Спосіб детекції вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби

Винахід, що заявляється, відноситься до молекулярної біології, вірусології та біотехнології, а саме до створення праймерів для детекції вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Він може бути використаний для раннього виявлення тварин, що інфіковані природно або експериментально вірусом імунодефіциту великої рогатої худоби. Інфікування великої рогатої худоби (ВРХ) вірусом імунодефіциту (ВІ) в природних умовах асоційовано із зниженням удоїв молока та характеризується деградацією нервової системи, прогресуючим виснаженням, розвитком виразок ротової порожнини, зменшенням ваги тварини. Для детекції ВІ ВРХ застосовують серологічні, вірусологічні та молекулярно-генетичні методи. Існує спосіб детекції ВІ ВРХ за допомогою непрямої флюоресценції (D.T. Scholl, R.E. Truax, J.M. Baptista, К. Ingawa, K.A. Orr, K.L. O'Reilly, B.F. Jenny. Natural transplacental infection of dairy calves with bovine immunodeficiency virus and estimation of effect on neonatal health // Preventive Veterinary Medicine. -2000. -V. 43. -P.239-252). В основі цього способу лежить візуалізація місць зв'язування вірусного антигену з антитілами до ВІ ВРХ за допомогою флюоресцентного барвника флюоресцеінізотіоцианата. Недоліком цього способу детекції ВІ ВРХ є можливість отримання, з одного боку, хибно негативних результатів аналізу внаслідок низької чутливості методу непрямої флюоресценції, тобто неможливість детектувати невелику кількість антитіл. З іншого боку, існує вірогідність отримання хибно позитивних результатів аналізу внаслідок можливості існування перехресних реакцій з неспецифічними до ВІ ВРХ антитілами. Крім того, істотними недоліками даного способу детекції ВІ ВРХ, що знижують його чутливість, є необхідність використання флюоресцентного мікроскопа та проблема приготування стабільних препаратів. Існує також спосіб детекції ВІ ВРХ за допомогою непрямого флюоресцентного аналізу та гніздової полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (С.М. Gradil, R.E. Watson, R.W. Renshaw, R.O. Gilbert, E.J. Dubovi. Detection of bovine immunodeficiency virus DNA in the blood and semen of experimentally infected bulls // Veterinary Microbiology. -1999. -V.70. -P.21-31). Для виявлення ВІ ВРХ було використано набори праймерів для детекції генів роl та env провірусної ДНК вірусу імунодефіциту за допомогою ПЛР. Було показано, що праймери для детекції фрагмента гена роl у 30-100 разів є більш чутливими у порівнянні з праймерами до гена env. Крім того, було продемонстровано, що ПЛР відрізняється більш високою чутливістю у порівняні з методом непрямої флюоресценції при виявленні тварин, експериментально інфікованих вірусом імунодефіциту ВРХ. Антитіла до ВІ ВРХ за допомогою методу непрямої флюоресценції не було виявлено у двох з трьох ПЛР-позитивних зразків. В той же час недоліком наборів ПЛР-праймерів, що пропонуються у даній роботі для детекції ВІ ВРХ, є їх недостатньо висока специфічність внаслідок присутності помилкових (неспарених) нуклеотидів у комплексі праймер-однонитковий продукт ПЛР. Найбільш близьким є спосіб детекції ВІ ВРХ за допомогою гніздової ПЛР та наступної саузерн-блотгібридизації (S. Meas, Н. Kabeya, S. Yoshihara, К. Ohashi, S. Matsuki, Y. Mikami, C. Sugimoto and M. Onuma. Seroprevalence and field isolation of bovine immunodeficiency virus // J. Vet. Med. Sci. -1998. -V. 60, No. 11. -P.11951202). За допомогою ПЛР було виявлено фрагмент провірусної ДНК ВІ ВРХ довжиною 298 пар основ у зразках крові та молоці ВРХ, а також у культурі інфікованих ВІ клітин сс81. В той же час цей фрагмент не було ідентифіковано у двох зразках крові серопозитивних щодо ВІ ВРХ корів. Було показано також, що японський ізолят ВІ ВРХ на 99-99,7% є гомологічним до американського ізоляту ВІ R29. Крім того, у даній роботі було продемонстровано можливість одночасного інфікування ВРХ вірусом імунодефіциту та вірусом лейкозу ВРХ. Так, серед 611 голів ВРХ 28,6% тварин були серопозитивними щодо вірусу лейкозу; 11,7% виявилися серопозитивними щодо ВІ; 4,2% тварин були серопозитивними щодо вірусу лейкозу та ВІ одночасно. В той же час