Спосіб детекції днк хламідій у зразках патологічного матеріалу

Винахід відноситься до ветеринарної мікробіології, та біотехнології, а саме до детекції різних видів хламідій у зразках патологічного матеріалу шляхом застосування двоступеневої (гніздової) полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням специфічних олігонуклеотидів, що відповідають ділянкам гену omp-1. Спосіб полімеразної ланцюгової реакції застосовується для діагностики інфекційних захворювань людини, тварин і птахів. В його основі лежить виявлення специфічного фрагменту геному збудника інфекції в зразках патологічного матеріалу і являє собою багаторазово повторювані цикли синтезу специфічної ділянки ДНК-мішені в присутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинук-леозидтрифосфатів, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок-праймерів, що визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Принцип методу полягає в реплікації ДНК, який включає розплетення її подвійної спіралі, розходження ниток нуклеїнової кислоти і комплементарний синтез нових ниток ДНК. Механізм реплікації включає зміну циклічно повторюваних температурних переходів (95-97°С, 55-65°С, 68-74°С), під час яких відбувається денатурація ДНК, приєднання специфічних ділянок олігонуклеотидів і добудова цих ділянок за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Кількість циклів складає від 25 до 45. Таким чином, суть методу полягає в тому, що після маркіровки ділянки ДНК специфічними для неї олігонуклеотидами, відбувається синтез тільки в межах цієї ділянки, а не по усій її довжині. Як наслідок відбувається експоненціальне збільшення кількості копій специфічного фрагмента ДНК й накопичується велика кількість одинакових ланок (з однією кількістю нуклеотидних послідовностей). Є патент US №2002168633 від 2002-11-14, кл. C12Q1/68 "Nucleotide fragment of the 23 S RNA of the genus chlamydia, use as a probe, primer, and in a reagent and a detection procedure". Bін виконується шляхом використання ПЛР для детекції хламідіозів, викликаних тільки C.trachomatis. Існує спосіб визначення ДНК збудників хламідіозу з використанням ділянки гену Іти В C.trachomatis за допомогою метода ампліфікації нуклеїнових кислот. (патент US №5837469 від 1998-11-17, кл. C12Q1/68 "Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acid". Це рішення може бути прототипом). Його недоліком є те, що спосіб призначений тільки для детекції Chlamydia trachomatis і не дає змогу проводити видову і родову ди ференціації. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб детекції ДНК хламідій у зразках патологічного матеріалу полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР), шляхом використання двоступеневої ПЛР, щоб забезпечити спосіб детекції і диференціації хламідій в зразках патологічного матеріалу. Можливість швидкого і практично повного виявлення багатьох збудників інфекційних захворювань людини і тварин у зразках крові, сечі, слини, у різних тканинах організму методом ампліфікації генів за допомогою ПЛР була продемонстрована вже через кілька років після її відкриття. Було показано, що ПЛР має високу чутливість і в той же час не вимагає, подібно серологічним методам, наявності імунної відповіді на проникнення збудника в організм хазяїна, що дає можливість стежити за ранніми стадіями інфекції і виявляти її латентний плин. Пізніше почали розробляти варіанти ПЛР, що дозволяють не тільки виявляти патогенні мікроорганізми, але і визначати їхню концентрацію в біологічних тканинах, активність в організмі хазяїна, а також диференціювати патогенні форми збудника. На кресленні зображена схема. Антигенні властивості хламідій визначаються внутрішньою мембраною, яка представлена ліпополісахаридом, а також білками зовнішньої мембрани, які врізані у вн утрішню мембрану. 60% усіх мембранних білків хламідій складає головний білок зовнішньої мембрани (Main Outer Membrane Protein-MOMP) з молекулярною масою 3845KD. Ген, який кодує головний білок зовнішньої мембрани, називається omp-1 (outer membrane protein). Його послідовність визначено для усіх видів хламідій. За допомогою порівняльного аналізу гена omp-1 було виявлено наявність чотирьох варіабельних доменів (ділянок) VD-1—VD-4, які чергуються з консервативними. (див.