Спосіб визначення механізму інтерфазної гетерохроматинізації

Спосіб визначення механізму інтерфазної гетерохроматинізації, який включає операції отримання стабільної лінії мух Drosophila virilis з епігенетичним фенотипом, при дії ДНК-деметилюючого реагенту 5-аза-цитидину у складі поживного сере 3 19657 4 гетерохроматину, індукованого епігенетичним тенних хромосом Drosophila virilis, як перицентроДНК-деметилюючим чинником. мерному так і інтеркалярному, індуковані ДНККонцентруючись в інтерфазному ядрі (бласттдеметилюючим чинником 5'-аза-цитидином, мають рансформованого лімфоциту) на стадії максимавірогідно поєднуватись з механізмом інтерфазної льної декомпактизації та реплікації хроматину, гетерохроматинізації мітотичних хромосом, індумітотичні інтерфазні хромосоми, насамперед за кованої глобальним ДНК-гіпометилюванням при розміром, лишаються за межею достатньо можлипухлинній прогресії, а саме з явищем гетеропікнового цитоморфологічного структурного аналізу, в зу (специфічної гетерохроматинізації), в основі тому числі, дослідження механізму імовірних морякого лежать механізми ектопічної коньюгації та фологічних змін гетерохроматину при виявленій екстрареплікація активованих деконденсованих нами специфічній інтерфазній гетерохроматинізагетерохроматинових районів (пуфів) політенних ції мітотичних лімфоцитів (за рівнем інтенсивності хромосом. Таким чином, деконденсація конституфлуоресценції з DAPI та Hoechst 33258 - гетерохтивного перицентромерного/центромерного гетероматин-специфічними флюорохромами та суттєрохроматину мітотичних хромосом, індукована вою ампліфікацією перицентромерних сателітних глобальним ДНК-гіпометилюванням при пухлинній Аlu-ДНК повторів) у хворих на пухлинну прогресію, прогресії, як показано раніше [Деклараційний паяка корелює з ДНК-деметилюванням та, поєднатент України на корисну модель No 13616, МПК ною з ним, деконденсацією конститутивного пери(2006) А61К31/727 (2006.01), G01N33/48, опубл. центромерного/центромерного гетерохроматину 17.04.2006 р., Бюл. №4], вірогідно може асоціюва[Деклараційний патент на корисну модель No тись з механізмами екстрареплікацй та ектопічної 15113, МПК (2006) А61В5/00, G01N33/49, коньюгації деконденсованого гетерохроматину, що G01N33/48, опубл. 15.06.2006. Бюл. №6]. лежать в основі інтерфазної гетерохроматинізації Тому, вирішення поставлених питань з'ясовумітотичних хромосом при пухлинній прогресії та валось на моделі політенних хромосом Drosophila явища гетеропікнозу (гетерохроматинізації) на virilis. По-перше, на підставі того, що політенні моделі гігантських інтерфазних політенних хромохромосоми Drosophila були та лишаються класичсом, спричинених дією одного чинника - епігенетиною моделлю структурно-генетичних досліджень чного ДНК гіпометилювання / деметилювання. геному еукаріот. По-друге, політенні хромосоми Суть пропозиції пояснюється за допомогою це гігантські інтерфазні хромосоми, які володіють графічних матеріалів. максимальною декомпактизацією, характерною На Фіг.1 показана деконденсація гетерохромадля інтерфазних хромосом. Саме за цим принцитину політенних хромосом у вигляді активного пупом мітотичні хромосоми та політенні хромосоми є фінгу, при дії ДНК деметилюючого реагенту 5'-азаімовірно тотожними для з'ясування поставлених цитидину. питань. По-третє, в політенних хромосомах, як і в На Фіг.2 показана ектопічна коньюгація деконмітотичних, надзвичайно високий вміст гетерохроденсованих гетерохроматинових пуфів політенних матину, з домінуючим конститутивним перицентхромосом у вигляді ектопічного тяжу, при дії ДНК ромерним гетерохроматином, що доповнюється деметилюючого реагенту 5'-аза-цитидину. інтеркалярним гетерохроматином. Як у "мовчащоНа Фіг.3 показана гетерохроматинізація фрагму" конденсованому гетерохроматині мітотичних ментів деконденсованого гетеро хроматину поліхромосом, у щільно компактизованих дисках контенних хромосом у вигляді краплин "помпон", при денсованого гетерохроматину політенних хромодії ДНК деметилюючого реагенту 5'-аза-цитидину. сом відсутня генна експресія. Гетерохроматинові На Фіг.4 показана екстрареплікація і ектопічна диски декомпактизуються і активуються лише на коньюгація блоків неконденсованого гетерохромаокремих стадіях розвитку Drosophila. Тому, імовіртину політенних хромосом у вигляді гетеропікнозу, но, що саме перицентромерний конститутивний при дії ДНК-деметилюючого реагенту 5'-азагетерохроматин, який на стадії інтерфазної клітини цитидину. - стадії максимальної декомпактизації хроматину На Фіг.5 методом електрофорезу в агарозному та S-фази реплікації ДНК, як мітотичних, так і полігелі (1.2%) показана поява фракції екстрареплікотенних хромосом, лишається висококомпактизованої ДНК гетерохроматину політенних хромосом ваним, є вірогідним матеріальним носієм епігенепри гетеропікнозі (гетерохроматинізації), індуковатичного контролю клітини. В свою чергу, ної дією ДНК-деметилюючого реагенту 5'-азаепігенетичні порушення в клітині, ключовим сигнацитидину. льним фактором яких є зміни в ДНК- метилюванні, 1. Хромоносомна ДНК людини а саме, виявлене значне ДНК- деметилювання при 2. ДНК політенних хромосом без дії деметипухлинній прогресії, що корелює з деконденсацією люючого реагенту 5'-аза-цитидину. конститутивного прицентромерно3. ДНК політенних хромосом після дії 5'-азаго/центромерного гетерохроматину метафазних цитидину 10-8 М. хромосом та інтерфазною гетерохроматинізацією 4. ДНК політенних хромосом після дії 5'-аза[Деклараційний патент на корисну модель No цитидину 10-6 М. 15113, МПК (2006) А61В5/00, G01N33/49, На Фіг.6 показана глобальна гетерохроматиніG01N33/48, опубл. 