Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до igg людини, придатних для використання у імуноферментних тест-системах

Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до IgG людини, придатних для 2 1:64000 3 Приклад 1. Одержання гібридом (процедура гібридизації) [3,4]. Тварину-донора імунокомпетентних лімфоцитів вибирали за результатами титрування сироваток мишей. Селезінку після забою миші стерильно видаляли та м'яко гомогенізували в середовищі з 10% ембріональної телячої сироватки (ETC). Для лізису еритроцитів селезінки клітини після центрифугування ресуспендували в 0,83% розчині хлориду амонію. Спленоцити витримували 3хв. при 4°С і осаджували при 1500об/хв. 5хв. Потім ще раз відмивали середовищем без сироватки, ресуспендували в 15мл DMEM та підраховували кількість життєздатних клітин у камері Горяєва. Таким чином одержували (3-5)х108 лімфоцитів із високою життєздатністю за результатами виключення тріпанового синього. їх змішували з мієломними клітинами у співвідношенні 2:1 і центрифугували при 1000об/хв протягом 12хв у пробірці ємністю 50мл. Середовище майже повністю видаляли, а клітинний осад старанно розбивали, постукуючи пробіркою по столу ламінарного боксу. Потім у суспензію клітин вносили 1мл 40% розчину ПЕГ з 5% ДМСО. Суміш клітин витримували в середовищі з ПЕГ 5хв при кімнатній температурі і центрифугували при 1000об/хв 2хв. Потім суспензію повільно розводили середовищем DMEM без сироватки до об'єму 50мл. До суспензії додавали 3мл ETC. Клітини після зливання осаджували при 1000об/хв 15хв. Надосад відсмоктували, а осад обережно ресуспендували у повному ростовому середовищі DMEM з 15% ETC і 50мкг/мл гентаміцину. Концентрацію клітин доводили до (1-2)х106/мл і вносили в 96-лункові планшети по 100мкл на лунку. Приклад 2. Зберігання гібридом у рідкому азоті. Для зберігання гібридом-продуцентів використовували кріосередовище, що містить 5% ДМСО, 50% ETC та 45% DMEM. В одну ампулу вносили від 105 до 2x106 клітин, які суспендували в 1мл кріосередовища, шляхом змивання моношару з 1-2 лунок 24-лункового планшету. Потім ампули поміщали в контейнер із теплоізоляційного матеріалу і повільно охолоджували до мінус 70°С. На другу добу ампули переносили в резервуар з рідким азотом. Таким чином, кріоконсервацію проводили по двоетапній схемі. Приклад 3. Клонування гібридом. Гібридоми клонували методом лімітувальних розведень [5]. Суть його полягає у поступовому розведенні клітинної суспензії, поки концентрація не досягне однієї або менше клітин на лунку. Клонування проводили на 96-лункових плашках, на які попередньо вносили фідер із перитонеальних макрофагів по 100мкл на лунку. Із суспензії гібридом відбирали об'єм від 1 до 10мкл, у залежності від вихідної концентрації клітин, і розводили до 3мл повним ростовим 28625 4 середовищем. Розносили по 100мкл на 1/4 передаються частину плашки. Потім ще тричі повторювали статевим шляхом розведення до заповнення всієї плашки. Таким чином, сумарний об'єм середовища в лунках становив 200мкл. У результаті отримували чотири різні концентрації клітин. У якомусь із розведень обов'язково росли ізольовані клони, які після тестування, пересаджували або знову клонували. Приклад 4. Одержання асцитичної рідини. Для накопичення значної кількості МКАТ гібридоми культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревно по 0,5мл пристану. Мінералне масло слугувало сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 2x106 до 107 гібридом в 1мл середовища. Через 58 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв. протягом 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Літературні посилання: 1. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю. и др. Моноклональные антитела к подклассам IgG человека: получение и исследование специфичности II Иммунология. 1998. - №3. - С.27-31. 2. Reimer С.В., Phillips D.J., Aloisio C.H. et al. Evaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies to human IgG epitopes //Hibridoma. - 1984. - Vol. 3,3. - P.263-275. 3. Ніколаєнко І.В. Отримання та порівняльний аналіз гібридом - продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, II та III типів: Автореф. дис.... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 18с. 4. Широбоков В.П., Ніколаснко І.В., Копаниця Л.В. та ін. Панель моноклональних антитіл для внутрішньотипової диференціації поліовірусів II типу // Мікробіол. журн. - 1997. - №6. – С.27-35. 5. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Acedemic press, 1996. 492p.