недоліком пропонуємої системи чотирьох праймерів є можливість отримання хибно негативних результатів ПЛРаналізу внаслідок недосконалого підходу до конструювання цих праймерів. Недосконалість підходу полягає в тому, що праймери було розроблено на основі знання послідовності тільки одного ізоляту ВІ ВРХ, без проведення множинного вирівнювання для всіх відомих ізолятів ВІ ВРХ та без урахування термодинамічних характеристик праймерів, що призводить до зниження надійності ПЛР-аналізу. У зв'язку з вищевикладеним в основу винаходу покладено задачу підвищення точності детекції вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби шляхом забезпечення специфічної ідентифікації ВІ ВРХ. Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі детекції ВІ ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції шляхом створення набору специфічних праймерів, згідно з винаходом, використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: BIV1 5' - GAA TGT GAA CAC TTA ACT GCA ATA-3' BIV2 5' - AAT GTC GGA CTA CAG TCT TCC - 3'. Створення наборів праймерів для ПЛР-детекції ВІ ВРХ передбачає пошук висококонсервативних фрагментів у геномі ізолятів ВІ. Із представлених у базах даних EMBL, GenBank та DDBJ варіантів ВІ ВРХ було створено підбази генів роl та env вірусу імунодефіциту ВРХ. У підбазу гена роl увійшли 26 ізолятів ВІ ВРХ, в тому числі 2 ізоляти з повністю відомою послідовністю геному ВІ ВРХ. За допомогою комп'ютерного аналізу було виявлено фрагменти гена роl ВІ ВРХ зі 100%-им рівнем гомології, з яких було обрано праймери для ранньої детекції вірусу імунодефіциту ВРХ. Сконструйований набір праймерів дозволяє виявляти провірусну ДНК ВІ ВРХ зі 100%-ою специфічністю та точністю для всіх відомих ізолятів ВІ ВРХ. Приклад 1 Фрагмент множинного вирівнювання гена роl для 9 ізолятів вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби із баз даних секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот EMBL, GenBank та DDBJ. Провали на чорних смугах демонструють, що для одного або декількох ізолятів у даній позиції є нуклеотиди, які не збігаються з нуклеотидами інших ізолятів. Термін "100% рівень гомології" означає, що для всіх відомих ізолятів (тобто для тих, які присутні у базах даних EMBL, GenBank, DDBJ) на момент проведення комп'ютерного аналізу ступінь гомології дорівнює 100%. В той же час є вірогідність, що існують варіанти ВІ ВРХ, секвенс яких невідомий, або з часом буде секвеновано ізоляти ВІ ВРХ, для яких ступінь гомології визначених нами фрагментів гена роl буде меншим, ніж 100%. BIV1 - один із розроблених нами праймерів для детекції провірусної ДНК вірусу імунодефіциту ВРХ. Ступінь гомології цього праймера, як і іншого пропонуємого нами праймера BIV2, складає 100%. Чорні смуги під послідовностями вказують на висококонсервативні фрагменти гена роl ВІ ВРХ. Приклад 2 Детекція продуктів ампліфікації провірусної ДНК ВІ ВРХ після проведення полімеразної ланцюгової реакції та електрофореза у 2% агарозному гелі. 1 - специфічний продукт очікуваної довжини після ампліфікації із розробленими праймерами BIV1-BIV2, комплементарними до фрагменту гена роl ВІ КРС. Довжина амплікону складає 101 пару нуклеотидів (пн). 2 - амплікон довжиною 175пн після ампліфікації з праймерами з роботи (Suarez D., Van Der Maaten M., Whetstone С. Improved early and long-term detection of bovine lentivirus by a nested polymerase chain reaction test in experimentally infected calves // Am. J. Vet.Res. V. 57, P.305, 1995). 3 - негативний контроль ампліфікації. 4 - 100пн маркер молекулярної маси. Як позитивний контроль використовували плазмідну ДНК, в яку було клоновано провірусну ДНК ВІ ВРХ. Геномну ДНК ВІ ВРХ було виділено із ізоляту ВІ ВРХ Florida 112, що культивували у трансформованій клітинній лінії тестикулів великої рогатої худоби SK40 (RD420). Таким чином, у даному винаході представлено набір праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для детекції провірусної ДНК вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби. Розроблена система праймерів BIV1-BIV2 може бути використана для раннього виявлення тварин, інфікованих як експериментально, так і природно вірусом імунодефіциту ВРХ.