Спосіб визначення екдизону у культуральному середовищі

Спосіб визначення екдизону (Е) у культуральному середовищі, що передбачає інкубацію in vitro слинних залоз личинок 3-ї стадії дрозофіли у міжлиняльний період розвитку у 3 рівень Е. У личинок виділяють слинні залози та інкубують їх у середовищі, що тестується на наявність Е, при температурі 24-25°С на протязі 30 хв. Після цього готують давлені ацетоорсеїнові препарати політенних хромосом. Отримані препарати аналізують на наявність у політенних хромосомах набору пуфів, що специфічно активуються Е, а саме: 2В5-6 (Х-хромосома), 50CD (хромосома 2R), 63F, 71 СЕ (хромосома 3L), 88D та 93D (хромосома 3R). Даний метод дозволяє визначити у розчині чи у живильному середовищі наявність Е або його аналога, а також визначити активну концентрацію гормонального препарату. Приклади використання способу, що заявляється. Приклад 1. Метою дослідження було визначити за допомогою пуф-теста активність синтетичного аналога Е - (24 R)-5 a -стигмастан-3 b 5,6 b -тріолу. Спочатку слинні залози личинок 3-ї стадії дрозофіли, що взяті у міжлиняльній період розвитку, видержували у фізіологічному розчині Ефруссі-Бідла, що містив гормональний препарат у концентрації 1 мкг/мл при 25°С на протязі 30 хв. Потім на давлених ацетоорсеїнових препаратах досліджували пуфінг політенних хромосом. Було встановлено наявність пуфів у індикаторних локусах та визначені їх розміри по відношенню до близько розташованого диску, не залученого у процес пуфіювання (відношення пуф/диск). Дані наведені у таблиці. 1. 27010 4 описаною вище методикою. Отримані результати представлені у таблиці 2. Вплив різних концентрацій екдистерону у складі препарату ВЕСБ дрозофіли Пуф/диск 2В 5-6/1Е 50CD/50B 63F/63B 71 СЕ/72 А 88D/88C 93D/93C контроль 0,81±0,06 0,94±0,09 1,05±0,07 0,99±0,08 1,06±0,05 0,92±0,09 Розмір пуфів (відношенн Концентр 0,001 0,01 1,13±0,09 1,26±0 0,96±0,105 1,22±0 1,16±0,09 1,24±0 1±0,09 1,15±0 1,06±0,05 1,18±0 1,07±0,104 1,28±0,1 Отримані результати свідчать про те, що при концентрації екдистерону 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл і 1 мкг/мл препарат ВЕСБ активує пуфи в усіх досліджених локусах політенних хромосом, тоді як при концентрації гормону 0,001 мкг/мл достовірна активація пуфінгу спостерігається лише у локусі 2В 5-6. Таким чином, пороговою для даного препарату є концентрація екдістерону 0,01 мкг/ мл. Джерела інформації: Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Какпаков В.Т. Способ определения экдисерона в культуральной среде. - А.с. CCCP,SU 1130605, 23.12.1984. Бюл. №47. Таблиця 1 Вплив (24R)-5 a -стигмастан-3 a ,5,6 b -тріолу на активність пуфів політенних хромосом дрозофіли Пуф/диск 2В5-6/1Е 50CD/50B 63F/63B 71СЕ/72А: 88D/88C 93D/93C Усього у даному експерименті було досліджено по 20-25 пуфів у кожному з вказаних локусів політенних хромосом. Таким чином, за здатністю викликати активність екдізонових пуфів у політенних хромосомах дрозофіли встановлено, що препарат (24R)-5 a -стигмастан-3 b ,5,6 b -тріол є біологічним аналогом екдизону. Приклад 2. Метою дослідження було встановити вплив різних концентрацій екдистерону у складі препарату ВЕСБ (вітамінний, екдистероновий стимулятор бджіл) та визначити порогову концентрацію, при якій даний гормональний препарат проявляє свою біологічну дію. Досліджували вплив гормону на пуфінґ політенних хромосом слинних залоз личинок дрозофіли у міжлиняльний період розвитку у концентраціях 0,001 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл та 1 мкг/мл за Розмір пуфів (відношення розмірів пуф/диск) 1,59 ±0,07 1,84 ±0,05 1,51 ±0,07 1,42 ±0,06 1,53 ±0,06 1,3 8 ±0,05