креслення). Варіабельні домени з координатами амінокислотних залишків VD-1 (64-83), VD-2 (139-160), VD-3 (224-337), VD-4 (288-317) відрізняються довжиною та послідовністю пар нуклеотидів. В варіабельних доменах розташовані видо- і сероварспецифічні епітопи. Консервативні домени — це ділянки одинакової довжини, що обумовлює можливість появи перехресних реакцій. Вони містять родоспецифічні епітопи, занурені в клітинну мембрану і залишок цистеїну, який включається в дисульфідні зв'язки. Загальний розмір кодуємої ділянки складає 1290 пар нуклеотидів. На основі поліморфізма варіабельних ділянок, а також їх чергування з консервативними розроблено методику детекції та диференціації хламідій, виділених із зразків патологічного матеріалу за допомогою двоступеневої (гніздової) ПЛР. Гніздова полімеразна ланцюгова реакція характеризується більш високою чутливістю і специфічністю, ніж стандартна ПЛР. Спосіб гніздової полімеразної ланцюгової реакцій для детекції та диференціації хламідій, який ми пропонуємо, базується на роботах Kaltenbock et al. ( Kaltenboeck В., Kousulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol., 1991, 29:19691975. Kaltenboeck В., Kousulas K.G., Storz J. Two-step polymerase chain reaction and restriction endonuclease analyses detect and and differentiate omp A DNA of Chlamydia spp. J.Clin.Microbiol., 1992, 30:1098-1104). Застосовуються власні праймери (Таблиця ) з удосконаленням температурних профілей амліфікації і процесом виділення ДНК із зразків патологічного матеріалу. Особливість способа полягає в тому, що власне ПЛР проводиться в 2 етапи. На першому етапі проводиться родоспецифічна діагностика із застосуванням чотирьох родоспецифічних праймерів — двох зовнішніх і двох вн утрішні х. Ці праймери зв’язуються з консервативними доменами гена omp-1, які розташовані між варіабельними доменами VD-2 і VD-3, а також нижче VD-4. Зовнішні праймери обмежують фрагмент гена omp-1, довжиною 1120 нуклеотидів, а внутрішні фрагмент довжиною 950 нуклеотидів. Продукт ПЛР, отриманий із зовнішніми праймерами, використовувався для реампліфікації із внутрішніми, після чого фрагмент довжиною 950 нуклеотидів виявляють електрофорезом. На другому етапі проводиться видоспецифічна діагностика. При цьому використовуються видоспецифічні праймери, кожен з яких із загальним родоспецифічним праймером утворює фрагмент довжиною, характерною тільки для одного вида хламідій, і зв’язується з варіабельними доменами (VD-2 і VD-3 для С. psittaci і С. pecorum або VD-3 і VD-4 для С. trachomatis і С. psittaci). Продукт ампліфікації відзначається високою специфічністю і в подальшому піддається детекції при проведенні електрофорезу . Приклад 1. Виділення ДНК хламідій із зразків патологічного матеріалу: Виділення ДНК із фекалій: - додавали 200мкл води до 100мг фекалій і енергійно перемішували на вертексі протягом 1 хвилини; нагрівали суспензію протягом 10 хвилин; - супернатант відбирали і вносили в іншу пробірку, додавали 300мкл фенола і енергійно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - проводили центрифугування при 14000об/хв. - 5 хвилин; - відбирали супернатант и переносили до іншої пробірки; - до супернатанта додавали 300мкл хлороформ-изоамілової суміші (24:1); - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - проводили центрифугування при 14000об/ за хв. протягом 5 хвилин; - відбирали супернатант і переносили в іншу пробірку; - до супернатанта додавали 200мкл ізопропанола для осадження ДНК; - інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин; проводили центрифугування при 14000об/хв, а потім видаляли супернатант; - висушували осад; - осад розчиняли в 20мкл води і використовували 1мкл для проведення ампліфікації. Приклад 2. Виділення ДНК із паренхиматозних органів: - в пробірку, яка містила подрібнений шматочок паренхіматозного органа, вносили 0,5мл фізіологічного розчину і центрифугували при 2тис.об/хв. протягом 10 секунд; - відбирали супернатант; - додавали додецил-сульфата натрію 200мкл, 20мкл протеінази К і інкубували при 55°С протягом 1 години; - додавали 200мкл фенола; - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; проводили центрифугування при 12000об/ за хвил. протягом 5 хвилин; - відібирали супернатант і переносили в іншу пробірку; - додавали 200мкл хлороформ-изоамілової суміші; - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - відбирали супернатант і переносили в іншу пробірку; - додавали 120мкл ізопропанола (для зв'язування ДНК). Перемішували реагенти і інкубували при кімнатній температурі; - центрифугували при 14000об/хв. і видаляли супернатант; - висушували осад; - осад розчиняли в 20мкл води і використовували 1мкл для проведення ампліфікації. Приклад 3. Виділення ДНК із зразків сперми: - розчиняли 50мкл сперми в пробірці в 150мкл розчину додецил-сульфата натрія і інтенсивно перемішували; - додавали 20мкл розчину протеінази К (для розщеплення білків) і інтенсивно перемішували протягом 