Гібридома-продуцент моноклональних антитіл до основного білка зовнішньої мембрани chlamydia trachomatis, придатних для використання у імуноферментних тест-системах

Гібридома-продуцент моноклональних антитіл до основного білка зовнішньої мембрани Chlamydia trachomatis, придатних для IgG2b 1,2 Приклад 1. Одержання гібридом (процедура гібридизації) [3, 4]. Тварину-донора імунокомпетентних лімфоцитів вибирали за результатами титрування сироваток мишей. Селезінку після забою миші стерильно видаляли та м'яко гомогенізували в середовищі з 10% ембріональної телячої сироватки (ETC). Для лізису еритроцитів селезінки клітини після центрифугування ресуспендували в 0,83% розчині хлориду амонію. Спленоцити витримували 3хв. при 4°С і осаджували при 1500об/хв. 5хв. Потім ще раз відмивали середовищем без сироватки, ресуспендували в 15мл DMEM та підраховували кількість життєздатних клітин у камері Горяєва. Таким чином одержували (3-5)х108 лімфоцитів із високою життєздатністю за результатами виключення тріпанового синього. їх змішували з 28627 392В2 Титр МК у культураль (11) Константа афінності МКАТ, х 1010М UA Ізотип МКАТ (19) Назва гібридоми (13) Характеристика моноклональних антитіл Chlamydia trachomatis, які продукують одерж 1:100 3 мієломними клітинами у співвідношенні 2:1 і центрифугували при 1000об/хв протягом 12хв у пробірці ємністю 50мл. Середовище майже повністю видаляли, а клітинний осад старанно розбивали, постукуючи пробіркою по столу ламінарного боксу. Потім у суспензію клітин вносили 1мл 40% розчину ПЕГ з 5% ДМСО. Суміш клітин витримували в середовищі з ПЕГ 5 хв при кімнатній температурі і центрифугували при 1000об/хв 2хв. Потім суспензію повільно розводили середовищем DMEM без сироватки до об'єму 50мл. До суспензії додавали 3мл ETC. Клітини після зливання осаджували при 1000об/хв 15хв. Надосад відсмоктували, а осад обережно ресуспендували у повному ростовому середовищі DMEM з 15% ETC і 50мкг/мл гентаміцину. Концентрацію клітин доводили до (1-2)х106/мл і вносили в 96-лункові планшети по 100мкл на лунку. Приклад 2. Зберігання гібридом у рідкому азоті. Для зберігання гібридом-продуцентів використовували кріосередовище, що містить 5% ДМСО, 50% ETC та 45% DMEM. В одну ампулу вносили від 105 до 2x106 клітин, які суспендували в Імл кріосередовища, шляхом змивання моношару з 1-2 лунок 24-лункового планшету. Потім ампули поміщали в контейнер із теплоізоляційного матеріалу і повільно охолоджували до мінус 70°С. На другу добу ампули переносили в резервуар з рідким азотом. Таким чином, кріоконсервацію проводили по двоетапній схемі. Приклад 3. Клонування гібридом Гібрид оми клону вали методом лімітувальних розведень [5]. Суть його полягає у поступовому розведенні клітинної суспензії, поки концентрація не досягне однієї або менше клітин на лунку. Клонування проводили на 96-лункових плашках, на які попередньо вносили фідер із перитонеальних макрофагів по 100мкл на лунку. Із суспензії гібридом відбирали об'єм від 1 до 10мкл, у залежності від вихідної концентрації клітин, і розводили до 3мл повним ростовим середовищем. Розносили по 100мкл на 1/4 частину плашки. Потім ще тричі повторювали розведення до заповнення всієї плашки. Таким чином, сумарний об'єм середовища в лунках становив 200мкл. У результаті отримували чотири різні концентрації клітин. У якомусь із розведень обов'язково росли ізольовані клони, які після тестування, пересаджували або знову клонували. Приклад 4. Одержання асцитичної рідини. Для накопичення значної кількості МКАТ гібридоми культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревно по 0,5мл пристану. Мінеральне масло слугувало сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 2x106 до 107 гібридом в 1мл середовища. Через 58 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після 28627 4 центрифугування при 3000об/хв. протягом 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Літературні посилання: 1. Kaul R., Duncan M.J.J., Guest J. et al. Expression of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein-encoding gene in Escherichia coli: role of the 3' end in mRNA stability //Gene. - 1990. Vol. 87, 1. - P.97-103. 2. Pal S., Theodor I., Peterson E.M. et al. Monoclonal immunoglobulin A antibody to the major outer membrane protein of the Chalamydia trachomatis mouse pneumonitis biovar protects nice against a chlamydial genital challenge //Vaccine. 1997. - Vol. 15, 5. - P.575-582. 3. Ніколаєнко І.В. Отримання та порівняльний аналіз гібридом -продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, II та III типів: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 18с. 4. Широбоков В.П., Ніколаснко І.В., Копаниця Л.В. та ін. Панель моноклональних антитіл для внутрішньотипової диференціації поліовірусів II типу //Мікробіол. журн.- 1997. - №6. - С.27-35. 5. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Acedemic press, 1996. 492p.