Спосіб збагачення суспензії клітин ембріонального мозку людини попередниками дофамінергічних нейронів

Спосіб збагачення суспензії клітин ембріона 3 37592 В основу збагачення суспензії ембріональних нервових клітин попередниками дофамінергічних нейронів, що відбувається із використанням BDNF, покладена його здатність запобігати запрограмованій загибелі клітин-попередників нейрогенезу [3]. Нейропротекторна антиапоптична активність BDNF здійснюється через систему сигналів, що запускаються після активації тирозинкінази. Ця система є складовою частиною регуляції чисельності дофамінергічних нейронів і виникнення нейромедіаторних провідних шля хів в онтогенезі. Проте, недоліком способу-прототипу є його низька результативність. В результаті вищеописаного способу культивування чисельність ТГпозитивних клітин збільшується на 70-80% [3]. Причиною цього є обмежена чисельність стовбурових нервових клітин в ви хідній суспензії. Завдання, яке вирішує корисна модель, що заявляється, полягає у збільшенні ефективності збагачення суспензії ембріональних нервових клітин людини попередниками дофамінергічних нейронів. Поставлене завдання досягається тим, що у відомому способі збагачення суспензії ембріональних нервових клітин людини попередниками дофамінергічних нейронів, який включає виділення тканини ембріонального мозку людини, механічне суспендування, культивування у присутності BDNF, згідно корисної моделі після суспендування додатково здійснюють попереднє культивування із фактором-мітогеном FGFb в концентрації 2нг/мл на протязі 7 діб, а потім продовжують культивування з BDNF, додаючи дофамін в концентрації 10мкМоль. Збагачення суспензії ембріональних нервових клітин людини попередниками дофамінергічних нейронів досягається тим, що додаткова фаза культивування з мітогеном стимулює поділ стовбурових клітин нервової системи, а присутність дофаміну одночасно з BDNF в культуральному середовищі сприяє диференціюванню стовбурових клітин по дофамінергічному напрямку і кращому виживанню клітин-попередників, оскільки є важливою частиною позиційної інформації, яку отримують нервові клітини в ембріогенезі під час формування дофамінергічних провідних шляхі в. В результаті вдається збільшити чисельність клітин-попередників в середньому в 4-5 разів, в той час, коли застосування засобу-прототипу призводить до збільшення їх чисельності у 0,76 рази [3, 4]. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: з фрагментів ембріональних тканин, отриманих з абортивного матеріалу виділяють Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 4 ембріональний мозок, промивають фізіологічним розчином, суспендують в культуральному середовищі ДМЕМ та культивують на протязі 7 діб у присутності FGFb в концентрації 2нг/мл, потім середовище змінюють на ДМЕМ із додаванням BDNF (50нг/мл) та дофаміну (10мкМоль). Оцінку чисельності детермінованих попередників дофамінергічних нейронів здійснюють по наявності ТГпозитивних клітин. Приклад 1 Фрагмент мозку ембріону людини 10 тижнів гестації промили фізіологічним розчином, провели механічну дезінтеграцію з допомогою пастерівської піпетки, отримали суспензію ембріональних нервових клітин, провели підрахунок чисельності клітин з допомогою камери Горяєва з 0,2% розчином трипанового синього. Кінцева концентрація клітин в поживному середовищі становила 1,65х10 в 1мл, вміст незабарвлених клітин - 82%, вміст ТГпозитивних клітин - 6,4%. Після цього здійснювалось двостадійне культивування на середовищі ДМЕМ, в яке на першому етапі додавався FGFb в концентрації 2нг/мл на протязі 7 діб, а на другому BDNF (50нг/мл) та дофамін (10мкМоль), також, протягом 7 діб. Кінцева концентрація ТГпозитивних клітин становила 30%. Отже, концентрація попередників дофамінергічних нейронів збільшилася у 4,68 рази. Таким чином, нами розроблено спосіб збагачення суспензії ембріональних нервових клітин людини попередниками дофамінергічних нейронів, який є більш результативним по чисельності отриманих ТГ-позитивних клітин ніж відомі прототипи. Цей спосіб може бути використаний в експериментальних і клінічних дослідженнях, спрямованих на вдосконалення методів клітинної терапії неврологічних захворювань. Література: 1. Carpenter M.K., Нu Х.С., Jackson J., et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells // Exp. Neurol. - 1999. - №158. - p. 265-278. 2. Zeng X., Cai J., Chen J., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells // Stem Cells. - 2004. - v.22. - p. 925-940. 3. Studer L., Spenger S., Seiler R.W., et al. Effects of brain-derived neurotrophic factor on neuronal structure of dopaminergic neurons in dissociated cultures of human fetal methencephalon // Exp. Brain Res. - 1996. - v.108. - №2. - p. 328-326. 4. Pliego Rivero F.B., McCormack W.J., Jauniaux E., et al. Forscolin-induced expression of tyrosine hydroxylase in human fetal brain cortex // De v. Brain Res. - 1999. - v.l 14. - №2. - p. 201-206. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601