1 хвилини; - інкубували при 55°С на протягом 1 години; - додавали 200мкл фенолу; - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - центрифугували при 12000об/хв. протягом 5 хвилин; - відбирали супернатант і переносили в іншу пробірку; - додавали 200мклхлороформ-ізоамілової суміші; - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - відбирали супернатант і переносили в іншу пробірку; - додавали 120мкл ізопропанола для зв'язування ДНК. Добре перемішували реагенти і інкубували при кімнатній температурі; - центрифугували при 14000об/хв. і видаляли супернатант; - висушували осад; - осад розчиняли в 20мкл води і використовували 1мкл для проведення ампліфікації. Приклад 4. Виділення ДНК із зішкрябів (назальні, вагінальні, конъюнктивальш) слизових оболонок: - в пробірку, яка містила ватний тампон, вносили 500мкл буфера для лізису; - інтенсивно перемішували на вортексі протягом 1 хвилини; - центрифугували при 12000об/хв. на протязі 30 секунд; - переносили тампон піпеткою з наконечником, нижня частина якого зрізана, в іншу пробірку; - центрифугували при 12000об/хв. протягом 1 хвилини для того, щоб вичавити рідину, яку містить тампон; - видаляли супернатант і розчиняли осад в 50мкл буфера для лізису; - додавали 20мкл протеінази К і інкубували при 60°С протягом 2 годин; - інактивували протеіназу К, нагріванням при 97°С на протязі 15 хвилин; - центрифугували при 12000об/хв. протягом 5 хвилин для того, щоб видалити осад; - використовували 5мкл супернатанта для проведення ампліфікації. Приклад 5. Проведення ампліфікації: Родоспецифічна детекція хламідій. Готували реакційну суміш для проведення ампліфікації, яка складалась з: - 1мкл суміші д НТФ (2мМоль кожного) - праймери: а) зовнішні-для першої ампліфікації-191СНОМР\371CHOMP (20пМоль/мкл кожного)- по 1мкл кожного. б) внутрішні-для другої ампліфікації-201СНОМР\336СНОМР (20пМоль\мкл кожного)- по 1мкл кожного. - 5мкл 10х реакційного буфера для Taq-полімерази. - 0,2мкл Taq ДНК-полімерази. - 40,8мкл деіонізованої води (36,8мкл якщо досліджуються зішкряби). - 1мкл ДНК, виділеної із зразків матеріалу (5мкл, якщо досліджуються зішкряби). контролі: позитивний—ДНК хламідій референтних штамів і негативний – вода. Ампліфікацію проводили за такими температурними профілями: 95°С-30сек - 1 цикл (початкова денатурація ДНК) 95°С-30сек - 50 циклів (денатурація ДНК) 50°С-60сек - 1 цикл (відпал (приєднання) праймерів) 72°С-60сек - 2 цикла (добудова праймерів) Видоспецифічна детекція хламідій: Готували реакційну суміш для проведення ампліфікації, яка містила: - 1мкл суміші дНТФ (2мМоль кожного) - 5мкл 10х реакційного буфера для Taq-полімерази. - 0,2мкл Taq ДНК-полімерази - 40,8мкл деіонізованої води (36,8мкл якщо досліджуються зішкряби) - вибирали пару праймерів згідно схемі (див. схему) - 1мкл прямого праймера 201 СНОМР+1мкл зворотного праймера TRACH 269 або PNEUM 268 і відповідно 1мкл прямого праймера 204 РЕ-COR або 218 PSITT+1мкл зворотного праймера 336 СНОМР - 1мкл продукту попередньої ампліфікації - контролі: позитивний-ДНК хламідій референтних штамів, негативний - вода Ампліфікація проводиться за такими температурними профілями: 97°С-1сек-30 циклів (початкова денатурація ДНК) 97°С-1сек-1 цикл (денатурація ДНК) 50°С-60сек- 1 цикл (відпал – приєднання - праймерів) 72°С-60сек - 2 цикла (добудова праймерів) При позитивному результаті розмір смуг на електрофореграмі складає 250п.о для С. trachomatis, 244п.о для С. pneumoniae, 389-404п.о для С. psittaci і 426-441 для С. pecorum. Спосіб детекції ДНК хламідій у зразках патологічного матеріалу двоступеневою полімеразною ланцюговою реакцією, з використанням специфічних ділянок гену оmp-1, відзначається високою специфічністю і використовується для родо- і видоспецифічної діагностики, для швидкого і практично повного виявлення збудника хламідіозів в зразках патологічного матеріалу. Таблиця Назва Chlamydia spp. Chlamydia spp. Chlamydia spp. Chlamydia spp. C.psittaci C.trachomatis C.pneumoniae C.pecorum Праймер 191 CHOMP CHOMP 371 201 CHOMP CHOMP336s 218 PSITT TRACH 269 PNEUM 268 204 PECOR Послідовність* 5' - GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC - 3' 5' - TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAY GTG IGCIGC - 3' 5' - GGI GCW GMI TTC C AA TAY GCI CAR ТС – 3' 5' - CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT - 3' 5' - GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG -3' 5' - ACC ATT TAA CTC C AA TGT ARG GAG TG -3' 5' - GTA CTC CAA TGT ATG GC A СТА AAG A - 3' 5' - CCA ATA YGC АС А АТС KAA ACC TCG G -3' * Дегенеровані нуклеотиди: K=G; M=A,C; W=A,T; Y=C,T; І=інозин.