15.06.2006. Бюл. №6], мають, в зація політенних хромосом у вигляді масивних свою чергу, імовірно реалізуватись через структурайонів гетеропікнозу, при дії ДНК-деметилюючого рно-морфологічні зміни в організації конститутивреагенту 5'-аза-цитидину. ного гетерохроматину, як мітотичних хромосом, Приклад. Отримували стабільну лінію мух так і політенних. Отже, показані ключові принципоDrosophila virilis з індукованим епігенетичним феві зміни в конститутивному гетерохроматині полінотипом. Об'єктом досліджень були політенні хро 5 19657 6 мосоми лінії дикого типу К9 Drosophila virilis. Мухи літенних хромосом, індукованим дією ДНК демеутримувались на стандартному поживному серетилюючого чинника (5'-аза-цитидин), що передадовищі (манна каша, пивні дріжжі, ізюм, з добавється від першої генерації мух до наступної (на ленням пропіонової кислоти, як антимікробного протязі 21 пасажів). 2. Виявлена специфічна епігенетична нестабізасобу) при +24...+25 С. Контрольною групою слульність гетерохроматину, що обумовлюється дією гували мухи лінії дикого типу К9 Drosophila virilis ДНК деметилюючого чинника: показано, що при дії (15 самок і 15 самців), які утримувались, на протязі специфічного ДНК-деметилюючого реагенту 5’21 пасажів, на поживному середовищі без ДНКаза-цитидину має місце індукція активної декондедеметилюючого реагенту - 5'-аза-цитидину. Друнсації перицентромерного та інтеркалярного гетегою групою слугували мухи лінії дикого типу К9 рохроматину політенних хромосом, що асоціюєтьDrosophila virilis (15 самок і 15 самців), які утримуся з активним пуфінгом (фіг.1). вались на поживному середовищі з 5'-аза3. На моделі політенних хромосом вперше поцитидином, в кінцевій концентрації 10-4М та 10-6М казано, що при дії ДНК-деметилюючого реагенту на протязі першої генерації мух. Наступні генерації має місце специфічна індукція ектопічної коньюгамух з індукованим епігенетичним фенотипом підтції деконденсованих гетерохроматинових районів, римувались на поживному середовищі без 5'-азаяк між хромосомами, так і в межах окремих хромоцитидину на протязі 20 пасажів. Личинки (передсом (Фіг.2, Фіг.4). лялечки) відбирали на кінці третьої личинкової 4. На моделі інтерфазних політенних хромостадії, коли хромосоми в клітинах слинних залоз сом вперше показано, що при дії ДНКDrosophila проходять максимальний цикл ендоредеметилюючого чинника поряд з ектопічною коньдуплікації і, таким чином, досягають максимальноюгацією районів деконденсованого гетерохромаго ступеня політенії. Застосовували стандартну тину має місце значна гетерохроматинізація за методику давлених ацетоорсеїнових препаратів рахунок екстрареплікації ДНК районів деконденсоінтерфазних ядер клітин слинних залоз для отриваного гетерохроматину (фіг. 5), що супроводжумання політенних хромосом: слинні залози личиється появою "ектопічних тяжів" (Фіг.2), краплин нок препарували у фізіологічному розчині (0,15М "помпонів" (Фіг.3) та масивних районів гетеропікNaCl ), витримували в ацетоорсеїновому барвнику нозу (Фіг.4, Фіг.6). Таким чином, показано, що інтена протязі 2-3 годин, та переносили на предметне рфазна гетерохроматинізація політенних хромоскло в краплину 45% уксусної кислоти, накривали сом, індукована дією ДНК деметилюючого чинника покровним скельцем та обережно давили поверх - 5'-аза-цитидину, асоціюється з явищем гетеропіфільтрувального папірця. Проводили цитоморфокнозу, що безпосередньо поєднується з механізлогічний аналіз інтенсивно забарвлених ацетоормами екстрареплікації ДНК та ектопічної коньюгасеїном політенних хромосом за допомогою світлоції районів деконденсованого гетерохроматину. вої мікроскопії при збільшенні 25х1,25 та 40х1,25 5. Вперше проводиться експериментальна ек[Жимулев И. Ф. Политенные хромосомы: морфостраполяція між, індукованим ДНК-деметилюючим логия и структура. - Новосибирск: "Наука", Сибирчинником, гетеропікнозом деконденсованого гетеское отд-ние. -1992,480 с.. Политенные хромосорохроматину інтерфазних політенних хромосом та мы: морфология и структура. - Новосибирск: інтерфазною гетерохроматинізацією деконденсо"Наука", Сибирское отд-ние. -1992,480 с.]. ваного гетерохроматину мітотичних хромосом, Таким чином, в результаті досліджень було: індукованою глобальним ДНК-гіпометилюванням 1. Отримано стабільну лінію мух Drosophila при пухлинній прогресії. virilis з епігенетичним мутаторним фенотипом по 7 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 19657 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601