твердого живильного середовища - агару, а також висока трудомісткість операцій вирощування, яка вимагає пересаджування калюсу через кожних 4 тижні. В основу пропонованої корисної моделі поставлено завдання розробити менш трудомісткий і методично простіший спосіб вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого [Gentiana punctata L.] завдяки використанню в живильному середовищі дешевого підтримуючого субстрату. Зазначене завдання вирішується пропонованим способом вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого [Gentiana punctata L.], який, як і відомий спосіб вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого, включає експлантацію та вирощування калюсу на живильному середовищі на основі Мурасіге-Скуга (МС) з половинним вмістом макро- і мікросолей (МС/2), доповненому 6-бензиламінопурином і 2,4-дихлорфеноксіоцтовою кислотою, а, відповідно до пропозиції, у приготовленому рідкому живильному середовищі доводять рН до 5,5-5,7, розливають його у колби, в яких у якості підтримуючого субстрату використовують поролонові підкладки; живильне середовище автоклавують протягом 15-20 хвилин при тиску в одну атмосферу, охолоджують його до кімнатної температури; на одержане живильне середовище висаджують калюс, який культивують без пересадки протягом 90-105 діб; у колби через 30-35, а потім через 60-70 діб від дати висадження калюсу доливають по 510мл свіжого рідкого живильного середовища такого ж складу, а через кожні 90-105 діб калюс переносять в колби із новим аналогічним за складом та способом приготування субстратом і цикл повторюють до одержання біомаси калюсної тканини тирличу крапчастого [Gentiana punctata L.]. Авторами експериментальнo розроблено послідовність операцій, що стосуються способу отримання калюсної культури тирличу крапчастого з використанням в якості підтримуючого субстрату поролонових підкладок. Приклад . Готували живильне середовище МС/2 наступного складу, мг/л: NН4 NО3 825 KNO3 950 СаСІ 2 х 2Н2O 220 MgSO4 x 7H2O 185 КН2РO4 85 КI 0,415 Н3ВО3 3,15 MnSO4 x 4H2O 11,1 ZnSO4 x 7H2O 4,3 Na2 MoO4 x 2H2O 0,125 CuSO4 x 5H2O 0,0125 CoSO4 x 6H2O 0,0125 Nа2ЕДТА х 2Н2O 18,65 FeSO4 x 7H2O 13,9 Тіамін HCl(B6) 0,1 Піридоксин НСl (В6) 0,5 Нікотинова кислота (РР) 0,5 6-бензиламінопурин 0,1 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 0,5 Мезоінозит 100 Сахароза 20000 Вода до 1л, у приготовленому живильному середовищі доводили рН до 5,5-5,7. Із поролону товщиною 15мм вирізали круглі підкладки і поміщали в колби об'ємом 250мл, які наповнювали дистильованою водою і автоклавували при тиску в 1 атмосферу протягом 15-20хв. Після зливу води у колби з поролоновими підкладками наливали по 50мл рідкого живильного середовища і знову автоклавували при тиску в 1атм. протягом 15хв. На поверхню поролонових підкладок у колби з рідким живильним середовищем поміщали приблизно по 2г калюсної тканини Gentiana punctata, яку вирощували без доступу світла при температурі +24...26°С і відносній вологості повітря 70-80%. Калюс Gentiana punctata культивували без пересадки у рідкому живильному середовищі відповідного складу протягом 90 діб. Для забезпечення росту культури потрібними поживними компонентами у колби через 30 та 60 діб доливали свіжі порції (по 5мл) рідкого живильного середовища такого ж складу. Через кожні 90 діб калюс переносили в колби із новим субстратом, приготовленим за вищенаведеною схемою. Через кожні 30 діб культивування нарощений калюс зважували в асептичних умовах і визначали відносний приріст його сирої маси. Відносний приріст сирої маси калюсу через 210 діб складав 4,5. Паралельно авторами досліджено відносний приріст сирої маси калюсу тирличу крапчастого на агаризованому живильному середовищі МС/2 із додаванням 0,1мг/л 6-бензиламінопурину та 0,5мг/л 2,4дихлорфеноксіоцтової кислоти. Встановлено, що при використанні поролонових підкладок як підтримуючого субстрату, відносний приріст калюсу через 210 діб вирощування складав 4,5 і на 70% перевищував такий на аналогічному за складом агаризованому живильному середовищі (табл.). Таким чином, запропонований спосіб вирощування калюсної тканини Gentiana punctata у рідкому живильному середовищі МС/2 із застосуванням в якості підтримуючих субстратів поролонових підкладок дозволяє: 1) утричі скоротити трудомісткість процедури вирощування, пересаджуючи калюс не через кожні 30, а через 90-105 діб; 2) зменшити матеріальні затрати, а, отже, і собівартість отриманої біомаси, у 4-5 разів при одноразовому використанні поролонових підкладок та у 20-25 разів, враховуючи можливість їх 5-6-кратного використання; 3) більше, ніж у 2 рази зменшити кількість використаного живильного середовища, не пересаджуючи калюс через кожні 30 діб, а лише доливаючи в колби невеликі об’єми (5-10мл) свіжого живильного середовища; 4) підвищити відносний приріст свіжої сирої маси калюсу Gentiana punctata на 70%. Таблиця Відносний приріст свіжої маси калюсу тирличу крапчастого Gentiana punctata при вирощуванні його на агаризованому середовищі (відомий спосіб) та у рідкому живильному середовищі з поролоновими підкладками (приклад). Час культивування, доба 30 60 90 120 150 180 210 Відомий спосіб (вирощування на Розроблений спосіб агаризованому середовищі) (Приклад ) Відносний приріст біомаси 0,162+0,027 0,121±0,016 0,585±0,076 0,462±0,068 1,062±0,038 1,232±0,013 1,589±0,029 2,075±0,05б 2,109±0,187 3,452+0,068 2,389±0,213 3,900±0,122 2,670±0,214 4,542±0,075 Ефект стимуляції,% 74,7 78,9 116 130,6 163,7 163,2 170,1 Література: 1. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка, 1980. - 488с. 2. Мясоедов Н.А., Бутенко Р.Г., Слепян Л. И. Выращивание биомассы ткани Раnах ginseng G.А. Меу. с применением поддерживающего субстрата // Раст. ресурсы. - 1986. - №3.-C.341-344. 3. Страшнюк Н.М., Грицак Л.Р., Лесысова О.М., Грубінко В.В. Особливості введення в культуру т vitro лікарського виду Gentiana punctata L. // «Наукові записки» Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія 4: Біологія. - №1 (16). - 2002. - С.91-96.