Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до iga людини, придатних для використання у імуноферментних тест-системах

Набір гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до IgA людини, придатних для використання у імуноферментних тест-системах, 2 3 28628 повністю видаляли, а клітинний осад старанно розбивали, постукуючи пробіркою по столу ламінарного ооксу. Потім у суспензію клітин вносили 1мл 40% розчину ПЕГ з 5% ДМСО. Суміш клітин витримували в середовищі з ПЕГ 5хв при кімнатній температурі і центрифугували при 1000об/хв 2хв. Потім суспензію повільно розводили середовищем DMEM без сироватки до об'єму 50мл. До суспензії додавали 3мл ETC. Клітини після зливання осаджували при 1000об/хв 15хв. Надосад відсмоктували, а осад обережно ресуспендували у повному ростовому середовищі DMEM з 15% ETC і 50мкг/мл гентаміцину. Концентрацію клітин доводили до (1-2)×10 6/мл і вносили в 96-лункові планшети по 100мкл на лунку. Приклад 2. Зберігання гібридом у рідкому азоті. Для зберігання гібридом-продуцентів використовували кріосередовище, що містить 5% ДМСО, 50% ETC та 45% DMEM. В одну ампулу вносили від 105 до 2×106 клітин, які суспендували в Імл кріосередовища, шляхом змивання моношару з 1-2 лунок 24-лункового планшету. Потім ампули поміщали в контейнер із теплоізоляційного матеріалу і повільно охолоджували до мінус 70°С. На другу добу ампули переносили в резервуар з рідким азотом. Таким чином, кріоконсервацію проводили по двоетапній схемі. Приклад 3. Клонування гібридом Гібридоми клонували методом лімітувальних розведень [5]. Суть його полягає у поступовому розведенні клітинної суспензії, поки концентрація не досягне однієї або менше клітин на лунку. Клонування проводили на 96-лункових плашках, на які попередньо вносили фідер із перитонеальних макрофагів по 100мкл на лунку. Із суспензії гібридом відбирали об'єм від 1 до 10мкл, у залежності від вихідної концентрації клітин, і розводили до 3мл повним ростовим середовищем. Розносили по 100мкл на 1/4 частину плашки. Потім ще тричі повторювали розведення до заповнення всієї плашки. Таким чином, сумарний об'єм середовища в лунках становив 200мкл. У результаті отримували чотири різні концентрації клітин. У якомусь із розведень обов'язково росли ізольовані клони, які після тестування, пересаджували або знову клонували. Приклад 4. Одержання асцитичної рідини. Для накопичення значної кількості МКАТ гібридоми культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревно по 0,5мл пристану. Мінеральне масло слугувало сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 2×106 до 107 гібридом в 1мл середовища. Через 58 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв. протягом 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Літературні посилання: 4 1. Kurth В., Weston С, Redd: P. et al. Oviductal antibody response to a defined recombinant sperm antigen in macques // Biol. Reproduct. - 1997. - Vol. 57. - P.981-989. 2. Miller L., Izzo M., Wemett Г). et al. Increased plasma IgA, slgA, and C3-and IgA-containing immune complexes with renal glomerular deposits in diabetic rats // Diabetes. - 1988. - Vol. 37, 2. - P.185 - 193. 3. Ніколаєнко І.B. Отримання та порівняльний аналіз гібридом - продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, II та III типів: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 18с. 4. Широбоков В.П., Ніколаенко І.В., Копаниця Л.В. та ін. Панель моноклональних антитіл для внутрішньотипової диференціації поліовірусів II типу // Мікробіол. журн. - 1997. - №6. - С.27-35. 5. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Acedemic press, 1996. 492p.