Штам бактерій brevibacterium sp. – продуцент лізіну

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма-продуцента 1лиэина, незаменимой аминокислоты, которую используют в качестве кормовой добавки. Известны мутантные аналогорезистентные штаммы Cor. glutamlcum, используемые для получения лизина и не требующие для роста аминокислоты /1/. Эти прототрофные штаммы продуцируют 28-38 г/л лизина на средах с глюкозой или сахарозой, не содержащих дорогих источников ростовых факторов. Коэффициент конверсии углерода в лизин составляет 25-38 %. В качестве источника необходимого этим штаммам биотина используется препарат дестиобиотин или кукурузный экстракт. Использование мелассы в этих способах не предусматривается. В промышленности прототрофные штаммы не нашли применения, так как глюкоза и сахароза являются дефицитным сырьем. В производстве Лизина в СНГ, так и за его пределами в качестве источника углеводов используют мелассу, а в качестве продуцентов ауксотрофные по гомосерину штаммы. В СНГ в настоящее время применяется аналогорезистентный ауксотрофный по гомосерину штамм Brevlbacterlum Е531. Использование ауксотрофиных штаммов-продуцентов предусматривает введение в состав сред необходимых для роста аминокислот в виде гидролизатов белковых субстратов, например соевого или арахисового шрота (3-4 %), дорогостоящего полипептона (1,5 %), либо гидролизата дрожжевой биомассы (5-12 %). Недостатком известных ауксотрофиных штаммов является низкая конверсия сахара в лизин, высокая потребность в ростовых факторах (аминокислоты) и высокая требовательность к аэрации. По совокупности признаков и достигаемому эффекту в качестве штамма-прототипа выбран отечественный штамм-продуцент лизина Brevlbacterium sp.531 [2]. Штамм нуждается для роста в гомосерине, устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину. Продукция лизина при использовании штамма-прототипа достигает в опытах в лабораторных колбах на качалке - 44-46 г/л за 8 часов на средах с мелассой (24 %) игидролизатом БВК (6 % или 1,2 % в расчете на технический вес БВК). В промышленных аппаратах на средах с мелассой и гидролизатом БВК выход лизина достигает 49 г/л за 60 часов ферментации. Конверсия источника углерода в лизин - 32-37 %. Основным недостатком штамма-прототипа является необходимость использования в большом количестве гидролизата БВК в составе сред. Уровень накопления лизина и коэффициент конверсии источника углерода также не отвечает потребностям производства. В основу изобретения поставлена задача создания штамма-продуцента лизина с высоким коэффициентом конверсии сахара в лизин, способного накапливать высокий уровень целевого продукта на мелассных средах со сниженной концентрацией ростовых-факторов в условия х умеренной аэрации. Поставленная задача решается созданием нового штамма Brevlbacterlum sp.90. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ D-5593. Штамм получен путем многоступенчатой селекции с применением мутагена нитрозогуанидина из штамма Brevlbacterlum sp.E531. На первом этапе были получены ревертанты исходного штамма, не нуждающиеся для роста в гомосерине. На втором этапе от одного, из таких ревертантов получены мутанты, устойчивые к структурному аналогу лизина S-(2-аминозтил)-цистеину. На третьем этапе селекции от одного из устойчивых мутантов был получен штамм 90, нуждающийся для роста в лейцине. Полученный штамм Brevibacterium sp.90 превышает по продуктивности штамм-прототип и другие известные штаммы. Конверсия сахара в лизин составляет 42-49 %, уровень накопления лизина достигает 65 г/л за 68 часов ферментации при культивировании в колбах на качалке. Штамм Brevibacterium sp.90 имеет сравнительно низкую потребность в ростовых факторах и способен накапливать высокий уровень лизина на мелассных средах без гидролизата БВК, либо при небольшой добавке его (2-3 %), что соответствует 0,4-0,5 % по тех. массе БВК. Высокие показатели по продуктивности достигаются при использовании небольших количеств кукурузного экстракта или, что более эффективно, гидролизата кукурузного экстракта (1,0-1,5 % по тех. массе кукурузного экстракта). Штамм в этих условия х резко снижает уровень накопления лизина. Преимуществом нового штамма является также сниженная потребность в аэрации Новый штамм Brevlbacterlum sp.90 имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки. Культурально-морфологические признаки. Клетки овальные, размеры 1,0-1,5, 0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют. Через 3-5 суток роста при 30°С на МПА и на агаре Хоттингера колонии диаметром 2-4 мм, желтоватокремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, края ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 суток рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный. Через 3-5 суток роста при 30°С из глюкозо-минеральной среде Гловера, содержащей лейцин, биотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний светло-кремовый. Рост штриха на этой среде через 2 суток умеренный. Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Желатину не разжижает. Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе. Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот. Растет при температуре 24-42°С. Оптимальная температура 32°С. Растет на средах с РН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2. Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и I-лейцине. Устойчив к бактериофагам, лизирующим штамм-прототип Brevlbacierium sp.E531. Устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэ-тил)-цистеину (АЭЦ). Штамм хранится при температуре 4°C на косяках с агаром Хоттингера в течение 6 месяцев или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 года. Получение лизина с использованием штамма Brevibacterium sp.90 осуществляют следующим образом. Клетки штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем засеивают колбы с посевной средой. Колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об/мин) и инкубируют в течение 18-24 часов при 30°С. Выращенный посевной материал вносят в колбы с ферментационной средой, содержащей источник углерода, минеральные соли и ростовые факторы. Ферментацию проводят в колбах на качалке при 30-32°С в течение 5070 часов. Уровень накопления лизина в культуральной жидкости составляет 50-65 г/л. Конверсия сахара в лизин составляет 42-49 %. Препарат L-лизина из ферментационного раствора готовят в виде кормового концентрата или выделяют как кристаллический продукт известными способами. Пример 1. Клетки штамма Brevibacterium sp.90, а также штамма-прототипа Brevibacterium sp.E531, выращенные при 30°С в течение 1-2 суток на МПа, петлей засевают колбы объемом 250 мл с 15 мл посевной среды следующего состава (%): меласса - 3; кукурузный экстракт - 6; хлорид аммония – 0,5; мел - 0,8. Все компоненты посевной среды стерилизуются совместно. Колбы помещают на круговую качалку (220 об/мин) и выращивают в течение 24 час при 32°С. Готовым посевным материалом в количестве 5 % засевают колбы на 750 мл, содержащие 20 мл ферментационной среды следующего состава (%):. меласса - 24; сульфат аммония 3,5; гидрофосфат калия - 0.1; сульфат магния семиводный - 0,05; мел - 3. В состав ферментационной среды в качестве стимулирующих рост факторов вводят кукурузный экстракт - 1,5 % (среда 1) или гидролизат БВК - 0,5 % по тех, массе БВК (среда 2). Ферментацию проводят в течение 64 часов при температуре 32°С на круговой качалке (250 об/мин). Результаты ферментации приведены в табл. 1. Как видно из результатов табл. 1, предлагаемый штамм Brevibacterium sp.90 на среде с 1,5 % кукурузного экстракта накапливает почти в 2 раза больше лизина, чем штамм-прототип Е531 (50,3 и 25,4 г/л). При этом новый штамм превышает штамм-прототип и по конверсии сахара в лизин в 1,7 раза (45,2 против 26,25 %). На среде 2 с гидролизатом БВК (0,5 % по БВК) штамм 90 накапливает лизин в концентрации 52,2 г/л, а штамм-прототип - 32,4 г/л. Конверсия составляет соответственно 48,4 и 30,2 %. Пример 2. Выращивание посевного материала штаммов 90 и Е531 проводят по примеру 1. Ферментационная среда имеет следующий состав (%): меласса - 28, сульфат аммония -4; гидролизат КЭ-2,0 (в расчете на технический вес КЭ); гидрофосфат аммония - 0,2; сульфат магния семиводный - 0,05; дестиобиотин - 100 мкг/л. Ферментацию проводят в колбах на качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 72 час. С целью создания разной аэрации использовали колбы Эрленмейера емкостью 750 мл с объемом среды 20 и 30 мл, а также, колбы Эрленмейера объемом 250 мл без отбойников (объем среды 10 и 15 мл) и с четырьмя отбойниками (объем среды 15мл). Интенсивность кислородного массообмена (сульфитные числа, г0/л час) и результаты по уровню накопления лизина приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что штамм 90 менее чувствителен к недостатку кислорода, чем штамм штамм-прототип. При ухудшении аэрации с 5,5 до 2.5 г/л час штамм 90 снижает накопление лизина в 1,8 раза (с 65,3 до 38,6 г/л), тогда как штамм-прототип - в 2,3 раза (с 46,1 до 20,0 г/л). Пример 3. Выращивание посевного материала штамма 90 и состав ферментационной среды как в примере 1. Отличием является то, что в ферментационную среду вместо гидролизата кукурузного экстракта добавляется L-лейцин в концентрации 0,03 %. Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с отбойниками. Объем ферментационной среды 15 мл. Через 68 часов ферментации содержание лизина достигает 59,7 г/л. Конверсия углеводов в лизин составляет 48 %. Пример 4. Выращивание посевного материала штамма Brevibacterium sp.90 и условия проведения ферментации по примеру 1, но используется ферментационная среда следующего состава (%): сахар-сырец -12; сульфат аммония – 4 %; гидрофосфат калия - 0,2 %; сульфат магния семиводный - 0,05; дестиобиотин –200 мкг/мл; тиамин -100 мкг/мл; мел – 3 %; L-лейцин - 0,05. Через 72 час ферментации содержание лизина в культуральной жидкости - 50 г/л. Конверсия углеводов в лизин – 42 %. Пример 5. Выращивание посевного материала и условия ферментации по примеру 3, но в составе ферментационной среды вместо L-лейцина содержится лейцин - содержащая культуральная жидкость с концентрацией в ней L-лейцина 21 г/л, приготовленная по авт. свидетельству в СССР 1394711. Концентрации лейцина в приготовленной таким образом ферментационной среде 0,3 г/л. Через 68 час ферментации содержание лизина в культуральной жидкости – 56,6 г/л, конверсия углеводов в лизин 47 %. Пример 6. Выращенным посевным материалом штаммов Brevibacterium sp.90 и Brevibacterium sp.E531 в посевной среде, как это показано в Примере 1, в объеме 1 л засевают 2,5 куб м посевной среды того же состава, помещенную в ферментер емкостью 5 куб.м. Ферментер оборудован барботером для распределения воздуха и рубашкой для охлаждения. Выращивание культуры проводят при 30-32°С в течение 21 с непрерывной аэрацией (2-3 куб. м и воздуха в мин). Выращенной культурой объемом 2,5 куб. м засевают 30 куб. м ферментационной среды, приготовленной в ферментере емкостью 50 куб. м. Ферментер оборудован барботажным воздухораспределением. Ферментационная среда имеет следующий состав (%): меласса - 25, хлорид аммония 1,3; гидрофосфа т аммония -0,1; гидролизат БВК - 4 (в пересчете на технический вес продукта -0,8), пропинол 0,1 %. Значения рН в ходе ферментации поддерживается на уровне 6,8-7,0 путем автоматической подачи водного аммиака (25 %) по датчику рН. Скорость подачи воздуха 1 объем на 1 объем ферментационной среды в минуту. Через 58 часов ферментации концентрация лизина составила 56 г/л. Конверсия углеводов в лизин – 45 %. В контроле при тех же условия х ферментации и при той же продолжительности при использовании штамма Е531 концентрация лизина составила 40 г/л. Конверсия источника углерода составила – 33 %. Представленные примеры показывают, что при использовании нового штамма Brevibacterium sp.90 высокий выход лизина (до 65 г/л) и высокий уровень конверсии углеводов в лизин (до 49 %) достигается при использовании ферментационных сред со сниженным в 1,5-2 раза содержанием ростовых факторов кукурузного экстракта и гидролизата БВК. Штамм способен давать высокий выход лизина на мелассной среде и в отсутствие гидролизата БВК, что позволяет исключить из технологического процесса это экологически вредное и дорогое сырье. На мелассной среде с 1,5 % кукурузного экстракта штамм 90 превышает по выходу лизина штамм-прототип на 30-50 %. Новый штамм значительно менее, чем штамм-прототип чувствителен к недостатку аэрации. При снижении аэрации по сульфитному числу с 5,5 до 2,3 г0/л час штамм снижает уровень продукции лизина в 1,7 раза (с 65,3 до 37,6 г/л), а штамм-прототип уменьшает продукцию в 2,2 раза (с 45,1 до 20,5 г/л). При применении нового штамма в промышленности имеется возможность использования ферментеров с малой интенсивностью аэрации, не оборудованных мешалками. В условиях сниженной аэрации уменьшается также и тепловыделение, борьба с которым связана с определенными трудностями из-за недостатка воды на охлаждение.